一类N-杂环-1,5-二取代-4-吡唑甲酰胺类化合物及其应用

一类n-杂环-1,5-二取代-4-吡唑甲酰胺类化合物及其应用
技术领域
1.本发明涉及药物化学领域，特别涉及一类n-杂环-1,5-二取代-4-吡唑甲酰胺类化合物及其在抗植物病原真菌方面的应用。


背景技术：

2.植物真菌病害导致了全球主要粮食和经济作物的产量每年减少达20％；另外，一些真菌还可以产生霉菌毒素，对人类的健康构成重大威胁。而化学手段仍是预防和控制真菌病害的主要方法。其中，杀菌剂在保护农业生产和促进粮食稳定增收等方面发挥着重要作用。近年来各大农药公司对具有新型结构杀菌剂的研发取得快速的进展，得到了多种具有新作用机制的杀菌剂，例如干扰代谢物质的合成、影响细胞结构以及阻碍呼吸作用的杀菌剂等等。而琥珀酸脱氢酶抑制剂由于能够阻碍真菌呼吸代谢，且表现出高效广谱的杀菌活性在近年来脱颖而出，成为新农药研究的热点之一。分析商品化琥珀酸脱氢酶抑制剂及其衍生结构发现，大多数包含五元杂环“吡唑”和经典官能团“酰胺”；进一步对吡唑环上的取代基位置的分析发现，大多为“1,3-二取代”和“1,3,5-三取代”，很少有“1,5-二取代”。
3.本课题组在前期工作中，发现了一类独特的“1-苯基-5-三氟甲基-4-吡唑甲酰胺”的活性骨架，其衍生物作为潜在的琥珀酸脱氢酶抑制剂对禾谷镰刀病菌表现出良好的抑制活性。在前期工作基础上，通过对吡唑“1-位、“5-位”的取代基及酰胺中“胺”部分进行拓展，设计一系列新型的1,5-二取代-4-吡唑甲酰胺衍生物，期望能够发现一类具有高抗植物病原真菌活性的n-杂环-1,5-二取代-4-吡唑甲酰胺类化合物，并能够应用在植物真菌病害的防治中。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是：提供一种具有抗植物病原真菌活性的n-杂环-1,5-二取代-4-吡唑甲酰胺类化合物，用以防治由植物病原真菌引起的植物真菌病害。
5.本发明的技术方案：一类n-杂环-1,5-二取代-4-吡唑甲酰胺类化合物，其结构式如下：其中r1为甲基、一氯甲基、二氟甲基、三氟甲基或三氯甲基；r2为异丙基、叔丁基、环己基、苯基或邻取代苯基，其中取代基为甲基、三氟甲基、乙基或卤素；r3为4-吡啶基、2-取代-4-吡啶基、3-噻吩基或2-取代-3-噻吩基，其中所述的2-取代-4-吡啶基中的取代基为甲基或卤素；其中所述的2-取代-3-噻吩基中的取代基为支链烷烃。
6.优选的，r1为一氯甲基、二氟甲基或三氟甲基；r2为苯基或邻取代苯基，其中取代基为甲基、三氟甲基、乙基或卤素；r3为4-吡啶基、2-取代-4-吡啶基或3-噻吩基，其中取代基为甲基或卤素。
7.所述的一类n-杂环-1,5-二取代-4-吡唑甲酰胺类化合物的制备方法，反应式如下：
[0008][0009]
所述的一类n-杂环-1,5-二取代-4-吡唑甲酰胺类化合物在植物病原真菌引起的植物真菌病害上的应用。
[0010]
所述的一类n-杂环-1,5-二取代-4-吡唑甲酰胺类化合物在制备抗植物病原菌活体药物中的应用。优选的，所述的r1为一氯甲基、二氟甲基或三氟甲基；r2为苯基或邻取代苯基，其中取代基为乙基或卤素；r3为4-吡啶基、2-取代-4-吡啶基或3-噻吩基，其中所述的2-取代-4-吡啶基中的取代基为甲基或卤素。
[0011]
本发明的有益效果：本发明在课题组前期工作中发现的“1-苯基-5-三氟甲基-4-吡唑甲酰胺”的活性骨架基础上，通过对吡唑“1-位、“5-位”的取代基及酰胺中“胺”部分进行拓展，合成了系列新型的1,5-二取代-4-吡唑甲酰胺衍生物，通过化合物的抗植物病原真菌活性测试发现，该类化合物不仅对导致水稻真菌性病害的禾谷镰刀病菌和稻黒孢霉菌表现出优良的抑菌活性；同时部分化合物对多种植物病原菌表现出良好的抑菌活性，表现出明显的广谱活性。另外，部分化合物对由禾谷镰刀病原菌侵染的玉米植株和稻黒孢霉病原菌侵染的水稻植株表现出优良的保护和治疗活性。这表明该类化合物不仅能够为新农药的研发和创制提供重要的科学基础，而且具有产业化的前景。
附图说明
[0012]
图1为在100mg/l的浓度下化合物对禾谷镰刀病原菌侵染的玉米植株活体活性保护活性a:空白；b:氰烯菌酯；c:化合物e63；治疗活性d:空白；e:氰烯菌酯；f:化合物e63；
[0013]
图2为在40mg/l的浓度下化合物对稻黒孢霉病原菌侵染的水稻植株的活体活性；保护活性a：空白；b:化合物e77；治疗活性c：空白；d:化合物e77。
具体实施方式
[0014]
含一类n-杂环-1,5-二取代-4-吡唑甲酰胺类化合物的合成：
[0015]
[0016]
以取代乙酰乙酸乙酯(a)为起始原料，通过关环、水解、酰氯化和取代反应，合成目标化合物e。
[0017]
中间体b的制备：以1-(2-氟-苯基)-5-一氯甲基-1h-4-吡唑甲酸乙酯为例
[0018][0019]
在圆底烧瓶中，将一氯乙酰乙酸乙酯(0.1mol)、原甲酸三乙酯(0.2mol)和乙酸酐(0.3mol)混合，在130℃下搅拌4小时，然后减压蒸馏得到中间体。将邻氟苯肼(7.9g，49.5mmol)溶解在乙醇(100ml)中，加入中间体，在100℃反应2小时。通过减压蒸馏除去溶剂，混合物用乙酸乙酯萃取，盐水洗涤，无水硫酸钠干燥并浓缩，粗产物通过柱层析(pe/ea＝50/1)纯化得到。棕色油状液体，产率86％.1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.17(s,1h,pyrazole h),7.71-7.65(m,2h,phenyl h),7.57-7.53(m,1h,phenyl h),7.46-7.43(m,1h,phenyl h),4.87(s,2h,ch2cl),4.31(q,j＝7.0hz,2h,och2ch3),1.32(t,j＝7.1hz,3h,och2ch3)；
13
c nmr(126mhz,dmso-d6)δ161.88,157.76,155.76,143.08,141.84,132.60(d,j＝7.9hz),129.24,125.32(d,j＝3.4hz),117.02(d,j＝19.2hz),112.87,60.31,32.87,14.13；
19
f nmr(471mhz,dmso-d6)δ-122.00.
[0020]
中间体c的制备：1-(2-氟-苯基)-5-一氯甲基-1h-4-吡唑甲酸为例
[0021][0022]
在圆底烧瓶中，加入中间体b(28.5mmol)、thf(30ml)和水(30ml)。溶液搅拌均匀后，加入氢氧化锂(114.2mmol)。将反应混合物在80℃搅拌2h。减压蒸馏后使用盐酸(2m)将ph值调节至约4，过滤并干燥得到c。
[0023]
中间体d的制备：1-(2-氟-苯基)-5-一氯甲基-1h-4-吡唑甲酰氯为例
[0024][0025]
根据文献报道的方法，以socl2为溶剂，合成了酰化试剂d。反应结束后真空除去溶剂，粗品直接用于下一步反应。
[0026]
目标化合物e1-e96的合成
[0027][0028]
在100ml的圆底烧瓶中，将取代胺(3.2mmol)、中间体d(3.5mmol)和nah(6.4mmol)在无水thf(5ml)中室温下搅拌过夜。混合物经减压蒸馏除去溶剂，用乙酸乙酯和水萃取，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化可得目标化合物化合物e。
[0029]
目标化合物的结构和理化数据：
[0030]
[0031]
[0032]
[0033]
[0034]
[0035]
[0036]
[0037]
[0038]
[0039]
[0040]
[0041]
[0042]
[0043]
[0044]
[0045]
[0046]
[0047]
[0048]
[0049]
[0050]
[0051]
[0052][0053]
目标化合物的抗植物病原真菌生物活性测试方法
[0054]
试验材料和培养基的配制
[0055]
植物真菌：油菜菌核病菌、禾谷镰刀病菌、茄子黄萎病菌、水稻纹枯病菌、葡萄座腔病菌、番茄早疫病菌、大豆茎溃疡病菌、水稻穗腐病菌、辣椒枯萎病菌、长柄链格孢病菌、蓝莓根腐病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌和稻黑孢霉病菌。
[0056]
对照药剂：吡噻菌胺(98％原药，瀚香生物科技有限公司)、啶酰菌胺(98％原药，上海阿达玛斯试剂有限公司)、氰烯菌酯(98％原药，德国dr.ehrenstorfer gmbh公司)。
[0057]
配制pda培养基：称取800克去皮土豆，煮汁后过滤，加入琼脂80g、葡萄糖80g，混匀溶解后以每瓶90ml转移到200ml锥形瓶中，封口后在120℃条件下高压灭菌30分钟，冷却后备用。
[0058]
配制药液：称取待测化合物10mg溶解到1.0ml dmso中，在无菌超净台中转移至含9.0ml无菌吐温水的15ml离心管中，再加到已灭菌的90mlpda培养基中混匀，使得药液最终浓度为100μg/ml，将培养基平均倒入9个培养皿中冷却备用，以等量的dmso吐温水作为空白对照，以商品药吡噻菌胺、啶酰菌胺和氰烯菌酯作为对照药。
[0059]
化合物对植物病原菌的活性测试
[0060]
采用菌丝生长速率法测定了目标化合物对十四种植物病原真菌的抑制活性。取提前活化好的真菌边缘打孔制成直径为4.0mm的菌饼，用无菌接种针移接到含药培养基中央，置于28℃的恒温培养箱中培养2-6天。
[0061]
待空白对照组菌落长到6.0cm左右时用直尺按十字交叉法测量菌丝直径。根据下列公式计算抑制率，计算公式如下，其中i为抑制率，c为空白对照菌丝测量直径，t为药物处理组测量直径。
[0062]
i(％)＝[(c-t)/(c-0.4)]
×
100
[0063]
化合物对植物病原真菌毒力回归方程和ec
50
值的测定
[0064]
根据活性初步筛选数据，对高活性化合物和对照药进行了毒力回归方程和ec
50
值的测定。将待测药液分别配置成5个梯度浓度，以等量的dmso吐温水作为空白对照，采用菌丝生长速率法测定了对相应植物真菌的抑菌活性，采用十字交叉法测量菌丝直径，抑制率计算方法同上，浓度取对数与抑制率做线性回归方程，从而得出其ec
50
值。
[0065]
目标化合物抗植物病原菌离体活性数据分析
[0066]
采用菌丝生长速率法测定了目标化合物在100μg/ml浓度下对十四种植物病原真菌和卵菌的的抑制活性，结果如表1-4所示。
[0067]
表1目标化合物e1-e96在100μg/ml浓度下对六种植物病原菌活性测试结果a[0068]
[0069]
[0070][0071]a每组实验重复三次，
“‑‑”
为未测试。
[0072]
表2部分目标化合物在100μg/ml浓度下对三种植物病原菌活性测试结果a[0073]
[0074][0075]a每组实验重复三次，
“‑‑”
为未测试。
[0076]
表3部分目标化合物在100μg/ml浓度下对四种植物病原菌活性测试结果a[0077][0078][0079]a每组实验重复三次，
“‑‑”
为未测试。
[0080]
表4部分目标化合物在100μg/ml浓度下对稻黑孢霉病菌活性测试结果a[0081]
编号稻黑孢霉病菌编号稻黑孢霉病菌编号稻黑孢霉病菌e1788.8
±
2.1e4125.5
±
1.1e6892.3
±
1.2e1855.9
±
1.1e4215.9
±
0.0e6990.7
±
2.5e1962.9
±
1.4e436.5
±
0.0e76100e2089.7
±
2.3e4453.0
±
15.7e77100e2196.2
±
3.3e4533.0
±
1.1e7855.7
±
7.1e2291.7
±
2.0e460e79100e2326.0
±
1.1e4763.6
±
1.9e80100e2488.6
±
2.5e4825.5
±
1.1e81100e2550.5
±
1.9e4964.4
±
0.5e82100e26100e5022.2
±
2.9e8329.7
±
0.6e2771.4
±
1.4e5167.9
±
1.1e8472.3
±
3.8e2889.4
±
4.6e5281.9
±
5.7e8592.7
±
1.5e2994.9
±
1.5e5352.7
±
0.5e8654.0
±
4.6e3021.0
±
1.9e5449.5
±
1.0e8749.3
±
0.6e3192.4
±
1.0e5591.7
±
0.5e8879.7
±
0.6e3224.1
±
1.1e5690.5
±
2.5e9029.3
±
0.6e3335.5
±
1.9e5743.2
±
1.5e9186.0
±
1.0e3415.9
±
0.0e5815.9
±
1.5e9267.7
±
3.1e3515.6
±
0.5e5993.7
±
5.8e9367.7
±
5.5e3650.5
±
1.9e600e9478.3
±
3.1e3771.0
±
1.9e6169.8
±
0.5e95100e380e6296.2
±
3.3e96100e390e6391.7
±
2.0啶酰菌胺76.7
±
3.2e4068.2
±
0.9e6488.6
±
2.5
ꢀꢀ
[0082]a每组实验重复三次，
“‑‑”
为未测试。
[0083]
由表1-4的初步真菌活性筛选结果分析发现，在100μg/ml的浓度下目标化合物对油菜菌核病菌、禾谷镰刀病菌、茄子黄萎病菌、水稻纹枯病菌、葡萄座腔病菌、番茄早疫病菌、大豆茎溃疡病菌、水稻穗腐病菌、辣椒枯萎病菌、长柄链格孢病菌、蓝莓根腐病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌和稻黑孢霉病菌表现出明显的离体抑制活性。其中，其中大部分化合对禾谷镰刀病菌、茄子黄萎病菌和稻黑孢霉病菌表现出良好的抑菌活性。而部分化合物则表现出良好的广谱的抑菌活性如e9、e13、e59、e63和e64。
[0084]
由表5-7结果分析发现化合物e9对禾谷镰刀病菌、葡萄座腔病菌、水稻穗腐病菌和辣椒枯萎病菌的ec
50
值分别为13.1、14.4、13.3和18.2μg/ml；e13对禾谷镰刀病菌和葡萄座腔病菌的ec
50
值分别为16.8和13.9μg/ml；e59对水稻纹枯病菌和茄子黄萎病菌的ec
50
值分别为6.6和10.6μg/ml；e63对水稻纹枯病菌、禾谷镰刀病菌和茄子黄萎病菌的ec
50
值分别为12.8、5.5和17.6μg/ml。
[0085]
化合物e63、e76、e77和e81对稻黒孢霉的ec
50
值分别为9.8、5.8、3.7和5.5μg/ml。化合物e63和e64对禾谷镰刀病菌的ec
50
值分别为5.5和6.5μg/ml。
[0086]
表5部分目标化合物对三种植物病原菌的ec
50
值a[0087][0088]a每组实验重复三次，
“‑‑”
为未测试。
[0089]
表6部分目标化合物对三种植物病原菌的ec
50
值a[0090][0091]a每组实验重复三次，
“‑‑”
为未测试。
[0092]
表7部分目标化合物对稻黒孢霉的ec
50
值a[0093]
编号ec
50
(μg/ml)编号ec
50
(μg/ml)e2641.2
±
2.1e7820.0
±
1.3e2812.1
±
1.2e7916.1
±
0.6e5941.0
±
1.5e8017.0
±
0.5e639.8
±
0.8e815.5
±
1.3e6410.5
±
0.4e8216.8
±
0.4e6832.2
±
1.0e8337.8
±
9.2e6917.3
±
0.4e8422.5
±
8.1e7511.4
±
0.3e8526.3
±
2.9e765.8
±
0.6e9537.1
±
0.6e773.7
±
0.1e9613.8
±
4.7
[0094]a数值是三个重复的平均值
±
sd.
[0095]
化合物抗植物病原真菌活体活性测试方法
[0096]
(1)选取对水稻纹枯病菌离体活性较好的化合物e9和e63，以玉米植株为宿主，进行活体治疗和保护活性测试；以含等量dmso的无菌水为空白对照。
[0097]
治疗活性实验：将玉米种子(正单958)种植在湿润的土壤中，在25℃的恒温培养箱中培养至发芽。将具有相同生长和健康的幼苗移入盆中，培养6天。用砂纸将玉米叶打磨干净，然后将菌丝放在破损处上，用湿棉布润湿，放置24h后，将含有活性化合物e9(100μg/ml)的溶液喷洒在叶子上，用dmso(1％)水溶液作空白对照，5天后测量病斑长度。保护效果计算如下：保护效果(％)＝(a
0-a1)/a0×
100％，其中a0代表空白对照组的病灶长度，a1代表化合物治疗的病灶长度。
[0098]
保护活性实验：将玉米种子(正单958)种植在湿润的土壤中，在25℃的恒温培养箱中培养至发芽。将具有相同生长和健康的幼苗移入盆中，培养4天。将化合物e9(100μg/ml)的溶液喷洒在叶子上。dmso(1％)水溶液用作空白对照。在培养箱中放置两天后，用砂纸将玉米叶打磨干净，然后将菌丝放在伤口上，用湿棉布润湿。10天后测量病班长度。保护效果计算如下：保护效果(％)＝(a
0-a1)/a0×
100％，其中a0代表空白对照组的病斑长度，a1代表化合物保护的病斑长度。(2)选取对水稻稻黒孢霉病菌离体活性较好的化合物e77，以水稻植株为宿主，进行活体治疗和保护活性测试；以含等量dmso的无菌水为空白对照。
[0099]
治疗活性实验：将水稻种子(湘两优)种植在湿润的土壤中，在25℃的恒温培养箱中待大部分水稻种子发芽，牙尖长至0.5-1cm左右时，进行移栽。待水稻苗长至40cm左右，每株水稻有3片叶子可以接种时，进行接种。用砂纸将水稻苗打磨干净，然后将菌丝放在破损处上，用湿棉布润湿，放置24h后，将含有化合物e77(40μg/ml)的溶液喷洒在叶子上，用dmso(1％)水溶液作空白对照，5天后测量病斑长度。保护效果计算如下：保护效果(％)＝(a
0-a1)/a0×
100％，其中a0代表空白对照组的病灶长度，a1代表化合物治疗的病灶长度。
[0100]
保护活性实验：将水稻种子(湘两优)种植在湿润的土壤中，在25℃的恒温培养箱中待大部分水稻种子发芽，牙尖长至0.5-1cm左右时，进行移栽。待水稻苗长至40cm左右，将化合物e77(40μg/ml)的溶液喷洒在叶子上。dmso(1％)水溶液用作空白对照。在培养箱中放置两天后，用砂纸将玉米叶打磨干净，然后将菌丝放在伤口上，用湿棉布润湿。5天后测量病班长度。保护效果计算如下：保护效果(％)＝(a
0-a1)/a0×
100％，其中a0代表空白对照组的病斑长度，a1代表化合物保护的病斑长度。
[0101]
目标化合物抗植物病原菌活体活性数据分析
[0102]
表8化合物e9对禾谷镰刀病原菌侵染的玉米活体的保护活性(100μg/ml)
[0103][0104]
注：显著性差异分析采用邓肯检验方法，数据处理软件为ibm spss statistics 20。表中同一列中不同字母的标记表示有显著差异，p《0.05。
[0105]
表9化合物e63对禾谷镰刀病原菌侵染的玉米活体的保护与治疗活性(100μg/ml)
[0106][0107]
注：显著性差异分析采用邓肯检验方法，数据处理软件为ibm spss statistics 20。表中同一列中不同字母的标记表示有显著差异，p《0.05。
[0108]
如表8和9所示，在100μg/ml的浓度下，化合物e9对由禾谷镰刀病原菌侵染的玉米植株表现出明显的保护活性(50.7％)；而化合物e63表现出明显的保护活性(57.2％)和治疗活性(44.2％)(图1)。与化合物e9在同等条件下的保护活性相比可知，化合物e63对玉米植株的保护作用得到了明显地提高。
[0109]
表10化合物e77对稻黒孢霉病原菌侵染的水稻的活体保护与治疗活性(40μg/ml)
[0110][0111]
注：显著性差异分析采用邓肯检验方法，数据处理软件为ibm spss statistics 20。表中同一列中不同字母的标记表示有显著差异，p《0.05。
[0112]
如表10所示，在40μg/ml的浓度下，化合物e77对由稻黒孢霉病原菌侵染的水稻植株表现出优异的保护活性(92.6％)和明显的治疗活性(53.0％)(图2)。