一种用于检测口蹄疫病毒抗体的蛋白及其应用

1.本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种用于检测口蹄疫病毒抗体的蛋白及其应用。


背景技术：

2.口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，fmdv)引起的口蹄疫(foot-and-mouth disease，fmd)是一种急性、热性、高度接触性传染病，传染对象主要为猪、牛、羊等偶蹄动物，易感动物多达70余种。fmd的临床症状主要表现为体温升高，口腔黏膜、舌面、鼻镜、蹄部、乳房、皮肤发生水泡和溃疡，发病率高，可极大削弱患病动物的生产能力，是危害全球畜牧养殖业发展的重大动物疫病之一。因为fmd的存在，相关易感动物的肉制品出口贸易数量会大幅下降，各国经济往来也会因此受到阻碍，这就使得fmd的防疫工作显得更为重要。
3.大多数国家防控口蹄疫的核心策略是强制接种灭活疫苗进行免疫预防，因此在临床检测中，如何正确区分“免疫与感染”是诊断的关键，这对于口蹄疫的防控十分重要，也是oie判定有无fmd流行的依据。fmdv的nsp(非结构蛋白)是在病毒的增殖过程中合成并释放的，机体免疫灭活疫苗后，理论上不产生针对nsp的抗体，因此nsp可用来做鉴别诊断。
4.现有检测口蹄疫病毒抗体的试剂盒，灵敏度和特异性还不能满足实际需要。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的在于提供一种用于检测口蹄疫病毒抗体的蛋白及其应用，灵敏度和特异性较高，可以鉴别是fmdv疫苗免疫还是自然感染。
6.为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
7.一种用于检测口蹄疫病毒抗体的蛋白，序列如seq id no:3所示。
8.编码权利要求1所述蛋白的基因。
9.在本发明中，所述基因的序列如seq id no:2所示。
10.本发明还提供包含所述基因的重组载体或细胞。
11.一种重组大肠杆菌菌株，所述重组大肠杆菌菌株含有携带权利要求2所述基因的表达载体，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no:m2020402，保藏日期为2020年8月7日。
12.本发明还提供所述蛋白在制备用于检测口蹄疫病毒的试剂或者用于预防和/或治疗口蹄疫病毒感染的药物中的用途。
13.一种口蹄疫病毒抗体竞争elisa检测试剂盒，所述试剂盒包括采用权利要求1所述蛋白包被的酶标板和检测抗体，所述检测抗体是保藏编号为cgmcc no.45034的杂交瘤细胞株fmdv-3b-1分泌的。
14.在本发明中，所述检测试剂盒中还包括二抗，所述二抗为hrp标记的羊抗鼠igg抗体。
15.在本发明中，还包括终止液和洗涤液，所述终止液为2m的硫酸水溶液，所述洗涤液
为含有吐温20的pbs缓冲液。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明建立的口蹄疫抗体竞争elisa试剂盒，是针对口蹄疫病毒非结构蛋白3b蛋白的抗体，3b蛋白参与rna病毒的起始合成和衣壳的形成，且3b蛋白在不同血清型的口蹄疫毒株之间高度保守，因此可以用于检测fmdv，尤其是可以鉴别是fmdv疫苗免疫还是自然感染产生的抗体。通过设计了大量的抗原，发现仅有seq id no：2所示的序列编码的抗原，不仅可以实现可溶性表达，而且可以作为包被抗原，配合本发明筛选的杂交瘤细胞株fmdv-3b-1分泌的单克隆抗体，对口蹄疫抗体实现高灵敏度、高特异性的检测。
附图说明
17.图1是重组表达载体pet-32a-fmdv-3b-opti的结构示意图。
18.图2是重组表达载体pet-32a-fmdv-3b-opti经ecor i和not i双酶切鉴定电泳图；泳道1：pet-32a-fmdv-3b-opti双酶切产物，泳道2：载体pet-32a双酶切产物。
19.图3为经iptg诱导后各重组菌裂解产物上清和沉淀的sds-page电泳图，m：蛋白marker；泳道1：重组菌bl21(de3)/pet-32a-fmdv-3b裂解产物上清；泳道2：重组菌bl21(de3)/pet-32a-fmdv-3b裂解产物沉淀；泳道3：重组菌bl21(de3)/pet-32a-fmdv-3b-opti裂解产物上清；泳道4：重组菌bl21(de3)/pet-32a-fmdv-3b-opti的裂解产物沉淀。
20.图4是iptg浓度对fmdv-3b-opti蛋白表达影响的sds-page鉴定图；m：蛋白marker；泳道1：0.3mm iptg诱导浓度；泳道2：0.4mm iptg诱导浓度；泳道3：0.5mm iptg诱导浓度；泳道4：0.6mm iptg诱导浓度；泳道5：0.7mm iptg诱导浓度；泳道6：0.8mm iptg诱导浓度；泳道7：0.9mm iptg诱导浓度；泳道8：1mm iptg诱导浓度。
21.图5是纯化的重组fmdv-3b-opti电泳图，其中泳道1是重组菌bl21(de3)/pet-32a-fmdv-3b-opti裂解液上清；泳道2是纯化过程中的蛋白滤液；泳道3是纯化后的重组fmdv-3b-opti。
22.图6杂交瘤细胞株fmdv-3b-1制备的单克隆抗体的western blot鉴定图，m是蛋白marker。
23.图7显示了本发明试剂盒与商品化试剂盒的检测结果对比。
具体实施方式
24.鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.在如下实施例中，若非特别说明，则所使用的试剂、设备、实验操作、检测方式等均是本领域已知的，例如可以参考但不限于《分子生物学实验手册》(马文丽主编，人民军医出版社，2011年出版)等工具书。
26.实施例1：表达fmdv-3b-opti蛋白的基因工程重组大肠杆菌构建
27.fmdv-3b-opti蛋白基因的获取：通过对asia 1型口蹄疫病毒ind 151-94株3b基因所编码的氨基酸(seq id no:1，genbank登录号：dq989303.1)进行分析和筛选，并根据大肠
杆菌密码子使用的偏嗜性规律，进行密码子优化设计，得到抗原基因片段fmdv-3b-opti(seq id no:2)，在该抗原基因片段两端分别加上ecor i和not i限制性内切酶识别位点，委托生物科技公司进行合成。fmdv-3b-opti片段所编码的蛋白命名为fmdv-3b-opti蛋白，序列如seq id no:3所示。
28.fmdv-3b-opti基因原核表达载体构建：使用限制性内切酶ecor i和not i对原核表达载体pet-32a进行酶切，回收载体骨架，并将合成的基因片段和载体骨架进行连接，得到重组表达载体pet-32a-fmdv-3b-opti(结构示意图如图1所示)。重组表达载体pet-32a-fmdv-3b-opti经ecor i和not i酶切之后，经琼脂糖凝胶电泳鉴定可观察到5.9kb大小的载体条带和141bp大小的目的条带，而pet-32a空载体酶切后仅观察到5.9kb大小的载体条带(见图2)。将重组表达载体pet-32a-fmdv-3b-opti进一步转化到bl21(de3)感受态细胞，获得的重组菌命名为bl21(de3)/pet-32a-fmdv-3b-opti。
29.将fmdv-3b蛋白的编码基因(genbank:dq989303.1)序列插入pet-32a，然后导入bl21(de3)感受态细胞，获得的重组菌命名为bl21(de3)/pet-32a-fmdv-3b。
30.重组菌bl21(de3)/pet-32a-fmdv-3b-opti的保藏信息如下：
31.保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，
32.地址：中国，武汉，武汉大学，
33.分类命名：大肠杆菌bl21(de3)/pet-32a-fmdv-3b-opti，
34.escherichia coli bl21(de3)/pet-32a-fmdv-3b-opti，
35.保藏日期：2020年8月7日。
36.保藏编号：cctcc no:m2020402。
37.实施例2：重组蛋白fmdv-3b-opti的原核表达和纯化
38.将培养至对数生长期的重组菌bl21(de3)/pet-32a-fmdv-3b-opti按照接种量为1:100的比例(v/v)接种于添加了100μg/ml氨苄青霉素(amp)的lb培养基中，220r/min振荡培养至菌液od
600nm
为在0.5，加入终浓度为0.6mmol/l的iptg，在37℃进行诱导表达，4h后收集细菌，用pbs(ph 7.2)洗涤2次后重悬菌体沉淀，然后在60hz、间隔3s的条件下进行超声破碎，离心分离上清和沉淀，分别进行sds-page分析。
39.另外，采用bl21(de3)/pet-32a-fmdv-3b-opti的相同方法诱导重组菌bl21(de3)/pet-32a-fmdv-3b表达fmdv-3b蛋白，超声破碎诱导表达后的重组菌，离心分离上清和沉淀，分别进行sds-page分析。
40.结果如图3。重组菌bl21(de3)/pet-32a-fmdv-3b-opti裂解物上清在25kda出现了特异性的条带，说明fmdv-3b-opti蛋白实现了可溶性表达。bl21(de3)/pet-32a-fmdv-3b的裂解物沉淀在29kda处出现了大量的包涵体，上清中几乎没有目标蛋白表达。
41.将bl21(de3)/pet-32a-fmdv-3b-opti菌液接种于含有amp(100μg/ml)的lb液体培养基中，培养至菌液od
600nm
值为0.5，在37℃诱导表达5h，分别考察iptg诱导浓度为0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1mm对蛋白表达的影响。诱导结束后，分别取1ml菌液离心，然后采用1ml的pbs缓冲液重悬，采用超声裂解(功率60hz，裂解3s，间隔3s)，离心，分别取裂解液上清和沉淀，进行sds-page鉴定，确定最佳诱导条件。结果如图4，在iptg的诱导浓度为0.7mm时，蛋白的表达量最大。
42.由于bl21(de3)/pet-32a-fmdv-3b-opti表达的重组蛋白fmdv-3b-opti携带his标
签，因此，将诱导表达后的重组菌bl21(de3)/pet-32a-fmdv-3b-opti裂解液上清，利用ni-nta亲和层析介质纯化重组蛋白fmdv-3b-opti。纯化完成后收集蛋白滤液(杂蛋白)和洗脱液(是纯化后的蛋白)，与蛋白原液(裂解液上清)进行sds-page鉴定。结果如图5，泳道3在25kda处有单一的蛋白条带，表明获得了纯化重组蛋白fmdv-3b-opti。
43.实施例3重组蛋白fmdv-3b-opti作为抗原制备其单克隆抗体
44.将实施例2纯化后所得重组蛋白fmdv-3b-opti和弗氏完全佐剂按照体积比为1:1混合，乳化，然后对balb/c小鼠进行首次免疫，免疫剂量为100mg(蛋白)/只；将重组蛋白fmdv-3b-opti和弗氏不完全佐剂按照体积比为1:1混合乳化，首免后14天对小鼠进行第二次免疫，免疫剂量为50mg(蛋白)/只。并以携带gst蛋白标签的fmdv-3b-opti蛋白(将fmdv-3b-opti编码基因插入pgex-6p-1中，然后导入bl21(de3)感受态细胞中，所得重组菌采用iptg诱导表达后，采用gst融合蛋白纯化介质纯化后所得)作为包被抗原建立elisa检测方法，实验条件：蛋白(携带gst蛋白标签的fmdv-3b-opti蛋白)采用包被液(称取1.59g的na2co3，2.93g的nahco3，用超纯水溶解并定容至1l)稀释至4μg/ml，在酶标板的每孔中加入100μl，4℃包被过夜。次日取出，用洗涤液(浓度为0.01m、ph7.4的pbs缓冲液中加入0.05％的tween-20)洗净、拍干；每孔加入100μl浓度为1％(质量百分浓度)的明胶水溶液，37℃封闭2h，用洗涤液洗净、拍干；待检血清采用洗涤液按如下稀释度进行梯度稀释：1:200、1:400
…
1:25600、151200，每孔加入100μl，37℃孵育1h后，采用洗涤液洗净、拍干；每孔加入采用洗涤液按照稀释度为1:10000稀释的羊抗鼠hrp酶标抗体(购自bioworld，产品编号bs12478)100μl，37℃孵育1h，用洗涤液洗净、拍干；每孔加入100μl的tmb显色液，37℃孵育15min；每孔加入100μl的2m硫酸水溶液终止反应，在波长为450nm下测定od
450nm
值，按照常规方法计算效价。待小鼠血清抗体经上述elisa方法检测，效价达到1:10000以上，采集小鼠脾细胞与事先培养好的sp2/0细胞进行融合，同样使用上述elisa方法对融合细胞进行筛选，获得分泌抗口蹄疫病毒3b蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株fmdv-3b-1。将杂交瘤细胞株fmdv-3b-1打入石蜡致敏的balb/c小鼠腹腔内制备腹水，经protein g纯化，得到该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
45.采用western blot鉴定杂交瘤细胞株fmdv-3b-1分泌的单克隆抗体特异性。将fmdv-3b-opti基因克隆至真核表达载体pegfp-c1中，将获得的真核表达质粒转染入293t细胞中，48h后收集细胞样进行sds-page电泳，然后转印在nc膜上，杂交瘤细胞株fmdv-3b-1分泌的单克隆抗体作为一抗，羊抗鼠hrp酶标抗体(购自bioworld，产品编号bs12478)为二抗，进行western blot鉴定，结果如图6所示，杂交瘤细胞分泌的抗体能与重组蛋白fmdv-3b-opti发生特异性结合，在约20kda处有特异性的发光条带，说明了杂交瘤细胞株fmdv-3b-1分泌的单克隆抗体可以特异性结合重组蛋白fmdv-3b-opti。
46.保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，
47.地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，
48.参椐的生物材料(株)：fmdv-3b-1，
49.建议的分类命名：分泌抗口蹄疫病毒3b蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，
50.保藏日期：2022年1月19日，
51.保藏编号：cgmcc no.45034。
52.实施例4口蹄疫病毒抗体竞争elisa检测试剂盒和检测方法的建立
53.1.口蹄疫病毒抗体竞争elisa检测试剂盒(缩写为本发明试剂盒)
54.(1)采用重组蛋白fmdv-3b-opti包被的酶标板
55.配制包被液和洗涤液。包被液：称取1.59g的na2co3，2.93g的nahco3，用超纯水溶解并定容至1l。洗涤液：浓度为0.01m、ph 7.4的pbs缓冲液中加入0.05％(体积百分浓度)的tween-20。
56.采用包被液配制浓度为5μg/ml的重组蛋白fmdv-3b-opti溶液，在酶标板的每孔中加入100μl，4℃包被过夜。次日取出，用洗涤液洗净、拍干；每孔加入100μl浓度为1％(质量百分浓度)的明胶水溶液，37℃封闭2h，用洗涤液洗净、拍干，得到了采用重组蛋白fmdv-3b-opti包被的酶标板。
57.(2)抗体
58.检测抗体溶液是浓度为0.5μg/ml的杂交瘤细胞株fmdv-3b-1分泌的单克隆抗体。该单克隆抗体的制备方法同实施例3。
59.二抗：hrp标记的羊抗鼠igg抗体，购买来源bioworld，产品编号bs12478。
60.(3)阳性对照和阴性对照
61.阳性对照：阳性对照是兔源多克隆抗体血清，制备方法如下：采用重组蛋白fmdv-3b-opti免疫兔，然后采血、分离血清，采用如下elisa法检测制备血清的效价：以携带gst蛋白标签的fmdv-3b-opti蛋白(将fmdv-3b-opti编码基因插入pgex-6p-1中，然后导入bl21(de3)感受态细胞中，所得重组菌采用iptg诱导表达后，采用gst融合蛋白纯化介质纯化后所得)作为包被抗原建立elisa检测方法，实验条件：蛋白(携带gst蛋白标签的fmdv-3b-opti蛋白)采用包被液(称取1.59g的na2co3，2.93g的nahco3，用超纯水溶解并定容至1l)稀释至4μg/ml，在酶标板的每孔中加入100μl，4℃包被过夜。次日取出，用洗涤液(浓度为0.01m、ph 7.4的pbs缓冲液中加入0.05％的tween-20)洗净、拍干；每孔加入100μl浓度为1％(质量百分浓度)的明胶水溶液，37℃封闭2h，用洗涤液洗净、拍干；待检血清采用洗涤液按如下稀释度进行梯度稀释：1:200、1:400
…
1:25600、151200，每孔加入100μl，37℃孵育1h后，采用洗涤液洗净、拍干；每孔加入采用洗涤液按照稀释度为1:10000稀释的羊抗兔hrp酶标抗体(购买来源bioworld，产品编号bs13278)100μl，37℃孵育1h，用洗涤液洗净、拍干；每孔加入100μl的tmb显色液，37℃孵育15min；每孔加入100μl的2m硫酸水溶液终止反应，在波长为450nm下测定od
450nm
值，按照常规方法计算效价，血清效价达到1:12800。
62.阴性对照：口蹄疫病毒抗体阴性的兔血清。
63.(4)tmb显色液
64.tmb显色液购买来源solarbio，货号pr1200。
65.(5)终止液
66.终止液是浓度为2m的硫酸水溶液。
67.2.口蹄疫病毒抗体竞争elisa检测方法的建立
68.采用本发明试剂盒建立检测方法。
69.将60μl临床血清样品(s)采用洗涤液稀释50倍，然后与浓度为0.5μg/ml的杂交瘤细胞株fmdv-3b-1分泌的单克隆抗体在微量板中按照体积比为1:1混匀，37℃孵育1h后吸取100μl到采用重组蛋白fmdv-3b-opti包被的酶标板的每个样品检测孔内，37℃孵育1h，采用洗涤液洗净、拍干；设置2个阳性对照孔(pc)，2个阴性对照孔(nc)；阳性对照孔以兔源多克
隆抗体血清与杂交瘤细胞株fmdv-3b-1分泌的单克隆抗体的混合物(制备方法同血清样品)替代临床血清样品与杂交瘤细胞株fmdv-3b-1分泌的单克隆抗体的混合物，其他同样品检测孔；阴性对照孔(nc)以口蹄疫病毒抗体阴性的兔血清与杂交瘤细胞株fmdv-3b-1分泌的单克隆抗体的混合物(制备方法同血清样品)替代临床血清样品与杂交瘤细胞株fmdv-3b-1分泌的单克隆抗体的混合物，其他同样品检测孔。每孔加入采用洗涤液按照稀释度为1:5000稀释的hrp标记的羊抗鼠igg抗体100μl，37℃孵育1h，用洗涤液洗净、拍干；每孔加入100μl的tmb显色液，37℃孵育15min；每孔加入100μl的2m硫酸水溶液终止反应，在波长为450nm下测定od
450nm
值，根据如下公式计算抑制率i％：i％＝(od
nc-ods)/(od
nc-od
pc
)
×
100％，其中od
nc
为阴性对照孔检测值，ods为样品检测孔检测值，od
pc
为阳性对照孔检测值。
70.采用上述方法对30份fmdv牛阴性血清(样品)进行检测，计算血清抑制率。根据统计学方法，按公式：对检测结果进行分析，为所测得30份fmdv牛阴性血清抑制率的平均值，sd为所测的阴性血清抑制率的标准方差。根据结果(表1)，sd＝4.46，所以阴阳性临界值为为了判定更为清晰，设定待检血清的抑制率(i％)≧40％时，待检血清判断为阳性，待检血清的抑制率(i％)《40％时，待检血清判断为阴性。
71.表1 30份牛阴性血清的检测结果
72.牛阴性血清序号i％牛阴性血清序号i％牛阴性血清序号i％122.171134.552118.77222.351227.652221.28319.761320.752323.79429.171421.752426.3523.741522.752528.81626.731623.752631.32725.321726.172728.95821.31821.322818.75923.851923.892918.751026.42026.463011.04
73.实施例5口蹄疫抗体竞争elisa检测试剂盒的性能
74.分别购自青岛立见生物科技有限公司、山东绿都生物科技有限公司和真瑞生物科技有限公司的口蹄疫非结构蛋白抗体elisa试剂盒作为对照试剂盒，命名为试剂盒1(青岛立见生物科技有限公司)、试剂盒2(山东绿都生物科技有限公司)和试剂盒3(真瑞生物科技有限公司)。利用本发明试剂盒对128份临床牛血清样品(经试剂盒1、2和3检测均为阴性)进行检测，样品抑制率均＜40％，与试剂盒1、2和3检测结果符合率为100％。试剂盒1、2和3对阴阳性判定的临界值：血清的抑制率≧50％，为阳性；血清的抑制率＜50％，为阴性。
75.将同一待检血清样品(重组蛋白fmdv-3b-opti免疫后获得的兔源多克隆抗体血清)，采用本发明试剂盒中的洗涤液按照稀释度为1:200～1:12800的梯度倍比稀释，然后分别用本发明试剂盒和试剂盒1、2和3进行检测，在波长为450nm处读取od
450nm
值，计算抑制率。
76.结果如图7，在相同血样品清检测中，本发明试剂盒在血清样品稀释度为1:12800
时，仍然为阳性。试剂盒1、2和3对该相同样品检测时，在稀释度为1:3200时，抑制率大于50％，为阳性，但是抑制率显著低于本发明试剂盒；在稀释度为1:6400时，为阴性，且抑制率显著低于本发明试剂盒。上述结果说明，本发明试剂盒具有更高的灵敏度。
77.采用本发明试剂盒对猪流行性腹泻病毒阳性血清、猪伪狂犬病毒阳性血清、塞内卡病毒阳性血清、口蹄疫病毒抗体阴性猪血清、口蹄疫病毒抗体阴性牛血清、口蹄疫病毒抗体阴性羊血清和口蹄疫病毒抗体阴性兔血清进行检测，结果均为阴性。该实验结果说明，本发明试剂盒特异性高。