一种鞍带石斑鱼抗神经坏死病毒个体的选择方法与流程

1.本发明属于石斑鱼育种技术领域，具体涉及一种鞍带石斑鱼抗神经坏死病毒个体的选择方法。


背景技术：

2.鞍带石斑鱼又名龙胆石斑鱼或龙趸石斑，隶属鲈形目(perciformes)，鮨科(serranidae)，石斑鱼属(epinephelus)。是石斑鱼类中体型最大者，也被称为“斑王”。鞍带石斑鱼个体大、营养丰富、肉质鲜美，生长速度快，是人们喜爱的海水鱼珍品。在我国南方沿海广东、海南、福建、广西等地鞍带石斑鱼已成为海水养殖的主要对象，经济价值巨大。
3.目前，随着养殖量的不断增加，石斑鱼养殖过程中病虫害问题的日益显现，尤其是病毒性神经坏死病(viral nervous necrosis，vnn)，其病原是神经坏死病毒(nervous necrosis virus，nnv)。该病毒属于β诺达病毒属，是一类细小rna病毒，可分成4个基因型：拟鳍神经坏死病毒基因型(stripedjack nnv，sjnnv)、红鳍东方鲀神经坏死病毒基因型(tiger puffer nnv，tpnnv)，条斑星鲽神经坏死病毒基因型(barfin flounder nnv，bfnnv)和赤点石斑神经坏死病毒基因型(red spotted grouper nnv，rgnnv)。对石斑鱼危害最大的是rgnnv，石斑鱼在幼苗期基本都会感染此病毒，主要引起石斑鱼神经系统和视网膜损伤，仔鱼和稚鱼易受其感染，感染死亡率在90％以上，甚至达到100％。目前没有有效疫苗并且该病毒在稚鱼期就开始发病，疫苗难以注射。
4.因此，开展抗病品种的培育，是应对该病毒，提高石斑鱼产量的有效方式。但是，在选育过程中，发现鞍带石斑鱼繁殖周期长，一般需要6-8年繁殖一代，如果采用传统选育方式不太现实。因此，结合鞍带石斑鱼本身的遗传信息进行选育可以加快选育的进程，此外，抗病性状无法通过表型观察，尤其无法挑选到抗病的亲本进行子代培育，导致选育难度进一步加大，因此迫切需要一种准确的且能通过遗传信息如snp标记来预测鞍带石斑鱼抗病能力的方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种鞍带石斑鱼抗神经坏死病毒个体的选择方法，从鞍带石斑鱼snp标记中筛选抗神经坏死病毒权重最大的snp标记，以此建立一种能够选择抗神经坏死病毒个体的方法。
6.本发明的上述目的可以通过以下技术方案来实现：一种鞍带石斑鱼抗神经坏死病毒个体的选择方法，包括如下步骤：
7.(1)鞍带石斑鱼snp位点信息的获得：选取健康鞍带石斑鱼苗，用赤点石斑神经坏死病毒(rgnnv)对其进行攻毒，采集死亡鱼苗的鳍条或肌肉保存，设置易感组和抗感组，进行全基因组重测序和gwas分析，获得鞍带石斑鱼snp位点信息；
8.(2)snp标记抗病权重值的分析和snp标记的选取：以抗感和易感作为表型，利用cropgbm软件，计算snp位点的权重挖掘与表型相关的snp位点，筛选获得722个权重值最高
的snp标记，用于鞍带石斑鱼抗病能力个体的选择；
9.(3)候选鞍带石斑鱼个体snp位点信息的获取和抗神经坏死病毒能力个体的选择：采集候选群体鱼的鳍条，提取鳍条基因组dna，进行全基因组重测序，利用步骤(2)中获取的722个snp标记，采用gapit3方法计算候选鞍带石斑鱼的抗病育种值，选择育种值数值大于28的为抗神经坏死病毒个体，小于28的为抗神经坏死病毒能力差的个体；
10.(4)抗病个体选择准确性检验：当候选群体是长度在10cm以内的鱼苗时，则对计算得到的育种值大于28和小于28的鱼个体进行攻毒，分别统计死亡率，当育种值大于28的个体抗病能力强，育种值小于28的个体抗病能力差的时候，则步骤(3)中采用育种值选择鞍带石斑鱼抗神经坏死病毒个体的方式准确；当候选群体是亲鱼群体时，则对育种值大于28和小于28的亲本繁殖的子代进行功毒，当育种值大于28的亲本繁殖的子代抗病力强于育种值小于28的亲本繁殖的子代的时候，则步骤(3)中采用育种值选择鞍带石斑鱼亲本抗神经坏死病毒个体的方式准确。
11.在上述鞍带石斑鱼抗神经坏死病毒个体的选择方法中：
12.优选的，步骤(1)中所述健康鞍带石斑鱼苗的大小均一，长度为4～6cm，数量为600～800条。
13.优选的，步骤(1)中所述赤点石斑神经坏死病毒(rgnnv)采用腹腔注射，注射的赤点石斑神经坏死病毒(rgnnv)滴度为107～108tcid
50
/m。
14.优选的，步骤(1)中所述赤点石斑神经坏死病毒(rgnnv)分离自赤点石斑鱼，采用常规方法实验室培育获得，培育方法可参考但不限于以下文献：一株鲈鲤源鲤春病毒血症病毒的分离鉴定及其病理观察，郑李平等，中国水产科学，2019.5；或鱼类病毒性神经坏死病毒的分离和部分特性的研究，蒋方军，华中农业大学硕士学位论文，2008。
15.优选的，步骤(1)中采集死亡鱼苗的鳍条或者肌肉保存，要求每隔2～3小时去观察一次，并记录死亡的时间点，剪取死亡且刚死不久的鱼的鳍条或肌肉，保存在体积百分含量为95％的酒精中，随后转移到-80℃冰箱长期保存。
16.优选的，步骤(1)中选取最先死亡的100～200尾鱼作为易感组，步骤(1)中选取没有死亡的100～200尾鱼作为抗感组，如果没有死亡的鱼数量不足100～200尾，则选取剩下的活鱼加上最后死亡的鱼合计100～200尾作为抗感组。
17.优选的，步骤(1)中采用gwas(全基因组关联分析)分析时，以鞍带石斑鱼基因组为参考基因组结合抗感和易感性状进行全基因组关联分析(gwas)分析，其中，参考基因组为鞍带石斑鱼基因组，其来源如下：asm528154v1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝asm528154v1。
18.优选的，步骤(2)中以抗感和易感作为表型，利用cropgbm(crop genomic breeding machine)软件，使用的计算方法为梯度提升决策树(gradient boosting decision tree，gbdt)进行大量优化后的lightgbm算法，计算snp位点的权重挖掘与表型相关的snp位点。
19.优选的，步骤(2)中计算snp位点的权重挖掘与表型相关的snp位点过程如下：调用plink，根据缺失率、杂合度对基因型数据进行预处理，并生成ped文件，然后进行表型数据预处理、训练模型和snp位点筛选，最终筛选获得722个权重值最高的snp标记，用于进行鞍带石斑鱼抗病能个体的选择。
20.优选的，步骤(3)中提取鳍条基因组dna采用动物组织dna提取试剂盒，提取的dna进行凝胶电泳时要求单挑带。
21.优选的，步骤(3)中采用gapit3方法计算候选鞍带石斑鱼的抗病育种值，其中gapit3方法为genomic association and prediction integrated tool。
22.优选的，步骤(4)中攻毒时，候选群体鱼的数量为100尾以上。
23.优选的，步骤(4)中攻毒时采用赤点石斑神经坏死病毒(rgnnv)，所述赤点石斑神经坏死病毒(rgnnv)采用腹腔注射，注射的赤点石斑神经坏死病毒(rgnnv)滴度为107～108tcid
50
/ml。
24.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
25.(1)本发明从鞍带石斑鱼snp标记中筛选抗神经坏死病毒权重最大的snp标记，以此建立一种能够筛选抗神经坏死病毒鞍带石斑鱼个体的方法。
26.(2)本发明方法具有较高的准确性和较大的使用价值，综合判定准确率较高；
27.(3)本发明提供的鞍带石斑鱼抗神经坏死病毒个体的选择方法，解决了鞍带石斑鱼抗病力无法从外观上判定的问题；
28.(4)本发明方法具有高效准确，对亲鱼伤害小等优点；
29.(5)本发明方法在石斑鱼育种方面具有显著的经济效益和社会效益。
具体实施方式
30.下面通过实施例对本发明作进一步具体的描述，但本发明的实施方式不限于此。
31.实施例1
32.本实施例提供的鞍带石斑鱼抗神经坏死病毒个体的选择方法，包括以下步骤：
33.(1)鞍带石斑鱼snp位点信息的获得
34.选取健康鞍带石斑鱼苗(健康鞍带石斑鱼苗的大小均一，长度为4～6cm，数量为600尾)，用rgnnv(赤点石斑神经坏死病毒(rgnnv)分离自赤点石斑鱼，采用常规方法实验室培育获得，培育方法可参考但不限于以下文献：一株鲈鲤源鲤春病毒血症病毒的分离鉴定及其病理观察，郑李平等，中国水产科学，2019.5；或鱼类病毒性神经坏死病毒的分离和部分特性的研究，蒋方军，华中农业大学硕士学位论文，2008)对其进行攻毒，每天采集死亡鱼苗的鳍条或者肌肉保存，并记录死亡的时间点；
35.采集死亡鱼苗的鳍条或肌肉保存，要求每隔2小时去观察一次，并记录死亡的时间点，剪取死亡且刚死不久的鱼的鳍条和肌肉，保存在95％(体积百分含量)的酒精中，随后转移到-80℃冰箱长期保存；
36.选取最先死亡作为易感组和攻毒后活下来的鱼作为抗感组各100尾，进行全基因组重测序和gwas分析，获得鞍带石斑鱼snp位点信息；
37.gwas(全基因组关联分析)分析时，以鞍带石斑鱼基因组为参考基因组结合抗感和易感性状进行全基因组关联分析(gwas)分析时，参考基因组为鞍带石斑鱼基因组，其来源如下：
38.asm528154v1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝asm528154vl。
39.(2)snp标记抗病权重值的分析和snp标记的选取：以抗感和易感作为表型，利用crop genomic breeding machine(cropgbm)软件，使用的计算方法为梯度提升决策树
(gradient boosting decision tree，gbdt)进行了大量优化后的lightgbm算法，计算snp位点的权重挖掘与表型相关的snp位点用于鞍带石斑鱼抗病能力的预测；
40.计算snp位点的权重挖掘与表型相关的snp位点过程如下：调用plink，根据缺失率、杂合度对基因型数据进行预处理，并生成ped文件，然后进行表型数据预处理、训练模型和snp位点筛选，最终筛选获得722个权重值最高的snp位点(如表1所示)，用于进行鞍带石斑鱼抗病能力的预测。
41.表1 22个权重值最高的snp位点
42.43.44.45.46.47.48.49.50.51.52.53.54.55.56.57.58.[0059][0060]
(3)候选鞍带石斑鱼个体snp位点信息的获取和抗神经坏死病毒能力个体的选择：候选群体的建立与全基因组重测序：采集候选群体鱼(每条鱼打上标记)的鳍条，提取鳍条基因组dna，进行全基因组重测序，处理分析snp位点数据，在缺失表型值的情况下，进行基因组选择计算，个体育种值的计算采用步骤(2)中筛选出的722个snp位点信息(表1)，用genome association and prediction integrated tool(gapit3)方法进行计算，在计算结束后生成并输出每条鱼的育种值，根据计算得到育种值数值大于28的判定为抗病个体，数值小于28的判定为抗病力差的个体；
[0061]
其中提取鳍条基因组dna采用动物组织dna提取试剂盒，提取的dna进行凝胶电泳时要求单挑带。
[0062]
(4)抗病个体选择准确性检验：对计算得到的育种值大于28和小于28的个体进行攻毒，分别统计死亡率，统计死亡率时，如果计算所得的育种值高于28的个体抗病能力强(死亡率低)，而育种值低于28的个体抗病能力差(死亡率高)，则判定该育种值可以准确选择鞍带石斑鱼抗神经坏死病毒的能力高的个体。
[0063]
实际检验时，当候选群体是长度在10cm以内的鱼苗时，则对计算得到的育种值大于28和小于28的鱼个体进行攻毒，分别统计死亡率，当育种值大于28的个体抗病能力强，育种值低于28的个体抗病能力差的时候，则步骤(3)中采用育种值选择鞍带石斑鱼抗神经坏死病毒个体的方式准确；当候选群体是亲鱼群体时，则对育种值大于28和小于28的亲本繁殖的子代进行功毒，当对育种值大于28的亲本繁殖的子代抗病力强于育种值小于28的亲本繁殖的子代的时候，则步骤(3)中采用育种值选择鞍带石斑鱼亲本抗神经坏死病毒个体的方式准确。
[0064]
其中攻毒时病毒滴度在107tcid
50
/ml以上的病毒，攻毒方式优选腹腔注射，攻毒时鱼的大小为4～5cm左右。
[0065]
实施例2
[0066]
为了验证实施例1中的鉴别方法的准确性，本实施例采用以下试验进行验证：
[0067]
(1)在2020年6月20号选取110条海南晨海水产有限公司养殖的大小为3.15
±
0.23cm的鞍带石斑鱼苗，此时从外观上并不能够判断鱼苗的抗病能力，剪取鳍少量尾鳍后，用单独的饲养盒子饲养，在盒子上做好标记；
[0068]
(2)提取每条鱼的dna进行重测序，获得每条鱼snp位点信息；
[0069]
(3)在进行重测序的同时对每条鱼进行攻毒，对每条鱼采用腹腔注射30μl浓度为
2.46
×
107tcid
50
/ml的病毒，记录死亡鱼盒子上的标记号；
[0070]
(4)根据重测序结果采用genome association and prediction integrated tool(gapit3)计算育种值，育种值大于28的鱼条数为11条，小于28的条数为99条(表2)；
[0071]
表2鞍带石斑鱼苗育种值及抗病情况
[0072]
[0073]
[0074]
[0075][0076]
(5)对应11条鱼的标记号，计算育种值大于28的鱼死亡条数为3条，死亡率为27.27％，育种值小于28的鱼死亡条鱼为89死亡率为89.90％。表明本发明方法判定石斑鱼抗病能力准确率较高。
[0077]
实施例3
[0078]
为了验证实施例1中的鉴别方法的准确性，本实施例还采用以下试验进行验证：
[0079]
(1)在2020年4月16号选取200条海南晨海水产有限公司养殖的大小为123.15
±
24.56kg的鞍带石斑鱼亲鱼，此时从外观上并不能够判断鱼苗的抗病能力，剪取鳍尾鳍后，在每条鱼背部肌肉上打上电子标记，记录好每条鱼对应的标记号。
[0080]
(2)提取每条鱼的dna进行重测序，获得每条鱼snp位点信息。
[0081]
(4)根据重测序结果采用genome association and prediction integrated tool(gapit3)计算育种值，育种值大于28的鱼条数为32条，小鱼28的条数为168条(表3)。
[0082]
(5)对应标记号将32条抗病亲本和168条不抗病亲本分进行繁殖，采用人工授精方
式获得抗病亲本产生的子代5.67万尾，不抗病亲本产生的子代16.34万尾。饲养到4cm左右时每组随机选取500条鱼进行攻毒，采用腹腔注射30μl浓度为2.46
×
107tcid
50
/ml的病毒，记录死亡率。结果表明判定为抗病亲本产生的子代死亡率为60.80％，而判定为不抗病亲本产生的子代死亡率为92.20％(表3)。表明本发明判定石斑鱼亲本抗病能力准确率较高。
[0083]
表3鞍带石斑鱼亲鱼育种值及子代抗病分析
[0084]
亲本抗病判断亲本条数平均育种值子代数目(万尾)抽样攻毒数目(尾)抽样子代死亡率抗病亲本3231.8647
±
2.12465.6750060.80％不抗病亲本16818.9423
±
5.479816.3450092.20％
[0085]
综上，通过观测样本的结果表明本发明方法具有较高的准确性和较大的使用价值，综合判定准确率较高。本发明提供的鞍带石斑鱼抗神经坏死病毒个体的鉴别方法，解决了鞍带石斑鱼抗病力无法预测的问题，且具有高效准确，对亲鱼伤害小等优点。该技术在石斑鱼育种方面将有显著的经济效益和社会效益。
[0086]
上面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以上具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。