农杆菌侵染菜豆叶片实现目的基因瞬时过表达或瞬时沉默的方法

1.本发明涉及植物基因瞬时过表达和瞬时沉默技术领域，更具体地，涉及农杆菌侵染实现基因瞬时过表达和瞬时沉默技术领域，特别是指一种农杆菌侵染菜豆叶片实现目的基因瞬时过表达或瞬时沉默的方法。


背景技术：

2.菜豆(学名：phaseolus vulgaris linn)是一种可以食用的豆科植物，一年生缠绕或近直立草本。嫩荚或种子可作鲜菜，也可加工制罐、腌渍、冷冻与干制，营养成分丰富，是一种难得的高钾、高镁、低钠食品，能够提高人体免疫力、缓解慢性疾病，具有很高的食用和药用价值，因此深受人们的喜爱。但菜豆转基因是世界性的难题，限制了菜豆分子生物学和基因功能研究。
3.基因瞬时过表达技术是基因功能研究的常见手段，在越来越多的物种中得到应用。瞬时表达技术是指将目的基因通过植物表达载体导入植物活体组织内，并在一段时间内能够大量表达，快速地反映基因的功能，外源片段不能随细胞分裂而一同复制，导致表达时间短暂，且表达量随时间逐渐下降。基因瞬时表达的方法主要有农杆菌侵染和基因枪轰击植物组织，以及基于原生质体的转化方法，基因枪法对设备和成本要求较高，而原生质体对材料有较高要求，农杆菌转化法简单快捷，是最易于实施的方法，与稳定表达相比，瞬时表达所需时间短，不需要将目的基因整合到宿主细胞的染色体中，也能在细胞内建立起暂时高效的表达系统。由于其具有操作简单、成本低、周期短、转化效果好等优点，已被国内外众多学者广泛应用。其中，农杆菌介导的瞬时表达最为普遍。烟草、莴苣、水稻、马铃薯等多种作物的瞬时表达系统已逐渐完善。
4.rna干扰(rnai)是指在进化过程中高度保守的、由双链rna(dsrna)诱发的、同源mrna高效特异性降解的现象。具体地，rnai是指在真核生物中双链rna专一的rnaseiii家族的核酸内切酶
‑‑
dicer剪切双链rna或部分双链发夹结构产生20nt长度左右的sirna，然后形成rna诱导沉默复合体riscs，该复合体利用rna序列匹配，专一地识别靶标基因，在转录水平、转录后水平或翻译水平抑制靶标基因表达的现象。rnai普遍存在于大多数真核生物中，通过用农杆菌表达含有发夹结构的载体，植物识别发夹结构，阻断生物体内特定基因的表达，人为地使基因沉默，从而使植物表现出特定基因缺失的表型。rnai技术可以将目的基因进行瞬时沉默，为基因功能研究奠定基础。
5.目前，在菜豆中缺乏高效的瞬时表达应用体系。由于菜豆叶片中叶脉密集，非常不利于农杆菌注射，无法进一步将目的基因转入到菜豆叶片细胞中，使得转化效率低，这对于菜豆基因功能研究是非常不利的。
6.因此，希望提供一种农杆菌侵染菜豆叶片实现目的基因瞬时过表达和瞬时沉默的方法，其能够通过农杆菌侵染菜豆叶片，从而将目的基因瞬时表达载体或目的基因的rnai表达载体转入到菜豆叶片细胞中，实现目的基因的高效瞬时表达和高效沉默，有利于菜豆
基因功能研究。


技术实现要素：

7.为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种农杆菌侵染菜豆叶片实现目的基因瞬时过表达或瞬时沉默的方法，其能够通过农杆菌侵染菜豆叶片，从而将目的基因瞬时表达载体或目的基因的rnai表达载体转入到菜豆叶片细胞中，实现目的基因的瞬时过表达或瞬时沉默，有利于菜豆基因功能研究，适于大规模推广应用。
8.本发明的另一目的在于提供一种农杆菌侵染菜豆叶片实现目的基因瞬时过表达或瞬时沉默的方法，其操作简便快捷，可操作性强，节省人力物力，成本低，适于大规模推广应用。
9.为达到以上目的，本发明提供了一种农杆菌侵染菜豆叶片实现目的基因瞬时过表达或瞬时沉默的方法，其特点是，包括以下步骤：
10.(1)对菜豆植株的叶片不进行扎孔处理，将所述叶片浸入农杆菌侵染液中，所述农杆菌侵染液中的农杆菌含有目的基因瞬时表达载体或目的基因的rnai表达载体；
11.(2)在真空条件下进行真空渗透，使所述农杆菌侵染液渗入所述叶片中。
12.较佳地，在所述步骤(1)中，所述菜豆植株是红花青荚菜豆品种。
13.较佳地，在所述步骤(1)中，所述农杆菌侵染液包括10mm mgcl
2 6h2o、10mm mes和200μm乙酰丁香酮，所述农杆菌侵染液的ph为5.6，所述农杆菌侵染液的od
600
为0.5～0.7。
14.较佳地，在所述步骤(1)中，在将所述叶片浸入农杆菌侵染液中之前，将所述农杆菌侵染液预先静置。
15.较佳地，在所述步骤(1)中，所述目的基因瞬时表达载体为pcv-目的基因-gfp瞬时表达载体。
16.更佳地，在所述步骤(1)中，所述目的基因瞬时表达载体为pcv-pvvoz1-gfp瞬时表达载体。
17.较佳地，在所述步骤(1)中，所述的目的基因的rnai表达载体为pfgc-5941-目的基因正向片段-intron-目的基因反向片段表达载体。
18.更佳地，在所述步骤(1)中，所述的目的基因的rnai表达载体为pfgc-5941-pvtps9基因正向片段-intron-pvtps9基因反向片段表达载体。
19.较佳地，在所述步骤(2)中，所述真空渗透的时间为3min～6min。
20.较佳地，在所述步骤(2)之后，所述的农杆菌侵染菜豆叶片实现目的基因瞬时过表达或瞬时沉默的方法还包括以下步骤：
21.(3)取出所述叶片，对所述叶片喷施蒸馏水保湿。
22.本发明的有益效果在于：
23.a.本发明的农杆菌侵染菜豆叶片实现目的基因瞬时过表达或瞬时沉默的方法包括以下步骤：(1)对菜豆植株的叶片不进行扎孔处理，将叶片浸入农杆菌侵染液中，农杆菌侵染液中的农杆菌含有目的基因瞬时表达载体或目的基因的rnai表达载体；(2)在真空条件下进行真空渗透，使农杆菌侵染液渗入叶片中，因此，能够通过农杆菌侵染菜豆叶片，将目的基因瞬时表达载体或目的基因的rnai表达载体转入到菜豆叶片细胞中，实现目的基因的瞬时过表达或瞬时沉默，有利于菜豆基因功能研究，适于大规模推广应用。
24.b.本发明的农杆菌侵染菜豆叶片实现目的基因瞬时过表达或瞬时沉默的方法包括以下步骤：(1)对菜豆植株的叶片不进行扎孔处理，将叶片浸入农杆菌侵染液中，农杆菌侵染液中的农杆菌含有目的基因瞬时表达载体或目的基因的rnai表达载体；(2)在真空条件下进行真空渗透，使农杆菌侵染液渗入叶片中，因此，操作简便快捷，可操作性强，节省人力物力，成本低，适于大规模推广应用。
25.本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明和附图得以充分体现，并可通过说明书中特地指出的方法、手段和它们的组合得以实现。
附图说明
26.图1为对菜豆叶片进行农杆菌抽真空侵染的示意图及抽真空后浸润部位效果示意图，其中a、菜豆叶片农杆菌抽真空侵染示意图，其中1烧杯；2农杆菌侵染液；3菜豆植株；4叶片；5真空容器；6真空泵；b、菜豆叶片农杆菌浸润部位效果对比图，其中左边为对照，未抽真空植株；右边为抽真空植株。
27.图2为构建的目的基因瞬时表达载体pcv-pvvoz1-gfp的示意图。
28.图3为采用含有目的基因瞬时表达载体pcv-pvvoz1-gfp的农杆菌侵染液抽真空侵染菜豆叶片后，目的基因瞬时表达载体pcv-pvvoz1-gfp在菜豆叶片中瞬时表达的pvvoz1-gfp融合蛋白在共聚焦激光显微镜下的荧光成像结果照片。
29.图4为构建的目的基因的rnai表达载体pfgc-5941-pvtps9基因正向片段-intron-pvtps9基因反向片段的示意图，其中直线实心箭头所指为pvtps9基因正向片段，直线空心箭头所指为pvtps9基因反向片段。
30.图5为构建目的基因的rnai表达载体pfgc-5941-pvtps9插入pvtps9正向片段与反向片段pcr检测扩增产物电泳图，其中marker左边泳道和右边泳道采用的pcr模板和顺序均相同，因此，第4个pcr模板均扩增出相应产物，该pcr模板正确，均含有pvtps9基因正向片段和pvtps9基因反向片段。
31.图6为采用含有目的基因的rnai表达载体pfgc-5941-pvtps9基因正向片段-intron-pvtps9基因反向片段的农杆菌侵染液抽真空侵染菜豆叶片，使得菜豆叶片中pvtps9基因瞬时沉默，经qrt-pcr检测的菜豆叶片中pvtps9基因的转录水平相对表达量示意图，其中gus-rnai作为阴性对照，使用t检验分析平均表达值，柱状图上的字母不同表示显著差异(p＜0.05)。
具体实施方式
32.为了解决现有不能在菜豆叶片中快速、高效实现基因瞬时过表达和瞬时沉默的现状问题，本发明提供了一种农杆菌侵染菜豆叶片实现目的基因瞬时过表达或瞬时沉默的方法，包括以下步骤：
33.(1)对菜豆植株的叶片不进行扎孔处理，将所述叶片浸入农杆菌侵染液中，所述农杆菌侵染液中的农杆菌含有目的基因瞬时表达载体或目的基因的rnai表达载体；
34.(2)在真空条件下进行真空渗透，使所述农杆菌侵染液渗入所述叶片中。
35.在所述步骤(1)中，所述菜豆植株可以是任何合适的菜豆品种，较佳地，在所述步骤(1)中，所述菜豆植株是红花青荚菜豆品种。
36.在所述步骤(1)中，所述农杆菌侵染液可以具有任何合适的构成，较佳地，在所述步骤(1)中，所述农杆菌侵染液包括10mm mgcl
2 6h2o、10mm mes和200μm乙酰丁香酮，所述农杆菌侵染液的ph为5.6，所述农杆菌侵染液的od
600
为0.5～0.7。
37.在所述步骤(1)中，在将所述叶片浸入农杆菌侵染液中之前，所述农杆菌侵染液可以静置，也可以直接使用，较佳地，在所述步骤(1)中，在将所述叶片浸入农杆菌侵染液中之前，将所述农杆菌侵染液预先静置。静置的时间可以是例如3h。
38.在所述步骤(1)中，所述目的基因瞬时表达载体可以是任何合适的目的基因瞬时表达载体，较佳地，在所述步骤(1)中，所述目的基因瞬时表达载体为pcv-目的基因-gfp瞬时表达载体。其中的目的基因可以根据需要确定，更佳地，在所述步骤(1)中，所述目的基因瞬时表达载体为pcv-pvvoz1-gfp瞬时表达载体。
39.在所述步骤(1)中，所述的目的基因的rnai表达载体可以是任何合适的目的基因的rnai表达载体，较佳地，在所述步骤(1)中，所述的目的基因的rnai表达载体为pfgc-5941-目的基因正向片段-intron-目的基因反向片段表达载体。其中的目的基因可以根据需要确定，更佳地，在所述步骤(1)中，所述的目的基因的rnai表达载体为pfgc-5941-pvtps9基因正向片段-intron-pvtps9基因反向片段表达载体。
40.在所述步骤(2)中，所述真空渗透的时间可以根据需要确定，较佳地，在所述步骤(2)中，所述真空渗透的时间为3min～6min。
41.在所述步骤(2)之后，所述的农杆菌侵染菜豆叶片实现目的基因瞬时过表达或瞬时沉默的方法还可以包括其它任何合适的步骤，较佳地，在所述步骤(2)之后，所述的农杆菌侵染菜豆叶片实现目的基因瞬时过表达或瞬时沉默的方法还包括以下步骤：(3)取出所述叶片，对所述叶片喷施蒸馏水保湿，优选地，使得所述叶片的相对湿度保持在例如90％以上。
42.在所述步骤(3)中，所述保湿的时间可以根据需要确定，更佳地，在所述步骤(3)中，所述保湿的时间为12h。
43.为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york：cold spring harbor laboratory press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
44.实施例1
45.为了高效、快速、简便的用农杆菌侵染菜豆叶片以快速表达目的基因，以“红花青荚”菜豆品种为原材料(来自浙江勿忘农种业股份有限公司)，采用本发明的农杆菌侵染菜豆叶片实现目的基因瞬时过表达或瞬时沉默的方法在该菜豆品种的叶片中实现目的基因瞬时表达，具体包括以下步骤：
46.(1)目的基因瞬时表达载体的构建
47.1)以目的基因为菜豆的pvvoz1(phavul.003g073700)基因(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/xm_007153831.1？report＝genbank&log$＝nucltop&blast_rank＝1&rid＝16akumhz016)为例，设计pvvoz1基因cds区段的引物，并带上lic接头。
48.pvvoz1基因cds区段(1431bp)引物序列：
49.pvvoz1-cds-f：如seq id no：1所示
50.pvvoz1-cds-r：如seq id no：2所示
51.2)以菜豆叶片cdna为模板，通过pcr，获取扩增产物即目的基因片段，然后加入datp；
52.pcr反应体系：
[0053][0054]
pcr程序：95℃预变性3min；
[0055]
95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，循环32次；
[0056]
72℃延伸5min。
[0057]
3)用apai酶将pcv-gfp质粒线性化，获取线性化载体，然后加入dttp；
[0058]
4)将加入datp的目的基因片段和加入dttp的线性化载体，在t4聚合酶作用下，进行lic连接，获取连接产物；
[0059]
(2)大肠菌菌液的培养
[0060]
将步骤(1)中的连接产物通过热激转入大肠杆菌dh5 d感受态细胞，加入800μl液体无抗lb培养基，37℃，200rpm轻摇4h，4000rpm离心5分钟，弃大部分上清液，剩余200μl左右，吹打悬浮，均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基中，过夜培养，挑取单克隆菌落，通过测序确认，提取重组质粒即含有目的基因pvvoz1的瞬时表达载体pcv-pvvoz1-gfp；
[0061]
(3)农杆菌菌液的培养
[0062]
将含有目的基因pvvoz1的瞬时表达载体pcv-pvvoz1-gfp电转导入农杆菌gv3101感受态细胞中，加入800μl液体无抗lb培养基，28℃，200rpm轻摇1-2h，4000rpm离心5min，弃大部分上清液，剩余200μl左右，吹打悬浮，均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的lb固体培养基中，28℃培养。挑取含有目的基因瞬时表达载体的农杆菌单菌落，将容积为50ml的离心管中倒入20ml含有50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的lb液体培养基，再将挑取的农杆菌菌落接种于该液体培养基中，置于28℃、200rpm的摇床中培养过夜至浑浊且无白色絮状物；
[0063]
(4)菌体收集
[0064]
将步骤(3)中得到的农杆菌菌液置于离心管中，放入大型离心机中，5000rpm离心5min后，倒掉上清液；将得到的菌体分别用20mlddh2o悬浮，再置于大型离心机中，5000rpm离心5min后，倒掉上清液，目的是用蒸馏水洗去菌体中的抗生素和培养基，备用；
[0065]
(5)植物瞬时转染液的制备
[0066]
植物瞬转液中含有10mm mgcl
2 6h2o，10mm mes，200μm乙酰丁香酮，待其溶解后用
1m的naoh调整至ph＝5.6，蒸馏水定容至100ml；
[0067]
mes用作生物缓冲剂，乙酰丁香酮(as)用于诱导农杆菌vir基因的活化，从而促进目的基因的整合。
[0068]
(6)农杆菌侵染液的制备
[0069]
用移液枪吸取步骤(5)中制备的植物瞬转液2ml，吹打黏附在步骤(4)中的离心管底部的菌体，直至菌体完全溶解在植物瞬转液中，使菌体重悬，之后用分光光度计测定重悬后菌液的od
600
值，继续向离心管中加入植物瞬转液重悬，直至od
600
＝0.5，得到农杆菌侵染液；静置3h，备用；
[0070]
应保证重悬后农杆菌侵染液总量大于20ml，静置3h的目的是为了充分活化农杆菌，农杆菌侵染液体积大有利于农杆菌侵染液进入叶片组织；
[0071]
(7)农杆菌的侵染
[0072]
将步骤(6)中制备的农杆菌侵染液倒入烧杯内，将选取的菜豆植株的叶片浸入烧杯内的农杆菌侵染液的液面以下，将烧杯连带菜豆植株一起置于真空容器中，使用真空泵对真空容器抽真空，在真空下真空渗透3min，使农杆菌侵染液完全渗入叶肉组织(图1)。然后取出叶片，用蒸馏水喷施，保持90％相对湿度12h，利于农杆菌侵染；侵染48-96h即实现目的基因pvvoz1在菜豆叶片中的瞬时表达；
[0073]
(8)目的基因瞬时表达检测
[0074]
将步骤(7)中的植株叶片进行打孔，置于载玻片上，在共聚焦激光扫描显微镜下，在20倍镜下对叶片进行荧光成像，图3的荧光成像结果显示，pvvoz1-gfp融合蛋白主要定位于细胞膜和细胞核上，呈高度表达状态。
[0075]
实施例2
[0076]
为了高效、快速、简便的用农杆菌侵染菜豆叶片以基于rnai使目的基因下调，以“红花青荚”菜豆品种为原材料(来自浙江勿忘农种业股份有限公司)，采用本发明的农杆菌侵染菜豆叶片实现目的基因瞬时过表达或瞬时沉默的方法在该菜豆品种的叶片中实现目的基因瞬时沉默，具体包括以下步骤：
[0077]
(1)目的基因的rnai表达载体的构建1)以目的基因为菜豆的pvtps9(phavul.002g072400)基因(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/xm_007157410.1？report＝genbank&log$＝nucltop&blast_rank＝10&rid＝16b0ske9013)为例，设计pvtps9基因正向片段与pvtps9基因反向片段的引物，使pvtps9基因正向片段和pvtps9基因反向片段分别带上载体酶切位点两端的同源臂，构建载体pfgc-pvtps9-5941；以外源无关基因gus连接pfgc-5941，作为阴性对照。pfgc-gus-5941由宁波大学陈剑平院士团队馈赠，构建方法同pfgc-gus-5941。
[0078]
pvtps9基因反向片段(270bp)的引物序列：
[0079]
pvtps9-bamhi-f：如seq id no：3所示
[0080]
pvtps9-bamhi-r：如seq id no：4所示
[0081]
pvtps9基因正向片段(270bp)的引物序列：
[0082]
pvtps9-xbai-f：如seq id no：5所示
[0083]
pvtps9-xbai-r：如seq id no：6所示
[0084]
2)以菜豆叶片cdna为模板，通过pcr，分别获取扩增产物即目的基因正向片段和目
的基因反向片段；
[0085]
pcr反应体系：
[0086][0087]
pcr程序：95℃预变性3min；
[0088]
95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，循环32次；
[0089]
72℃延伸5min。
[0090]
3)用bamhi酶将rnai载体pfgc-5941线性化，获取线性化载体；
[0091]
4)将步骤2)中的目的基因正向片段利用同源重组的方法与步骤3)中线性化载体连接，转化大肠杆菌，经测序正确后获取重组质粒；
[0092]
5)用xbai酶将步骤4)中的重组质粒线性化，获取线性化载体；
[0093]
6)将步骤2)中的目的基因反向片段利用同源重组的方法与步骤5)中线性化载体连接，获取连接产物。
[0094]
(2)大肠菌菌液的培养
[0095]
将步骤(1)中的连接产物通过热激转入大肠杆菌dh5α感受态细胞，加入800μl液体无抗lb培养基，37℃，200rpm轻摇4h，4000rpm离心5分钟，弃大部分上清液，剩余200μl左右，吹打悬浮，均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基中，过夜培养，挑取单克隆菌落，以插入片段引物和载体上的通用引物作为检测引物，进行pcr检测(图5)后送测序，经测序正确后获得重组质粒即目的基因的rnai表达载体pfgc-5941-pvtps9基因正向片段-intron-pvtps9基因反向片段表达载体，简写为pfgc-5941-pvtps9(图4)。
[0096]
pcr检测引物序列：
[0097]
pvtps9基因正向片段的检测引物序列：
[0098]
pvtps9-bamhi-f：如seq id no：3所示
[0099]
intron-r：如seq id no：7所示
[0100]
pvtps9基因反向片段的检测引物序列：
[0101]
pvtps9-xbai-f：如seq id no：5所示
[0102]
pfgc-ocs-r：如seq id no：8所示
[0103]
目的基因的rnai表达载体pfgc-5941-pvtps9的结构为35s启动子 目的基因正向片段 intron 目的基因反向片段 ocs终止子。
[0104]
(3)农杆菌菌液的培养
[0105]
将目的基因的rnai表达载体pfgc-5941-pvtps9和pfgc-gus-5941电转导入农杆菌gv3101感受态细胞中，加入800μl液体无抗lb培养基，28℃，200rpm轻摇1-2h，4000rpm离心
5min，弃大部分上清液，剩余200μl左右，吹打悬浮，均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的lb固体培养基中，28℃培养。挑取含有pfgc-5941-pvtps9和pfgc-gus-5941的农杆菌单菌落，将容积为50ml的离心管中倒入20ml含有50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的lb液体培养基，再将挑取的农杆菌菌落接种于该液体培养基中，置于28℃、200rpm的摇床中培养过夜至浑浊且无白色絮状物；
[0106]
(4)菌体收集
[0107]
将步骤(3)中得到的含有pfgc-5941-pvtps9和pfgc-gus-5941的农杆菌菌液置于离心管中，放入大型离心机中，5000rpm离心5min后，倒掉上清液；将得到的菌体分别用20mlddh2o悬浮，再置于大型离心机中，5000rpm离心5min后，倒掉上清液，目的是用蒸馏水洗去菌体中的抗生素和培养基，备用；
[0108]
(5)植物瞬时转染液的制备
[0109]
植物瞬转液中含有10mm mgcl
2 6h2o，10mm mes，200μm乙酰丁香酮，待其溶解后用1m的naoh调整至ph＝5.6，蒸馏水定容至100ml；
[0110]
mes用作生物缓冲剂，乙酰丁香酮(as)用于诱导农杆菌vir基因的活化，从而促进目的基因的整合。
[0111]
(6)农杆菌侵染液的制备
[0112]
用移液枪吸取步骤(5)中制备的植物瞬时转染液2ml，吹打黏附在步骤(4)中的离心管底部的菌体，直至菌体完全溶解在植物瞬转液中，使菌体重悬，之后用分光光度计测定重悬后菌液的od
600
值，继续向离心管中加入植物瞬转液重悬，直至od
600
＝0.7，得到农杆菌侵染液；静置3h，备用；
[0113]
应保证重悬后农杆菌侵染液总量大于20ml，静置3h的目的是为了充分活化农杆菌，农杆菌侵染液体积大有利于农杆菌侵染液进入叶片组织；
[0114]
(7)农杆菌的侵染
[0115]
将步骤(6)中制备的带有pfgc-5941-pvtps9和pfgc-5941-gus(用于阴性对照)的农杆菌侵染液倒入烧杯内，将选取的菜豆植株的叶片浸入烧杯内的农杆菌侵染液的液面以下，将烧杯连带菜豆植株一起置于真空容器中，使用真空泵对真空容器抽真空，在真空下真空渗透6min，使农杆菌侵染液完全渗入叶肉组织(图1)。然后取出叶片，用蒸馏水喷施，保持95％相对湿度12h，利于农杆菌侵染；侵染48-96h即实现了目的基因pvtps9在菜豆叶片中的瞬时沉默；
[0116]
(8)利用qrt-pcr检测pvtps9基因沉默效率
[0117]
农杆菌侵染后60h，对菜豆叶片取样，同trizol法提取总rna。用逆转录试剂盒(诺唯赞，南京)逆转录成cdna。设计pvtps9基因的qrt-pcr检测引物，以pvactin11作为内参基因，进行qrt-pcr检测该基因下调情况。
[0118]
pvtps9基因(188bp)和内参基因pvactin11(190bp)的qrt-pcr检测引物序列：
[0119]
pvtps9-qrt-f：如seq id no：9所示
[0120]
pvtps9-qrt-r：如seq id no：10所示
[0121]
pvactin11-qrt-f：如seq id no：11所示
[0122]
pvactin11-qrt-r：如seq id no：12所示
[0123]
根据步骤(8)所得实验结果(图6)为，农杆菌转染后的菜豆叶片中的pvtps9基因的
表达下调80％以上。
[0124]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0125]
1)本发明基于目前在菜豆中难以高效、快速进行基因瞬时超表达和瞬时沉默的现状，提出的一种由农杆菌抽真空介导的在菜豆叶片中实现目的基因瞬时过表达和rnai瞬时沉默的方法，可实现目的基因在菜豆叶片中的高效瞬时表达，可实现rnai载体在菜豆叶片中的高效沉默；
[0126]
2)本发明通过对菜豆叶片组织进行抽真空处理，利用真空气压迫使农杆菌菌液向叶片组织流动，减小了对叶片的损伤，实现农杆菌对完整叶片的大面积侵染，在菜豆叶片中实现基因瞬时超表达和瞬时沉默，为菜豆功能基因分子生物学研究奠定基础；
[0127]
3)本发明通过活体不扎孔侵染，避免了一些遗传操作致死的缺点，抽真空后可继续保持生长状态，得到完整植株；
[0128]
4)本发明通过对抽真空后的植株进行高湿处理，由于抽真空可能会对植物叶片产生损伤而导致叶片萎蔫，本发明通过不扎孔抽真空后，对叶片进行蒸馏水喷施，并在保护罩上喷施大量蒸馏水，将植株罩住过夜，保持植株水分，避免了植株萎蔫死亡。
[0129]
因此，本发明针对目前在菜豆中难以进行基因的瞬时超表达和瞬时沉默，通过对菜豆叶片进行不扎孔抽真空侵染处理，减小了对叶片的损伤，实现对农杆菌介导的目标基因和rnai载体的转化，建立了基于农杆菌抽真空介导的菜豆叶片基因瞬时表达和瞬时沉默技术体系。此方法具有操作简单、转化周期短、转化效率高等优点。本发明用农杆菌真空侵染法在菜豆活体材料中实现目标基因瞬时高表达和目标基因瞬时下调，节省了转化周期和成本，为菜豆功能基因和分子生物学研究奠定了基础，具有较高的实用性和科研应用价值。同时该技术适用面广泛，还可用于大多数葫芦科植物。
[0130]
综上所述，本发明的农杆菌侵染菜豆叶片实现目的基因瞬时过表达或瞬时沉默的方法能够通过农杆菌侵染菜豆叶片，从而将目的基因瞬时表达载体或目的基因的rnai表达载体转入到菜豆叶片细胞中，实现目的基因的瞬时过表达或瞬时沉默，有利于菜豆基因功能研究，操作简便快捷，可操作性强，节省人力物力，成本低，适于大规模推广应用。
[0131]
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
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