一种鉴定刀鲚遗传性别的SNP标记及其引物和应用的制作方法

nasus)provides novel insights into migratory adaptation.gigascience,2020,9:1-13.
10.5.zhou y,wu j,wang z,et al.identification of sex-specific markers and heterogametic xx/xy sex determination system by 2b-rad sequencing in redtail catfish(mystus wyckioides).aquaculture research,2019,50:2251-2266.


技术实现要素：

11.本发明的目的在于提供检测刀鲚lg18染色体上的第12186257位碱基的试剂在鉴定刀鲚性别中的应用。
12.为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
13.申请人对雌雄刀鲚2b-rad测序数据进行比对分析，在雌雄鱼间发现了大量的snp标记。对与刀鲚性别差异相关性最为显著的10个snp标记进行筛选验证，其中一个snp标记表现出准确的雌雄特异性，该snp位点位于刀鲚lg18染色体上的第12186257位碱基，对应的基因组为ncbi sra id:prjna422339。因此，检测刀鲚lg18染色体上的第12186257位碱基的试剂可用于刀鲚性别的鉴定。
14.以上所述的应用，所述的试剂可以为引物。
15.优选的，引物为：
16.forward primer：gcacaaagttgcactgttcc
17.reverse primer：atgcacaacacggatcttgc。
18.利用上述引物扩增出的片段，通过检测第第178位碱基进行判断雌雄，snp标记为t/g基因型的个体为雌性刀鲚，snp标记为t/t基因型的个体为雄性刀鲚。
19.与现有技术相比，本发明的优点如下：
20.(1)本发明所提供的遗传性别鉴定方法能够以基因组dna为模板，仅仅通过简单的pcr和sanger测序就能够进行性别的鉴定。该方法不受个体发育时期、环境的影响，能稳定的鉴别出刀鲚各个群体中不同个体的遗传性别，包括胚胎、幼体和成体，从而克服其他方法操作较繁琐、耗时较长等缺点，适合于对大样本进行快速鉴定。
21.(2)本发明操作简单、快速、准确，并适合于推广应用。将该snp标记应用于生产实践可以有效地识别与鉴定各种发育阶段遗传性别，有助于将刀鲚雌雄鱼区分开来，从而为培育刀鲚全雌养殖群体做准备；能进一步提高刀鲚鱼池塘养殖的养殖和经济收益。
22.(3)本发明的snp标记检测准确度达到了100％。
附图说明
23.图1为sanger测序的测序结果的snp位点及其峰图；
24.其中a为雌鱼对应snp位点的测序峰图；b为雄鱼对应snp位点的测序峰图。
具体实施方式
25.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例
中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
26.实施例1：
27.刀鲚性别特异snp标记的开发与验证
28.刀鲚是二倍体生物且为zw/zz型性别决定系统，雌性为zw，雄性为zz。通过对10组来自于江苏省镇江市江之源渔业科技有限公司养殖群体雌雄刀鲚2b-rad测序数据进行比对分析，在雌雄鱼间发现了大量的snp标记。对与刀鲚性别差异相关性最为显著的10个snp标记进行筛选验证，其中一个snp标记表现出准确的雌雄特异性，该snp位点位于刀鲚lg18染色体上的第12186257位碱基。
29.结果如表1，表现为来自雌鱼的序列中在图1所示snp位点上有t/g两种碱基，来自雄鱼的序列在该位点则不存在snp多态性，所有序列在该位点的碱基都是t。
30.表1筛选得到的snp分子标记信息
[0031][0032]
针对表1的snp分子标记设计引物：
[0033]
forward primer：gcacaaagttgcactgttcc
[0034]
reverse primer：atgcacaacacggatcttgc。
[0035]
在刀鲚雌鱼中扩增到的序列为seq id no.1所示，在该序列中第178位碱基为t/g，在雄鱼中扩增到的序列为seq id no.2所示，在该序列中第178位碱基为t/t。
[0036]
实施例2：
[0037]
pcr产物测序初步验证snp位点的准确性
[0038]
本实例所采用44条来源于江苏省镇江市江之源渔业科技有限公司养殖群体(遗传性别已确定)的刀鲚样本(雌雄各22条)进行雌雄鉴定。
[0039]
利用酒精消毒后的剪刀剪取刀鲚部分尾鳍约0.5
×
0.5cm，放入无水乙醇中4℃保存。通过醋酸铵法对鳍条基因组dna进行提取。采用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna质量，利用紫外分光光度计(eppendorf，ag2231型)检测浓度，-20℃保存备用。
[0040]
所述pcr扩增反应体系为：
[0041][0042]
forward primer：gcacaaagttgcactgttcc
[0043]
reverse primer：atgcacaacacggatcttgc
[0044]
pcr扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸10min。
[0045]
结果
[0046]
将pcr产物经过1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测后，送至武汉擎科生物科技有限公司(tsingke，武汉，中国)做sanger测序，对测序结果的snp位点及其峰图进行统计，结果见表2。
[0047]
表2第178位snp位点在44条刀鲚中验证的统计结果
[0048][0049][0050]
实施例3：
[0051]
pcr产物测序及扩大样本验证snp位点的准确性
[0052]
本实例所采用48条来源于3个群体(遗传性别已确定)的刀鲚样本(雌性33条，雄性15条)进行雌雄鉴定。群体1为江苏省镇江市江之源渔业科技有限公司养殖群体(雌15条，雄1条)，群体2为湖北省武汉市武汉恒宇信科技养殖专业合作社养殖群体(雌4条，雄10条)；群体3为湖北省野芷湖野生群体(雌14条，雄4条)。
[0053]
利用酒精消毒后的剪刀剪取刀鲚部分尾鳍约0.5
×
0.5cm，放入无水乙醇中4℃保存。通过醋酸铵法对鳍条基因组dna进行提取。采用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna质量，利用紫外分光光度计(eppendorf，ag2231型)检测浓度，-20℃保存备用。
[0054]
所述pcr扩增反应体系为：
[0055][0056]
forward primer：gcacaaagttgcactgttcc
[0057]
reverse primer：atgcacaacacggatcttgc
[0058]
pcr扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸10min。
[0059]
(4)结果
[0060]
将pcr产物经过1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测后，送至武汉擎科生物科技有限公司(tsingke，武汉，中国)做sanger测序，对测序结果的snp位点及其峰图进行统计，结果见表3。
[0061]
表3第178位snp位点在48条刀鲚中验证的统计结果
[0062][0063][0064]
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。