一种基于四元稠合喹喔啉结构的荧光探针及其应用

1.本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种以四元稠合喹喔啉作为荧光基团和马来酰亚胺作为识别基团的荧光探针及其在生物硫醇检测中的应用。本发明还提供了所述荧光探针的制备方法。


背景技术：

2.半胱氨酸(cysteine，cys)、同型半胱氨酸(homocysteine，hcy)和谷胱甘肽(glutathione，gsh)是体内重要的生物硫醇，在维持生物体内氧化还原动态平衡方面起着至关重要的作用。细胞中生物硫醇水平的异常与许多疾病有关。例如，cys水平异常往往与肝脏损伤、皮肤损伤、生长缓慢等疾病有关，hcy水平升高是诱发阿尔茨海默症和心血管疾病的危险因素之一。gsh是细胞内含量最丰富的非蛋白质类生物硫醇(1-15mm)，可以保护细胞成分免受活性氧和毒素的破坏，其水平异常升高是导致肿瘤细胞对放疗或化疗耐受的原因之一。
3.目前已报道的生物硫醇分析方法有很多，包括高效液相色谱法、电泳法、流动注射分析法、分光光度法、伏安法以及电喷雾电离-质谱联用法等。这些方法能够满足生物硫醇检测的需求，但是仍存在一些问题，如样品处理方式复杂、实验仪器价格昂贵以及需要专业的分析人员等。近年来，关于荧光探针检测生物硫醇的报道越来越多，该方法灵敏度高，操作简单，能对活细胞甚至活体成像，因此得到越来越多的关注。以马来酰亚胺为识别基团的荧光探针其马来酰亚胺结构中的缺电子双键可以与给电子基团发生michael加成反应，探针分子内的电荷分布发生变化而产生荧光。文献《a maleimide-based thiol fluorescent probe and its application for bioimaging》公开了一种以萘酰亚胺为荧光基团、马来酰亚胺为识别基团的荧光探针(sensors and actuators b:chemical,2014,195:246
–
251)，将该探针应用于硫醇检测时，最大发射波长仅393nm，检测后探针的荧光强度仅增强4倍。文献《a turn-on green fluorescent thiol probe based on the 1,2-addition reaction and its application for bioimaging》公开了以氧杂蒽为荧光基团、马来酰亚胺为识别基团的荧光探针(sensors and actuators b:chemical,2015,207:139
–
143)。该探针的水溶性不好，检测时需要应用高比例的有机溶剂(h2o/dmso＝1:3)。
4.由于生物体内的给电子体有很多，如人体内的氨基酸含有的氨基、羟基等基团。因此，以马来酰亚胺为识别基团的荧光探针在检测生物硫醇时容易受人体内的含有氨基或羟基的物质的干扰，这是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于四元稠合喹喔啉结构的荧光探针。进一步，本发明还提供所述荧光探针的制备方法及其在生物硫醇检测、活细胞荧光成像以及活体成像中的应用。
6.为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
7.一种基于四元稠合喹喔啉结构的荧光探针，所述荧光探针以四元稠合喹喔啉作为荧光基团，以马来酰亚胺作为识别基团。
8.本发明一个具体的示例，所述荧光探针结构式如式(ⅰ)所示：
[0009][0010]
本发明还公开了上述荧光探针作为指示剂在巯基化合物检测中的应用。优选的，所述巯基化合物为生物硫醇，如半胱氨酸、同型半胱氨酸或谷胱甘肽。
[0011]
本发明所述荧光探针可用于巯基化合物，特别是生物硫醇的定性或定量检测。
[0012]
上述应用的一个具体示例为液体、细胞或生物体(活体)荧光成像。
[0013]
本发明所述的荧光探针作为诊断试剂在生物硫醇异常有关的疾病诊断中的应用，所述生物硫醇异常有关的疾病选自肝脏损伤、皮肤损伤、生长缓慢、阿尔茨海默症、抑郁症、心血管疾病、神经管缺陷、炎症性肠病、骨质疏松症、化疗的耐药性。
[0014]
一个具体的示例，本发明所阐述的荧光探针(i)的应用，包括以下步骤：
[0015]
(1)配制荧光探针体系；
[0016]
(2)配制生物硫醇的水溶液；
[0017]
(3)将所述生物硫醇的水溶液加入所述荧光探针体系中，配制得到生物硫醇浓度不同的混合溶液；
[0018]
(4)测试所述混合溶液在490nm处的荧光强度，并根据所述荧光强度与生物硫醇浓度的关系，绘制成标准曲线；
[0019]
(5)根据所述标准曲线，定量检测待测溶液中生物硫醇的含量。
[0020]
上述配制荧光探针体系的步骤包括：
[0021]
(1)将所述荧光探针(ⅰ)溶解于有机溶剂中，得到母液，且使所述母液中探针的浓度为5
×
10-7
～5
×
10-3
mol/l；
[0022]
(2)将所述母液的浓度用缓冲液稀释，得到荧光探针体系。
[0023]
(3)制备荧光探针母液的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃、丙酮、醋酸、dmf、dma、dmso中的一种或几种。
[0024]
(4)稀释母液的缓冲液为pbs缓冲液、hepes缓冲液、tris缓冲液中的一种或几种。
[0025]
本发明另一目的在于提供本发明所述的荧光探针(ⅰ)的制备方法，将化合物(
ⅴ
)与化合物(vi)在催化剂催化下反应得到荧光探针(ⅰ)，
[0026][0027]
上述反应所选溶剂选自甲酸、乙酸、丙酸、乙腈、thf、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、dmso、甲苯、二甲苯、1,4-二氧六环、2-甲基吡咯烷酮中的一种或几种。
[0028]
优选反应温度为0℃～200℃，所选催化剂选自乙酸钠、乙酸钾、nb2o5、乙酰氯、亚硫酰氯、五氧化二磷、亚硫酰氯、三氟乙酸酐-三乙胺、氯甲酸乙酯-三乙胺和n,n
′‑
二环己基碳二亚胺(dcc)中的一种或几种。
[0029]
上述反应中的化合物(
ⅴ
)可参考张勇等人的方法(tetrahedron letters,2015,56(18):2332-2335.；cn110818706b；chemistry
–
a european journal,2019,25(60):13709-13713.；new journal of chemistry,2020,44(46):20434-20440.)制备。化合物(vi)可商业购买。
[0030]
化合物(v)的制备包括如下步骤：
[0031]
(a)将化合物(ⅱ)与化合物(ⅲ)在催化剂催化下反应得到化合物(ⅳ)
[0032][0033]
(b)将化合物(ⅳ)在催化剂催化下反应得到化合物(
ⅴ
)，
[0034][0035]
上述制备方法中，优选步骤(a)溶剂选自甲醇、乙醇、正丁醇、乙腈、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、丙酮、醋酸、dma、dmso、甲苯中的一种或几种；步骤(b)所选溶剂选自甲醇、乙醇、正丁醇、乙腈、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、丙酮、醋酸、dma、dmso、甲苯中的一种或几种。优选步骤(a)所用的催化剂为i2、cuo、叔丁基过氧化氢、n-碘代丁二酰亚胺、四丁基碘化铵、ki和双三氟乙酰碘苯中的一种或几种；步骤(b)所用的催化剂为pd/c、raney ni、铁粉、sncl2、连二亚硫酸钠、水合肼、ticl3和hsicl3中的一种或几种。
[0036]
本发明一个具体的制备方法如下：
[0037]
(a)将化合物(ⅱ)、化合物(ⅲ)和催化剂溶于反应溶剂中，加热搅拌。反应完成后，反应冷却至室温，并用饱和na2so3溶液淬灭，然后用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用饱和食盐水洗涤，加入无水na2so4干燥。柱层析分离产品(ⅳ)。
[0038]
(b)将化合物(ⅳ)和催化剂溶于反应溶剂中，加热搅拌。反应完成后，反应冷却至室温，旋蒸除去大部分溶剂，然后用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用饱和食盐水洗涤，加入无水na2so4干燥。柱层析分离产品(
ⅴ
)。
[0039]
(c)将化合物(
ⅴ
)、化合物(vi)和催化剂溶于反应溶剂中，加热搅拌。反应完成后，反应冷却至室温，旋蒸除去大部分反应溶剂，然后向反应体系中加入水并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用饱和食盐水洗涤，加入无水na2so4干燥。柱层析分离荧光探针(ⅰ)。
[0040]
上述具体反应条件可参见实施例。
[0041]
本发明的有益之处在于：
[0042]
(1)本发明提供的荧光探针，采用四元稠合喹喔啉衍生物作为荧光母体，选择含有亲电位点的马来酸亚胺作为光诱导电子转移过程的识别基团，能够高选择性和高灵敏性地
响应生物硫醇，在生物硫醇存在下，荧光光谱出现明显新的发射峰，可用于生物硫醇的定性检测和定量检测，并可大大降低外部检测条件的干扰，具有较快的检测速度和较高的检测精度。
[0043]
(2)本发明提供的荧光探针，对细胞具有较低的毒性，生物兼容性良好，不仅可以检测溶液中的生物硫醇，还可以检测细胞中、斑马鱼体内的生物硫醇，可被用来深入研究生物硫醇在环境和生物体内的产生、转运及累积等过程的动力学机理，还有助于阐明生物硫醇在生理病理过程中的生物作用以及研究生物硫醇动态平衡的新机制。
附图说明
[0044]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0045]
图1是荧光探针(ⅰ)及其类似物的荧光光谱。(a)为结构中马来酰亚胺的取代位为8位或9位时的荧光光谱。(b)为荧光探针(ⅰ)结构中喹喔啉母核上选择不同取代基的荧光光谱。
[0046]
图2是荧光探针(ⅰ)(10μm)分别加入cys、hcy、gsh(200μm)后紫外光谱(a)、荧光光谱(b)以及紫外下颜色的变化(c)。检测体系为dmso-pbs(ph＝7.4,v/v＝1/9)，检测时的温度为37℃，激发波长400nm，狭缝2.5/2.5nm。
[0047]
图3是荧光探针(ⅰ)(10μm)加入半胱氨酸(200μm)后60分钟内荧光光谱(a)以及在495nm处的荧光强度变化(b)。检测体系为dmso-pbs(ph＝7.4,v/v＝1/9)，检测时的温度为37℃，激发波长400nm，狭缝2.5/2.5nm。
[0048]
图4是荧光探针(ⅰ)(10μm)加入谷胱甘肽(200μm)后180分钟内荧光光谱(a)以及在495nm处的荧光强度变化(b)。检测体系为dmso-pbs(ph＝7.4,v/v＝1/9)，检测时的温度为37℃，激发波长400nm，狭缝2.5/2.5nm。
[0049]
图5是荧光探针(ⅰ)(10μm)加入同型半胱氨酸(200μm)后180分钟内荧光光谱(a)以及在495nm处的荧光强度变化(b)。检测体系为dmso-pbs(ph＝7.4,v/v＝1/9)，检测时的温度为37℃，激发波长400nm，狭缝2.5/2.5nm。
[0050]
图6是荧光探针(ⅰ)(10μm)加入200μm生物硫醇(cys,gsh,hcy)后180分钟内荧光光谱在495nm处的荧光强度随时间的变化。检测体系为dmso-pbs(ph＝7.4,v/v＝1/9)，检测时的温度为37℃，激发波长400nm，狭缝2.5/2.5nm。
[0051]
图7是荧光探针(ⅰ)(10μm)加入不同浓度的cys(0～200μm)后荧光光谱(a)以及在495nm处的荧光强度随cys浓度的变化(b)。插图：荧光强度与浓度在0-8μm范围内的线性拟合图。检测体系为dmso-pbs(ph＝7.4,v/v＝1/9)，检测时的温度为37℃，孵育60分钟，激发波长400nm，狭缝2.5/2.5nm。
[0052]
图8是荧光探针(ⅰ)(10μm)加入不同浓度的gsh(0～200μm)后荧光光谱(a)以及在495nm处的荧光强度随gsh浓度的变化(b)。插图：荧光强度与浓度在0-7μm范围内的线性拟合图。检测体系为dmso-pbs(ph＝7.4,v/v＝1/9)，检测时的温度为37℃，孵育60分钟，激发波长400nm，狭缝2.5/2.5nm。
[0053]
图9是荧光探针(ⅰ)(10μm)加入不同浓度的hcy(0～50μm)后荧光光谱(a)以及在495nm处的荧光强度随gsh浓度的变化(b)。插图：荧光强度与浓度在0-10μm范围内的线性拟合图。检测体系为dmso-pbs(ph＝7.4,v/v＝1/9)，检测时的温度为37℃，孵育60分钟，激发波长400nm，狭缝2.5/2.5nm。
[0054]
图10是荧光探针(ⅰ)(10μm)在不同ph条件下加入200μm生物硫醇(cys,gsh,hcy)后荧光光谱在495nm处的荧光强度的变化。检测体系为dmso-pbs(v/v＝1/9)，检测时的温度为37℃，孵育60分钟，激发波长400nm，狭缝2.5/2.5nm。
[0055]
图11是荧光探针(ⅰ)(10μm)加入50μm的生物硫醇(cys、hcy、gsh)或500μm的各种氨基酸(cys、hcy、gsh、ala、arg、asp、gln、gly、his、lys、leu、met、phe、pro、ser、tyr、trp、thr和val)后荧光光谱(a)以及在495nm处的荧光强度的变化(b)。检测体系为dmso-pbs(ph＝7.4,v/v＝1/9)，检测时的温度为37℃，孵育60分钟，激发波长400nm，狭缝2.5/2.5nm。
[0056]
图12是荧光探针(ⅰ)(10μm)加入50μm的生物硫醇(cys、hcy、gsh)或500μm的各种氨基酸(cys、hcy、gsh、ala、arg、asp、gln、gly、his、lys、leu、met、phe、pro、ser、tyr、trp、thr和val)后溶液在365nm紫外灯下的颜色。
[0057]
图13是荧光探针(ⅰ)(10μm)加入50μm cys和500μm的各种氨基酸(cys、hcy、gsh、ala、arg、asp、gln、gly、his、lys、leu、met、phe、pro、ser、tyr、trp、thr和val)后荧光光谱在495nm处的荧光强度的变化。检测体系为dmso-pbs(ph＝7.4,v/v＝1/9)，检测时的温度为37℃，孵育60分钟，激发波长400nm，狭缝2.5/2.5nm。
[0058]
图14是荧光探针(ⅰ)对生物硫醇的识别机理图。
[0059]
图15是荧光探针(ⅰ)(1mm)加入10mm的cys后溶液的高分辨质谱。溶液温度为37℃，孵育60分钟。
[0060]
图16是荧光探针(ⅰ)(1mm)加入10mm的gsh后溶液的高分辨质谱。溶液温度为37℃，孵育60分钟。
[0061]
图17是荧光探针(ⅰ)(1mm)加入10mm的hcy后溶液的高分辨质谱。溶液温度为37℃，孵育60分钟。
[0062]
图18是荧光探针(ⅰ)(10μm)用于检测hela细胞内内源性和外源性生物硫醇的激光共聚焦显微镜照片。
[0063]
图19是荧光探针(ⅰ)(10μm)用于检测斑马鱼体内内源性生物硫醇的荧光显微镜照片。
具体实施方式
[0064]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行、清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，不应该用来限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
[0065]
实施例1：荧光探针的制备及筛选
[0066][0067]
步骤a：5,12,12-三甲基-9-硝基-2-三氟甲基-5,12-二氢喹啉[2,3-b]喹喔啉(ⅳ)
[0068]
将1,2,3,3-四甲基-5-三氟甲基-3h-吲哚-1-碘化物(ⅱ,5.55g,15mmol)、4-硝基邻苯二胺(ⅲ,2.76g,18mmol)和催化剂(45mmol)溶于反应溶剂中(45ml)中，100℃下搅拌2h。在反应完成后(通过tlc监测)，将混合物冷却至室温并用饱和na2s2o3溶液淬灭，然后用乙酸乙酯(3
×
150ml)萃取。将合并的有机层用饱和食盐水洗涤，加入无水na2so4干燥。柱层析分离产品(洗脱剂乙酸乙酯：石油醚＝1:100洗脱出目标化合物)。得黄色固体(ⅳ)2.04g，收率35％。
[0069]
结构测定：
[0070]
mp:190-191℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.90(d,j＝2.3hz,1h),8.43(dd,j＝9.1,2.4hz,1h),7.92(d,j＝9.1hz,1h),7.78(s,1h),7.64(d,j＝8.4hz,1h),7.27(d,j＝8.6hz,1h),3.85(s,3h),1.81(s,6h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ152.6,146.7,144.8,144.4,140.8,137.5,132.2,127.8,125.2(q,j
c-f
＝33hz),125.1(d,j
c-f
＝4.0hz),125.0,124.3(q,j
c-f
＝270hz),123.4,122.9(d,j
c-f
＝4.0hz),114.1,41.1,31.4,28.7；hrms(esi

)calcd for c
19h15
f3n4o2[m h]

389.12199,found 389.12210。
[0071]
步骤b：5,12,12-三甲基-9-氨基-2-三氟甲基-5,12-二氢喹啉[2,3-b]喹喔啉(
ⅴ
)
[0072]
将5,12,12-三甲基-9-硝基-2-三氟甲基-5,12-二氢喹啉[2,3-b]喹喔啉(ⅳ,1.94g，5.0mmol)、nh4cl(3.75g,70mmol)溶于h2o(30ml)和乙醇(30ml)的组成的混合溶剂中，向反应体系中加入还原铁粉(3.35g,60mmol)并回流12h。待反应完成后(由tlc监测)，将反应混合物冷却至室温，旋蒸除去溶剂，随后用乙酸乙酯(3
×
50ml)萃取。将合并的有机层用饱和食盐水洗涤，加入无水na2so4干燥。柱层析分离产品(洗脱剂乙酸乙酯：石油醚＝1:20洗脱出目标化合物)。得黄色固体(
ⅴ
)1.61g，收率90％。
[0073]
结构测定：
[0074]
mp:215-216℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.69(s,1h),7.67(d,j＝8.8hz,1h),7.53(d,j＝8.5hz,1h),7.16(d,j＝2.5hz,1h),7.12-7.04(m,2h),3.91(s,2h),3.70(s,3h),1.72(s,6h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ149.6,144.8,143.4,142.4,140.5,134.6,131.9,127.7,124.7(q,j
c-f
＝270hz),124.6(d,j＝3.8hz),123.3(q,j
c-f
＝32hz),122.5(d,j
c-f
＝3.7hz),120.9,112.9,109.8,40.6,31.0,28.3；hrms(esi

)calcd for c
19h17
f3n4[m h]

359.14781,found 359.14861。步骤c：荧光探针(ⅰ)的制备
[0075]
将5,12,12-三甲基-9-氨基-2-三氟甲基-5,12-二氢喹啉[2,3-b]喹喔啉(
ⅴ
,0.18g,0.5mmol)溶于乙酸(6ml)中，向反应体系中加入马来酸酐(vi,0.15g,1.5mmol)，随后
将升温至回流。待反应完成后(由tlc监测)，将反应混合物冷却至室温，旋蒸除去溶剂，随后加入饱和nahco3溶液除去残余的乙酸。加入乙酸乙酯(3
×
20ml)萃取。将合并的有机层用饱和食盐水洗涤，加入无水na2so4干燥。柱层析分离产品(洗脱剂乙酸乙酯：石油醚＝1:15洗脱出目标化合物)。得黄色固体(ⅰ)0.19g，收率88％。
[0076]
结构测定：
[0077]
mp:203-204℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.00(d,j＝1.8hz,1h),7.91(d,j＝8.9hz,1h),7.71(s,1h),7.60(dd,j＝8.9,1.9hz,1h),7.56(d,j＝8.6hz,1h),7.16(d,j＝8.6hz,1h),6.91(s,2h),3.76(s,3h),1.73(s,6h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ169.5,150.7,145.6,141.6,139.7,138.8,134.3,132.1,128.5,127.6,127.2,125.7,124.9(d,j
c-f
＝3.7hz),124.5(q,j
c-f
＝270hz),124.2(q,j
c-f
＝32hz),122.7(d,j
c-f
＝3.6hz),113.6,40.9,31.2,28.5；hrms(esi

)calcd for c
23h17
f3n4o2[m na ch3oh]

493.14580,found 493.14578。
[0078]
参照上述方法，制备一系列荧光探针(ⅰ)的类似物：
[0079]
1.将荧光探针(ⅰ)结构中马来酰亚胺基团的取代位由9位替换为8位。
[0080]
2.将荧光探针(ⅰ)结构中的cf3基团替换为h、ch3、cl、ch3o、br，分别制备相应的化合物。
[0081]
将荧光探针(ⅰ)以及类似物分别溶于二甲基亚砜(dmso)中，配制成浓度为10mm的探针储备液，保存于4℃药品阴凉柜中。测试时，将探针储备液用dmso稀释至浓度为1mm作为光谱测试的储备液来探究探针对生物硫醇响应后紫外和荧光光谱性质的变化。以去离子水为溶剂，配制浓度为10mm的cys溶液。为模拟生理实验，实验均在ph＝7.4(dmso-pbs，ph＝7.4,v/v＝1/9)、37℃下进行。将cys溶液分别与各探针溶液混合，探针的终浓度为10μm，cys浓度位200μm，摇匀溶液，平衡60min，将溶液倒进荧光皿中测定荧光光谱。荧光光谱的激发波长为400nm，狭缝宽度为2.5nm/2.5nm。结果如图1所示。
[0082]
图1(a)为荧光探针(ⅰ)结构中马来酰亚胺的取代位为8位或9位时的荧光光谱。结果显示，当马来酰亚胺基团处于9位时，检测后的荧光光谱的最大发射波长为495nm，处于8位时为445nm，蓝移50nm。马来酰亚胺结构处于8位的分子的荧光强度仅为9位的三分之一。表明马来酰亚胺基团处于9位时的检测效果更好。
[0083]
图1(b)为荧光探针(ⅰ)结构中喹喔啉母核上选择不同取代基的荧光光谱。结果显示，母核上的取代基为三氟甲基时，溶液的荧光强度变化最大，且最大发射波长较长，检测性能最好，最后选择荧光探针(ⅰ)作进一步的研究。
[0084]
实施例2：荧光探针(ⅰ)对生物硫醇的光谱响应
[0085]
用dmso与pbs缓冲溶液组成的混合溶液(dmso-pbs,ph＝7.4,v/v＝1/9)作为反应体系配制出10μm探针(ⅰ)与500μm生物硫醇(cys、hcy、gsh)的反应混合溶液，将配好的反应混合溶液在37℃下孵育60min后测定紫外光谱和荧光光谱。其中，荧光光谱的激发波长为400nm，最大发射波长为495nm，狭缝宽度为2.5nm/2.5nm。
[0086]
探针(ⅰ)在加入生物硫醇前后(cys、hcy、gsh)的紫外吸收光谱变化如图2a所示。从图2a可以看出：在加入生物硫醇后，检测溶液的紫外吸收有不同程度的增强(cys》gsh》hcy)，且检测三种硫醇后溶液的最大吸收波长接近(cys 422nm,hcy 415nm,gsh 413nm)。
[0087]
探针(ⅰ)在加入生物硫醇前后(cys、hcy、gsh)的荧光光谱变化如图2b所示。从图2b中可以看出：在加入生物硫醇前，检测溶液的荧光非常微弱；待加入生物硫醇后，溶液在
495nm处的荧光强度迅速增强，且不同生物硫醇增强的程度不同(cys》gsh》hcy)。
[0088]
在365nm紫外灯下，探针(ⅰ)溶液在加入生物硫醇前后(cys、hcy、gsh)的颜色变化如图2c所示。通过肉眼观察即可发现探针溶液从无色变为青绿色。
[0089]
上述研究结果表明，通过紫外、荧光光谱的变化以及肉眼观察，荧光探针(ⅰ)对生物硫醇具有很好的荧光响应。
[0090]
实施例3：荧光探针(ⅰ)对生物硫醇的响应时间
[0091]
用dmso与pbs缓冲溶液组成的混合溶液(dmso-pbs,ph＝7.4,v/v＝1/9)作为反应体系配制出10μm探针(ⅰ)与200μm生物硫醇(cys、hcy、gsh)的反应混合溶液，将配好的反应混合溶液在37℃下的不同时间点(0～180min)处测定荧光光谱。其中，荧光光谱的激发波长为400nm，最大发射波长为495nm，狭缝宽度为2.5nm/2.5nm。
[0092]
探针(ⅰ)在加入cys后荧光光谱以及在495nm处的荧光强度变化如图3所示。从图3可以看出：在加入cys后，溶液495nm处的荧光强度逐渐增强，并在30分钟内达到平台期，因此cys检测时间控制在30分钟(图3)。
[0093]
类似的，探针(ⅰ)在加入gsh以及hcy后荧光光谱(a)以及在495nm处的荧光强度变化(b)如图4、图5所示。从图4、5可以看出：在加入hcy或gsh后，溶液495nm处的荧光强度逐渐增强，并在180分钟内逐渐达到平台期(图4、图5)。
[0094]
与此同时，可以得到探针(ⅰ)检测cys、hcy和gsh的动力学曲线。如图6所示，探针(ⅰ)对cys的响应性高于hcy和gsh，对三种硫醇的检测动力学差异明显，因此能区分三种硫醇。
[0095]
实施例4：荧光探针(ⅰ)对生物硫醇的检测限
[0096]
用dmso与pbs缓冲溶液组成的混合溶液(dmso-pbs,ph＝7.4,v/v＝1/9)作为反应体系配制出10μm探针(ⅰ)与不同浓度的生物硫醇(cys、hcy、gsh)的反应混合溶液，将配好的反应混合溶液在37℃孵育1h后测定荧光光谱。其中，荧光光谱的激发波长为400nm，最大发射波长为495nm，狭缝宽度为2.5nm/2.5nm。根据3σ/k方法计算出探针(ⅰ)对生物硫醇的检测限，式中σ代表测量十次空白样品发射强度值的标准偏差，k代表荧光强度与生物硫醇浓度之间拟合直线的斜率。
[0097]
探针(ⅰ)在加入不同浓度的cys(0～200μm)后荧光光谱(a)以及在495nm处的荧光强度变化(b)如图7所示。在加入cys前，探针(ⅰ)的荧光强度很弱。随着cys浓度的增加，溶液495nm处的荧光显著增强。荧光强度与cys在0-8μm范围内成线性关系，得到线性回归方程为y＝46.82x 28.94，r2＝0.9994(图7b插图)。根据3σ/k方法计算出探针(ⅰ)对cys的检测限为36.6nm。这证明借助于该荧光探针能够对cys进行定量分析。
[0098]
探针(ⅰ)在加入不同浓度的gsh(0～200μm)后荧光光谱(a)以及在495nm处的荧光强度变化(b)如图8所示。在加入gsh前，探针(ⅰ)的荧光强度很弱。随着gsh浓度的增加，溶液495nm处的荧光显著增强。荧光强度与gsh在0-7μm范围内成线性关系，得到线性回归方程为y＝30.01x 35.49，r2＝0.9956(图8b插图)。根据3σ/k方法计算出探针(ⅰ)对gsh的检测限为57.1nm。这证明借助于该荧光探针能够对gsh进行定量分析。
[0099]
探针(ⅰ)在加入不同浓度的hcy(0～50μm)后荧光光谱(a)以及在495nm处的荧光强度变化(b)如图9所示。在加入hcy前，探针(ⅰ)的荧光强度很弱。随着hcy浓度的增加，溶液495nm处的荧光显著增强。荧光强度与hcy在0-10μm范围内成线性关系，得到线性回归方程
为y＝14.72x 19.73，r2＝0.9905(图9b插图)。根据3σ/k方法计算出探针(ⅰ)对hcy的检测限为116.5nm。这证明借助于该荧光探针能够对hcy进行定量分析。
[0100]
实施例5：ph对荧光探针(ⅰ)检测生物硫醇的影响
[0101]
用dmso与pbs缓冲溶液组成的混合溶液(dmso-pbs,v/v＝1/9)作为反应体系，利用3mol/l的盐酸与3mol/l的naoh溶液调节混合溶液的ph。随后利用这些不同ph的反应体系配制出10μm探针(ⅰ)与200μm的生物硫醇(cys、hcy、gsh)的反应混合溶液，将配好的反应混合溶液在37℃孵育1h后测定荧光光谱。其中，荧光光谱的激发波长为400nm，最大发射波长为495nm，狭缝宽度为2.5nm/2.5nm。
[0102]
通过用荧光光谱仪测试检测体系在495nm处的荧光强度变化，探针(ⅰ)在不同的ph条件下的稳定性以及对生物硫醇的检测能力如图10所示。从图中可以清晰的看出，在强酸性以及生理ph(ph＝7.0)附近，荧光探针具有较好的稳定性以及较好的检测性能，具有进一步用于细胞以及体内生物硫醇检测的潜在价值。
[0103]
实施例6：荧光探针(ⅰ)对生物硫醇识别的选择性
[0104]
通常而言，对目标分析物的高选择性是所有检测方法的核心要求。根据实施例1，以去离子水为溶剂，配制浓度为10mm的各种氨基酸溶液(cys、hcy、gsh、ala、arg、asp、gln、gly、his、lys、leu、met、phe、pro、ser、tyr、trp、thr和val)。为了研究探针(ⅰ)对生物硫醇的选择性，用dmso与pbs缓冲溶液组成的混合溶液(dmso-pbs,ph＝7.4,v/v＝1/9)作为反应体系配制出10μm探针(ⅰ)与50μm的生物硫醇(cys、hcy、gsh)或者500μm的各种氨基酸(cys、hcy、gsh、ala、arg、asp、gln、gly、his、lys、leu、met、phe、pro、ser、tyr、trp、thr和val)的反应混合溶液，将配好的反应混合溶液在37℃孵育1h后测定荧光光谱。其中，荧光光谱的激发波长为400nm，最大发射波长为495nm，狭缝宽度为2.5nm/2.5nm。
[0105]
探针(ⅰ)在加入50μm的生物硫醇(cys、hcy、gsh)或500μm的各种氨基酸(cys、hcy、gsh、ala、arg、asp、gln、gly、his、lys、leu、met、phe、pro、ser、tyr、trp、thr和val)后荧光光谱(a)以及在495nm处的荧光强度(b)变化如图11所示。只有生物硫醇才能引起探针的荧光光谱发生变化，而其余氨基酸不会造成探针的荧光光谱发生变化，说明探针(ⅰ)对于生物硫醇的选择性很高。此外，探针(ⅰ)对于生物硫醇的选择性有差异，对cys的选择性最好，对于gsh和hcy的选择性稍差。
[0106]
通过肉眼观察溶液颜色的变化也能说明探针(ⅰ)的选择性。如图12所示，在365nm的紫外灯照射下，加入其他氨基酸，探针溶液的颜色仍然为无色；当加入生物硫醇(cys、hcy、gsh)后溶液的颜色迅速由无色转化为青绿色，表明了探针对生物硫醇的高度选择性。
[0107]
实施例7：荧光探针(ⅰ)的竞争性实验
[0108]
为了证明荧光探针有良好的应用潜力，需要进行抗干扰性能的测试。向检测体系中加入有可能干扰荧光探针(ⅰ)检测的氨基酸，考察荧光探针(ⅰ)在这些氨基酸存在的情况下检测生物硫醇的能力是否会被干扰。
[0109]
用dmso与pbs缓冲溶液组成的混合溶液(dmso-pbs,ph＝7.4,v/v＝1/9)作为反应体系配制出10μm探针(ⅰ)、50μm的cys以及500μm的各种氨基酸(cys、hcy、gsh、ala、arg、asp、gln、gly、his、lys、leu、met、phe、pro、ser、tyr、trp、thr和val)的反应混合溶液，将配好的反应混合溶液在37℃孵育1h后测定荧光光谱。其中，荧光光谱的激发波长为400nm，最大发射波长为495nm，狭缝宽度为2.5nm/2.5nm。如图13所示，其余氨基酸不会干扰探针对cys的
检测，说明探针(ⅰ)的抗干扰性能很好。
[0110]
实施例8：荧光探针(ⅰ)识别生物硫醇的机理研究
[0111]
图14是探针(ⅰ)对生物硫醇的识别机理图。在荧光探针(ⅰ)的基本结构中，作为识别基团的马来酰亚胺部分具有很强的吸电子能力，因此荧光基团与马来酰亚胺之间的光致电子转移(pet)作用导致荧光淬灭，探针分子几乎无荧光。当生物硫醇的巯基与马来酰亚胺通过michael加成生成硫醚产物后，马来酰亚胺部分的吸电子能力减弱，pet过程被阻断，荧光基团的荧光恢复。
[0112]
为证明上述反应机理，用dmso与pbs缓冲溶液组成的混合溶液(dmso-pbs,ph＝7.4,v/v＝1/9)作为反应体系配制出1mm探针(ⅰ)与10mm的生物硫醇(cys、gsh、hcy)的反应混合溶液，将配好的反应混合溶液在37℃孵育1h后测定高分辨质谱。高分辨质谱结果如图15、16、17所示，能找到对应加成产物的分子离子峰，证明探针(ⅰ)与生物硫醇之间发生michael加成生成硫醚产物。
[0113]
实施例9：荧光探针(ⅰ)用于细胞内生物硫醇的检测
[0114]
将hela细胞预先培养于共聚焦皿中24h使细胞贴壁，在激光共聚焦显微镜下进行激光共聚焦成像(405nm激发波长，400nm～600nm收集荧光)，成像结果如图18中的a所示；向第二组hela细胞中加入10μm探针(ⅰ)并孵育30min，在激光共聚焦显微镜下进行激光共聚焦成像，成像结果如图18中的b所示；向第三组hela细胞中加入500μm的n-乙基马来酰亚胺(nem)，以清除细胞内的生物硫醇，在培养箱中孵育30min后用10μm探针(ⅰ)孵育30min，在激光共聚焦显微镜下进行激光共聚焦成像，成像结果如图18中的c所示；向第四组hela细胞中加入500μm的nem并孵育30min，随后加入200μm的cys继续孵育30min，最后加入10μm探针(ⅰ)并孵育30min，在激光共聚焦显微镜下进行激光共聚焦成像，成像结果如图18中的d所示。
[0115]
对比图18中的a～d可知：d的细胞内荧光最强，b的细胞内荧光其次，c的细胞内荧光最弱，符合实验预期。因此，可以证明荧光探针(ⅰ)能用于细胞内生物硫醇的检测。
[0116]
实施例11：荧光探针(ⅰ)用于斑马鱼体内生物硫醇的检测
[0117]
将斑马鱼在荧光显微镜下成像(405nm激发波长，400nm～600nm收集荧光)，成像结果如图19中的a所示；向第二组斑马鱼加入探针(10μm)并孵育30分钟，去除培养液，并用养鱼水洗涤3次，采集蓝色通道的荧光，成像结果如图19中的b所示；向第三组斑马鱼加入n-乙基马来酰亚胺(nem,20μm)并孵育30分钟以清除斑马鱼体内的生物硫醇，随后加入探针(10μm)并孵育30分钟，去除培养液，并用养鱼水洗涤3次，采集蓝色通道的荧光，成像结果如图19中的c所示；最后，向第四组斑马鱼加入n-乙基马来酰亚胺(nem,20μm)并孵育30分钟，随后加入cys(200μm)再孵育30min，最后加入探针(10μm)并孵育30分钟，去除培养液，并用养鱼水洗涤3次，采集蓝色通道的荧光，成像结果如图19中的d所示。
[0118]
对比图19中的a～d可知：b、d的荧光较强，c的细胞内荧光较弱，符合实验预期。因此，可以证明荧光探针(ⅰ)能用于斑马鱼体内生物硫醇的检测。
[0119]
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。