乌苏里拟鲿Y染色体序列的获取方法与流程

乌苏里拟鲿y染色体序列的获取方法
技术领域
1.本发明涉及水产养殖中性染色体分析技术领域，具体的涉及一种乌苏里拟鲿y染色体序列的获取方法。


背景技术：

2.鱼类普遍存在性别二态性，有些鱼类雄性生长速度明显大于雌性，而有些则是雌性生长速度大于雄性。在鱼类育种中，如果能充分利用这种性别生长差异，育成全雄或全雌品系，将为相应鱼类养殖产量的提高产生极大的推动作用。为了实现性别控制育种的目标，首先需要了解目标鱼类的性别决定机制，而获得性染色体序列是揭示其性别决定机制的重要突破口。
3.目前，对于xx-xy性别决定类型的鱼类而言，获得y染色体序列的主要方法是：1.利用雌激素处理xy遗传雄性的性腺未分化幼体，使之性逆转为生理雌性的伪雌性个体；2.将xy伪雌性个体饲养至性成熟后，与xy正常雄性个体交配产生后代；3.开发雄性特异分子标记，并利用分子标记从后代中鉴定出yy超雄性个体；4.利用三代基因组测序技术对yy超雄性个体测序，通过与已有的雌性基因组比对，获得y染色体序列。
4.乌苏里拟鲿（pseudobagrus ussuriensis）是分布于我国黑龙江至珠江水系的鲿科鱼类。由于味道鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱，同时其养殖技术难度不大、养殖病害少，养殖范围也在不断扩大，目前已在全国多省开展养殖。乌苏里拟鲿为xx-xy性别决定型鱼类，性别二态性特征非常明显，在二龄时，雄性个体大小可达雌性的3倍以上，因此，具有极大的全雄育种潜力。然而，目前对乌苏里拟鲿性别决定机制的认识非常有限，无法满足全雄育种的需要。


技术实现要素：

5.发明目的本发明要解决的技术问题在于提供一种乌苏里拟鲿y染色体序列的获取方法，能大幅缩短现有技术条件下获得y染色体序列所需时间，有力促进乌苏里拟鲿性别控制育种进程。
6.技术方案本发明提供了一种乌苏里拟鲿y染色体序列的获取方法，包括如下步骤：步骤一，构建种间杂交群体：挑选雌性圆尾拟鲿和雄性乌苏里拟鲿亲本通过人工催产与授精，构建杂交群体；步骤二，雄性杂交个体鉴定：取20尾饲养至3月龄的杂交个体，解剖取出性腺，利用体视显微镜观察性腺进行生理性别鉴定，并将每尾个体通过乌苏里拟鲿雄性特异分子标记进行遗传性别鉴定，将两种方法均鉴定为雄性的个体作为待检测样本；步骤三，雄性杂交个体三代基因组测序与组装：从待检测样本提取基因组dna后构建hifi测序文库，利用肌肉组织构建hi-c交联文库，进行三代基因组测序与染色体水平基因组组装；步骤四，与雌性基因组染色体比对获得y染色体序列：将组装获得的雄性乌苏里拟鲿的染色体序列与现有雌
性乌苏里拟鲿染色体序列进行比对，获得与x染色体同源的染色体，即y染色体序列。
7.优选地，步骤一中，所述雌性圆尾拟鲿的挑选标准为：腹部膨大、松软且富有弹性、仰腹可见卵巢轮廓、无伤病、体重在80克以上；所述雄性乌苏里拟鲿的挑选标准为：生殖突尖而长且末端泛红、体质强壮、无伤病、体重在200克以上。
8.优选地，在步骤一中，人工催产采用人工注射催产剂的方式进行。
9.优选地，所述催产剂采用10~15微克/千克的促黄体生成素释放激素类似物a2（lrh-a2）、1000~2000 iu/千克的人绒毛膜促性腺激素（hcg）与3~6毫克/千克的地欧酮（dom）三种药物配制得到。
10.优选地，雌性圆尾拟鲿共注射两针所述催产剂，第一针只注射lrh-a2，注射量为总注射剂量的20%～30%，间隔11~14小时后第二针注射余量；雄性乌苏里拟鲿注射一针所述催产剂，注射剂量为雌性圆尾拟鲿的60%。
11.优选地，步骤二中，所述通过性腺观察鉴定生理性别的标准为：性腺呈肉色或半透明白色，为两条短细线状结构，在体视显微镜下不可见颗粒状细胞，为雄性；性腺呈淡黄色，为两条长带状结构，在体视显微镜下可见颗粒状细胞，为雌性。
12.优选地，所述利用乌苏里拟鲿雄性特异标记鉴定遗传性别的标准为：在雄性特异位点能扩增出条带的为雄性；在雄性特异位点不能扩增出条带的为雌性。
13.优选地，步骤三中，所述hifi测序文库构建所用dna为利用大片段dna提取试剂盒抽提的高质量大片段dna。
14.优选地，在步骤三中，所述hi-c交联库构建所用肌肉组织样本为不少于1克的新鲜肌肉组织，且在建库前均用液氮保存。
15.优选地，步骤四中，所用雌性乌苏里拟鲿染色体序列采用nanopore三代测序技术获得。
16.有益效果（1）本发明采用圆尾拟鲿和乌苏里拟鲿的雄性杂交个体为测序样本，其y性染色体来自乌苏里拟鲿，x染色体来自圆尾拟鲿，利用这种远缘杂交个体可有效避免直接对乌苏里拟鲿xy雄性个体测序造成的x和y染色体序列相互干扰而无法正确组装，确保组装出的y染色体序列准确可靠；（2）本发明中待检测样本采用了生理性别和遗传性别同时鉴定的方法，使待检测样本的生理性别和遗传性别一致，从而确保能通过测序和组装获得乌苏里拟鲿y染色体序列；（3）本发明无需按照现有技术方法来构建yy超雄性个体，避免了人工性转、饲养至性成熟后再次人工繁殖、yy个体鉴定等繁琐操作，大大缩短了获得y染色体序列所需时间，有效降低了劳动强度，提高了工作效率。
17.综上，本发明所提供的一种乌苏里拟鲿y染色体序列的获取方法，能准确、高效地获取乌苏里拟鲿y染色体序列，大幅度缩短现有技术条件下获得y染色体序列所需时间，有效降低了获取y染色体序列信息的劳动强度，可有力促进乌苏里拟鲿性别控制育种进程。
具体实施方式
18.下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
19.实施例1一种乌苏里拟鲿y染色体序列的获取方法，包括如下步骤：步骤一，构建种间杂交群体：于2021年5月挑选腹部膨大、松软且富有弹性、仰腹可见卵巢轮廓、无伤病的雌性圆尾拟鲿6尾，平均体重95克；挑选生殖突尖而长且末端泛红、体质强壮、无伤病雄性乌苏里拟鲿3尾，平均体重268克；亲本挑选后于直径1.7米的圆形产卵池中暂养3天。于2021年5月20日7:00注射第一针催产剂，每尾雌性圆尾拟鲿注射5微克/千克的lrh-a2，雄性乌苏里拟鲿不注射。5月20日19:00注射第二针催产剂，每尾雌性圆尾拟鲿按照lrh-a
2 10微克 hcg 1500单位 dom 5毫克/千克注射，每尾雄性乌苏里拟鲿按照lrh-a
2 6微克 hcg 900单位 dom 3毫克/千克的剂量注射，之后将雌雄亲鱼放回产卵池。于5月21日6:00达到效应时间，挤出雌性圆尾拟鲿卵子于干燥的塑料盆中，将雄性乌苏里拟鲿精巢取出，在研钵中剪碎并研磨，并用0.65%生理盐水稀释，然后与雌性圆尾拟鲿的卵子混合进行人工授精。受精卵粘附在煮沸消毒过的棕榈片上，在21
ꢀ°
c水温条件下于5月24日5:00孵化出苗，共获得杂交个体约2000尾。
20.步骤二，雄性杂交个体鉴定：饲养至8月24日时，随机选取20尾杂交个体，利用解剖剪剪开每尾个体的腹部，取出性腺后，利用体视显微镜进行生理性别鉴定，发现有12尾个体的性腺呈肉色或半透明的白色，为两条短细线状结构，在体视显微镜下不可见颗粒状细胞，为雄性；8尾个体的性腺呈淡黄色，为两条长带状结构，在体视显微镜下可见颗粒状细胞，为雌性。提取上述20尾个体的dna，利用已研发的乌苏里拟鲿雄性特异分子标记（专利公开号：cn106811540b）进行pcr扩增和电泳分析，结果表明有12尾个体在雄性特异位点能扩增出清晰条带，为雄性；8尾个体在雄性特异位点不能扩增出条带，为雌性。对比结果表明20尾个体的生理性别和遗传性别均一致。
21.步骤三，雄性杂交个体三代基因组测序与组装：选取鉴定出的1尾雄性杂交个体，利用大片段dna提取试剂盒（德国qiagen公司产品）抽提其基因组dna，按照hifi文库构建试剂盒（美国pacbio公司产品）的操作说明构建hifi测序文库，利用pacbio平台进行三代基因组测序。取1.5克新鲜肌肉组织于液氮中保存，取0.1克组织利用hi-c建库试剂盒（北京百迈客生物公司产品）按照操作说明构建hi-c交联文库，并利用illumina hiseq x ten平台进行高通量测序。测序序列利用软件分别组装出了含26条染色体的雌性圆尾拟鲿和含26条染色体的雄性乌苏里拟鲿的染色体水平基因组序列。
22.步骤四，与雌性基因组染色体比对获得y染色体序列：将组装获得的雄性乌苏里拟鲿的染色体序列与本团队利用nanopore三代测序技术获得的雌性染色体序列进行比对，从而发现雄性乌苏里拟鲿的7号染色体与雌性x染色体同源，即雄性的7号染色体为y染色体， 序列长度为33.3 mb。
23.本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求范围内。