pSFVCs-EGFP和pSFV-EGFP病毒样颗粒及其制备方法、应用与流程

psfvcs
‑
egfp和psfv
‑
egfp病毒样颗粒及其制备方法、应用
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种psfvcs
‑
egfp和psfv
‑
egfp 病毒样颗粒及其制备方法、应用。


背景技术：

2.rna复制子是衍生于rna病毒基因组并能自主复制的rna。最常用于开发复制子的病毒是披膜病毒科中的甲病毒(alphavirus),如辛德比斯病毒 (sindbis virus,sin)、塞姆利基森林病毒(semliki forest virus,sfv)以及委内瑞拉马脑炎病毒(venezuelan equine encephalitis virus,vee)；除甲病毒外，还有黄病毒、小rna病毒、副粘病毒、杯状病毒等。被改造用于rna复制子疫苗的载体。本发明基于甲病毒载体，甲病毒是单股正链rna 病毒，sfv和sin 的基因组约12kb，由两个开放读码框架(orf)组成，靠近5末端的前2/3部分编码非结构蛋白，称为非结构区，该区共编码4种非结构蛋白(nspl—nsp4)；靠近3末端的后1/3部分称为结构区，编码数种结构蛋白，包括衣壳蛋白(c)，膜糖蛋白el、e2、e3以及6k蛋白等。在感染过程中5末端2/3的基因组 rna首先翻译，产生rna复制和转录所需要的nsps。然后在nsps的作用下，以基因组rna为模板合成负链，再以负链为模板合成新的基因组rna分子。结构蛋白由亚基因组mrna翻译到，亚基因组mrna沉降系数为26s，因此该亚基因组的启动子命名为p26s。基因组rna复制得到负链rna后，由亚基因组启动子p26s启动亚基因组mrna的转录,并在翻译的同时或之后经病毒和宿主编码蛋白酶的联合作用下而裂解为衣壳蛋白和膜糖蛋白。结构蛋白与先前合成的基因组rna装配成核衣壳后以出芽方式释放。甲病毒的特点使其可以作为一种基因转移的载体。rna复制子载体包含病毒基因组3末端的非编码区和非结构蛋白基因编码区，去掉了其结构区，而引入了多克隆位点。在该处插入外源基因之后，可以由26s启动子启动亚基因组mrna 控制表达。
3.表达抗原的rna复制子可由3种方式递送:(1)体外转录的裸rna；(2) 构建成质粒dna由细胞rna聚合酶ⅱ体内转录成复制子rna(基于dna)；(3)将复制子rna包装入病毒样颗粒。裸rna 存在不稳定、降解快、不易储存等缺点,而病毒样颗粒没有感染性,作为免疫原,它可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞,有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应,成为良好的疫苗；作为基因治疗载体,可以插入外源蛋白的表位,通过释放外源蛋白达到特异性治疗的目的；由于在细胞表面存在相应受体,既可提高其稳定性还可以增加效率而倍受关注。与其他表达载体相比,sfv复制子表达系统具有宿主范围广、表达效率高等优点，已被广泛用于表达外源基因和构建复制子疫苗以及基因治疗导向载体制备等领域，尤其是在疫苗研究方面，已有病毒和肿瘤复制子候选疫苗进入临床前期及临床试验，显示了其应用前景。
4.本发明以塞姆利基森林病毒(semliki forest virus,sfv)为载体，它包括两个独立的rna分子,一个rna分子是包含插入了egfp荧光蛋白基因的rna 复制子载体。另一个rna分子是辅助rna。增强egfp蛋白的表达，为后续其他重要外源蛋白的筛选和rna疫苗研制能够提供可靠的实验基础和科学依据，具有重大的意义。然而，如何提高以塞姆利基森林病毒
为载体的egfp蛋白的表达，目前尚未文献记载。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于，其以塞姆利基森林病毒为载体，提供一种psfvcs
‑
egfp和psfv
‑
egfp病毒样颗粒及其制备方法，可以避免融合蛋白的表达，增强了egfp蛋白的表达。
6.本发明还要解决的技术问题还在于，提供一种psfvcs
‑
egfp和psfv
‑
egfp 病毒样颗粒的应用。
7.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种psfvcs
‑
egfp病毒样颗粒的制备方法，包括：
8.(1)设计与合成引物，所述引物包括设计引物cs
‑
egfp
‑
f和cs
‑
egfp
‑
r，以及菌液鉴定引物egfp
‑
鉴定
‑
f和egfp
‑
鉴定
‑
r：
9.(2)以egfp
‑
c1为模板，以cs
‑
egfp
‑
f，cs
‑
egfp
‑
r为引物扩增cs
‑
egfp 片段，然后经过酶切、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，构建得到复制子质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp；
10.(3)将所述复制子质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp和辅助质粒sfv
‑
heleper进行体外转录；
11.(4)将所述复制子质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp及辅助质粒sfv
‑
heleper体外转录的mrna共电转入bhk细胞中，得到psfvcs
‑
egfp病毒样颗粒。
12.作为上述技术方案的改进，步骤(1)中，所述引物的序列设计如下：
13.cs
‑
egfp
‑
f的序列为seq id no.1；
14.cs
‑
egfp
‑
r的序列为seq id no.2；
15.egfp
‑
鉴定
‑
f的序列为seq id no.3；
16.egfp
‑
鉴定
‑
r的序列为seq id no.4。
17.作为上述技术方案的改进，步骤(2)包括：
18.以egfp
‑
c1为模板，cs
‑
egfp
‑
f，cs
‑
egfp
‑
r为引物扩增cs
‑
egfp片段；
19.用bamhi酶切质粒psfvcs
‑
lacz，得到酶切载体大片段；
20.将所述cs
‑
egfp片段和酶切载体大片段同源重组，得到重组产物；
21.将重组产物加入到感受态细胞dh5α细胞，进行重组产物转化；
22.将转化后的重组产物进行重组产物鉴定；
23.将鉴定后的重组产物提取质粒；
24.对所述质粒进行酶切鉴定及测序。
25.作为上述技术方案的改进，步骤(3)包括：
26.线性化所述复制子质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp及辅助质粒sfv
‑
heleper；
27.将线性化后的复制子质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp及辅助质粒sfv
‑
heleper进行体外转录。
28.相应的，本发明还提供了一种psfvcs
‑
egfp病毒样颗粒，其由上述制备方法制成。
29.本发明采用塞姆利基森林病毒(semliki forest virus,sfv)为载体构建了一种包装体系,它包括两个独立的rna分子,一个rna分子是包含插入了egfp 荧光蛋白基因的rna复制子载体。另一个rna 分子是辅助rna,它包括 5
′
—3
′
复制信号和亚基因组启动子和
编码结构蛋白的基因，这两个rna分子共转染细胞即包装成病毒样颗粒psfvcs
‑
egfp；然而，上述制备的病毒样颗粒psfvcs
‑
egfp融合表达了egfp蛋白和病毒衣壳蛋白，因此我们在此基础上又构建了去除病毒衣壳蛋白结构的复制子质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp，进而制备出病毒样颗粒psfv
‑
egfp。具体如下，本发明还提供了一种psfv
‑
egfp病毒样颗粒的制备方法，包括：
30.(1)设计与合成引物，所述引物包括egfp
‑
f、egfp
‑
r，通用
‑
f和egfp
‑
r：
31.(2)以上述psfvcs
‑
sp6
‑
egfp为模板，以egfp
‑
f，egfp
‑
r为引物扩增片段，然后经过酶切、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，构建得到复制子质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp；
32.(3)将所述复制子质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp和辅助质粒sfv
‑
heleper进行体外转录；
33.(4)将所述复制子质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp和辅助质粒sfv
‑
heleper体外转录的mrna共电转入bhk细胞中，得到psfv
‑
egfp病毒样颗粒。
34.作为上述技术方案的改进，步骤(1)中，所述引物的序列设计如下：
35.egfp
‑
f的序列为seq id no.5；
36.egfp
‑
r的序列为seq id no.6；
37.通用
‑
f的序列为seq id no.7；
38.egfp
‑
r的序列为seq id no.8。
39.作为上述技术方案的改进，步骤(2)包括：
40.以上述的psfvcs
‑
sp6
‑
egfp为模板，以egfp
‑
f，egfp
‑
r为引物扩增片段egfp片段；
41.用bamhi/bg1ii酶切双酶切质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp，得到酶切载体大片段；
42.将所述egfp片段和酶切载体大片段同源重组，得到重组产物；
43.将重组产物加入到感受态细胞dh5α细胞，进行重组产物转化；
44.将转化后的重组产物进行重组产物鉴定；
45.将鉴定后的重组产物提取质粒；
46.对所述质粒进行酶切鉴定及测序。
47.作为上述技术方案的改进，步骤(3)包括：
48.线性化所述复制子质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp和辅助质粒sfv
‑
heleper；
49.将线性化后的复制子质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp和辅助质粒sfv
‑
heleper进行体外转录。
50.相应的，本发明还公开了一种psfv
‑
egfp病毒样颗粒，其由上述的制备方法制成。
51.相应的，本发明还公开了一种psfv
‑
egfp病毒样颗粒在rna疫苗、制备基因治疗药物、动物模型中的应用。
52.实施本发明，具有如下有益效果：
53.本发明其以塞姆利基森林病毒为载体，成功制备了病毒样颗粒 psfvcs
‑
egfp，所述病毒样颗粒psfvcs
‑
egfp是一种复制缺陷型病毒，既能够高效表达外源蛋白，又具有较高的生物安全性，奠定了以塞姆利基森林病毒 (semliki forest virus,sfv)为载体包装成假病毒颗粒的实验基础。
54.本发明在病毒样颗粒psfvcs
‑
egfp的基础上去除病毒衣壳蛋白融合表达，进而成功制备出病毒样颗粒psfv
‑
egfp，增强了egfp蛋白的表达，成功建立了一种以塞姆利基森林病毒(semliki forest virus,sfv)为载体高效表达其它重要外源蛋白的平台，为后续rna疫苗研制奠定实验基础。
55.相较于其它载体拟采用塞姆利基森林病毒(semliki forest virus,sfv)的病毒样颗粒，本发明psfv
‑
egfp能够高效表达外源蛋白，且抑制病毒结构蛋白的表达。而且，其是一种复制缺陷型病毒，具有较高的生物安全性。
附图说明
56.图1是扩增cs
‑
egfp的模板质粒pegfp
‑
c1图谱；
57.图2是psfvcs
‑
lacz质粒图谱；
58.图3是psfvcs
‑
sp6
‑
egfp质粒图谱；
59.图4是cs
‑
egfp片段扩增结果示意图；
60.图5是bamhi酶切质粒psfvcs
‑
lacz结果示意图；
61.图6是重组质粒菌液鉴定结果示意图；
62.图7是重组质粒酶切鉴定结果示意图；
63.图8是spei分别酶切psfvcs
‑
sp6
‑
egfp及heleper的示意图；
64.图9是psfvcs
‑
sp6
‑
egfp体外转录电泳图；
65.图10是sp6
‑
heleper体外转录电泳图；
66.图11是倒置荧光显微镜检测细胞egfp荧光蛋白表达示意图；
67.图12是倒置荧光显微镜检测实验组和对照组细胞生长状态(
×
400)示意图；
68.图13是egfp扩增片段的示意图；
69.图14是bamhi/bg1ii酶切双酶切质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp电泳结果图；
70.图15是重组质粒菌液鉴定结果示意图；
71.图16是重组质粒酶切鉴定结果示意图；
72.图17是psfv
‑
sp6
‑
egfp和辅助质粒sfv
‑
heleper体外转录示意图；
73.图18是psfvcs
‑
egfp制备的病毒样颗粒psfv
‑
egfp病毒样颗粒在细胞中 egfp荧光细胞表达对比(
×
200)示意图。
具体实施方式
74.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
75.本发明提供了一种psfvcs
‑
egfp病毒样颗粒的制备方法，包括：
76.(1)引物设计与合成：
77.所述引物包括设计引物cs
‑
egfp
‑
f和cs
‑
egfp
‑
r，以及菌液鉴定引物egfp
‑ꢀ
鉴定
‑
f和egfp
‑
鉴定
‑
r：
78.具体的，根据snapgene软件，采用同源重组技术设计引物cs
‑
egfp
‑
f、 cs
‑
egfp
‑
r及菌液鉴定引物egfp
‑
鉴定
‑
f、egfp
‑
鉴定
‑
r，在金唯智科技有限公司(苏州)合成，设计引物如下表1：
79.表1扩增片段引物
[0080][0081]
(2)复制子质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp的构建：
[0082]
以egfp
‑
c1为模板，以cs
‑
egfp
‑
f，cs
‑
egfp
‑
r为引物扩增cs
‑
egfp片段，然后经过酶切、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，构建得到复制子质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp；
[0083]
其中，步骤(2)包括：
[0084]
(2.1)以egfp
‑
c1为模板，cs
‑
egfp
‑
f，cs
‑
egfp
‑
r为引物扩增cs
‑
egfp 片段；
[0085]
(2.2)用bamhi酶切质粒psfvcs
‑
lacz，得到酶切载体大片段；
[0086]
(2.3)将所述cs
‑
egfp片段和酶切载体大片段同源重组，得到重组产物；
[0087]
(2.4)将重组产物加入到感受态细胞dh5α细胞，进行重组产物转化；
[0088]
(2.5)将转化后的重组产物进行重组产物鉴定；
[0089]
(2.6)将鉴定后的重组产物提取质粒；
[0090]
(2.7)对所述质粒进行酶切鉴定及测序。
[0091]
具体的，作为本发明一优选的具体实施例，步骤(2)包括：
[0092]
(2.1)目的片段的扩增
[0093]
以egfp
‑
c1为模板(图1)，cs
‑
egfp
‑
f，cs
‑
egfp
‑
r为引物扩增cs
‑
egfp 片段，pcr体系和条件如下表2和表3所示：
[0094]
表2 cs
‑
egfp扩增pcr体系
[0095][0096]
表3 cs
‑
egfp扩增pcr程序
[0097][0098]
pcr扩增结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，在754bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将含有目的条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2ml的ep管中，进行胶回收，并测定dna浓度。
[0099]
(2.2)bamhi酶切质粒psfvcs
‑
lacz
[0100]
用bamhi酶切质粒psfvcs
‑
lacz(购自addgene)(图2)，酶切体系共300ul，分成6管，每管50ul，体系如下表8：
[0101]
表4酶切体系
[0102][0103]
酶切结束后进行0.8％核酸凝胶电泳鉴定，在3072bp、11851bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将11851bp左右条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2ml的ep 管中，进行胶回收，并测定dna浓度。
[0104]
(2.3)目的片段和酶切载体大片段同源重组
[0105]
胶回收结束后将目的片段和载体片段按照合适的体积，于冰上配置以下反应体系(表5)，温柔的轻轻摇匀后，在37℃水浴锅中孵育30min中，然后放置 4℃或冰上冷却。
[0106]
表5同源重组体系
[0107][0108]
(2.4)重组产物转化
[0109]
在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞dh5α细胞，取10μl重组产物加入到 100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2
‑
3min。加入900μlsoc，37℃摇菌1 h(转速200
‑
250rpm)。将相应含氯霉素抗性的lb平板固体培养基在37℃培养箱中预热。5,000rpm离心5min，弃掉900μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒涂在有含氯霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养 12
‑
16h。
[0110]
(2.5)重组产物鉴定
[0111]
过夜培养后，查看平板的菌落并挑取其中菌落进行菌液鉴定，至于加有含氯霉素抗性的lp培养基的2ml ep管中，在37℃的摇床中培养约5个小时，然后进行菌液鉴定,鉴定片段为413bp，鉴定pcr体系如下表：
[0112]
表6菌液鉴定pcr体系
[0113][0114]
取鉴定阳性的菌液100ul于加有含氯霉素抗性的lp培养基的50ml离心管中进行大摇，过夜培养。
[0115]
(2.6)提取质粒
[0116]
1.柱平衡步骤：向吸附柱cp3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液bl，12,000rpm(～13,400
×
g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0117]
2.取15ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000 rpm(～13,400
×
g)离心1min，尽量吸除上清。
[0118]
3.向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液p1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
[0119]
4.向离心管中加入500μl溶液p2，温和地上下翻转6
‑
8次使菌体充分裂解。注意：温
和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组dna，造成提取的质粒中混有基因组dna片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
[0120]
5.向离心管中加入700μl溶液p3，立即温和地上下翻转6
‑
8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400
×
g)离心10min。注意：p3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
[0121]
6.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱cp3中12,000rpm (～13,400
×
g)离心30
‑
60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中。
[0122]
7.向吸附柱cp3中加入600μl漂洗液pw(请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm(～13,400
×
g)离心30
‑
60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中。
[0123]
8.重复操作步骤7。
[0124]
9.将吸附柱cp3放入收集管中,12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱cp3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0125]
10.将吸附柱cp3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50
‑
100 μl洗脱缓冲液eb，室温放置2min，12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
[0126]
(2.7)酶切鉴定及测序：
[0127]
用smai、bamhi双酶切质粒，酶切体系共20ul，如下表7：
[0128]
表7酶切体系
[0129][0130]
酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，结果如图所示。条带经鉴定正确后，送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
[0131]
(3)将所述复制子质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp和辅助质粒sfv
‑
heleper进行体外转录；
[0132]
其中，步骤(3)包括：
[0133]
(3.1)线性化所述复制子质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp及辅助质粒sfv
‑
heleper；
[0134]
(3.2)将线性化后的复制子质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp及辅助质粒sfv
‑
heleper 进行体外转录。
[0135]
具体的，作为本发明一优选的具体实施例，步骤(3)包括：
[0136]
(3.1)线性化psfvcs
‑
sp6
‑
egfp及sfv
‑
heleper
[0137]
用spei分别酶切psfvcs
‑
sp6
‑
egfp及sfv
‑
heleper质粒，体系均为300ul(表 8、9)。
[0138]
表8 spei酶切psfvcs
‑
sp6
‑
egfp
[0139][0140]
表9 spei酶切复制质粒sfv
‑
helper
[0141][0142]
(3.2)线性化后的psfvcs
‑
sp6
‑
egfp及sfv
‑
heleper进行体外转录
[0143]
根据mmessage mmachine sp6转录试剂盒(am1340，购自赛默飞) 所述方法对线性化后的psfvcs
‑
sp6
‑
egfp及sfv
‑
heleper质粒进行体外转录，体系如下表10、11：
[0144]
表10 psfvcs
‑
sp6
‑
egfp体外转录体系
[0145][0146]
表11 sfv
‑
helper体外转录体系
[0147][0148]
上述体系配好后37℃转录40min，然后加入1ul gtp 37℃继续转录2h,随后再加入
1ul turbo dnase37℃、15min。转录结束后分别吸取1ul转录产物，加入4ul的nuclease
‑
free water及6
×
loading buffer进行稀释，注意无菌操作及防止rna降解，然后在1％sds
‑
page中进行电泳实验，验证条带正确与否。
[0149]
(4)将所述复制子质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp及辅助质粒sfv
‑
heleper体外转录的mrna共电转入bhk细胞中，得到psfvcs
‑
egfp病毒样颗粒。
[0150]
具体的，作为本发明一优选的具体实施例，步骤(4)包括：
[0151]
(4.1)细胞提前传至t75方瓶中，当细胞汇合度达到80％时，进行实验；
[0152]
(4.2)在冰上预冷1.5ml ep管和pbs。在
‑
20℃冰箱中预冷4mm比色杯 (电极杯)；
[0153]
(4.3)37℃预热6毫升培养基(含1％fbs dmem)；
[0154]
(4.4)胰蛋白酶消化t75方瓶中细胞并用5毫升完全培养基重新悬浮；
[0155]
(4.5)500g、4℃离心5分钟；
[0156]
(4.6)弃去上清液，并用10ml冰冷pbs清洗细胞颗粒；
[0157]
(4.7)500g、4℃离心5分钟，再次重复pbs清洗；
[0158]
(4.8)弃去上清液并完全去除残留的pbs,并用遇冷的520ul pbs重悬细胞，均分成二等份，每份含260ul的pbs细胞重悬液别置于预冷的1.5ml ep管；
[0159]
(4.9)第一份pbs细胞重悬液分别加入10ul的psfvcs
‑
sp6
‑
egfp及heleper 转录产物；第二份pbs细胞重悬液不加入任何物质，也放置冰上；
[0160]
(4.10)将上述三种混合物分别转移到3个预冷的电极杯(4mm)中，设置电转仪条件同为100v，25ms，电击一次，电击后置于冰上1min；
[0161]
(4.11)然后分别向电极杯中加入约400ul的含1％fbs dmem吹打混匀，随即转至t25方瓶中，并加入6ml含1％fbs dmem,放置37℃5％co2培养箱中进行培养；
[0162]
(4.12)电穿孔后8h至36h后，用倒置荧光显微镜进行观测，待36h后冻融三次收取上清液。
[0163]
相应的，本发明还提供了一种psfvcs
‑
egfp病毒样颗粒，其由上述制备方法制成。所述病毒样颗粒psfvcs
‑
egfp是一种复制缺陷型病毒，既能够高效表达外源蛋白，又具有较高的生物安全性，奠定了以塞姆利基森林病毒(semlikiforest virus,sfv)为载体包装成假病毒颗粒的实验基础。
[0164]
本发明采用塞姆利基森林病毒(semliki forest virus,sfv)为载体构建了一种包装体系,它包括两个独立的rna分子,一个rna分子是包含插入了egfp 荧光蛋白基因的rna复制子载体。另一个rna 分子是辅助rna,它包括 5
′
—3
′
复制信号和亚基因组启动子和编码结构蛋白的基因，这两个rna分子共转染细胞即包装成病毒样颗粒psfvcs
‑
egfp；然而，上述制备的病毒样颗粒psfvcs
‑
egfp融合表达了egfp蛋白和病毒衣壳蛋白，因此我们在此基础上又构建了去除病毒衣壳蛋白结构的复制子质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp，进而制备出病毒样颗粒psfv
‑
egfp。
[0165]
具体如下，本发明还提供了一种psfv
‑
egfp病毒样颗粒的制备方法，包括：
[0166]
(1)引物设计与合成：
[0167]
所述引物包括egfp
‑
f、egfp
‑
r，通用
‑
f和egfp
‑
r：具体的，根据snapgene 软件，采用同源重组技术设计引物egfp
‑
f、egfp
‑
r，并在金唯智科技有限公司(苏州)合成，设计引物如下表12：
[0168]
表12扩增egfp片段引物
[0169][0170]
(2)复制子质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp的构建：
[0171]
以上述psfvcs
‑
sp6
‑
egfp为模板，以egfp
‑
f，egfp
‑
r为引物扩增片段，然后经过酶切、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，构建得到复制子质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp；
[0172]
其中，步骤(2)包括：
[0173]
(2.1)以上述的psfvcs
‑
sp6
‑
egfp为模板，以egfp
‑
f，egfp
‑
r为引物扩增片段egfp片段；
[0174]
(2.2)用bamhi/bg1ii酶切双酶切质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp，得到酶切载体大片段；
[0175]
(2.3)将所述egfp片段和酶切载体大片段同源重组，得到重组产物；
[0176]
(2.4)将重组产物加入到感受态细胞dh5α细胞，进行重组产物转化；
[0177]
(2.5)将转化后的重组产物进行重组产物鉴定；
[0178]
(2.6)将鉴定后的重组产物提取质粒；
[0179]
(2.7)对所述质粒进行酶切鉴定及测序。
[0180]
具体的，作为本发明一优选的具体实施例，步骤(2)包括：
[0181]
(2.1)目的片段的扩增
[0182]
以psfvcs
‑
sp6
‑
egfp为模板(图3)，egfp
‑
f，egfp
‑
r为引物扩增片段， pcr体系和条件如下：
[0183]
表13 egfp片段扩增pcr体系
[0184][0185]
表14 egfp片段扩增pcr程序
[0186][0187][0188]
pcr扩增结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，在745bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将含有目的条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2ml的ep管中，进行胶回收，并测定dna浓度。
[0189]
(2.2)bamhi/bg1ii酶切双酶切质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp
[0190]
用bamhi/bg1ii酶切双酶切质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp，酶切体系共300ul，分成6管，每管50ul，体系如下表15：
[0191]
表15酶切体系
[0192][0193]
酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，在1508bp、11063bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将11063bp左右条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2ml的ep管中，进行胶回收，并测定dna浓度。
[0194]
(2.3)目的片段和酶切载体大片段同源重组
[0195]
胶回收结束后将目的片段和载体片段按照合适的体积，于冰上配置以下反应体系(表16)，温柔的轻轻摇匀后，在37℃水浴锅中孵育30min中，然后放置4℃或冰上冷却。
[0196]
表16同源重组体系
[0197]
[0198][0199]
(2.4)重组产物转化
[0200]
在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞dh5α细胞，取10μl重组产物加入到 100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。 42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2
‑
3min。加入900μl soc，37℃摇菌1h(转速200
‑
250rpm)。将相应含氯霉素抗性的lb平板固体培养基在 37℃培养箱中预热。5,000rpm离心5min，弃掉900μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒涂在有含氯霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养12
‑
16h。
[0201]
(2.5)重组产物鉴定
[0202]
过夜培养后，查看平板的菌落并挑取其中菌落进行菌液鉴定，至于加有含氯霉素抗性的lp培养基的2ml ep管中，在37℃的摇床中培养约5个小时，然后进行菌液鉴定,鉴定片段为1467bp，鉴定pcr体系如下表17：
[0203]
表17菌液鉴定pcr体系
[0204][0205]
取鉴定阳性的菌液100ul于加有含氯霉素抗性的lp培养基的50ml离心管中进行大摇，过夜培养。
[0206]
(2.6)提取质粒
[0207]
1.柱平衡步骤：向吸附柱cp3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液bl，12,000rpm(～13,400
×
g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0208]
2.取15ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm (～13,400
×
g)离心1min，尽量吸除上清。
[0209]
3.向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液p1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
[0210]
4.向离心管中加入500μl溶液p2，温和地上下翻转6
‑
8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组dna，造成提取的质粒中混有基因组dna片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
[0211]
5.向离心管中加入700μl溶液p3，立即温和地上下翻转6
‑
8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400
×
g)离心10min。注意：p3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
[0212]
6.将上一步收集的上清液用8.重复操作步骤7。
[0213]
移液器转移到吸附柱cp3中12,000rpm(～13,400
×
[0214]
g)离心30
‑
60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中。
[0215]
7.向吸附柱cp3中加入600μl漂洗液pw(请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm(～13,400
×
g)离心30
‑
60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中。
[0216]
9.将吸附柱cp3放入收集管中,12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱cp3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0217]
10.将吸附柱cp3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加 50
‑
100μl洗脱缓冲液eb，室温放置2min，12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min 将质粒溶液收集到离心管中。
[0218]
(2.7)酶切鉴定及测序：
[0219]
如下表18，用smai、bamhi双酶切，酶切体系共20ul
[0220]
表18酶切体系
[0221][0222][0223]
酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，结果如图7所示(m：依次是8000、 5000、3000、1500、1000、500)。条带经鉴定正确后，送去生工生物工程(上海) 股份有限公司进行测序。
[0224]
(3)将所述复制子质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp和辅助质粒sfv
‑
heleper进行体外转录；
[0225]
其中，步骤(3)包括：
[0226]
(3.1)线性化所述复制子质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp和辅助质粒sfv
‑
heleper；
[0227]
(3.2)将线性化后的复制子质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp和辅助质粒sfv
‑
heleper 进行体外转录。
[0228]
具体的，作为本发明一优选的具体实施例，步骤(3)包括：
[0229]
(3.1)线性化psfv
‑
sp6
‑
egfp及heleper
[0230]
如下表，用spei分别酶切psfv
‑
sp6
‑
egfp及sfv
‑
heleper。
[0231]
表19 spei酶切psfv
‑
sp6
‑
egfp
[0232][0233]
表20 spei酶切复制质粒helper
[0234][0235]
(3.2)线性化后的psfv
‑
sp6
‑
egfp及sfv
‑
heleper进行体外转录
[0236]
如下表21、22：根据mmessage mmachine sp6转录试剂盒(am1340，购自赛默飞)所述方法对线性化后的psfv
‑
sp6
‑
egfp及sfv
‑
heleper进行体外转录，体系如下：
[0237]
表21 psfv
‑
sp6
‑
egfp体外转录体系
[0238][0239]
表22 sfv
‑
helper体外转录体系
[0240][0241]
上述体系配好后37℃转录40min，然后加入1ul gtp 37℃继续转录2h,随后再加入
1ul turbo dnase37℃、15min。转录结束后分别吸取1ul转录产物，加入4ul的nuclease
‑
free water及6
×
loading buffer进行稀释，注意无菌操作及防止rna降解，然后在1％sds
‑
page中进行电泳实验，验证条带正确与否。
[0242]
(4)将所述复制子质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp和辅助质粒sfv
‑
heleper体外转录的mrna共电转入bhk细胞中，得到psfv
‑
egfp病毒样颗粒。
[0243]
具体的，作为本发明一优选的具体实施例，步骤(4)包括：
[0244]
(4.1)细胞提前传至t75方瓶中，当细胞汇合度达到80％时，进行实验
[0245]
(4.2)在冰上预冷1.5ml ep管和pbs，在
‑
20℃冰箱中预冷4mm比色杯(电极杯)
[0246]
(4.3)37℃预热6毫升培养基(含1％fbs dmem)
[0247]
(4.4)胰蛋白酶消化t75方瓶中细胞并用5毫升完全培养基重新悬浮
[0248]
(4.5)500g、4℃离心5分钟
[0249]
(4.6)弃去上清液，并用10ml冰冷pbs清洗细胞颗粒
[0250]
(4.7)500g、4℃离心5分钟，再次重复pbs清洗。
[0251]
(4.8)弃去上清液并完全去除残留的pbs,并用遇冷的780ul pbs重悬细胞，均分成三等份，每份含260ul的pbs细胞重悬液别置于预冷的1.5ml ep管。
[0252]
(4.9)第一份pbs细胞重悬液分别加入10ul的psfvcs
‑
sp6
‑
egfp及heleper 转录产物，第二份加入10ul的psfv
‑
sp6
‑
egfp及heleper转录产物,分别混匀放置冰上；第三份pbs细胞重悬液作为阴性对照不加入任何物质，也放置冰上。
[0253]
(4.10)将上述三种混合物分别转移到3个预冷的电极杯(4mm)中，设置电转仪条件同为100v，25ms，电击一次，电击后置于冰上1min
[0254]
(4.11)然后分别向电极杯中加入约400ul的含1％fbs dmem吹打混匀，随即转至t25方瓶中，并加入6ml含1％fbs dmem,放置37℃5％co2培养箱中进行培养。
[0255]
(4.12)电穿孔后8h至36h后，用倒置荧光显微镜进行观测比较实验组荧光强度强弱，待36h后冻融三次收取上清液。
[0256]
本发明在病毒样颗粒psfvcs
‑
egfp的基础上去除病毒衣壳蛋白融合表达，进而成功制备出病毒样颗粒psfv
‑
egfp，增强了egfp蛋白的表达，成功建立了一种以塞姆利基森林病毒(semliki forest virus,sfv)为载体高效表达其它重要外源蛋白的平台，为后续rna疫苗研制奠定实验基础。
[0257]
相应的，本发明还公开了一种psfv
‑
egfp病毒样颗粒，其由上述的制备方法制成。相较于其它载体拟采用塞姆利基森林病毒(semliki forest virus,sfv)的病毒样颗粒，本发明psfv
‑
egfp能够高效表达外源蛋白，且抑制病毒结构蛋白的表达。而且，其是一种复制缺陷型病毒，具有较高的生物安全性。
[0258]
相应的，本发明还公开了一种psfv
‑
egfp病毒样颗粒在rna疫苗、制备基因治疗药物、动物模型中的应用。
[0259]
实验结果：将上述psfvcs
‑
egfp和psfv
‑
egfp病毒样颗粒进行实验结果校验，具体如下；
[0260]
一、psfvcs
‑
egfp病毒样颗粒的制备
[0261]
(一)cs
‑
egfp扩增
[0262]
cs
‑
egfp片段扩增结果如图4所示，扩增的cs
‑
egfp片段是754bp,与理论值相符合。
其中，m由上至下分别为:5000,3000,2000,1500,1000,750；500；250；100， 1至7均是扩增的cs
‑
egfp片段。
[0263]
(二)bamhi酶切质粒psfvcs
‑
lacz
[0264]
bamhi酶切结束后进行0.8％核酸凝胶电泳鉴定，在3072bp、11851bp左右出现明显目的条带，如图5所示，图中，m由上至下分别
[0265]
为:15000,10000,7500,5000,3000,1500,1000,500。
[0266]
(三)重组质粒菌液鉴定
[0267]
分别挑取10个菌落，进行鉴定，如图2
‑
10大小均为413bp左右，与理论值大小相符合(如图6所示)。其中，m由上至下分别为:8000、5000、3000、1500、1000、500；1至9分别是单菌落鉴定片段。
[0268]
(四)酶切鉴定及测序
[0269]
用smai、bamhi双酶切,如图7所示片段大小分别为725bp、11051bp,与理论值大小相符合；其中，m由上至下分别:15000,10000,7500,5000,3000,1500， 1000，500；1：smai、bamhi双酶切片段。
[0270]
送至金唯智生物科技有限公司进行测序，测序结果完全相同。
[0271]
(五)复制子质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp和辅助质粒sfv
‑
heleper体外转录
[0272]
(1)用spei分别酶切psfvcs
‑
sp6
‑
egfp及heleper
[0273]
用spei分别酶切psfvcs
‑
sp6
‑
egfp及heleper，结果如图8所示，其中，m 由上至下分别:15000,10000,7500,5000,3000,1500，1000，500，1,2分别为spei 酶切heleper及psfvcs
‑
sp6
‑
egfp。线性化后的目的条带大小与理论值相符。
[0274]
(2)根据mmessage mmachine
tm sp6转录试剂盒(am1340，购自赛默飞)所述方法对psfvcs
‑
sp6
‑
egfp和辅助质粒sfv
‑
heleper进行体外转录的结果如图9、10所示，图9中，m由上至下分别:15000,10000,7500,5000,3000,1500， 1000，500；2为psfvcs
‑
sp6
‑
egfp体外转录电泳图；图10中，m由上至下分别:8000、5000、3000、1500、1000、500；1为sp6
‑
heleper体外转录电泳图。体外转录后目的条带大小与理论值相符合。
[0275]
(六)上述体外转录的psfvcs
‑
sp6
‑
egfp、sp6
‑
helper均10ul一起电转入 bhk细胞中(100v/25ms),然后接入t25方瓶中进行培养，24h在倒置荧光显微镜下观测荧光，有荧光表达，且有细胞病变发生；而阴性对照组既没有荧光表达，细胞有没有病变出现(图11、12)
[0276]
因此，由上述实验结果可知，本发明其以塞姆利基森林病毒为载体，成功制备了病毒样颗粒psfvcs
‑
egfp。
[0277]
二、psfv
‑
egfp病毒样颗粒的制备
[0278]
(一)egfp目的片段的扩增
[0279]
如图13扩增的egfp片段是754bp(泳道1),与理论值相符合。
[0280]
(二)bamhi/bg1ii酶切psfvcs
‑
sp6
‑
egfp
[0281]
bamhi/bg1ii酶切双酶切质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp，电泳结果如图14，目标大小为1508bp、11063bp左右，与理论相符。
[0282]
其中，m由上至下分别:15000,10000,7500,5000,3000,1500,1000,500；1
‑
5均为psfvcs
‑
sp6
‑
egfp酶切结果。
[0283]
(三)重组质粒菌液鉴定
[0284]
分别挑取10个菌落，进行鉴定，如图15所示，图中2
‑
10大小均为1472bp左右，与理论值大小相符合。其中，m由上至下分别:8000、5000、3000、1500、1000、500；1至10分别是单菌落鉴定片段。
[0285]
(四)酶切鉴定及测序
[0286]
用smai、bamhi双酶切,如图16所示片段大小分别为725bp、11051bp,与理论值大小相符合；其中，m由上至下分别:8000,5000,3000,1500，1000，500；1
‑
6:选取1
‑
6菌液鉴定成功的样品及提质粒后smai、bamhi双酶切片段。
[0287]
送至金唯智生物科技有限公司进行测序，测序结果完全相同。
[0288]
(五)复制子质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp和辅助质粒sfv
‑
heleper体外转录
[0289]
根据mmessagemmachinesp6转录试剂盒(am1340，购自赛默飞)所述方法对psfv
‑
sp6
‑
egfp和辅助质粒sfv
‑
heleper进行体外转录的结果，结果如图17所示。其中，m由上至下分别:8000、5000、3000、1500、1000、500；1为psfv
‑
sp6
‑
egfp体外转录电泳图，4、5同为sp6
‑
heleper体外转录电泳图。
[0290]
(六)上述体外转录的psfvcs
‑
sp6
‑
egfp、sfv
‑
helper及psfv
‑
sp6
‑
egfp、sfv
‑
helper一起电转入bhk细胞中(100v/25ms),然后接入t25方瓶中进行培养，24h在倒置荧光显微镜下观测荧光及进行对比，两者均有荧光，且后者荧光强度强于前者(图17)。
[0291]
综上可知，本发明在病毒样颗粒psfvcs
‑
egfp的基础上，去除病毒衣壳蛋白融合表达，进而成功制备出病毒样颗粒psfv
‑
egfp，增强了egfp蛋白的表达，为后续其它重要外源蛋白的表达筛选和rna疫苗研制提供可靠的实验基础和科学依据。
[0292]
需要说明的是，本发明使用的实验试剂和仪器如下：
[0293]
(1)试剂：
[0294]
dtaqdna聚合酶、10
×
pcrbuffermgcl2(25mm)、dntp(10mm)、marker、6
×
dnaloadingdye、10
×
tae、一步法快速感受态细胞制备试剂盒，sanprep柱式质粒dna少量抽提试剂盒、琼脂糖、dna柱式胶回收试剂盒购自生工生物工程股份有限公司；4sredplus核酸染色剂购自bbi血；胎牛血清(fetalbovineserum)、胰酶(0.25％trypsin
‑
edta)、dmem培养基(dmem/highglucose)、0.25％trypsin
‑
edta等试剂均来自gibco公司；组织基因组dna提取试剂盒购自天根；2xqpcrmix购自诺唯赞；18
‑
tvector、sybrpremixextaqtm(tlirnasehplus)(rr420a)、primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)(rr047a)、胶回收试剂盒(gelextractionkit)、stbl3感受态细胞、bamhi/asci限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司；rnapreppuretissuekit(dp431)购自tiangen；质粒提取试剂盒(plasmidminikit)购自omega公司；转染试剂lipofectamine3000regeant购自invitrogen公司；psfvcs
‑
lacz(#92076)购自addgene；egfp
‑
c1(9号楼)
[0295]
(2)仪器：
[0296]
生物安全柜1300seriesa2(thermo公司)；恒温水浴锅dk
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8d(一恒/上海)；二氧化碳培养箱forma371(thermo公司)；生化培养箱dhp
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9162(一恒/上海)；高性能高速台式冷冻离心机5804r(eppendorf/德国)；电热恒温培养箱dhp
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9162(一恒/上海)；涡旋振荡器vortex(thermo公司)；移液器researchplus(eppendorf/德国)；倒置显微镜dmi1(德国徕卡)；countstar细胞计数仪ic
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1000(上海睿钰生物科技有限公司)；荧光定量pcr仪7500
(abi)；microampoptical 96
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well reaction platen8010560(abi)；microamptm optical adhesivefilm4311971(abi)；洁净工作台sw
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cj
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2fd(苏净安泰)；荧光显微镜(leica，德国)；co2培养箱hf240(力康)；离心机neofuge 1600r(力康)；fc500 流式细胞仪(becton
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dickinson,美国)；高速离心机centrifuge 5840r(eppendorf 公司，德国)；超纯水仪(millipore公司，法国)；dyy
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6c型稳流稳压电泳仪 (北京六一)；h6
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1微型电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂)；fr980凝胶成像系统(上海复日科技有限公司)；sma4000微量分光光度计(merinton)； pcr反应扩增仪(bio公司)。
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以上所述的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
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