人参PgRb1-057-001基因及其应用

人参pgrb1-057-001基因及其应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及人参pgrb1-057-001基因及其应用。


背景技术：

2.人参(panax ginseng. c. a. meyer)是五加科人参属多年生植物，是吉林省特色植物资源，长期作为药材、膳食补充剂、功能性食品等被广泛应用并消费，因而成为了最畅销的贸易商品之一。人参皂苷是人参中主要的有效药用成分，人参皂苷属于三萜类物质，根据碳骨架结构和糖苷的数量可分为达玛烷型人参皂苷、齐墩果烷型人参皂苷和奥克梯隆型人参皂苷，其中达玛烷型人参皂苷又可分为原人参二醇型 (protopanaxdio, ppd)人参皂苷和原人参三醇型 (protopanaxatriol, ppt)人参皂苷。目前，在人参中已鉴定出了40多种单体皂苷，在众多单体皂苷中，人参皂苷rb1含量最高，它是原人参二醇型人参皂苷，已有研究证实人参皂苷rb1在多种疾病的治疗及日常保健中具有重要作用。
3.人参皂苷rb1的生物合成由甲羟戊酸合成途径的2,3-氧化鲨烯合成后的分支点开始，在达玛烯二醇合酶的催化下环化形成达玛烯二醇，以达玛烯二醇为分支点，有两条合成途径可以分别合成人参皂苷 rb1：
①
以达玛烯二醇为底物在 糖基转移酶催化下合成携带糖苷的达玛烯二醇，在细胞色素单加氧酶与原人参二醇合酶的催化下形成人参皂苷 ck，然后在糖基转移酶的催化下形成人参皂苷 f2，随后又进行一次糖基化修饰形成人参皂苷 rd，再经过一次糖基化修饰合成人参皂苷 rb1；
②
以达玛烯二醇为底物，在细胞色素单加氧酶和原人参二醇合成酶的作用下形成原人参二醇，在经过三次糖基化修饰后分别合成人参皂苷 rh2、rg3、rd，再以 rd 为作用底物，经过糖基转移酶的糖基化修饰合成人参皂苷 rb1。
4.人参生长周期长，一般 4-5 年，而且遗传转化后的再生植株栽培难度大，很难在短时间内通过遗传转化植株再生途径进行基因的功能验证。植物细胞和组织培养是生产人参皂苷的有效途径。发状根、不定根及悬浮细胞是人参组织培养常用的三种材料。一般情况下，发状根是由发根农杆菌侵染外植体产生的，在添加吲哚丁酸 (1h-indole-3-butanoic acid, iba) 的 ms 培养基中培养愈伤组织，即形成不定根。发状根和不定根由于其稳定的生物量积累和较高的人参皂苷产量而具有更大优势。目前，人参不定根已实现规模化的培养，不但人参皂苷产量高，且安全性好。
5.基因的遗传转化超表达是广泛用于验证基因功能的重要方法之一。人参不定根具有遗传背景清晰、培养周期短、培养不受季节限制、自动化程度高、成本低等优点，逐渐成为人参遗传转化、诱导子调控、胁迫处理等首选的实验材料。人参发状根具有生长快、激素自养的特点，更重要的是与人参根一样有皂苷生物合成的功能因而可以作为基因功能验证表型检测的实验材料。


技术实现要素：

6.本发明目的是提供人参pgrb1-057-001基因及其应用。
7.pgrb1-057-001基因，它的碱基序列如序列表seq id no.1所示。
8.pgrb1-057-001基因在提高人参皂苷rb1方面的应用。
9.本发明提供了pgrb1-057-001基因，它的碱基序列如序列表seq id no.1所示；pgrb1-057-001基因在提高人参皂苷rb1方面的应用；本发明将超量表达pgrb1-057-001基因阳性发状根单根系扩繁，在转基因阳性发状根中rb1含量出现显著变化，rb1含量增加，最高达到9.25 mg/g；表明pgrb1-057-001基因的超表达对人参皂苷rb1的生物合成有促进作用，同时控制rb1皂苷生物合成。
附图说明
10.图1 pgrb1-057-001基因全长序列pcr扩增琼脂糖凝胶电泳；m：marker dl 2000；1：空白对照；2
–
6：预期的1395 bp pcr产物；图2 pcambia3301:pgrb1-057-001重组质粒的酶切验证；m：marker dl 2000；1：xmai单酶切；图3 含pcambia3301:pgrb1-057-001重组质粒的发根农杆菌菌液pcr琼脂糖凝胶电泳；m：marker dl2000；1：空白对照；2
–
5：pcambia3301:pgrb1-057-001转化菌液pcr扩增；图4 pgrb1-057-001基因超量表达的遗传转化过程；图5 转基因(pgrb1-057-001
‑ꢀ
pcambia3301-c58c1)发状根pcr检测。i: pgrb1-057-001 gene (1,395 bp); ii: pcambia3301:pgrb1-057-001 (2,381 bp)；iii: pgrb1-057-001-f pcambia3301-r (1,803 bp)；iv: pcambia3301-f pgrb1-057-001-r (1,973 bp); v: rolc (586 bp); m: marker dl 5000; blank为空白对照；图6 pgrb1-057-001基因超量表达阳性发状根系中人参皂苷rb1的含量；*代表双尾显著性p《0.05，**代表双尾显著性p《0.01；control line代表转空载发状根单根系，positive line3/4/5/8/11/12/14/17/24/26/28/29/30/31/40/52/65/224为转基因阳性发状根单根系。
具体实施方式
11.实施例1 人参不定根rna的提取及反转录1、人参不定根的培养材料来源：人参不定根无性系为吉林省人参基因资源开发与利用工程研究中心前期研究获得，由人参无菌苗叶柄诱导得到人参不定根单根无性系。
12.培养条件为：含iba 的 b5固体培养基 (solarbio)；暗培养30~45天。
13.2、人参总 rna 的提取及总 rna 的反转录利用 tripure reagent 总 rna抽提试剂及 bioteke super rt kit，对人参样品中的总 rna 进行提取，并对提取的人参总rna 反转录为 cdna 并用 1 % 琼脂糖凝胶电泳进行检测。
14.实施例2 pgrb1-057-001基因的克隆pgrb1-057-001 基因序列全长为 1395 bp，碱基序列如序列表seq id no.1所示。
15.根据引物设计原则，对 pgrb1-057-001 基因进行特异性引物设计，同时在序列 5
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端和 3
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端添加 xmai 酶切位点，pgrb1-057-001 基因上下游引物为：
001-f：tcccccgggatggctgttttcatagttgtgcttg；001-r：tcccccgggttagtaagctgaaaccctaaggtgtaac；以人参样品 cdna 为模板、以目的基因的特异性引物进行 pcr 扩增，得到 pcr 产物的琼脂糖凝胶电泳（图1），所得条带清晰、单一，条带大小符合目的序列长度。对以上 pcr 产物进行凝胶回收、连接克隆载体并转化大肠杆菌 dh5α 感受态细胞，对单克隆抗性菌落进行 pcr 检测，对含有 pgrb1-057-001 基因的阳性单克隆工程菌进行测序，测序结果与上述序列完全一致，pgrb1-057-001 基因克隆成功。
16.实施例3 超量表达遗传转化1、超量表达载体构建提取 pgrb1-057-001基因重组克隆载体质粒及 pcambia3301 超表达载体质粒，进行 xmai 酶切、酶切产物回收、连接、转化感受态细胞，提取 pcr 检测阳性菌液中的重组表达载体质粒并进行酶切验证（图2）。重组质粒酶切后获得两个清晰的条带，其中一个与表达载体 pcambia3301长度一致，另一个与 pgrb1-057-001 基因长度一致，pgrb1-057-001基因与 pcambia3301 载体的重组质粒构建成功。
17.2、pgrb1-057-001基因超量表达工程菌的构建利用冻融法将pcambia3301:pgrb1-057-001重组质粒导入发根农杆菌c58c1中，构建成为诱导人参发状根进行pgrb1-057-001基因超表达的工程菌，对抗性筛选出的单克隆菌落进行pcr检测，菌液pcr获得的基因产物条带单一且清晰，大小与目的序列一致（图3），超量表达工程菌构建成功。
18.3、遗传转化利用发根农杆菌介导法对人参不定根进行遗传转化，分别进行预培养—共培养—筛选培养—发状根培养（图4），对获得的发状根进行命名并进行扩大培养。
19.实施例4 超量表达pgrb1-057-001基因发状根单根系的pcr检测采用 tps 法分别提取每个单根系的基因组dna，进行pcr检测。在检测阳性转基因材料时除了要检测目的基因以外，还要增加检测表达载体上的上下游部分与目的基因连接序列以保证目的基因的完整插入，因此设计引物如下：1）以克隆pgrb1-057-001时的上下游扩增引物为
①
和
②
；2）在pcambia3301表达载体的xmai酶切位点前后各设计一对引物
③
和
④
；3）由于发状根是由发根农杆菌ri质粒诱导产生的外植体类型，因此需要检测特异基因rolc以确保诱导产生的外植体为发状根，因此设计rolc基因引物
⑤
和
⑥
；
①
001-f：atggctgttttcatagttgtgcttg;
②
001-r：ttagtaagctgaaaccctaaggtgtaac;
③
3301-f: cgctctttctttccaaggtaatag;
④
3301-r: gttgtactccatcttattgcccag;
⑤
rolc-f：atggctgaagacgacttgtgttc;
⑥
rolc-r：ttagccgattgcaaactt;其中
①

②
= pgrb1-057-001=1395 bp；
③

④
=pcambia3301:pgrb1-057-001=2381 bp；
③

②
= pcambia3301-f pgrb1-057-001-r =1973 bp；
①

④
= pgrb1-057-001-f pcambia3301-r=1803 bp；
⑤

⑥
=rolc=586 bp。利用上述引物对遗传转化后诱导出的发状
根进行pcr检测，pcr产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果（图5）与上述片段大小完全相符的即为阳性发状根，同时设置转化空载体(pcambia3301:00)的发状根为阴性对照，发根农杆菌c58c1诱导的发状根为野生型发状根。
20.实施例5 超量表达pgrb1-057-001基因阳性发状根扩繁及皂苷含量检测1、超量表达pgrb1-057-001基因阳性发状根单根系扩繁及样品收集对于检测结果为阳性的转基因发状根单根系进行扩大培养，培养30天时取出发状根材料，称鲜重并烘干至恒重用于提取人参皂苷。
21.2、超量表达pgrb1-057-001基因阳性发状根皂苷提取及含量检测利用索氏回流提取法对阳性发状根进行人参皂苷的提取，样品经过萃取纯化后，利用高效液相色谱法对样品进行人参皂苷含量的检测。色谱条件：waters c18色谱柱(4.6 mm
×
250 mm, 5
ꢀµ
m)，检测波长：203 nm；流速1.000 ml/min；柱温为35 ℃，进样量为10
ꢀµ
l，流动相：水 (a)，乙腈 (b)，流动相洗脱条件为：0-40 min，12 % (b)；40-42 min，21 % (b)；42-46 min，26 % (b)；46-66 min，32 % (b)；66-71 min，33.5 % (b)；71-86 min，38 % (b)；86-91 min，65 % (b)；91-103 min，85 % (b)；103-125 min，18 % (b)。根据公式：样品浓度=标准品浓度*样品峰面积/标准品峰面积，利用所得检测结果中样品的峰面积计算各单体皂苷含量。（图6）最终的阳性发状根单根系的数量为18个，与空载发状根相比，转基因阳性发状根中rb1含量出现显著变化，rb1含量增加了2.69倍至4.04 倍不等，rb1含量最高达到9.25 mg/g (0.925 %)。说明pgrb1-057-001基因的超表达对人参皂苷rb1的生物合成有促进作用同时控制rb1皂苷生物合成。