一株皇簇菇菌株的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，具体是一株皇簇菇菌株。


背景技术：

2.田头菇别名春生田头菇或早生田头菇，在我国华南、华北广泛分布，在北美、欧洲各地亦较为常见。田头菇是一个由至少5种以上的生物学类型组成的种群，包括草腐型、针叶木腐型、阔叶木腐型和城市生境型等。我国田头菇属菌类资源丰富，具有独特的口感风味，以及丰富的营养成分，较高的药用价值和商品价值。优良的菌种能提高田头菇的质量，大大提高其营养价值，但是现在市面销售的田头菇中基本检测不到维生素d的存在，同时无法进一步提高田头菇中氨基酸的含量。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一株皇簇菇菌株，以至少达到提高其维生素d、钙含量及氨基酸含量，进一步提高其营养价值。
4.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明从任意一种田头菇属的组织分离获得，对其进行鉴定，该菌株命名为田头菇属zozo-xw-b皇簇菇(agrocybe smithiizozo-xw-b皇簇菇)，属于粪锈伞科(bolbitiacea)，田头菇属(agrocybe)；于2021年6月 11日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2021715。
5.所述皇簇菇菌株由田头菇经过试管培养基斜面培养得到，具体的培养方法包括以下步骤：
6.a1：选取一株七成熟的田头菇属菌株，其后用无菌水冲洗3次后备用；
7.a2：将步骤a1中清洗后的菌株用75％的酒精浸泡7s；
8.a3：用无菌纱布擦干步骤a2中浸泡后的菌株表面的酒精及水分；
9.a4：将步骤a3中擦干后的菌株通过烟雾灭菌剂灭菌15min；
10.a5：取出步骤a4中灭菌后的菌株置于超净工作台上，用解剖刀剖开菌株，在菌柄与菌盖的交界处挑出0.1mm的菌块；
11.a61：选取新鲜土豆去皮洗净后切片，向切好的200g土豆片中加入50g任意一种或多种蘑菇，同时加入500g桑树枝，将所述土豆片、蘑菇和桑树枝加入容器中；
12.a62：向步骤a61中所述的容器中加纯净水直至淹没所述土豆片、蘑菇和桑树枝，其后进行加热，煮沸后继续保持煮沸状态0.5h；
13.a63：将步骤a62最终得到的产物过滤，取1l滤液备用；
14.a64：向步骤a63中所述滤液中加入20g琼脂、20g蜂蜜、10g葡萄糖、1个鸡蛋黄、0.5g 磷酸二氢钾和0.5g硫酸镁；
15.a65：将步骤a64中得到的最终产物装入试管中，灭菌后得到试管培养基；
16.a7：将步骤a5中挑出的菌块在步骤a65中得到的试管培养基中进行培养，其后选取无污染的培养后得到的菌株连续纯化3次，得到皇簇菇菌株。
17.本发明的有益效果是：用该菌株培养得到的皇簇菇(agrocybe smithii zozo-xw-b皇簇菇)营养价值高，含有丰富的维生素、氨基酸及微量元素，尤其是维生素d及钙含量特别高，维生素d含量达44.1μg/100g，钙含量高达78.5mg/kg；且重金属含量符合gb 3762-2017食品安全国家标准食品中污染物限量。
具体实施方式
18.下面进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
19.实施例
20.本发明从任意一种田头菇属的组织分离获得，该菌株命名为田头菇属zozo-xw-b皇簇菇(agrocybe smithii zozo-xw-b皇簇菇)，属于粪锈伞科(bolbitiacea)，田头菇属(agrocybe)；于2021年6月18日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2021715；所述皇簇菇菌株由田头菇经过试管培养基斜面培养得到，具体的培养方法包括以下步骤：
21.a1：选取一株七成熟的田头菇属菌株，其后用无菌水冲洗3次后备用；
22.a2：将步骤a1中清洗后的菌株用75％的酒精浸泡7s；
23.a3：用无菌纱布擦干步骤a2中浸泡后的菌株表面的酒精及水分；
24.a4：将步骤a3中擦干后的菌株通过烟雾灭菌剂灭菌15min；
25.a5：取出步骤a4中灭菌后的菌株置于超净工作台上，用解剖刀剖开菌株，在菌柄与菌盖的交界处挑出0.1mm的菌块；
26.a61：选取新鲜土豆去皮洗净后切片，向切好的200g土豆片中加入50g任意一种或多种蘑菇，同时加入500g桑树枝，将所述土豆片、蘑菇和桑树枝加入容器中；
27.a62：向步骤a61中所述的容器中加纯净水直至淹没所述土豆片、蘑菇和桑树枝，其后进行加热，煮沸后继续保持煮沸状态0.5h；
28.a63：将步骤a62最终得到的产物过滤，取1l滤液备用；
29.a64：向步骤a63中所述滤液中加入20g琼脂、20g蜂蜜、10g葡萄糖、1个鸡蛋黄、0.5g 磷酸二氢钾和0.5g硫酸镁；
30.a65：将步骤a64中得到的最终产物装入试管中，灭菌后得到试管培养基；
31.a7：将步骤a5中挑出的菌块在步骤a65中得到的试管培养基中进行培养，其后选取无污染的培养后得到的菌株连续纯化3次，得到皇簇菇菌株。
32.对本发明涉及的皇簇菇菌株进行鉴定，鉴定步骤如下：
33.1、皇簇菇dna的提取
34.s1：从平板上刮取样品置于2ml离心管，加入200μl缓冲液ga，振荡至菌体彻底悬浮；
35.s2：向管中加入20μl proteinase k溶液，混匀；
36.s3：加入220μl缓冲液gb,振荡15sec，70℃放置10min至溶液变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
37.s4：加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
38.s5：将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)， 12,000rpm(～13,400
×
g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中；
39.s6：向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm(～13,400
×
g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中；
40.s7：向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw(使用前先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm(～13,400
×
g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中；
41.s8：重复操作步骤s7；
42.s9：将吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3至于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；
43.s10：将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50～200μl洗脱缓冲液te,室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min，将溶液收集到离心管中。
44.【注意：步骤s1中加入溶壁酶进行破壁处理，具体方法为：加入180μl缓冲液(20mm tris,ph 8.0；2mm na2-edta；1.2％trise；终浓度为20mg/ml的溶壁酶，37℃处理30min以上；
45.步骤s9的目的是将吸附柱中残留的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切，pcr等)实验；步骤s10中洗脱缓冲液的体积不应少于50μl，体积过小影响回收率。洗脱液的ph值对于洗脱效率有很大影响。若用ddh2o做洗脱液应保证其ph值在 7.0-8.5范围内，ph值低于7.0会降低洗脱效率；且dna产物应保存在-20℃，以防dna降解，为增加基因组dna的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱cb3中，室温放置2min， 12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min。】
46.2、基因组pcr扩增
47.在0.2ml离心管中加入表1中的成分，轻弹混匀，瞬时离心收集管壁上的液滴至管底,在 pcr扩增仪上进行pcr反应，反应参数表2所示，反应完成后，取3ulpcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。确认pcr扩增片段；引物的序列编号如表3所示。
48.表1：pcr扩增反应体系
49.试剂体积基因组dna(20ng/ul)1.0ul10
×
buffer(含2.5mm mg2 )5.0ultaq聚合酶(5u/μl)1.0uldntp(10mm)1.0ulits1引物(10um)1.5ulits4引物(10um)1.5ulddh2o39.0ul总体积50.0ul
50.表2：pcr扩增反应程序
[0051][0052]
表3：引物设计
[0053][0054]
3、pcr产物的回收
[0055]
pcr产物用axyprep dna凝胶回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行，步骤如下：
[0056]
b1：在紫外灯下切下含有目的dna的琼脂糖凝胶放入干净的离心管中，称取重量；
[0057]
b2：加入3个凝胶体积的buffer de-a，混合均匀后于75℃加热直至凝胶块完全熔化；
[0058]
b3：加0.5个buffer de-a体积的buffer de-b，混合均匀；当分离的dna片段小于400bp 时，加入1个凝胶体积的异丙醇；
[0059]
b4：将混合液，转移到dna制备管12,000
×
g离心1min。弃滤液。
[0060]
b5：将制备管置回2ml离心管，加500μl buffer w1，12,000
×
g离心30b，弃滤液；
[0061]
b6：将制备管置回2ml离心管，加700μl buffer w2，12,000
×
g离心30b，弃滤液；以同样的方法再用700μl buffer w2，12,000
×
g离心1min；
[0062]
b7：将制备管置回2ml离心管中，12,000
×
g离心1min；
[0063]
b8：将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加25-30μl去离子水，室温静置1min。12,000
×
g离心1min洗脱dna。
[0064]
4、序列测定
[0065]
取各个菌种纯化后的pcr产物，使用测序仪abi3730-xl进行dna测序。
[0066]
5、序列分析
[0067]
用ncbi blast程序将拼接后的序列文件与ncbi核酸数据库中的数据进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种信息，即为鉴定结果，与数据库中现有的agrocybe smithii 的各个菌株相应的一致性(identities)最接近，所以该菌株鉴定为agrocybe smithii，详细的比对结果见鉴定报告。
[0068]
表4：样品ncbi对比结果
[0069][0070]
表5：主要实验仪器及生产厂家
[0071][0072]
表5：主要实验试剂、耗材及生产厂家
[0073][0074][0075]
6、将皇簇菇送至四川省农业科学院分析测试中心进行检测，检测结果如表6、表7所示
[0076]
表6：四川省农业科学院分析测试中心检测结果1
[0077][0078][0079]
表7：四川省农业科学院分析测试中心检测结果2
[0080]
检测项目、单位标准值实测值(检出限)判定检验依据镉，ma/kg≤0.20.047符合gb5009.15-2014
总汞，mg/kg≤0.10.053符合gb5009.17-2014第一篇第一法铅，mg/kg≤1.00.0262符合gb5009.12-2017第二法砷，mg/kg≤0.50.036符合gb5009.11-2014第一篇第二法
[0081]
对比例
[0082]
以市面现有田头菇、松茸为对比例，检测其营养物质含量，具体检测结果如表8、表9所示。
[0083]
表8：市面贩售田头菇营养物质含量
[0084][0085][0086]
表9：市面贩售松茸营养物质含量
[0087][0088][0089]
对比表6和表8可知，皇簇菇对比现有的田头菇，检测出了含有维生素d，且含量高达 44.1μg/100g，检测出了γ-氨基丁酸，其他氨基酸：天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、络氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸以及精氨酸的含量都不同幅度地高于现有的田头菇的含量，钙含量高达77.5mg/kg，是现有田头菇钙含量的两倍有余。
[0090]
对比表6和表9，市面贩售的松茸的氨基酸含量基本都高于本发明所述的皇簇菇的氨基酸含量，但本发明所述的皇簇菇中检测出了γ-氨基丁酸、维生素d，且维生素d的含量为 44.1μg/100g，钙含量也高于松茸中的钙含量，为松茸中钙含量的蛋氨酸的含量高于市面贩售的松茸的蛋氨酸的含量。
[0091]
综上：本发明的皇簇菇相比现有田头菇，含有的氨基酸含量绝大部分增加，且增幅
较大；且同时新增了γ-氨基丁酸和维生素d，且维生素d的含量高达44.1μg/l00g；钙铁锌等元素含量也均增加；对比表6和表9，相比松茸，皇簇菇中含有的氨基酸含量虽然较低，但其含有高含量的维生素d及钙。本发明中的皇簇菇是一种高钙、高维生素的菌类。
[0092]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。