一种嗜尸性蝇类蛹期日龄推断试剂盒及应用

1.本发明属于法医昆虫学技术领域，特别涉及一种嗜尸性蝇类蛹期日龄推断试剂盒及应用。


背景技术：

2.死亡时间(postmortem interval,pmi)推断是指尸体被发现时距死亡时刻间隔的推测和判断，在案件线索提供、侦查范围划定、作案时间分析、案件定性等方面均有重要意义。pmi推断是刑事案件侦破的关键环节，也是法医学实践难点和研究热点。近年来，法医昆虫学在pmi推断，特别是腐败尸体pmi推断等方面体现出较好的应用前景，其中嗜尸性蝇类在pmi推断方面具有自身独特的优势，其应用价值较高，受到法医昆虫学者的广泛关注。
3.以前的专利或者研究通常关注幼虫期的年龄推断，然而通常来说，嗜尸性蝇类蛹期发育时间较长，占总发育历期的一半以上，是案件现场最常见的蝇类虫态，我们需要经常利用嗜尸性蝇类的蛹期日龄来进行尸体pmi推断，因此，蛹期日龄的推断在实际应用中比幼虫期更显得重要，且相对于幼虫期可以用体长、体重等指标来推断日龄外，嗜尸性蝇类蛹期发育日龄推断目前的一些方法缺乏客观判断指标，严重影响了蝇类证据的准确性和科学性进而阻碍其在法庭科学中被采纳应用，成为限制法医昆虫学发展的关键性问题，因此，寻找一种更加客观的嗜尸性蝇类蛹期日龄推断方法对于昆虫证据的应用非常重要。
4.嗜尸性蝇类是全变态发育昆虫，蛹期发育是一个细胞增殖、组织重塑、细胞迁移和程序性死亡的过程，许多基因参与到这些过程和变化中，差异表达基因(degs)在嗜尸性蝇类蛹期日龄推断中具有巨大的潜力，而且差异表达基因的结果客观性强，弱化了人为主观臆断因素，在法庭上更容易被接受，同时也能进行误差计算，更符合杜伯特法则的需求。转录组学是继基因组学后另一大组学研究热点，近年来转录组测序技术发展迅速，测序和数据分析技术愈发成熟，开展转录组测序、基因筛选和生物信息分析研究可以为法医昆虫学蛹期日龄推断研究提供大量可供选择的高灵敏度年龄指示基因，建立嗜尸性昆虫蛹期日龄推断的新方法。
5.棕尾別麻蝇(sarcophaga peregrina)是尸体上常见的嗜尸性蝇类，在死亡时间(pmi)推断等方面具有独特的优势，是一种重要的嗜尸性蝇类。因此，利用转录组学筛选差异表达基因作为分子标记来进行棕尾别麻蝇蛹期日龄的精确推断，对于棕尾别麻蝇在法医昆虫学pmi推断中的应用具有重要意义。


技术实现要素：

6.为了实现上述目的，本发明提供一种嗜尸性蝇类蛹期日龄推断试剂盒及应用。
7.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
8.一种嗜尸性蝇类蛹期日龄推断试剂盒，包括用于推算棕尾别麻蝇蛹期发育时间的分子标记，所述分子标记为evm.model.contig 1.824目的基因，所述evm.model.contig 1.824目的基因的dna序列如no.1所示；
9.所述分子标记evm.model.contig 1.824目的基因设计的引物组合物，所述引物组合物为用于检测evm.model.contig 1.824目的基因表达量的引物组合物；
10.所述用于检测evm.model.contig 1.824目的基因的引物组合物包括1.824-f和1.824-r，所述1.824-f的dna序列如no.3所示，所述1.824-r的dna序列如no.4所示。
11.一种嗜尸性蝇类蛹期日龄推断试剂盒，包括用于推算棕尾别麻蝇蛹期发育时间的分子标记，还包括用于校正目的基因表达量的evm.model.contig-actin内参基因，所述evm.model.contig-actin内参基因的dna序列如实施例1中no.2所示；
12.所述用于检测evm.model.contig-actin内参基因的引物组合物包括actin-f和和actin-r，所述actin-f的dna序列如no.5所示，所述actin-r的dna序列如no.6所示。
13.一种用于推算棕尾别麻蝇蛹期发育时间的试剂盒应用方法，包括以下步骤：
14.s1、以不同发育日龄的棕尾别麻蝇蛹为样本，提取rna，然后反转录cdna为模板；
15.s2、通过引物组合物，应用applied biosystems 7500实时荧光定量pcr仪检测仪器，进行evm.model.contig 1.824目的基因与evm.model.contig-actin内参基因的qrt-pcr扩增；
16.s3、对所述扩增的目的基因进行相对定量分析，获得该目的基因在棕尾别麻蝇不同发育日龄蛹样本中的相对表达量变化；
17.s4、绘制该目的基因相对表达量和棕尾别麻蝇蛹期发育日龄的拟合回归方程：
18.y＝2.80744 2.49763*x，所述y为蛹期日龄，所述x为evm.model.contig 1.824目的基因的相对表达量，即evm.model.contig 1.824目的基因与evm.model.contig-actin内参基因的ct差值(
△
ct)；
19.s5、在实际案件中，通过检测现场棕尾别麻蝇蛹期样本中evm.model.contig 1.824目的基因的相对表达量，代入上述拟合线性回归方程，然后可以计算棕尾别麻蝇蛹期的发育日龄，进而用于pmi推断。
20.本发明的有益效果：
21.(1)本发明首次提供了一种用于推算棕尾别麻蝇蛹期发育时间的分子标记evm.model.contig 1.824，结合qrt-pcr技术筛选出蛹期发育时间推算的分子遗传标记，构建棕尾别麻蝇差异表达基因evm.model.contig 1.824与蛹期发育时间的回归方程，来进行棕尾别麻蝇蛹期日龄的精确推断，其结果客观性强，更符合法庭科学的要求，对于在实际案件中利用棕尾别麻蝇蛹期日龄推断pmi具有重要意义。
22.(2)本发明首次提供了一种用于推算棕尾别麻蝇蛹期发育时间的引物组合物、试剂盒，经实验验证，设计的evm.model.contig 1.824目的基因与evm.model.contig-actin内参基因引物组合物，特异性强，扩增效率高。
23.(3)本发明首次提供了一种用于推算棕尾别麻蝇蛹期发育时间的试剂盒的应用方法，该方法操作简便，实用性强，便于在实验室的推广和使用，对于利用棕尾别麻蝇蛹期推断pmi具有重要意义。
附图说明：
24.图1为本发明的技术流程图。
25.图2为本发明中棕尾别麻蝇分子标记evm.model.contig 1.824目的基因与
evm.model.contig-actin内参基因的qrt-pcr溶解曲线。
26.图3为本发明中绘制的棕尾别麻蝇分子标记evm.model.contig 1.824目的基因相对表达量与蛹期发育日龄的变化趋势图。
27.图4为本发明中实际案例。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.如图1-图4所示：
30.实施例1
31.一种与棕尾别麻蝇蛹期发育时间相关的分子标记evm.model.contig 1.824，其dna序列如no.1所示，具体为：atgaaaagagtttttgctagtattttggcctttctggccctattacaaattagctgcgctcaacagcagccgagtaagagagtcgtatgttattatgattcggaaagttcaacaagatcaggatttgcacaattgccacaaaccgacttggaacaaggtttagaattctgtacgcatcttatatacggctatgctggtctaacacgtgaatcttttgagatattcagcttgaatgtggatcgtgacatgttccattatcgccaaataactgccttgaaggcaaagtttcctcaattgaaaatctatttaagtgtgggtggcgataaggacaatgatcaagtggatcccaataaatacattcatttcatggaaggcggcgaaccattgtatagaaatttcatccagtcatcgataaatctcttgaagacaaatggctttgatggcatcgatttagcttttcaatttccacgtaataaaccacgtaaagtacactcacagatcggtatggcttggaaaaaattcaagaaactctttaccggcaattttattgtggatcccgatgcggagacacataaacagcaatttactgagtttgttggcgttatggatgaggcatacagaattgccaatttatcgatgaccttgactgtattgccaaatgtcaattcaacatggtactttgatattcccgcaattaaagacaaatttgagtacgtaaatcttttcgcgtttgactttttaacgcccgaacgtaatcccgaagaagctgactacacagcccccatttacctcaaagatgaacaaaatcgtttgccccactataacattgattttcaagtgcaacattggattactaatggttgcccggccaacaaactcaatttaggcatcgcaacctatgcacgcacttggaaaatgacaaccgattcggaactatcaggcatgcccgtggtgccaggtacagtaggaccagccgaggcgggcttacaatcgaaacaagaggctggtgattttagaggccccaatgcccctatacgtaaagtagtagatcttgaacgtaaatatggtaactatgcctaccgggcggctgacgacaataatgaacatggcatatggattagttttgatgatccagattttgcaggcattaagactgaatatgccaaacaaaagggtctgggtggcattgccttgtacgatataagttatgatgatttccgtggtttgtgtactggtgccagataccccatactacgcatggttaagagtttgggcaaacttttaaatcctgaccttgagattgctttacaattctgttcacatttggtttacggttatatgggcattaagccccttacccatcaggtctttagcttgcatgaggatttggatgtgcataagcatcagttttccgaaattactgcattgaagagaaaattcccccaccttaaagtattgcttagcattggaggtgacaaagacatcgatcccggtcatcctgataaatatcttgagctattggagggcgaacgtgtcaagcagactgcttttataaataccgcctacacaatggtacgaacatatggttttgatggcatcgatttggcctaccagtttcccaagaacaagccactggatcccaatgctgacatgcataaagaacagtttaccacattgataagggacttgaggaatgttcttaagccagatggtttacttttgactctaactgtactgcctaatgttaattcgacatggtatttcaatgttcctgttgtttccaattttgttgattttgttaatttggccgcatttgattttcttacacccgatcgtaatcccgaagaggcagactacactgctcctttgtatgaactttacgatcagaatcgcttgcctcactacaatgccgactatcaggtaaactattggttgcaacatcaatgtccgg
cacataagattatattgggtatggctacatatggacgtgcttggaaaatgtcatccgactctggcaccactggtgaacccgttgtaccaacaactgagggccctgctgaagctgataggcaaagtcaaacacctggcttattaatttggcccgagatttgctataaactggcaaattccacaaattcatttctaaaaggtgcaaatgctcctttaagacgcgttagtgaactttatggcacatacgcttatcgaccagctgactcaaatggcgaacatggcatttgggtcagttatgaagatctcgaatcggcatcgaataaagctagttatgtccgctcaaagggcttaggtggtctgtcattcttcgatttaagttacgatgactttcgtggcacgtgcactggcgatagatatccattgttaaggactgtcaaatatcgcttatggacttatcttattccagaaacgaatttaaataaaaaataa。
32.内参基因evm.model.contig-actin，其dna序列如no.2所示，具体为：
33.atgattttgttggaaatcaataatcgtatagtggaagaaactcttctggttaaattccgcaatgccatagccggtctaaaaccagaatcaatagatgttaaaatagccgatttcgatggtgttttatttcatatatccaacataaatggtgataaaacaaaagttaggaccagcatttctttaaagttttaccaacaattacaagaacatggtgccgatgaattgctcaagcgtgaatatggtagtctcttaactgacacggaagatggctacaacgtatccgtacttattaatttagaagatataccctcagattgggaacaagtggctaaaaaaattggtctattaaagcgtaattgttttgcatcagtttttgaaaaatatttcgattttcaagaacaaggtgaagagggacaaaagcgtgctgttatcaattatagaaatgatgagactttatatgttgaagccaaagcggatcgtgttactgttgtttttagtaccatattccgcgatgaagacgatgttgttataggtaaagtttttatgcaagaattaagagaaggtcgacgtgcatcgcatactgcaccacaagtgcttttttcccatcgtgaaccaccattggaattggctaatacggacgcaaaagtcggcgataatattggttatgttacatttgtgctctttccacgtcatactaataaggaaactagagataataccattaatttaatacatatgttccgagattatttacattaccacattaagtgttcaaaggcttatatacactctagaatgcgtgcaaaaacttcagactttttgaaagttctcaatcgtgcaagaccagaagctaaaaatatggaaaagaagactataacggggagaacatttatacgcaaagaatga。
34.选取棕尾别麻蝇不同发育日龄的蛹期样本进行转录组测序及差异表达分析。分子标记目的基因evm.model.contig 1.824在蛹期不同发育时期差异表达显著，内参基因evm.model.contig-actin在不同发育时期稳定表达。
35.实施例2
36.一种用于推算棕尾别麻蝇幼虫期发育时间的引物组合物，包括根据evm.model.contig 1.824目的基因设计的引物1.824-f和1.824-r，以及根据evm.model.contig-actin内参基因设计的引物actin-f和actin-r。
37.所述1.824-f的dna序列如no.3所示，具体为：tggaggtgacaaagacatcg。
38.所述1.824-r的dna序列如no.4所示，具体为：ttcgtaccattgtgtaggcg。
39.所述actin-f的dna序列如no.5所示，具体为：aagaacaaggtgaagagggac。
40.所述actin-r的dna序列如no.6所示，具体为：tcgtcttcatcgcggaatatg。
41.实施例3
42.一种用于推算棕尾别麻蝇幼虫期发育时间的试剂盒，包括实施例2的引物组合物，2xgreen pro taq hs premix(rox plus)、rnase free water。
43.实施例4
44.一种用于推算棕尾别麻蝇蛹期发育时间的试剂盒应用方法，包括以下步骤：
45.(1)棕尾别麻蝇不同发育时间蛹样本的采集与保存：
46.野外动物尸体中采集棕尾别麻蝇成虫，经形态学鉴定为棕尾别麻蝇后置于置于智
能人工气候箱(12l:12d、h:75％)、温度为25℃恒温条件下饲养，当发育进入蛹期时(50％的离食期幼虫进入白蛹期)，收集若干样本记为p1，此后每隔48h收集一次蛹期样本，分别记为p2，p3，p4，p5直至羽化，进行三个生物学重复。
47.(2)试验样品的前处理：
48.从上述实验中分别取p1，p2，p3，p4，p5棕尾别麻蝇蛹样本，并进行三个生物学重复(共15组样本)，各组取样样本号的具体信息详见表1。每次取样8-10只，放入超纯水浸泡，反复冲洗3次，再置于滤纸上吸干，然后将完整虫体分别移入1.5ml ep管内，进行唯一编号后置于﹣80℃保存。
49.表1：采样信息表
50.样本编测试虫态测试组织采蛹期日龄备注1组蛹期完整虫体长0dp12组蛹期完整虫体长0dp13组蛹期完整虫体长0dp14组蛹期完整虫体长2dp25组蛹期完整虫体长2dp26组蛹期完整虫体长2dp27组蛹期完整虫体长4dp38组蛹期完整虫体长4dp39组蛹期完整虫体长4dp310组蛹期完整虫体长6dp411组蛹期完整虫体长6dp412组蛹期完整虫体长6dp413组蛹期完整虫体长8dp514组蛹期完整虫体长8dp515组蛹期完整虫体长8dp5
51.3、rna的提取
52.从上述收集的棕尾别麻蝇p1，p2，p3，p4，p5不同发育时间组样本中分别取出1-3只蛹(具体根据虫体大小)，剥掉蛹壳，取出完整的蛹组织用手持研磨器研磨，然后进行rna的抽提，具体根据takara minibest universal rna抽提试剂盒(takara、日本)使用说明书进行操作；从提取的rna中选取1μl然后用nandrop2000仪器检测rna的提取质量，以进行后续实验。
53.4、cdna的合成
54.将上述提取的rna样本应用evo m-mlv反转录预混型试剂盒(rt mix kit with gdna clean for qpcr)(accurate biotechnology(hunan)co.,ltd)进行cdna的合成。
55.详细步骤如下：
56.1)去除基因组dna。按照下表配制好反应液，进行基因组dna去除反应。
57.组分名称加入量rna模板1μl5
×
gdna clean reaction mix2μl
rnase-free water7μl
58.反应条件：42℃2min，然后4℃降温保存；
59.2)反转录反应。按照下表配制好反应液，置于pcr仪进行变性、退火反应。
60.组分名称加入量步骤1)反应液10μl5
×
evo m-mlv rt reaction mix4μlrnase-freewater6μl
61.反应条件：37℃15min，85℃5sec，然后4℃降温保存；
62.5、qpcr扩增
63.根据green premix pro taq hs qpcr kit(rox plus)(accurate biotechnology(hunan)co.,ltd)试剂盒说明书进行qpcr扩增，其中qpcr反应体系(20μl体系)参见表2，反应程序参见表3。
64.表2：qpcr反应体系
[0065][0066][0067]
表3：qpcr反应程序
[0068][0069]
应用applied biosystems 7500实时荧光定量pcr仪，检测目的基因evm.model.contig 1.824及内参基因evm.model.contig-actin在棕尾别麻蝇不同蛹期日龄样本中的表达量。
[0070]
6、数据处理与分析
[0071]
利用originpro 2021(v9.8.0.200，教育版)软件进行数据处理、汇总分析后，最终内参基因evm.model.contig-actin在15组棕尾别麻蝇蛹期样本中的表达量较为稳定，目的基因evm.model.contig1.824在所有样本中的差异表达较为显著，以此绘制线性回归方程进行目的基因相对表达量与蛹期发育时间的分析如图3，红色实线为拟合回归方程，粉红色区域为90％置信区间，拟合方程如下。
[0072]
目的基因相对表达量与蛹期发育时间的拟合回归方程：
[0073]
y＝2.80744 2.49763*x
[0074]
y轴：蛹期日龄，单位：d；
[0075]
x轴：
△
ct，目的基因ct值-内参基因的ct值；
[0076]
statistics
[0077][0078][0079]
7、盲测实验验证：
[0080]
随机选取上述不定时间所取样本(详见表4)，rna提取及cdna合成后，采用实施例2的引物组合物，应用applied biosystems 7500实时荧光定量pcr仪检测，将得出的表达量代入上述线性回归方程，计算出的发育时间，具体结果参见表4。
[0081]
表4：随机选取2个时间点样本盲测验证
[0082]
实际取样时间(d)
△
ct预测蛹日龄预测上、下限(d)2-0.70651.37307-3.71281-6.4589481.502947.571651.34541-13.7979
[0083]
从表4的结果可知：计算的蛹的发育时间基本与实际取样时间相符(在误差允许范围内)，因而可以确认所述分子标记可以作为棕尾别麻蝇蛹期不同发育时间的推算。
[0084]
8、实际案例验证：
[0085]
在一实际死亡现场，温度25℃左右，我们从尸体上发现嗜尸性蝇类的蛹(图4)，经鉴定为棕尾别麻蝇，带回实验室后，rna提取及cdna合成，采用实施例2的引物组合物，应用applied biosystems7500实时荧光定量pcr仪检测，得出基因evm.model.contig 1.824的相对表达量
△
ct为0.51958，将得出的表达量代入线性回归方程y＝2.80744 2.49763*x，计算出蛹的发育时间为4.8d，在预测上、下限(d)的范围内(1.3-8.2)，查阅资料加上幼虫发育的时间6d，得出死亡时间为10.8d，预测的死亡时间上下范围为(7.3-14.2)。后经调查证实死者的实际死亡时间为11d，在预测范围内，因而证实所述分子标记可以作为棕尾别麻蝇蛹期不同发育时间的推算。