一株枯草芽孢杆菌及其在粪便堆肥除臭中的应用的制作方法

1.本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体涉及一株新型枯草芽孢杆菌及其在粪便堆肥除臭中的应用。


背景技术：

2.随着人民生活水平的不断提高，对畜禽产品的需求不断增加，根据联合国粮农组织(fao)资料显示，到2050年全世界对肉类的需求量将增加73％，要满足肉类的需求，畜牧业需由传统的散养方式向将向集约化、规模化方向快速发展，随之而来的是产生的大量畜禽粪便成为重要的环境污染源。大量的畜禽粪便堆放占用土地的同时，产生的有害气体污染环境、严重危害人类健康，影响畜禽潜在生产性能的发挥，因此加强畜禽粪便无害化、资源化处理，是实现生态环境保护和畜牧业发展的迫切需要。
3.畜禽粪便中含有蛋白质和碳水化合物等，蛋白质在有氧的条件下分解为硝酸盐类物质，在无氧条件下分解氨气、硫化氢、甲胺等恶臭气体，排放到空气中的氨浓度过高形成酸沉降，造成水体和土壤污染。碳水化合物分解为甲烷、二氧化碳等温室气体造成全球温室效应，全球温室效应约50％的贡献来自养殖业。畜禽粪便产生的臭气危害养殖人员和周边居民的健康。主要危害神经系统、呼吸系统、循环系统、消化系统、内分泌系统及其他危害，如氨和醛类会刺激眼睛出现流泪、结膜炎、角膜浮肿等症状。
4.目前，国内外畜禽粪便恶臭治理主要有物理、化学和生物除臭技术，利用物理、化学和生物的作用的原理使恶臭物的物相和结构改变而达到除臭的效果。物理除臭技术是利用吸附剂和掩蔽剂进行暂时性的吸附、掩盖臭味而达到除臭效果，但是从根本上达不到除臭目的。化学除臭技术是通过添加的化学物质与恶臭物质发生反应而达到除臭的目的，包括氧化法和催化氧化法。氧化法是强氧化剂将还原性恶臭物质氧化成无害无臭物质的过程。目前，臭氧和高铁酸盐被普遍应用为氧化剂。催化氧化法是在催化剂的作用下氧化有机恶臭物质而达到除臭的目的，如烃类、醛类和醇类有机物。化学除臭技术除臭效果好，但存在成本高、反应复杂、有二次污染等缺点不易被推广使用。生物脱臭技术是上世纪50年代发展起来的技术，到70年代许多国家在此领域进行研究，其中日本、德国等在除臭方法和基本原理、除臭装置及操作工艺、除臭微生物、除臭动力学等方面取得了显著成果，我国在这方面的研究工作较迟，到80年代末期才进行恶臭气体的测定和研究工作。微生物除臭技术是利用微生物自身的代谢作用使恶臭成分降解为无臭、无害的终产物，如h2o、co2等，而达到除臭的目的。微生物除臭技术对臭气的除臭效果明显且对环境条件的要求低，生长繁殖所需的能量为氧化分解过程中产生的氧化能，不需要其他的营养物质，运行成本低。
5.例如，冯健等分离筛选的除臭菌株对畜禽粪便有较好的除臭效果。陈丽园等从养殖场周围的土壤中分离出菌株10mg能使新鲜猪粪nh3和h2s的释放量降低67.95％和26.6％，刘春梅等研究了筛选的耐高温除臭菌株对nh3和h2s的释放量和物质转化的影响，结果表明除臭菌株能有效减少nh3和h2s的释放，并保留氮素和硫素等养分。但由于臭气成分复杂，单一微生物除臭效果有限，多种微生物共同作用会具有更强的除臭效果。叶芬霞等对分离的3
株菌混合培养后制成复合微生物除臭剂，可使猪舍内nh3和h2s浓度分别降低了78.4％和66.7％，使猪粪堆肥场内nh3和h2s的浓度分别降低了84.4％、62.1％。高颖等研究不同种类的微生物对猪粪除臭的效果，结果表明嗜酸乳杆菌和短小芽孢杆菌对nh3去除效果好，细黄链霉菌、米根霉和班图酒香酵母菌对h2s的去除效果较好。
6.畜禽粪便生物除臭过程中主要是功能性微生物起关键作用，因此生物除臭的关键在于筛选高效除臭微生物。长期以来人们不断试图改进优化筛选除臭微生物的新方法和途径，因筛选方法的局限性和微生物的特异性等原因，筛选到的除臭微生物除臭效果不理想，因此，筛选高效的除臭微生物具有重要意义。


技术实现要素：

7.本发明为解决现有技术问题，提供了一株新型枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)及其在粪便堆肥除臭中的应用。所述枯草芽孢杆菌筛选自山东省烟台市蓬莱肉鸡养殖废弃物，对堆肥原料中的有机氮、硫元素具有固定作用，可有效减少氨气和硫化氢释放，提高有机肥品质，应用前景广泛。
8.本发明一方面提供了一种枯草芽孢杆菌ybs01(bacillus subtilis ybs01)，已于2021年1月13日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctcc no：m2021053。
9.本发明一方面提供了所述枯草芽孢杆菌在生物除臭中的应用。
10.本发明一方面提供了所述枯草芽孢杆菌在堆肥生产中的应用。
11.本发明还提供了一种生物除臭剂，包含上述枯草芽孢杆菌ybs01。
12.所述生物除臭剂还包含芽孢杆菌、曲霉菌、酵母菌、乳酸菌中的任意一种或两种或多种的组合。
13.所述生物除臭剂中枯草芽孢杆菌ybs01的活菌量至少为108cfu/g。
14.本发明还提供了上述生物除臭剂在粪便堆肥除臭中的应用。
15.所述粪便为畜禽粪便。
16.所述粪便为鸡粪、鸭粪、猪粪、牛粪、羊粪。
17.有益效果
18.本发明筛选获得的枯草芽孢杆菌ybs01能高产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶，其中该菌发酵上清液中蛋白酶的酶活为26.6u/ml。
19.所述枯草芽孢杆菌ybs01可单独应用于粪便堆肥，不仅能显著降低氨气和硫化氢等臭味气体的排放，还能明显提高堆肥温度，加快粪便腐熟进程，提高腐熟度和肥效。其中：
20.(1)接种枯草芽孢杆菌ybs01菌粉的处理组鸡粪，臭气释放的峰值降低了56％-58％，氨气的释放浓度最高降低了65％，硫化氢的释放浓度最高降低了60％，且在第3天，处理组2和处理组3的鸡粪已经完全消除硫化氢的排放；处理组鸡粪堆体的最高温度达到64℃-68℃，显著高于对照组(55℃)，平均温度达到51℃-55℃，也显著高于对照组(45℃)，腐熟度比对照组提高了170.7％，高达76.21％；
21.(2)接种枯草芽孢杆菌ybs01菌粉的处理组牛粪，氨气释放的峰值降低了79％-88％，氨气的释放浓度最高降低了88％；处理组牛粪中硫化氢的瞬时释放量在发酵的第3-4天降低为0，较对照组提前了2-3天；处理组牛粪堆体的最高温度达到66℃-69℃，显著高于
对照组(65℃)，平均温度达到54℃-56℃，也显著高于对照组(42℃)，腐熟度比对照组提高了64％，高达80％；
22.(3)接种枯草芽孢杆菌ybs01菌粉的处理组猪粪，氨气释放的峰值降低了55％-71％，氨气的释放浓度最高降低了71％；硫化氢释放的峰值降低了76％-80％，硫化氢的释放浓度最高降低了97％；处理组猪粪在发酵第5-6天已经完全消除硫化氢的排放，比对照组显著提前。处理组猪粪堆体的最高温度达到66℃-69℃，显著高于对照组(60℃)，平均温度达到56℃-57℃，也显著高于对照组(46℃)，腐熟度比对照组提高了130％，高达78％。
23.所述枯草芽孢杆菌ybs01还可与腐熟接种剂复配应用于粪便堆肥，腐熟效果更佳。与单独添加腐熟接种剂的对照组相比，同时添加枯草芽孢杆菌ybs01菌粉的处理组鸡粪的腐熟度得到显著提高，而且随着枯草芽孢杆菌ybs01添加量的增加，腐熟度进一步增加，最高达121.23％，比对照组提高了52.2％。此外，枯草芽孢杆菌ybs01还能显著提高鸡粪堆肥温度，与对照组相比，处理组堆肥最高温度和平均温度分别提高了8℃和4℃，约缩短了3天的腐熟周期，取得意料不到的技术效果。
24.本发明提供的枯草芽孢杆菌ybs01可作为除臭菌剂、有机肥堆肥腐熟接种剂等，广泛应用于农业生产领域，效果显著，应用前景广阔。
附图说明
25.图1为ybs01菌株的平板菌落形态图；
26.图2为ybs01菌株的maldi-tof ms质谱图。
具体实施方式
27.本发明实施例中选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
28.实施例中使用的培养基成分：
29.富集培养基：mgcl2·
6h2o 0.8g，nh4cl 1.0g，kh2po
4 2.0g，nahco
3 2.0g，na2s2o
3 5.0g，蒸馏水1000ml，ph 6.8～7.2，121℃灭菌20min；
30.分离培养基：在上述液体富集培养基中加入15-20g琼脂粉即成为固体培养基。
31.实施例中使用的腐熟接种剂是购于山东蔚蓝生物科技有限公司的腐熟发酵接种剂源康宝，50亿cfu/g。
32.下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
33.实施例1除臭菌株筛选
34.1、样品
35.采集自烟台蓬莱肉鸡养殖废弃物。
36.2、菌株的富集培养和纯化分离
37.取1g鸡粪加入到含有99ml无菌水的培养瓶中，并加入几粒玻璃珠，制成混悬液，然后从混悬液中取1ml接入含有50ml富集培养基的培养瓶中，封口，置于30℃生化培养箱中静置培养3-7d。富集培养物产气多、浑浊度大，将其涂布于分离培养基，30℃培养2d，分别挑出单菌落在营养琼脂培养基上继续纯化2～3次。将纯化的单菌落分别接种到50ml lb液体培
养基中，37℃，220r/min培养14h。采用平板计数法检测各菌株发酵液中的有效活菌数。
38.申请人将有效活菌数最高的3株菌分别命名为ybs01、ybs02、ybs03，其发酵液中的有效活菌数分别为2.76
×
108cfu/ml，2.12
×
108cfu/ml，2.83
×
108cfu/ml。
39.2、氨气、硫化氢降解菌株的复筛
40.(1)降氮效果
41.将初筛获得的三株菌ybs01、ybs02、ybs03分别接种到lb液体培养基中，30℃，150r/min培养24h，离心收集菌体，用生理盐水重悬，制成浓度为0.5
×
102cfu的菌悬液。将菌悬液按1％体积比接种至降氮筛选培养基(nano
2 1g，ch3coona 4.8g，琼脂15g，加水至1l，ph 7.5)中，在30℃，150r/min条件下培养20h。
42.培养结束后取样测定od
600
，8000r/min,10min离心后取上清测定亚硝态氮浓度，计算亚硝态氮和总氮去除率。具体结果见表1。
43.表1初筛菌株对亚硝态氮和总氮的降解效果
44.菌株亚硝态氮去除率总氮去除率ybs0170％65％ybs0255％47％ybs0364％51％
45.从表1的结果可知，本发明初筛获得的三株菌中ybs01菌株对亚硝态氮和总氮的降解能力最强，去除率分别高达70％和65％，效果非常显著。
46.(2)降硫效果
47.将初筛获得的三株菌ybs01、ybs02、ybs03分别接种于lb液体培养基中，30℃，150r/min培养3d，获得种子液，调整菌液浓度为106cfu/ml左右；
48.取100ml脱硫菌液体选择培养基(蛋白胨10g，牛肉膏2g，nacl
2 5g，na2s.9h2o
2 3g，蒸馏水1l)加入到250ml三角瓶中，接种上述种子液，以没有接种菌液的培养基作为空白对照，在30℃静置培养。定期通过碘量法测定培养基中硫化物的浓度。同时，以空白对照培养基中硫化物浓度计100％，计算接种的培养基中硫化物的含量百分比。
49.硫化物含量百分比(％)＝接种培养基中硫化物浓度/空白对照培养基中硫化物浓度
×
100％。
50.结果显示，接种ybs01菌株后第2天，培养基中硫化物的含量就降至空白对照组的27％；到第3天时，培养基中就测不到硫化物的含量，降硫效果显著，取得了意料不到的技术效果。而ybs02、ybs03菌株的除硫效果不明显，培养第4天仍有硫化物检出。
51.上述结果表明，本发明筛选获得的三株菌中，ybs01菌株对亚硝态氮和硫化物的降解能力最强。
52.实施例2 ybs01菌株的鉴定
53.2.1菌落形态鉴定
54.ybs01菌株的菌落形态如图1所示，菌落呈淡黄色，直径5-57mm，菌落边缘粗糙不透明，中间平整，菌体为短直杆状，革兰氏阳性菌，可产生芽孢。芽孢呈椭圆形，局部呈圆形，孢子囊不膨胀。细胞单独、成对或呈短链状存在。
55.2.2 16s rdna分子鉴定
56.采用试剂盒提取ybs01菌株的基因组。然后以该基因组为模板，利用特异性引物对
其16s rdna进行扩增。将扩增得到的pcr产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并送测序公司进行测序。
57.测序结果显示，pcr扩增产物的序列为seq id no:1。通过将该序列在ncbi数据库中进行blast比对，发现其与枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的相似性最高。因此，初步确定ybs01菌株为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。
58.seq id no:1如下所示：
59.gttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtg。
60.2.3 maldi-tof-ms蛋白质谱鉴定
61.取少量ybs01单菌落以薄膜的形式涂布于靶板上；加1μl质谱样本预处理试剂盒中的裂解液，室温下自然晾干；加1μl质谱样本预处理试剂盒中的基质溶液覆盖样品，室温下自然晾干；将样品靶放入质谱仪进行鉴定。鉴定结果显示，ybs01菌株为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，其蛋白质谱峰图如图2所示。
62.申请人利用16s rdna测序和maldi-tof-ms蛋白质谱鉴定系统两种分子生物学手段对ybs01菌株进行鉴定，鉴定结果一致。再结合ybs01菌株的菌落形态特征，申请人确定该菌株为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，命名为枯草芽孢杆菌ybs01(bacillus subtilis ybs01)。
63.申请人已于2021年1月13日将上述枯草芽孢杆菌ybs01(bacillus subtilis ybs01)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2021053。
64.实施例3枯草芽孢杆菌ybs01产酶能力评价
65.1、菌液的制备
66.将活化后的枯草芽孢杆菌ybs01接种于lb液体培养基中，37℃，220r/min培养14h，
获得活菌量为10
8-109cfu/ml的菌液。
67.2、产蛋白酶能力评价
68.将枯草芽孢杆菌ybs01菌液点种到含有脱脂牛奶的琼脂培养基上，37℃培养48h，可以看到枯草芽孢杆菌ybs01周围有透明圈产生，透明圈直径为25mm。从而说明，枯草芽孢杆菌ybs01可以产生一定的蛋白酶。
69.进一步，将枯草芽孢杆菌ybs01菌液在4℃、12000rpm条件下离心5min，取上清液；利用下述方法检测枯草芽孢杆菌ybs01发酵上清液中蛋白酶的酶活。
70.结果显示，枯草芽孢杆菌ybs01发酵上清液中蛋白酶的酶活为26.6u/ml。
71.(1)酶活定义
72.在一定条件下，每分钟水解底物，生成等同于1微摩尔酪氨酸的酶量，被定义为1个单位。
73.(2)蛋白酶活测定方法
74.①
吸取1ml待测酶液于16
×
120mm的试管中，37℃预热5min；
75.②
加入1ml酪蛋白于酶液中，不要震荡，37℃反应10min；
76.③
加入2ml三氯乙酸终止液，涡旋振荡；
77.④
在室温中放置5min，再次涡旋振荡；
78.⑤
用whatman 1号滤纸过滤，直径9cm；
79.⑥
取酶促反应液1ml，加5mlna2co3溶液，2mlfolin-酚试剂37℃反应20min
80.⑦
680nm下比色。
81.⑧
空白：将
②③
步骤互换，其余与样品反应一致，每一批次反应只需要只做1个空白。
82.(3)酶活计算
83.标准曲线：ph7.5：mu/ml＝11
×
abs。
84.酶活：u＝y
×
(1/1000)
×
n。
85.其中，y—酶活mu；
86.1/1000—mu到u的转换系数；
87.n—稀释倍数。
88.3、产淀粉酶能力评价
89.将枯草芽孢杆菌ybs01菌液点种到含有淀粉的琼脂培养基上，37℃培养48h，可以看到枯草芽孢杆菌ybs01周围有透明圈产生，透明圈直径为19mm。从而说明，枯草芽孢杆菌ybs01可以产生一定的淀粉酶。
90.4、产淀纤维素酶能力评价
91.将枯草芽孢杆菌ybs01菌液点种到到含有羧甲基纤维素的琼脂培养基上，37℃培养48h，可以看到枯草芽孢杆菌ybs01周围有透明圈产生，透明圈直径为15mm。从而说明，枯草芽孢杆菌ybs01可以产生一定的纤维素酶。
92.实施例4枯草芽孢杆菌ybs01除臭能力评价
93.1、臭源的制备
94.将鸡粪与花生壳秸秆按3:1的质量比混合均匀，调节水分65％，取200g置于500ml锥形瓶中，备用。
95.2、除臭实验
96.将实施例3中制备的枯草芽孢杆菌ybs01菌液调至1亿cfu/ml，按照1％的体积比接种到上述臭源中，对照组为接种相应剂量的lb液体培养基。处理组和对照组各做三个重复。在37℃下培养6天，每天在12:00左右利用泵吸式气体检测仪检测臭源中氨气和硫化氢的瞬时释放浓度(ppm)，取平均值。具体结果见表2。
97.表2枯草芽孢杆菌ybs01对鸡粪的除臭效果
[0098][0099]
从表2的结果可以看出，与对照组相比，接种枯草芽孢杆菌ybs01的处理组鸡粪每天释放氨气和硫化氢的浓度均大幅下降，臭气释放的峰值也降低了34-47％。其中，氨气的释放浓度最高降低了70％，硫化氢的释放浓度最高降低了78％，取得了意料不到的技术效果。
[0100]
3、腐熟度及其他堆肥指标检测
[0101]
腐熟度即为腐熟程度，指堆肥中有机物经矿化、腐殖化过程后达到稳定的程度。
[0102]
根据有机肥料ny/t525-2021新标准，发芽指数(gi)检测指标用来评价有机肥料的腐熟度，且指数要≥70％。发芽指数越高表示腐熟物料对作物根系的毒力越小。
[0103]
gi的测定方法如下：
[0104]
称取上述腐熟6天后的污泥样品10g，加100ml蒸馏水，200rpm，25℃条件下振荡30min；取滤液5ml，加到铺有滤纸的9cm培养皿内；每皿点播10粒饱满的黄瓜种子，28℃恒温恒湿避光培养72h，同时以蒸馏水作对照，重复3次。分别统计各组黄瓜种子的发芽率和种子根长，计算腐熟度(发芽指数)。
[0105]
gi＝(试验组的发芽率
×
种子根长)/(对照组的发芽率
×
种子根长)
×
100％。
[0106]
按照有机肥料ny/t525-2021的规定对上述腐熟鸡粪的堆肥指标进行化验，具体结果见表3。
[0107]
表3鸡粪堆肥指标化验结果
[0108]
指标ckybs01处理组腐熟度gi44.33％76.31％有机质45％40％总养分(氮磷钾)7.56％8.21％水分85％77％
[0109]
从表3的结果可以看出，与对照组相比，接种枯草芽孢杆菌ybs01的处理组鸡粪的
腐熟度高达76.31％，比对照组提高了72.1％，而且处理组鸡粪的总养分含量明显提高，有机质和水分含量明显下降。从而说明，本发明提供的枯草芽孢杆菌ybs01能有效减少对氮源的消耗，增加对有机质的利用率，大大提高鸡粪堆肥的腐熟度和肥效，效果非常显著。
[0110]
实施例5枯草芽孢杆菌ybs01在鸡粪堆肥除臭中的应用
[0111]
1、枯草芽孢杆菌ybs01菌粉制备
[0112]
将枯草芽孢杆菌ybs01在5吨发酵罐中进行液体发酵，当镜检芽孢率达到90％以上时停止发酵；5000rpm离心10min，去除发酵上清液，将菌泥进行喷雾干燥，制得活菌量为100亿/g的菌粉。
[0113]
2、鸡粪堆肥物料搭配
[0114]
将400吨鸡粪与100吨花生壳秸秆混合均匀，做成宽2.5米，高1米，长60米的梯形发酵堆体四条，备用。
[0115]
3、除臭实验
[0116]
(1)实验地点：山东省烟台市蓬莱区民和生物科技堆肥车间。
[0117]
(2)实验设计：
[0118]
将枯草芽孢杆菌ybs01菌粉用麸皮或秸秆粉分别稀释成3亿cfu/g，6亿cfu/g，12亿cfu/g三种剂量。将稀释后的菌粉分别加入鸡粪发酵堆体，每个处理对应一个堆体。
[0119]
空白对照组：无任何处理；
[0120]
处理组1：添加3亿cfu/g ybs01菌粉40kg；
[0121]
处理组2：添加6亿cfu/g ybs01菌粉40kg；
[0122]
处理组3：添加12亿cfu/g ybs01菌粉40kg。
[0123]
从每个堆体取6个点，每天12:00左右在各点取三个样，分别测定样品温度和样品中氨气和硫化氢的瞬时释放浓度(ppm)，取平均值。具体结果见表4。
[0124]
表4枯草芽孢杆菌ybs01在鸡粪堆肥中的除臭效果
[0125][0126]
从表4的数据可以看出，与对照组相比，接种枯草芽孢杆菌ybs01菌粉的各处理组鸡粪中氨气和硫化氢的释放浓度均有大幅度降低，且随着菌粉添加量的增加，臭气的释放浓度降低明显。其中，臭气释放的峰值降低了56％-58％，氨气的释放浓度最高降低了65％，
硫化氢的释放浓度最高降低了60％，且在第3天，处理组2和处理组3的鸡粪已经完全消除硫化氢的排放。从而说明本发明提供的枯草芽孢杆菌ybs01对氨气和硫化氢有明显的降解作用，取得了意料不到的技术效果。
[0127]
4、腐熟度及其他堆肥指标检测
[0128]
腐熟度检测方法与实施例4相同。按照有机肥料ny/t525-2021的规定对上述腐熟鸡粪的堆肥指标进化验，具体结果见表5。
[0129]
表5鸡粪堆肥指标化验结果
[0130][0131][0132]
从表5的结果可以看出，接种枯草芽孢杆菌ybs01菌粉的处理组鸡粪堆体的最高温度达到64℃-68℃，显著高于对照组(55℃)，平均温度达到51℃-55℃，也显著高于对照组(45℃)。而且，随着枯草芽孢杆菌ybs01菌粉添加量的增加，处理组鸡粪中总养分含量和腐熟度明显提高，有机质和水分含量明显下降。其中，处理组3鸡粪的腐熟度比对照组提高了170.7％，高达76.21％，取得了意料不到的技术效果。
[0133]
上述结果表明，本发明提供的枯草芽孢杆菌ybs01能够显著提高鸡粪堆肥温度，有利于快速杀灭堆肥中的病原微生物，加快腐熟进程；同时该菌株能有效减少对氮源的消耗，增加对有机质的利用率，大大提高了堆肥的腐熟度和肥效，效果非常显著。
[0134]
实施例6枯草芽孢杆菌ybs01在牛粪堆肥除臭中的应用
[0135]
1、牛粪堆肥物料搭配
[0136]
将100吨新鲜牛粪与20吨蘑菇渣混合均匀，做成宽2.5米，高1米，长30米的梯形发酵堆体四条，备用。
[0137]
2、堆肥除臭实验
[0138]
(1)实验地点：山西省晋中鸿泰谷发酵车间。
[0139]
(2)实验设计：
[0140]
将枯草芽孢杆菌ybs01菌粉用麸皮或秸秆粉分别稀释成3亿cfu/g，6亿cfu/g，12亿cfu/g三种剂量。将稀释后的菌粉分别加入牛粪发酵堆体，每个处理对应一个堆体。
[0141]
空白对照组：无任何处理；
[0142]
处理组1：添加3亿cfu/g ybs01菌粉30kg；
[0143]
处理组2：添加6亿cfu/g ybs01菌粉30kg；
[0144]
处理组3：添加12亿cfu/g ybs01菌粉30kg。
[0145]
每2天翻堆一次，从每个堆体取6个点，每天12:00左右在各点取三个样，分别测定
样品温度和样品中氨气和硫化氢的瞬时释放浓度(ppm)，取平均值。具体结果见表6。
[0146]
表6枯草芽孢杆菌ybs01在牛粪堆肥中的除臭效果
[0147][0148][0149]
从表6的数据可以看出，与对照组相比，接种枯草芽孢杆菌ybs01菌粉的各处理组牛粪硫化氢和氨气的释放浓度均有大幅度降低，且随着剂量的增加臭气的释放浓度呈现明显降低趋势。其中，氨气释放的峰值降低了79％-88％，氨气的释放浓度最高降低了88％；处理组1牛粪中硫化氢的瞬时释放量在发酵的第4天降低为0，较对照组提前了2天，而处理组2和处理组3硫化氢瞬时释放量在发酵的第3天即降低为0，较对照组提前了3天。从而说明本发明提供的枯草芽孢杆菌ybs01对氨气和硫化氢有明显的降解作用，取得了意料不到的技术效果。
[0150]
3、腐熟度及其他堆肥指标检测
[0151]
腐熟度检测方法与实施例3相同，按照有机肥料ny/t525-2021的规定对上述腐熟物料的堆肥指标进行化验，具体结果见表7。
[0152]
表7堆肥指标化验结果
[0153][0154]
从表7的结果可以看出，在堆肥过程中，接种枯草芽孢杆菌ybs01菌粉的处理组牛粪堆体的最高温度达到66℃-69℃，显著高于对照组(65℃)，平均温度达到54℃-56℃，也显著高于对照组(42℃)。而且，随着枯草芽孢杆菌ybs01菌粉添加量的增加，处理组污泥堆肥
中总养分含量和腐熟度明显提高，有机质和水分含量明显下降。其中，处理组3牛粪堆肥的腐熟度比对照组提高了64％，高达80％，取得了意料不到的技术效果。
[0155]
上述结果表明，本发明提供的枯草芽孢杆菌ybs01能够升高牛粪堆肥温度，有利于快速杀灭堆肥中的病原微生物，加快腐熟进程；同时该菌株能有效减少对氮源的消耗，增加对有机质的利用率，大大提高了堆肥的腐熟度和肥效，效果非常显著。
[0156]
实施例7枯草芽孢杆菌ybs01在猪粪堆肥除臭中的应用
[0157]
1、猪粪堆肥物料搭配
[0158]
将40吨猪粪与10吨花生壳秸秆混合均匀，做成宽2.5米，高1米，长10米的梯形发酵堆体四条，备用。
[0159]
2、堆肥除臭实验
[0160]
(1)实验地点：山东省烟台莱阳市三合生物发酵车间。
[0161]
(2)实验设计：
[0162]
将枯草芽孢杆菌ybs01菌粉用麸皮或秸秆粉分别稀释成3亿cfu/g，6亿cfu/g，12亿cfu/g三种剂量。将稀释后的菌粉分别加入猪粪发酵堆体，每个处理对应一个堆体。
[0163]
空白对照组：无任何处理；
[0164]
处理组1：添加3亿cfu/g ybs01菌粉12.5kg；
[0165]
处理组2：添加6亿cfu/g ybs01菌粉12.5kg；
[0166]
处理组3：添加12亿cfu/g ybs01菌粉12.5kg。
[0167]
每天翻动一次，从每个堆体取6个点，每天12:00左右在各点取三个样，分别测定样品温度和样品中氨气和硫化氢的瞬时释放浓度(ppm)，取平均值。具体结果见表8。
[0168]
表8枯草芽孢杆菌ybs01在猪粪堆肥中的除臭效果
[0169][0170][0171]
从表8的数据可以看出，与对照组相比，接种枯草芽孢杆菌ybs01菌粉的各处理组猪粪硫化氢和氨气的释放浓度均有大幅度降低，且随着剂量的增加臭气的释放浓度呈现明显降低趋势。其中，氨气释放的峰值降低了55％-71％，氨气的释放浓度最高降低了71％；硫化氢释放的峰值降低了76％-80％，硫化氢的释放浓度最高降低了97％；处理1组1和处理组
2猪粪在发酵第6天已经完全消除硫化氢的排放，处理组3在发酵的第5天已经完全消除硫化氢的排放，比对照组显著提前。从而说明本发明提供的枯草芽孢杆菌ybs01对猪粪中的氨气和硫化氢有明显的降解作用，取得了意料不到的技术效果。
[0172]
4、腐熟度及其他堆肥指标检测
[0173]
腐熟度检测方法与实施例3相同，按照有机肥料ny/t525-2021的规定对上述腐熟物料的堆肥指标进行化验，具体结果见表9。
[0174]
表9堆肥指标化验结果
[0175][0176]
从表9的结果可以看出，在堆肥过程中，接种枯草芽孢杆菌ybs01菌粉的处理组猪粪堆体的最高温度达到66℃-69℃，显著高于对照组(60℃)，平均温度达到56℃-57℃，也显著高于对照组(46℃)。而且，随着枯草芽孢杆菌ybs01菌粉添加量的增加，处理组污猪粪堆肥中总养分含量和腐熟度明显提高，有机质和水分含量明显下降。其中，处理组3猪粪堆肥的腐熟度比对照组提高了130％，高达78％，取得了意料不到的技术效果。
[0177]
上述结果表明，本发明提供的枯草芽孢杆菌ybs01能够升高猪粪堆肥温度，有利于快速杀灭堆肥中的病原微生物，加快腐熟进程；同时该菌株能有效减少对氮源的消耗，增加对有机质的利用率，大大提高了猪粪堆肥的腐熟度和肥效，效果非常显著。
[0178]
实施例8枯草芽孢杆菌ybs01与腐熟接种剂复配的除臭能力评价
[0179]
1、臭源的制备
[0180]
将鸡粪与花生壳秸秆按4:1的质量比混合均匀，调节水分65％，每个处理取200g置于500ml锥形瓶中，备用。
[0181]
2、除臭实验
[0182]
将实施例3制备的枯草芽孢杆菌ybs01菌液调至1亿cfu/ml，按不同剂量接种到上述臭源中。
[0183]
(1)空白对照组：按1％体积比接种lb液体培养基；
[0184]
(2)接种剂对照组：接种0.1g的腐熟接种剂(50亿cfu/g)；
[0185]
(3)ybs01对照组：按1％体积比接种枯草芽孢杆菌ybs01菌液(1亿cfu/ml)；
[0186]
(4)ybs01复配组：按1％体积比接种枯草芽孢杆菌ybs01菌液(1亿cfu/ml)，同时接种0.1g的腐熟接种剂(50亿cfu/g)。
[0187]
每个处理组和对照组各做三个重复。在37℃下培养7天，每天在12:00左右利用泵吸式气体检测仪检测臭源中氨气和硫化氢的瞬时释放浓度(ppm)，取平均值。具体结果见表10。
[0188]
表10不同处理对鸡粪的除臭效果
[0189][0190][0191]
从表10的结果可以看出，与空白对照组相比，接种剂对照组的氨气释放量有所降低，但硫化氢的释放量明显提高，说明腐熟剂的加入会进一步提高鸡粪中硫化氢的释放量；而枯草芽孢杆菌ybs01无论是单菌或与腐熟接种剂复配均能明显减少氨气和硫化氢的释放，明显降低臭气释放的峰值，使臭源在较短时间臭气释放达到较低水平。其中，单独添加枯草芽孢杆菌ybs01的对照组鸡粪氨气和硫化氢的释放峰值降低了44-62％，氨气的释放浓度最高降低了66％，硫化氢的释放浓度最高降低了89％；而同时添加枯草芽孢杆菌ybs01和腐熟接种剂的复配组鸡粪氨气和硫化氢的释放峰值降低了45-55％，氨气的释放浓度最高降低了48％，硫化氢的释放浓度最高降低了80％，效果均非常显著。4、腐熟度及其他堆肥指标检测
[0192]
腐熟度检测方法与实施例4相同。按照有机肥料ny/t525-2021的规定对上述腐熟鸡粪的堆肥指标进化验，具体结果见表11。
[0193]
表11鸡粪堆肥指标化验结果
[0194]
处理空白对照组接种剂对照组ybs01对照组ybs01复配组腐熟度(gi)53.62％76.31％64.94％90.08％有机质42％38％39％35％总养分(氮磷钾)8.18％8.03％8.20％8.21％水分84％72％75％70％
[0195]
从表11的结果可以看出，在6天的发酵周期内，本发明提供的枯草芽孢杆菌ybs01无论是单菌或与腐熟接种剂复配，均能显著提高鸡粪的腐熟度，最高达90％，有机质分解加
快，养分消耗减少，水分蒸发量大，有利于加快堆肥进程，缩短堆肥周期。
[0196]
实施例9枯草芽孢杆菌ybs01与堆肥腐熟接种剂搭配在鸡粪堆肥中应用
[0197]
1、实验地点：山东省烟台市蓬莱区民和生物科技堆肥车间。
[0198]
2、污泥堆肥物料搭配：
[0199]
将400吨鸡粪与100吨花生壳秸秆混合均匀，做成宽2.5米，高1米，长60米的梯形发酵堆体四条，备用。
[0200]
3、除臭实验：
[0201]
将枯草芽孢杆菌ybs01菌粉用麸皮或秸秆粉分别稀释成3亿cfu/g，6亿cfu/g，12亿cfu/g三种剂量。将稀释后的菌粉分别加入鸡粪发酵堆体，每个处理对应一个堆体。
[0202]
空白对照组：添加腐熟接种剂40kg，不添加ybs01菌粉；
[0203]
处理组1：添加腐熟接种剂40kg，3亿cfu/g ybs01菌粉40kg；
[0204]
处理组2：添加腐熟接种剂40kg，6亿cfu/g ybs01菌粉40kg；
[0205]
处理组3：添加腐熟接种剂40kg，12亿cfu/g ybs01菌粉40kg。
[0206]
从每个堆体取6个点，每天12:00左右在各点取三个样，分别测定样品温度和样品中氨气和硫化氢的瞬时释放浓度(ppm)，取平均值。具体结果见表12。
[0207]
表12枯草芽孢杆菌ybs01复配接种剂在鸡粪堆肥中的除臭效果
[0208][0209]
从表12的数据可以看出，与对照组相比，同时添加腐熟接种剂和枯草芽孢杆菌ybs01菌粉的处理组鸡粪硫化氢和氨气的释放浓度均有大幅度降低，臭气释放的峰值也显著降低。其中，氨气的释放浓度最高降低了60％，硫化氢的释放浓度最高降低了83％，而且处理组1鸡粪在第5天已经完全消除硫化氢的排放，处理组2和3在第3天硫化氢的量不可检出，而对照组在第6天仍可检出。从而说明本发明提供的枯草芽孢杆菌ybs01对硫化氢、氨气有明显的降解作用，可以增加腐熟剂的除臭功能，取得了意料不到的技术效果。
[0210]
4、腐熟度检测及其他堆肥指标检测
[0211]
腐熟度检测方法与实施例3相同，按照有机肥料ny/t525-2021的规定对上述腐熟物料的堆肥指标进行化验，具体结果见表13。
[0212]
表13堆肥指标化验结果
[0213]
处理ck处理组1处理组2处理组3最高温度℃70℃72℃74℃78℃平均温度℃61℃62℃62℃65℃腐熟度(gi)79.65％88.38％105.66％121.23％有机质45％45％43％40％总养分(氮磷钾)7.98％7.92％8.14％8.17％水分46％44％44％42％
[0214]
从表13的结果可以看出，与对照组相比，枯草芽孢杆菌ybs01与腐熟接种剂复配能明显提高腐熟接种剂的效果，处理组鸡粪的腐熟度得到显著提高，而且随着枯草芽孢杆菌ybs01添加量的增加，腐熟度进一步增加，最高达121.23％，比对照组提高了52.2％。此外，枯草芽孢杆菌ybs01还能显著提高鸡粪堆肥温度，与对照组相比，处理组堆肥最高温度和平均温度分别提高了8℃和4℃，约缩短了3天的腐熟周期，取得意料不到的技术效果。
[0215]
综上所述，本发明提供的枯草芽孢杆菌ybs01可单独使用，也可与芽孢杆菌、曲霉菌、酵母菌、乳酸菌中的任意一种或两种或多种的组合或腐熟接种剂进行复配，广泛应用于粪便堆肥，不仅能显著降低氨气和硫化氢等臭味气体的排放，还能明显提高堆肥温度，加快腐熟进程，缩短堆肥周期，提高腐熟度和肥效，应用前景广阔。