一种早期鉴别红橙变异植株的分子标记及其应用

1.本技术涉及植物分子鉴定技术领域，尤其涉及一种早期鉴别红橙变异植株的分子标记及其应用。


背景技术：

2.红橙，是芸香科柑橘属下甜橙的一个栽培品种植物，原由廉江市内的红江农场培育成功。红橙是一个变异单株，是甜橙和红桔的嫁接嵌合体，属嫁接嵌合体变异。红橙在生长发育过中会出现橙型的红肉果、黄肉果、红黄肉嵌合果以及桔型的桔变果、嵌合桔变果等5种变异果实，极少情况下五种果实会在同一植株上同时出现，更多的是同一植株结一种或两种类型果实。五种果实中，橙型红肉果为商品果，其品质优、数量多、商品性好，为红橙的代表类型，而其他四种均为非商品果。
3.因此，如何早期对红橙苗进行鉴定并筛选出橙型红肉果类型植株进行培育是本领域亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本技术的目的在于提供一种早期鉴别红橙变异植株的分子标记及其应用，以在一定程度上解决上述技术问题之一。
5.第一方面，本技术实施例公开了一种早期鉴别红橙变异植株的分子标记，所述分子标记为甜橙cs3g14240基因，位于三号染色体第18641380-18646722之间，其核苷酸序列如seq id no:1所示。
6.第二方面，本技术实施例提供了一组用于扩增第一方面分子标记seq id no:1序列的引物对，其序列如下：
7.p1：如seq id no:2所示；
8.p2:seq id no:3所示。
9.第三方面，本技术实施例提供了一种早期鉴别红橙变异植株的方法，包括以下步骤：
10.提取早期红橙苗待检样品总rna；
11.以mrna为模板，逆转录成cdna；
12.以第二方面所述引物对对cdna进行pcr扩增，获得pcr产物；
13.对pcr产物进行分析，从而鉴定早期红橙变异植株类型，筛选出橙型红肉果类型的植株；
14.培育筛选的红肉果类型植株，进行培育，并对筛选的结果进行验证。
15.第四方面，本技术实施例提供了第一方面所述分子标记的筛选方法，包括以下步骤：
16.对红橙橙型红肉果、橙型黄肉果和橘变果三个样品组进行转录组分析；
17.通过韦恩图分析，找出橙型红肉果、橙型黄肉果和橘变果三个样品组中共有或独
有的差异基因；
18.筛选差异基因，并对差异基因进行表达分析，在橙型红肉果表达量最大的差异基因即为第一方面所述分子标记。
19.具体的实施例中，所筛选出的差异基因，均为上调基因，即该基因在转录成mrna时受到正向调控，促进表达。
20.与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果之一：
21.本技术中涉及一种早期鉴别红橙变异植株的分子标记及其应用，通过所述分子标记可以达到早期鉴定红橙橙型红肉果和其他变异株型，该鉴定方法简单、快速，准确，对红橙苗育种及针对变异株型进行早期干预有积极作用。
附图说明
22.图1为本技术实施例提供的橙型红肉果、橙型黄肉果和橘变果三个样品组差异基因韦恩分析图。
23.图2为本技术实施例提供的分子标记基因在橙型红肉果、橙型黄肉果和橘变果相对表达量结果图。
24.图3为本技术实施例提供的针对pcr扩增产物分析的电泳图。
具体实施方式
25.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。本技术中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
26.早期鉴别红橙变异植株的分子标记的筛选
27.红橙植株的生长发育，会发生不同程度的分离变异，其果实可分离为橙型红肉果(hc)及变异株型：橙型黄肉果(cb)、橘变果(jb)及他们的嵌合果等。
28.(1)通过对橙型红肉果(hc)、橙型黄肉果(cb)和橘变果(jb)三个样品组进行转录组分析。
29.(2)通过韦恩图分析，找出橙型红肉果、橙型黄肉果和橘变果三个样品组中共有或独有的差异基因。
30.(3)筛选差异基因(为上调基因，即该基因在转录成mrna时受到正向调控，促进表达)，并对差异基因进行表达分析，在橙型红肉果表达量最大的差异基因即为第一方面所述分子标记。
31.结果：如表1所示，橙型红肉果(hc)、橙型黄肉果(cb)和橘变果(jb)三个样品组的差异基因较多，其中橙型红肉果(hc)和橘变果(jb)之间差异基因总数最多，达5156个，多数为下调基因(即该基因在转录成mrna时受到负向调控，抑制表达)，为3538个；其次是橙型黄肉果(cb)与橘变果(jb)之间，差异基因总数也达5052个；橙型红肉果(hc)与橙型黄肉果(cb)差异最小，其差异基因总数为1673个，上调的只有358个。
32.表1
[0033][0034]
通过韦恩图直观展示不同比较组合间差异基因的重叠情况，如图1所示，筛选8个差异基因(为上调基因)作为候选分子标记(g1～g8)。
[0035]
对g1～g8进行表达分析，其中g4在橙型红肉果(hc)表达量最大,即为第一方面所述分子标记，所述分子标记核苷酸序列如eq id no:1所示，为甜橙cs3g14240基因，位于三号染色体第18641380-18646722之间。
[0036]
分子标记在早期鉴别红橙变异株型的应用
[0037]
1.红橙苗样品
[0038]
本实施例使用了8个早期红橙苗叶片样品，分别编号1～8，样品来源于广东省湛江市廉江市红橙果园。
[0039]
2.红橙苗叶片总rna的提取
[0040]
(1)称取50mg红橙苗叶片样品，用1ml trizol试剂对组织进行裂解。
[0041]
(2)将上述trizol裂解液转入ep管中，在室温(15～30℃)下放置5分钟。
[0042]
(3)在上述ep管中，加入0.2ml氯仿，盖上ep管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下(15～30℃)放置2～3分钟后，12000g(2～8℃)离心15分钟。
[0043]
(4)取上层水相置于新ep管中，加入0.5ml异丙醇，在室温下(15～30℃)放置10分钟后，12000g(2～8℃)离心10分钟。
[0044]
(5)取上清液，按照每1ml trizol加1ml 75％乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g(2～8℃)离心5分钟，弃上清液。
[0045]
(6)将沉淀的rna置于室温下自然干燥；用rnase-free water溶解rna沉淀。
[0046]
3.以mrna为模板，逆转录成cdna。
[0047]
(1)在0.5ml微量离心管中，加入总rna2μg，在管中加入1μl oligodt(18)(10μm)、1μl dntp mix(10mm)，再加入无rna酶的ddh2o至总体积15μl，混匀。
[0048]
(2)将离心管置于65℃保温5分钟后，置于冰上。
[0049]
(3)向离心管中加入4μl 5
×
first-strand buffer，1μl逆转录酶，混匀。
[0050]
(4)将离心管置于42℃孵育1h。
[0051]
(5)将离心管置于于70℃加热15min以终止反应。
[0052]
(6)将管插入冰中，加入1μlrnase h，37℃孵育20min，降解残留的rna，-20℃保存备用。
[0053]
4.以第二方面所述引物对对cdna进行pcr扩增，获得pcr产物。
[0054]
5.对pcr产物进行分析，从而鉴定早期红橙变异植株类型，筛选出橙型红肉果类型的植株；
[0055]
6.培育筛选的红肉果类型植株，进行培育，并对筛选的结果进行验证。
[0056]
结果：分别对8组pcr扩增产物进行分析，如表1所示。
[0057]
表1
[0058]
编号12345678pcr产物明显明显无无明显明显明显明显
[0059]
从表中可以看出，编号为1、2、5～8的样品，通过上述操作后，可以得到明显的pcr扩增产物，因此，上述编号的早期红橙苗可鉴定为红肉果型(hc)。
[0060]
将编号1～8的红橙苗培育出果实，区分出红肉果与其它变异株型，与表1结果进行对比，验证准确性为100％。
[0061]
综上所述，本技术中涉及一种早期鉴别红橙变异植株的分子标记及其应用，通过所述分子标记可以达到早期鉴定红橙橙型红肉果和其他变异株型，该鉴定方法简单、快速，准确。
[0062]
以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。