使用尺寸排阻色谱与多角度光散射技术表征基因治疗病毒颗粒的制作方法

使用尺寸排阻色谱与多角度光散射技术表征基因治疗病毒颗粒
相关申请的交叉引用
1.本技术要求于2019年9月27日提交的美国临时专利申请序列号62/907,509和于2020年6月24日提交的美国临时专利申请序列号63/043,571的优先权，其全部内容以引用方式并入于本技术。
技术领域
2.本发明涉及使用尺寸排阻色谱和/或尺寸排阻色谱和多角度光散射技术来表征病毒颗粒，例如腺相关病毒和慢病毒颗粒。所公开的方法还可用于评估病毒颗粒的滴度、确定病毒颗粒的完整性和评估病毒颗粒中包裹的脱氧核糖核酸的量。


背景技术：

3.腺相关病毒(aav)是一种小型、复制缺陷、无包膜的动物病毒，可感染人类和其他一些灵长类动物。aav的几个特征使这种病毒成为以基因治疗方式递送治疗性蛋白的具有吸引力的载体，包括，例如，目前已知aav不会引起人类疾病和诱导温和免疫反应，并且aav载体可以感染分裂细胞和静止细胞，而不会整合到宿主细胞基因组中。
4.aavs由微小病毒科的大小范围为25nm的病毒颗粒家族组成。这些是具有二十面体蛋白外壳的无包膜病毒，由三种不同的包裹着长度约为4.7千碱基(kb)的单链dna基因组病毒蛋白(vp1、vp2和vp3)组成(balakrishnan et al.,curr gene ther 14,86-100,2014)。由于它们的相对安全性和长期基因表达，目前重组aav载体的不同血清型用于非临床和临床阶段的各种基因治疗项目。目前，全球有150项使用重组aavs(raavs)的基因治疗试验处于i、ii和iii期阶段，其中处于iii期临床试验，其中6项在美国进行iii期临床试验(http://www.abedia.com/wiley/search.php)。多年来已经开发了几种纯化方法来大规模生产这些病毒颗粒用于临床，取得了惊人的成功(brument et al.,mol ther 6,678-686,2002,qu et al.,j virolmethods 140,183-192,2007,okada et al.,hum gene ther 20,1013-1021,2009,mietzsch et al.,hum gene ther 25,212-222,2014,clement et al.,mol ther methods clin dev 3,16002,2016)。然而，开发稳健的分析来解释整个工艺开发和aav药物最终纯化产品中存在的所有变量仍然是一个处于发展中的领域。
5.重组慢病毒(rlvs)可将异源转基因(即非慢病毒(lv)原生基因)递送至造血干细胞，用以治疗腺苷脱氨酶缺乏症等遗传疾病(farinelli,et al,2014)、β-地中海贫血、镰状细胞病(negre et al.,2016)、严重的联合免疫缺陷、异染性脑白质营养不良、肾上腺脑白质营养不良、wiskott-aldrich综合征、慢性肉芽肿病(booth et al.,2016)和几种溶酶体贮积症障碍(rastall,et al.,2015)。
6.lv基因属于逆转录病毒家族。lv的特点是在宿主发病前潜伏期较长，其名称来源于拉丁语“lente”，意思为“缓慢”(milone and o’doherty,leukemia 32,1529-1541，2018)。通过对慢病毒衣壳的深入优化，在初始基因递送后无法复制的非致病性慢病毒载体
的成功生产确立了lv载体生物治疗的安全性和有效性。这些载体中的大多数建立在人类免疫缺陷病毒(hiv)基础上，hiv由包裹在排列成一个锥形衣壳的2,000个p24蛋白内的两条单链rna拷贝组成(milone and o’doherty,leukemia 32,1529-1541，2018)。衣壳完整性进一步受到pl7基质的保护，所有基质被一个直径约120nm的大致球形磷脂包膜包裹(milone and o’doherty,leukemia 32,1529-1541,2018)。这些达到百万道尔顿大小范围的巨大病毒颗粒能够包裹高达8.5kb的大型基因组(milone and o’doherty,leukemia 32,1529-1541，2018)31。这种单链rna基因组编码9个基因，其中5个是病毒生存和功能必不可少的基因，4个辅助基因，两侧是长末端重复序列(ltrs)(milone and o’doherty,leukemia 32,1529-1541，2018)。在为基因治疗目的而设计的重组lv载体中，磷脂包膜最常被可以识别普遍表达的脂蛋白(ldl)受体的水泡性口炎病毒g(vsv-g)包膜取代，从而能够在多种细胞类型中进行载体转导(milone and o’doherty,leukemia 32,1529-1541,2018)。此外，去除病毒辅助基因以增强载体安全性，并被治疗性基因表达盒取代。一般感染过程涉及载体包膜上的糖蛋白与其各自的细胞膜受体结合后，通过受体介导的内吞作用或膜融合进入细胞(milone and o’doherty,leukemia 32,1529-1541，2018)。病毒进入细胞后，基因组脱壳，释放的单链核糖核酸(ssrna)进行逆转录。然后新合成的cdna被转运到细胞核，整合到宿主基因组中。详细了解感染性步骤对于加强lv载体的合理设计是至关重要的。然而，这些步骤的许多方面还没有完全了解。
7.lv感染过程中基因组脱壳步骤是一个特别重要的领域。重要的是，递送的核糖核酸(rna)的逆转录仅在基因组脱壳成功时发生(milone and o’doherty,leukemia 32,1529-1541，2018)。因此，可以推断lv载体的细胞转导效率部分取决于它们的脱壳效率。迄今为止，关于lv基因组脱壳的确切信息知之甚少。然而，据推测降低局部ph值的变化会促进脱壳过程(milone and o’doherty,leukemia 32,1529-1541，2018)。此外，关于使用生物物理工具和表征方法来评估lv生物和物理特性之间的关系的文献很少。
8.基因治疗项目已显示基因拷贝数的存在和蛋白质表达以及潜在的副作用之间存在线性关系。8-10因此成功的基因治疗项目高度依赖于给药后的安全性和有效性结果，反过来又依赖于aav载体滴度测定和表征方法的精确性和准确性。不同的方法，如电子显微镜、动态光散射、分析超速离心(auc)、酶联免疫吸附试验(elisa)和聚合酶链反应(pcr)已用于跟踪纯化衣壳颗粒的不同属性，分别包括大小、聚集倾向、稳定性、空衣壳到完整衣壳的数量、衣壳和载体基因组滴度。尽管它们在基因治疗领域已使用了一段时间，但每种现有方法从低通量到高可变性都有其自身的相关局限性。
9.过去已经使用体积光密度测量方法来量化腺病毒制剂的载体基因组和衣壳蛋白的含量(maizel et al.virology 36,115-125,1968,mittereder et al.,j virol 70,7498-7509,1996,sweeney et al.,virology 295,284-288.,2002)。后来，类似的想法被应用于量化相对简单的结构化aav2衣壳颗粒的载体基因组和衣壳蛋白的含量(sommer et al.,mol ther 7,122-128,2003)。虽然，结果表明与现有方法(如qpcr和elisa)相比有很好的相似性，但一个主要局限性是溶液中会在相同的uv范围内吸收的外部杂质(如蛋白质、核酸和缓冲液成分)产生的显著影响。此外，由于该方法是衣壳溶液的批量测量，因此无法单独估计外部杂质和衣壳聚集体的量。由于这些潜在的局限性以及该方法无法具体量化衣壳内包裹的基因组，该方法的使用仅限于学术实验室和非临床试验。
10.基因治疗病毒颗粒的表征需要更有效的高通量技术。例如，需要能够对病毒颗粒进行计数并确定病毒浓度未知或难以确定病毒浓度的样品中病毒大小分布的准确方法。本发明公开的方法是高度可靠的，并能快速和自动化地对病毒颗粒进行大小分布分析和量化。


技术实现要素：

11.本发明提供了高通量和多用途表征方法，利用尺寸排阻色谱(sec)或sec与多角度光散射(mals)联用技术来监测病毒颗粒衣壳大小、高阶衣壳聚集体的存在、非衣壳化脱氧核糖核酸(dna)和蛋白质杂质、衣壳完整性、轻衣壳的数量、衣壳蛋白和包裹dna的分子量、衣壳滴度和基因组滴度。这些方法结合折射计和光散射利用衣壳蛋白和包裹的dna分别在紫外(uv)280纳米(nm)和uv260 nm处的吸光度特性，以在单次运行中监测aav衣壳的多个属性。因此急需一种能够计数病毒颗粒并确定病毒浓度未知或难以确定的样品中病毒大小分布的准确方法。病毒样品中此类特性的表征可能提供更多信息，以帮助缩短病毒制备条件优化和稳定配方确定的开发时间。按大小分离病毒颗粒可以评估病毒颗粒聚集体的数量，并产生更准确的病毒计数。一旦病毒颗粒聚集体被分离，它们的聚集状态(每个聚集体的单个病毒粒子数量和聚集体的几何形状)就可以进行表征。
12.本发明提供了使用sec和/或尺寸排阻色谱与多角度光散射联用(sec-mals)来表征和量化病毒颗粒(例如aav和lv颗粒)的方法、过程和系统。
13.sec，一种基于大小的分离技术，其优点是基于从固定相的孔隙中排除部分较大的物质将高阶聚集体与单体物质分离。该方法已用于流感颗粒等大型vlps(病毒样颗粒)，并使用这些分子的紫外吸收特性来监测它们的洗脱曲线。(vajda et al.j chromatogr a 1465,117-125.,2016,weigel et al.,j virol methods 207,45-53,2014,lagoutte et al.,j virol methods 232,8-11,2016,yang et al.,vaccine 33,1143-1150,2015,ladd effio et al.vaccine 34,1259-1267,2016)。如果结合多角度光散射(mals)和折射率(ri)检测器，该技术的实用性可以进一步增强。mals已广泛与sec或场流分级结合使用以确定聚合物的绝对分子量、大小、构象和分布以及蛋白质生物治疗剂(ye et al.,anal biochem 356,76-85,2006,wyatt et al.,analytica chimica acta 272,1-40,1993,zinovyev et al.,chemsuschem 77,3259-3268,2018,letourneau et al.,protein pept lett 25,973-979,2018,sahin et al.,methods molbiol 899,403-423,2012minton et al.,analbiochem 501,4-22,2016)。最近，一些研究表明，除了其他特性，光散射还可用于量化溶液中vlps(steppert et al.,j chromatogr a 1487,89-99,2017,mcevoy et al.,biotechnol prog 27,547-554,2011,weiet al.,j virol methods 144,122-132,2007,makra et dx.,methods 2,91-99,2015)。
14.本发明也描述了将sec-mals表征方法与各种生物物理工具结合进行开发和使用，以全面表征lv载体结构和稳定性随ph值的变化。值得注意的是，所描述的sec-mals方法被认为是一种无需校准曲线即可直接量化lv颗粒和评估其中lv颗粒滴度的快速且可重复的方法。此外，与已提出的基因组脱壳机制一致，本发明的结果表明lv衣壳在酸性条件下并不稳定。
15.一方面，各种实施例的方法、过程和系统包括以下步骤，先使用sec分析包含包裹
在衣壳内的载体基因组的病毒颗粒制剂样品，并通过sec分析表征和量化病毒颗粒。表征和量化包括量化制剂中病毒颗粒的聚集体，量化制剂中核酸和/或蛋白质杂质的浓度，确定衣壳和载体基因组的重均分子量(weight averaged molecular weights)，以及量化制剂中病毒颗粒和没有包裹载体基因组的衣壳的浓度。sec分析包括以下步骤，即通过尺寸排阻色谱进行样品分级(fractioning)、测量病毒颗粒的属性和表征病毒颗粒。测量包括测量级分(fractions)在约260nm和约280nm波长处的光吸收。在一项改进中，表征步骤包括当至少一个级分表现出第一波长与第二波长(第一波长：第二波长)的吸光度比率为1.13-1.75时，识别其中的病毒颗粒如aav。在各种实施例中，各种实施例的方法、过程和系统进一步包括步骤：在sec分析之前使用分析超速离心分析样品，以识别病毒颗粒和/或没有包裹载体基因组的衣壳。
16.另一方面，各种实施例的方法、过程和系统包括以下步骤：先使用sec和sec-mals分析包含包裹在衣壳内的载体基因组的病毒颗粒制剂样品，并通过sec和sec-mals分析表征和量化病毒颗粒。表征和量化包括量化制剂中病毒颗粒的聚集体，量化制剂中核酸和/或蛋白质杂质的浓度，确定衣壳和载体基因组的重均分子量，以及量化制剂中病毒颗粒和没有包裹载体基因组的衣壳浓度。sec分析包括以下步骤，即通过尺寸排阻色谱进行样品分级、测量病毒颗粒的属性和表征病毒颗粒。测量包括测量级分在约260nm和约280nm波长处的光吸收。在一项改进中，表征步骤包括当至少一个级分表现出第一波长与第二波长(第一波长：第二波长)的吸光度比为1.13-1.75时，识别其中的病毒颗粒如aav。sec-mals分析包括以下步骤，即通过尺寸排阻色谱进行样品分级、测量病毒颗粒的属性和表征病毒颗粒。测量包括级分的折射率、级分在紫外光谱内波长处的光吸收以及使用mals检测的级分的光散射强度。在各种实施例中，所述方法、过程和系统还进一步包括步骤：通过动态光散射分析确定制剂中病毒颗粒和/或没有包裹载体基因组的衣壳的大小分布。病毒颗粒的大小分布可以包括病毒颗粒的回转半径(rg)和/或流体动力学半径(rh)。在各种实施例中，量化各种实施例的制剂中病毒颗粒和没有包裹载体基因组的衣壳的浓度可以包括通过动态光散射分析确定病毒颗粒和/或没有包裹载体基因组的衣壳的rg和rh，其中rg与rh的比率与制剂中病毒颗粒的百分比浓度相关。在各种实施例中，其方法、过程和系统进一步包括步骤：在sec或sec-mals分析之前使用分析超速离心分析样品，以识别病毒颗粒和/或没有包裹载体基因组的衣壳。
17.另一方面，各种实施例的方法、过程和系统包括以下步骤，即使用sec分析含有包裹在衣壳内的载体基因组的病毒颗粒制剂的多个样品，然后通过sec分析监测每个样品中衣壳的结构完整性。每个样品都被修饰，具有与其他样品不同的属性。例如，属性是指在25℃下存储的时间长度。此外，样品之间蛋白质和核酸浓度的变化与衣壳结构完整性的变化相关。sec分析包括以下步骤，即通过尺寸排阻色谱分离样品、测量病毒颗粒的属性和表征病毒颗粒。测量包括测量级分在约260nm和约280nm波长处的光吸收。在一项改进中，表征步骤包括当至少一个级分表现出第一波长与第二波长(第一波长：第二波长)的吸光度比为1.13-1.75时，识别其中的病毒颗粒如aav。在各种实施例中，所述方法、过程和系统进一步包括步骤：在sec-mals分析之前使用分析超速离心分析样品，以识别病毒颗粒和/或没有包裹载体基因组的衣壳。
18.另一方面，各种实施例的方法、过程和系统包括以下步骤，即使用sec和sec-mals
分析含有包裹在衣壳内的载体基因组的病毒颗粒制剂的多个样品，然后通过sec和sec-mals分析监测每个样品中衣壳的结构完整性。每个样品都被修饰，成为具有与其他样品不同的属性。例如，属性是指在25℃下存储的时间长度。此外，样品之间蛋白质和核酸浓度的变化与衣壳结构完整性的变化相关。sec分析包括以下步骤，即通过尺寸排阻色谱进行样品分级、测量病毒颗粒的特性和表征病毒颗粒。测量包括测量级分在约260nm和约280nm波长处的光吸收。在一项改进中，表征步骤包括当至少一个级分表现出第一波长与第二波长(第一波长：第二波长)的吸光度比为1.13-1.75时，识别其中的病毒颗粒如aav。sec-mals分析包括以下步骤，即通过尺寸排阻色谱分离样品、测量病毒颗粒的属性和表征病毒颗粒。测量包括级分的折射率、级分在紫外光谱内的波长处的光吸收、以及使用mals检测的级分的光散射强度。在各种实施例中，方法、过程和系统进一步包括步骤：在sec-mals分析之前使用分析超速离心分析样品，以识别病毒颗粒和/或没有包裹载体基因组的衣壳。
附图说明
19.图1显示的是aav样品中轻、中间和重衣壳种类图。该图描绘了来自分析超速离心的0％和100％轻衣壳材料的沉降。轻衣壳的沉降通过约50-60s峰描绘，而重衣壳沉降为-80-100s。中间衣壳通过重衣壳峰约70-80s的肩部描绘。
20.图2a、2b、2c、2d、2e和2f是通过尺寸排阻色谱uv吸光度值所得的滴度计算图。图2a显示了重aav样品的280nm和260nm吸光度曲线。图2b显示了轻aav样品的280nm和260nm吸光度曲线。图2c显示了衣壳滴度拟合的线性回归模型。图2d显示了vg滴度与轻衣壳含量(n＝3)的函数关系。图2e显示了通过紫外吸光度值与轻衣壳含量的函数关系计算得到的衣壳滴度被低估，且vg滴度被高估，分别拟合成指数和线性回归(n＝3)。图2f显示了260nm和280nm吸光度比率与轻衣壳(n＝3)的函数关系拟合的多项式回归模型。
21.图3a和3b是通过尺寸排阻色谱法计算滴度的衣壳和载体基因组标准曲线图。图3a显示了280nm吸光度相对于衣壳载量(n＝3)的图。图3b显示了260nm吸光度相对于载体基因组载量(n＝3)的图。
22.图4a、4b、4c和4d是强调多角度光散射测量衣壳和包裹的dna的质量和摩尔质量并实现滴度计算的图。图4a是重aav样品的光散射色谱图，显示了衣壳蛋白和包裹的dna的摩尔质量。图4b是轻aav样品的光散射色谱图，显示了衣壳蛋白和包裹的dna的摩尔质量。图4c显示了衣壳质量和包裹dna质量分别与轻衣壳含量(n＝3)的函数关系拟合的线性回归模型。图4d显示了衣壳摩尔质量和包裹的dna的摩尔质量分别与轻衣壳含量(n＝3)的函数关系拟合的线性回归模型。
23.图5a、5b、5c和5d显示在多角度光散射滴度计算中对轻和中间衣壳的说明图。图5a显示了多角度光散射获得的蛋白质占比(protein fraction)与轻衣壳含量(n＝3)的趋势。图5b显示了通过光散射质量计算而得的重衣壳百分比相对于通过线性回归模型(n＝3)拟合计算而得的预期轻衣壳百分比的图。图5c显示了载体衣壳和载体基因组滴度与轻衣壳(n＝3)的函数关系拟合的线性回归模型。图5d显示了通过多角度光散射计算而得的衣壳/载体基因组比率相对于含有0-100％轻衣壳样品的预期值拟合的线性回归模型(n＝3)。
24.图6a和6b显示了来自mals的衣壳和载体基因组与理论值的差异图。对于含有0-100％轻衣壳(n＝3)的aav样品，计算衣壳和载体基因组与理论值的百分比差异。阴影区域
突出显示与理论值的
±
5％差异。
25.图7a、7b、7c、7d、7e和7f显示了重和轻衣壳热稳定性的sec-mals分析图。图7a显示了重衣壳样品从25℃到95℃以10℃为间隔进行孵育的280nm吸光度曲线。图7b显示了轻衣壳样品从25℃到95℃以10℃为间隔进行孵育的280nm吸光度曲线。图7c显示了重衣壳和轻衣壳的单体280nm峰值吸光度百分比与温度(n＝3)的函数关系，拟合的玻尔兹曼s形回归模型。重衣壳模型的v50值(50.03℃)由垂直虚线表示。图7d显示了重衣壳和轻衣壳的单体峰a60/a280与温度的函数关系(n＝3)。经重衣壳数据拟合的玻尔兹曼s型回归模型得到的v50值(61.22℃)由垂直虚线表示。图7e显示了单体重和轻衣壳种类的流体动力学半径(rh)和回转半径(rg)与温度的函数关系(n＝3)。图7f显示了重和轻衣壳蛋白和包裹dna的摩尔质量与温度的函数关系(n＝3)。经重衣壳dna数据拟合的玻尔兹曼s型回归模型得到的v50值(57.89℃)由垂直虚线表示。
26.图8a显示了具有代表性的sec和高效液相色谱(hplc)曲线。插图显示了260nm处标记峰的100倍放大，插表标识了曲线中的每个峰。每个峰使用基于pcr的方法进行识别。
27.图8b显示了aav衣壳颗粒的sec代表性洗脱曲线。
28.图9a、9b和9c显示了通过监测sec峰面积的变化对衣壳稳定性进行分析。腺相关病毒(aav)样品在25℃下保存0、1、3、5、7、10、14、21和28天。外部(extraneous)脱氧核糖核酸(dna)峰的％峰面积线性增加了约2倍，这表明衣壳的稳定性发生了变化。
29.图10a、10b和10c显示了sec洗脱的衣壳和包裹载体基因组的多角度光散射(mals)分析。
30.图11和12显示了从aav样品的sec-mals分析中获取的数据示例。
31.图13a、13b和13c是突出显示aav颗粒的dna质量随着轻衣壳浓度的增加而线性下降的图，而因为衣壳的总浓度(完整或空)没有变化，所以蛋白质质量保持不变。
32.图14a是突出显示通过mals测量的aav颗粒(衣壳和dna)的总分子量(mw)的图，显示mw随着轻衣壳浓度的增加而降低。
33.图14b和14c显示了如图14a所示的aav颗粒的总mw随着dna部分的mw降低而降低的图。图14b和14c还显示，dna部分的分子量随着轻衣壳浓度的增加而线性降低，而无论轻衣壳的占比如何，衣壳的分子量保持恒定。
34.图15是aav样品中包裹的dna的琼脂糖凝胶经溴化乙锭染色形成的荧光图。
35.图16显示了轻、中间和重衣壳沉降图。
36.图17a、17b和17c显示了完整衣壳浓度、衣壳浓度和载体浓度的百分比相对于轻衣壳百分比的图。
37.图18a和18b显示了通过mals计算的不同aav样品之间的mw和大小分布的比较图。
38.图19显示了使用sec-mals数据估计空衣壳颗粒百分比的图。
39.图20a、20b、20c和20d显示了使用sec-mals估计aav颗粒的衣壳和载体基因组滴度的图。
40.图21提供了lv样品的sec洗脱曲线。在纯化的lv样品进样后收集级分1-12，选择圆圈标记的级分进行p24和微滴式数字pcr(droplet digital pcr)(ddpcr)分析。这些分析证实了在色谱柱的空隙体积中洗脱的lv颗粒的存在，表现为19分钟标记处附近的峰。25到45分钟之间的剩余峰代表蛋白质或核酸样品杂质。
41.图22提供了缓冲盐浓度对lv sec曲线的影响。将50μl纯化lv样品进样后，通过280nm处的uv吸光度检测sec洗脱曲线。包含300mm nacl(粗线)或150mm nacl(虚线)的ph 7.40的20mm tris用作洗脱缓冲液，流速为0.300ml/min。
42.图23a和23b提供了lv样品的sec-mals洗脱曲线。图23a提供了lv样品一式三份40μl进样后通过280nm处的uv吸光度检测的平均sec洗脱曲线。图23b提供了将相同样品进样后获得的相应平均mals曲线。17分钟标记处附近出现显著光散射峰，进一步支持p24和ddpcr数据，表明lv颗粒在柱的空隙体积中洗脱。
43.图24a和24b提供了lv样品的mals数量密度分析的线性模型。图24a提供了在10μl、20μl、40μl和80μl lv样品一式三份进样后获得的平均mals峰曲线。不管进样体积(injection volume)如何，在17分钟处洗脱的颗粒平均mw都是一致的(～1.25x108da)，mals信号的强度与进样体积成正比。图24b提供了sec-mals方法的校准曲线，将sec-mals测量的数量密度与样品进样体积相关联。线性模型的有效性通过f检验统计方法获得的95％置信区间得以证实，平均相关系数为0.9947。
44.图25a和25b提供了lv颗粒的sec-mals ph稳定性分析。图25a提供了透析至ph 4.00、ph 7.40和ph 10.00的lv颗粒一式三份25μl进样后，通过280nm处的uv吸光度检测的平均sec洗脱曲线。衣壳的洗脱表现为进样后约17分钟处观察到的峰。与ph 7.00lv颗粒的sec曲线相比，ph 4.00lv峰几乎可以忽略不计，而ph 10.00峰扩大了。图25b提供了平均mals峰曲线，与上述sec曲线中看到的趋势相同。
45.图26提供了lv颗粒蛋白的圆二色性(cd)二级结构分析与ph的函数关系(as a function of)。将ph为4.00、7.40和10.00的lv颗粒的cd曲线叠加。曲线特征，包括210nm和220nm处的双极小值，表明lv颗粒在ph 7.40和10.00时主要是α-螺旋构象。这种构象在ph 4.00时完全消失。
46.图27a和27b提供了lv颗粒的动态光散射(dls)熔解(melting)曲线与ph的函数关系。图27a提供了lv颗粒在ph 6.00、ph 7.40和ph 10.00下的热曲线比较，通过监测dls评估的lv颗粒流体动力学直径与温度的函数关系得到。每个ph值样品的熔解温度由垂直虚线表示。图27b提供了一个lv熔解温度的统计显著性差异随ph变化的条形图。
47.图28a和28b提供了lv颗粒的sec-mals盐稳定性分析。图28a提供了透析至0mm、300mm和1mm nacl的lv颗粒一式三份25μl进样后，通过280nm处的uv吸光度检测的平均sec洗脱曲线。衣壳的洗脱表现为进样后约17分钟处观察到的峰。图28b提供了对应于上述图28a中sec曲线的平均mals峰曲线。
48.图29提供了lv盐样品的cd曲线。
49.图30a和30b提供了lv颗粒的dls升温梯度(thermal ramp)与盐的函数关系。图30a提供了在0mm、300mm和1mm nacl下的lv颗粒的热曲线比较，通过监测dls评估的lv颗粒流体动力学直径与温度的函数关系得到。每个盐样品的熔解温度由垂直虚线表示。图30b提供了一个lv熔解温度的统计显著性差异与盐的函数关系的条形图。
50.图31a、31b、31c和31d提供了使用内部荧光和圆二色性对空的和完整的raav5衣壳的初始热稳定性分析。图31a显示了空衣壳和完整衣壳的代表性内部荧光曲线的一阶导数，表明两个衣壳的蛋白质的熔解温度约为90℃，与先前报道的由dsc测定的aav5熔解温度一致。图31b提供了空衣壳和完整衣壳的代表性远紫外cd光谱，显示了210nm和270nm处的吸光
度差异。在空衣壳光谱中观察到的210nm附近的显著性最小值表明空衣壳蛋白比完整衣壳蛋白具有更多的α-螺旋构象。完整衣壳包裹的dna在270nm处显示有吸收，而在未包裹dna的空衣壳中并没有看到。图31c提供了空衣壳和完整衣壳的熔解曲线比较，通过监测220nm处的cd椭圆率与温度的函数关系得到。两种衣壳类型的熔解温度都在90℃左右，由垂直虚线表示，而仅在完整衣壳中观察到双相事件的开始，见箭头指示。图31d提供了空衣壳和完整衣壳的熔解曲线的比较，通过监测270nm处的cd椭圆率与温度的函数关系得到。同样，两种衣壳类型的熔解温度均为90℃，由垂直虚线表示，而仅在完整衣壳中观察到箭头所指的在熔解温度之前观察到的双相事件。
51.图32a、32b、32c和32d提供了空衣壳和完整raav5衣壳的sec-mals热稳定性分析。图32a提供了将空衣壳从25℃到95℃以10℃为间隔进行孵育后一式三份进样所得的平均sec洗脱曲线，通过280nm的uv吸光度进行检测。衣壳的洗脱表现为进样后约11分钟处观察到的显著峰。空衣壳的sec曲线保持相对恒定，到75℃时主峰大小减少有限，随后由于蛋白质衣壳在85℃和95℃间熔解而急剧下降。图32b提供了不同温度孵育下的完整衣壳一式三份进样后所获得的平均sec的uv 280nm洗脱曲线。完整衣壳的sec曲线的变化始于45℃，在45℃和65℃之间观察到显著峰大小下降。图32c提供了空衣壳和完整衣壳的主要uv峰百分比的测量和绘图，显示出衣壳完整性与温度的函数关系呈现下降趋势。图32d提供了空衣壳和完整衣壳的主mals峰值的百分比，反映了与uv峰值百分比相同的趋势。
52.图33a和33b提供了衣壳蛋白和包裹的dna分子量与温度的函数关系的mals分析。图33a显示了空衣壳和完整衣壳的蛋白质衣壳的分子量与温度的函数关系。图33b显示了空衣壳和完整衣壳内包裹dna的分子量与温度的函数关系。
53.图34a、34b和34c提供了使用sybr金染料对空的和完整的raav5衣壳的外部荧光分析。图34a提供了一种外部荧光测定方案。图34b显示了与完整衣壳混合的sybr金染料的荧光光谱与温度的函数关系。图34c显示了对完整衣壳和空衣壳的荧光曲线下总面积与温度的函数关系进行测量并绘制的图。获得了完整衣壳的双相拟合，而空衣壳在该图上没有显示任何趋势。垂直虚线表示所观察到的完整衣壳的两个转变温度中最大值的一半。
54.图35a和35b提供了内部和vigene aav5样品的琼脂糖凝胶图。图35a显示了包被一系列单链基因组大小的aav5衣壳的琼脂糖凝胶图。图35b显示包被来源于vigene biosciences的3.5kb或4.5kb基因组的aav5衣壳的琼脂糖凝胶图。
55.图36a、36b、36c和36d提供了外部荧光分析以确定dna载量对raav5衣壳完整性的影响。图36a和36c提供了与包裹具有可变大小的dna的衣壳混合的sybr金染料的荧光光谱，同时计算和绘制来源a和来源b的衣壳的曲线下面积与温度的函数关系的图。图36b和36d提供了raav5衣壳转变温度的统计显著差异与来自于来源a和来源b的衣壳包裹基因组大小的函数关系的条形图。随着包裹基因组大小的增加，作为衣壳降解指标的转变温度降低。
56.图37a、37b、37c和37d提供了sec分析以确定dna载量的增加对raav5衣壳完整性的影响。样品2衣壳(图37a)、样品4衣壳(图37b)和样品6衣壳(图37c)分别经过25℃、55℃和75℃30分钟后的sec曲线。样品的选择是基于如本发明图22中的碱性凝胶图所示的衣壳dna载量的增加。虽然所有样品在25℃(均匀的raav5衣壳峰)和75℃(《10％的原始峰)下都显示出相似的曲线，但三个样品中每一个样品在55℃下获得的曲线会根据每个衣壳的转变温度基于包裹基因组大小的不同而发生变化。
具体实施方式
详细说明
57.在此，病毒颗粒(如aav或lv)的生物物理表征通过使用sec或sec-mals实现。特别是，这些方法用于量化制剂中病毒颗粒的聚集，量化制剂中核酸和/或蛋白质杂质的浓度，确定衣壳和载体基因组的重均分子量，量化制剂中病毒颗粒和没有包裹载体基因组的衣壳浓度，确定制剂中病毒颗粒和/或没有包裹载体基因组的衣壳的大小分布，并监测衣壳的结构完整性。
58.此外，通过使用sec-mals、cd、dls和荧光评估衣壳结构，实现了aav(非包膜)或lv(包膜)颗粒的生物物理表征。特别是，这些方法用于确定病毒颗粒大小和病毒衣壳失稳。衣壳完整性与ph值呈正相关。此外，高离子条件有助于稳定lv衣壳。最后，识别了包裹基因组大小在调节aav衣壳热稳定性中的作用。这些生物物理工具(sec和mals)的联合使用可作为阐明基因治疗病毒载体的综合表征和结构功能的有效手段。一般技术
59.除非另有说明，本方法的实施将采用细胞生物学、分子生物学、细胞培养、病毒学等本领域技术人员的常规技术。这些技术已在当前文献中充分公开，具体参考sambrook,fritsch和maniatis eds.,"molecular cloning，a laboratory manual",2nd ed.,cold spring harbor laboratory press(1989)；celis j.e."cell biology，a laboratory handbook"academic press,inc.(1994)和bahnson et al.,j.ofvirol.methods,54:131-143(1995)。此外，本说明书中引用的所有出版物和专利申请都表明了这些方法所属领域的技术人员的技术水平，因此通过引用将其整体并入本文。定义
60.在整个本发明中，使用了几个术语，定义如下。
61.尽管开放式术语“包括”作为非限制性术语的同义词，例如包括、包含或具有，在本发明中用于描述和要求保护本技术的实施例，可以替代使用更多限制性术语描述实施例，例如“由
……
组成”或“基本上由
……
组成”。
62.如本发明所用，术语“大约”在应用于值时表示在计算或测量时允许值有一些轻微的不精确性(通过某种方法接近值的准确性；近似或合理地接近该值；几乎)。如果由于某种原因，由“大约”规定的不精确性在本领域中没有以这种常规含义理解，那么本发明所用的“大约”至少表示可能由测量或使用此类参数的常规方法引起的变异。
63.如本发明所用，术语“和/或”包括相关列出项目的一个或多个中任何一个和所有组合。
64.术语“病毒颗粒”或“病毒粒子”是指具有蛋白质外壳的rna或dna核心，并且取决于病毒，可能核心和蛋白质包含外部包膜。示例性病毒颗粒是aav颗粒、lv颗粒、腺病毒颗粒、甲病毒颗粒、疱疹病毒颗粒、逆转录病毒颗粒和痘苗病毒颗粒。
65.术语“衣壳颗粒”是指可能包含或不包含rna或dna核心的蛋白质外壳。例如，不包含rna或dna核心的衣壳颗粒也可以描述为空的或轻的衣壳颗粒，或者空的或轻的衣壳。包含rna或dna核心的衣壳颗粒也可以描述为完整的衣壳颗粒或病毒颗粒或病毒粒子，具体取决于病毒类型(例如，没有外部包膜的病毒)。
66.如本发明所用，“aav载体”是指单链或双链核酸，具有位于蛋白质编码序列侧翼的
aav 5'反向末端重复(itr)序列和aav 3'itr(优选地，功能性治疗性蛋白质编码序列；例如，fviii、fix和pah)可操作地连接至与aav病毒基因组异源的转录调控元件，即，一种或多种启动子和/或增强子，以及任选地，聚腺苷酸化序列和/或插入在蛋白质编码序列外显子之间的一个或多个内含子。单链aav载体是指存在于aav病毒颗粒基因组中的核酸，并且可以是本发明公开的核酸序列的有义链或反义链。这种单链核酸的大小以碱基表示。双链aav载体是指存在于质粒dna中的核酸，例如puc19，或双链病毒例如杆状病毒的基因组，用于表达或转移aav载体核酸。这种双链核酸的大小以碱基对(bp)表示。
[0067]“aav病毒粒子”或“aav病毒颗粒”或“aav载体颗粒”或“aav病毒”是指如本发明所述的由至少一种aav衣壳蛋白和包裹的多核苷酸aav载体组成的一种病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸(即除野生型aav基因组之外的多核苷酸，例如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，则通常将其称为“aav载体颗粒”或简称为“aav载体”。因此，aav载体颗粒的生产必然包括aav载体的生产，因为这样的载体包含在aav载体颗粒中。
[0068]
术语“慢病毒”是指一组复杂的逆转录病毒，而术语“重组慢病毒”是指来自于被工程改造后不能复制但可以在培养细胞(例如293t细胞)中产生的慢病毒基因组(例如hiv-1基因组)的重组病毒，并可以将基因递送到目的细胞。
[0069]
术语“泡状病毒”是指弹状病毒科中的负义单链逆转录病毒属。
[0070]
术语“包膜蛋白”是指在病毒表面决定病毒可以转导的物种和细胞类型的跨膜蛋白。
[0071]
术语“假分型”是指用来自异源病毒的组分替换病毒的任何组分。特别地，“假分型”表示包含不同于野生型包膜的包膜并因此具有修饰向性的重组病毒。在假型慢病毒的情况下，它们是含有异源包膜的慢病毒，该包膜来源于非慢病毒或慢病毒的不同种或亚种，例如来源于另一种病毒，或细胞来源的，或包膜被另一种病毒或细胞的细胞膜蛋白替代。
[0072]
术语“vsv包膜”是指来自水疱性口炎病毒(vsv)的弹状病毒的包膜蛋白。这种蛋白质经常也被称为vsv-g蛋白质，其中“g”是指糖蛋白。弹状病毒的包膜蛋白是唯一糖基化的弹状病毒蛋白。
[0073]“尺寸排阻色谱”(sec)，也称为“凝胶过滤色谱”，是指一种色谱方法，通过凝胶过滤方法基于分子大小将其分离。
[0074]
术语“分级”是指通过sec凝胶基质分离不同分子量的分子。使用这种分离方法，目的分子应落在凝胶的分离范围内。术语“级分”是指从sec凝胶基质上洗脱下来的分子峰。
[0075]
术语“流速”是指每单位时间通过sec柱的给定横截面积的流体体积。一般来说，中等流量提供最高分离度。流速与所使用的介质类型有关。中等流速使分子有时间完全进入固相的表面，使较小mw的物质有时间进入孔隙，从而提高不同mw物质的区分。流速太慢会降低分离度，因为峰或带在穿过色谱柱时会过度扩散。
[0076]“多角度光散射”(mals)是指一种测量被样品散射成多个角度的光的技术。该技术可通过检测分子如何散射光来确定溶液中分子的绝对摩尔质量和平均大小。“多角度”术语是指在不同离散角度处检测散射光，例如，通过所选特定角度的范围内移动的单个检测器或固定在特定角度位置的检测器阵列来测量。mals测量值通常表示为散射强度或散射辐照度。
[0077]“折射率增量”或“dn/dc”是一个常数，表明折射率随病毒颗粒、衣壳或载体基因组
而变化。snell定律中使用折射率增量来测量折射率(ri)的浓度。例如，蛋白质的dn/dc为0.185，dna的dn/dc为0.170。折射率增量可以通过auc确定。
[0078]“消光系数”、“摩尔消光系数”或“s”是衡量化学物质或物质吸收特定波长光强度的指标。朗伯-比尔定律(beer-lambert law)中使用消光系数通过波长(例如280nm)的光吸收来测定浓度。例如，aav5衣壳的消光系数为1.79，示例性载体基因组的消光系数为17.0。
[0079]
空病毒颗粒，也称为“空衣壳”或“轻衣壳”，是指含有少量或不含病毒基因组dna的病毒颗粒。空衣壳通常在aav或lv载体生产过程中形成。在色谱纯化过程中，这些空病毒颗粒可能与含有基因组的载体颗粒共纯化，并且通过吸光度简单测定载体基因组浓度时，过量的空衣壳会引起混淆。
[0080]
衣壳颗粒(cp)滴度是指每毫升病毒颗粒的数量。
[0081]
载体基因组(vg)滴度是指每毫升病毒基因组的数量。该滴度可能通过病毒颗粒在uv 260/uv 280处的吸光度比率来确定。高度纯化的aav制剂的吸光度((a260)取决于载体dna的mw和衣壳蛋白的数量。
[0082]“回转半径(rg)”也称为“均方根半径”，是指通过mals测量溶液中病毒颗粒的绝对摩尔质量。该测量由病毒颗粒中每个质量元素到分子核心的质量加权平均距离确定。rg可以通过动态光散射分析来确定。
[0083]“流体动力学半径(rh)”是等效硬球的半径，其扩散速率与所观察的病毒颗粒相同。rh通过mals检测器中的动态光散射测定。由于病毒颗粒的溶液不作为“硬球”存在，因此确定的rh反映了溶液中病毒颗粒所采用的表观大小。rh可以通过动态光散射分析确定。病毒颗粒表征方法
[0084]
本发明提供了利用sec和sec-mals技术的联合方法。这些方法为量化aav和lv颗粒的多种属性提供了一种稳定而直接的方法。这些方法运用衣壳和包裹dna的吸光度和光散射特性来推断溶液中总衣壳颗粒(cp)和包裹载体基因组(vg)的含量。此外，这些方法可确定aav或lv纯化制剂中病毒颗粒和包裹载体基因组的平均分子量、病毒颗粒的大小分布和聚集特征、外部dna的数量、衣壳完整性以及空病毒颗粒与完整病毒颗粒的比率。目前多种技术已用来生成相同数量的信息，而准确性和精密度各不相同。所公开的方法利用衣壳颗粒和包裹载体基因组的内在特性，在一次运行中提供关键信息和量化aav或lv溶液的许多物理特性，精度高且样品操作步骤最少。通过这些方法生成的数据与正交技术进行了比较，结果表明sec-mals测定能够快速且高精度地确定aav或lv的各种质量属性。这种已确立方法投入新应用是aav基因治疗领域产品开发和过程分析的强大工具。
[0085]
目前多种技术已用来生成相同数量的信息，而准确性和精密度各不相同。所公开的方法利用病毒颗粒和包裹载体基因组的内在特性，在一次运行中提供关键信息和量化aav或lv溶液的许多物理特性，精度高且样品操作步骤最少。
[0086]
中间体和最终病毒载体产品的全面生物物理表征对于生物医学应用的合理设计和开发至关重要。此外，生物物理工具可用于阐明病毒载体的结构-功能关系。因此，本研究中对lv样品的初步工作重点是开发lv表征方法，方法设计的基本原理集中于使用生物物理工具来定性和定量测量参数，包括lv颗粒的实时异质性、大小和滴度。
[0087]
目前，sec也称为凝胶过滤色谱法，广泛用作行业主力，耗费最少成本和精力对生物治疗药物进行快速、可重复的评估。sec是一种可提供有关样品中生物分子的异质性、分
布和聚集信息的强大技术。sec据溶液中分子的大小或重量分离溶液中的分子，较大的物质从色谱柱中洗脱的速度比较小的物质快。
[0088]
一般来说，sec凝胶由含有特定孔径分布的球形珠子组成。当不同大小的分子被纳入或排除在基质内的孔中时，就会发生分离。小分子扩散到孔隙中，根据它们的大小造成流过色谱柱的流动延迟，但大分子不进入孔隙而在色谱柱的空隙体积中被洗脱。因此，分子在通过色谱柱时根据其大小进行分离，并按照分子量(mw)递减的顺序被洗脱。
[0089]
操作条件和凝胶选择取决于所应用和所需分离度。通过sec分离有两种常见类型，分离和脱盐(或缓冲液交换)。分离的分离度取决于粒径、孔径、流速、柱长和直径以及样品体积。一般来说，粒径越小，分辨率越高。孔径控制介质的排除极限和分离范围。分离度随着色谱柱长度的增加而增加，并且随着色谱柱直径的增加，色谱柱或床体积变大，色谱柱的容量也会增加。然后用uv检测器检测柱洗脱液，在这种情况下为280nm，即溶液中蛋白质的吸收光波长。尽管此工具在评估病毒样品方面提供了许多优势，但一个重要的障碍是它提供数据的定性相对于定量的性质。然而，这可以通过将sec与定量生物物理工具相结合来增强。
[0090]
色谱柱填充对分离度至关重要；过度填充的色谱柱会使珠子中的孔塌陷，导致分离度降低。填充不足的色谱柱增加了孔外的混合体积，导致分离度更低的更宽的峰。色谱柱顶部的死体积会显著降低分离度，因为样品在进入柱床之前被允许扩散，导致“条带变宽”或峰变宽。色谱柱顶部的死体积可能是最关键的考虑因素，因为随着分子通过色谱柱，分离度的损失会成倍增加。
[0091]
可用于所公开方法的示例性色谱柱包括tskgel g5000pwxl(tosoh bioscience)、superdex20010/300gl、sepax sec 1000柱(sepax technologies)、superdex 200(ge lifescience)或superdex xk26/60(ge healthscience)qev尺寸排除柱(izon scientific)。为分离aav或lts所选择的色谱柱要能够分离100千道尔顿(kda)至10兆道尔顿(mda)范围内或流体动力学大小介于10和40nm之间的蛋白质。
[0092]
aav或lt颗粒在sec上的洗脱曲线分析表明，在大约uv260:uv280处的第一个和第二个峰是外部dna，第三个峰代表病毒颗粒的二聚体，第四个峰代表单体病毒颗粒，第五个峰代表小核苷酸和缓冲液成分。尽管sec允许对aav和lv载体样品进行定性分析，但无法定量评估基因治疗载体是该方法的一个重大缺点。这些定量分析测量，包括总病毒颗粒计数和大小，是有效了解病毒载体生物物理参数的关键。因此，在开发aav或lv生物物理表征方法时，经评估将sec与mals联合是扩大可获得数据范围的一种手段。
[0093]
在本研究中，将sec与mals联合用于直接量化从sec柱洗脱的生物分子。mals测量溶液中分子在多个角度散射的光，利用散射光的强度来确定光散射分子的分子量、大小和数量。光散射原理表明mals峰的强度等于光散射分子量的平方。
[0094]
具有多角度静态光散射的尺寸排阻色谱在本发明中称为“sec-mals”。sec根据流体动力学体积分离分子，但取决于与一组参考标准的相似性以进行准确质量测定。mals利用散射光的强度和角度依赖性来测量溶液中分子的绝对摩尔质量和大小(均方根半径，rg)。mals系统中的角度数可以在2到20个角度之间变化，每个角度可同时检测到散射。虽然任何光散射检测器(单角度或多角度)都可以测量分子量，但是将获得的光散射数据作为散射角的函数的主要好处是通过计算rg或均方根(rms)半径可以给出分子大小。在sec-mals
实验中将sec和mals联合使用，可以比单独使用任何一种方法进行质量测量更为准确。嵌入式(inline)准弹性光散射(qels)，也称为动态光散射(dls)检测器，可以测量流体动力学半径。
[0095]
lv和aav粒子的大尺寸，理论上能够散射大量光，这使得mals成为lv和aav粒子分析中的一个有吸引力的工具。mals的另一个优点是，作为一种绝对方法，它不需要制备校准曲线。使用steppert等人先前概述的表征病毒样颗粒方法(j chromatogr a.2017；1487:89-99)做为起点，开发了一种生物物理分析lv颗粒的sec-mals方法，并在此公开。值得注意的是，所公开的方法不仅允许对aav或lv颗粒进行定性和定量评估，而且提供了一种新的、可重复的方法来快速估算lv颗粒滴度。
[0096]
在任何公开的方法中，使用至少2个角度、至少3个角度、至少4个角度、至少5个角度、至少6个角度、至少7个角度、至少8个角度、至少9个角度、至少10个角度、至少11个角度、至少12个角度、至少13个角度、至少14个角度、至少15个角度、至少16个角度、至少17个角度、至少18个角度、至少19个角度和至少20个角度来确定aav或lv的分子量。
[0097]
在本发明所述的任何方法中，sec-mals的实施以约0.1ml/ml至1.5ml/min的流速，或约0.3ml/min至约1.0ml/min的流速，或0.3ml/min至约0.5ml/min的流速，或0.5ml/min至约1.0ml/min的流速进行。例如，sec-mals以约0.1ml/min、约0.2ml/min、约0.3ml/min、约0.4ml/min、约0.5ml/min、约0.6ml/min、约0.7ml/min、约0.8ml/min、约0.9ml/min、约1.0ml/min、约1.1ml/min、约1.2ml/min、约1.3ml/min、约1.4ml/min、约1.5ml/min、约1.6ml/min、约1.7ml/min、约1.8ml/min、约1.9ml/min和约2.0ml/min的流速运行。重组aav颗粒
[0098]
如本发明所用，术语“aav”是腺相关病毒的标准缩写。腺相关病毒是一种单链dna细小病毒，仅在由共同感染的辅助病毒提供某些功能的细胞中生长。目前已鉴定出13种aav血清型。aav的一般信息和评论可以在例如carter,1989,handbook of parvoviruses,vol.1,pp.169-228；和berns,1990,virology,pp.1743-1764,raven press,(new york)中找到。然而，完全可以预计相同的原理将适用于其他aav血清型，因为众所周知各种血清型在结构和功能上非常密切相关，甚至在遗传水平上也是如此。(参见，例如，blacklowe，1988,pp.165-174of parvoviruses and human disease,j.r.pattison,ed.；和rose,comprehensive virology 3:1-61(1974))。例如，所有aav血清型明显表现出非常相似的复制特性，由同源rep基因介导产生；并且都带有三种相关的衣壳蛋白。异源双链分析进一步表明了相关程度，揭示了血清型之间沿基因组长度的广泛交叉杂交；并且在对应于“反向末端重复序列”(itrs)的末端存在类似的自退火片段。相似的感染模式也表明每个血清型的复制功能处于相似的调控之下。
[0099]“raav病毒”或“raav病毒颗粒”或“raav载体颗粒”或“aav病毒”是指如本发明所述的一种病毒颗粒，由至少一种衣壳或cap蛋白和包裹raav载体基因组组成。如果颗粒包含异源多核苷酸(即，除野生型aav基因组之外的多核苷酸，例如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，它通常被称为“raav载体颗粒”或简称为“raav载体”。因此，aav载体颗粒的生产必然包括raav载体的生产，因为这样的载体包含在raav载体颗粒中。
[0100]
治疗有效性aav颗粒或治疗性aav病毒能够感染细胞，使得受感染的细胞表达(例如通过转录和/或通过翻译)目的元素(例如核苷酸序列、蛋白质等)。就此而言，治疗有效性
564；chiorini et al.,j.vir.(1999)vol.73,pp.1309-1319；rutledge et al.,j.vir.(1998)vol.72,pp.309-319；和wu et al.,j.vir.(2000)vol.74,pp.8635-8647)。
[0105]
所有已知的aav血清型的基因组组织非常相似。aav的基因组是长度小于约5,000个核苷酸(nt)的线性单链dna分子。反向末端重复(itrs)位于非结构rep蛋白和结构(vp)蛋白的独特编码核苷酸序列的两侧。vp蛋白形成衣壳。末端145nt是自我互补的和有组织的，因此可以形成能量稳定的分子内双链体以形成t-形发夹。这些发夹结构的功能是病毒dna复制的起点，可作为细胞dna聚合酶复合物的引物。rep基因编码rep蛋白质，rep78、rep68、rep52和rep40。rep78和rep68从p5启动子转录，rep52和rep40从pl9启动子转录。cap基因编码vp蛋白质，vp1、vp2和vp3。cap基因从p40启动子转录。在所公开的载体中使用的itrs可以对应于与相关cap基因相同的血清型，或者可以不同。在一个特别优选的实施例中，在所公开的载体中使用的itrs对应于aav2血清型并且cap基因对应于aav5血清型。
[0106]
在一些实施例中，编码aav衣壳蛋白的核酸序列可操作连接到表达控制序列用于在特定细胞类型如sf9或hek细胞中表达。本发明可以使用本领域技术人员已知的用于在昆虫宿主细胞或哺乳动物宿主细胞中表达外源基因的技术。昆虫细胞多肽的分子工程和表达方法，例如，在summers and smith(1986)a manual of methods for baculovirus vectors and insect culture procedures,texas agricultural experimental station bull.no.7555,college station,tex.；luckow(1991)in prokop et al.,cloning and expression of heterologous genes in insect cells with baculovirus vectors'recombinant dna technology and applications,97-152；king,l.a.and r.d.possee(1992)the baculovirus expression system,chapman and hall,united kingdom；o'reilly,d.r.,l.k.miller,v.a.luckow(1992)baculovirus expression vectors:a laboratory manual,new york；w.h.freeman and richardson,c.d.(1995)baculovirus expression protocols,methods in molecular biology,volume 39；美国专利号为4,745,051；us2003148506；和wo 03/074714，所有这些都以引用方式全文并于此。特别适合于编码aav衣壳蛋白的核苷酸序列进行转录的启动子是，例如多面体启动子。然而，在昆虫细胞中具有活性的其他启动子是本领域已知的，例如，p10、p35或ie-1启动子和上述参考文献中提到的其他启动子。
[0107]
昆虫细胞用于表达异源蛋白质的用途已得到充分证明，例如将核酸(例如载体，例如昆虫细胞相容性载体)导入此类细胞的方法以及将此类细胞维持在培养物中的方法。(参见，例如，methods in molecular biology,ed.richard,humana press,n j(1995)；o'reilly et al.,baculovirus expression vectors,a laboratory manual,oxford univ.press(1994)；samulski et al.,j.vir.(1989)vol.63,pp.3822-3828；kajigaya et al.,proc.natl.acad.sci.usa(1991)vol.88,pp.4646-4650；ruffing et al.,j.vir.(1992)vol.66,pp.6922-6930；kirnbauer et al.,vir.(1996)vol.219,pp.37-44；zhao et al.,vir.(2000)vol.272,pp.382-393；和美国专利号为6,204,059)。在一些实施例中，昆虫细胞中编码aav的核酸构建体是一种昆虫细胞相容性载体。如本发明所用，“昆虫细胞相容性载体”或“载体”是指能够生产性转化或转染昆虫或昆虫细胞的核酸分子。示例性生物载体包括质粒、线性核酸分子和重组病毒。只要与昆虫细胞相容，可以使用任何载体。载体可以整合到昆虫细胞基因组中，但昆虫细胞中的载体不必是永久存在的，也包括瞬时游离型
载体。载体可以通过任何已知方式导入，例如通过细胞的化学处理、电穿孔或感染。在一些实施例中，载体是杆状病毒、病毒载体或质粒。在一个更优选的实施例中，载体是杆状病毒，即该构建体是杆状病毒载体。杆状病毒载体及其在昆虫细胞分子工程中的使用方法在上述引用的参考文献中已有描述。
[0108]
杆状病毒是节肢动物的包膜dna病毒，其中有两个成员是众所周知的表达载体，用于在细胞培养物中产生重组蛋白。杆状病毒具有环状双链基因组(80-200kbp)，可对其进行工程改造以允许将大量基因组内容递送至特定细胞。用作载体的病毒通常是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(acmnpv)或家蚕核多角体病毒(bmnpv)。
[0109]
杆状病毒通常用于感染昆虫细胞以表达重组蛋白。特别地，在昆虫中可以完成异源基因的表达，例如在美国专利号为4,745,051；friesen et al(1986)；ep 127,839；ep 155,476；vlak et al(1988)；miller et al(1988)；carbonell et al(1988)；maeda et al(1985)；lebacq-verheyden et al(1988)；smith et al(1985)；miyajima et al(1987)；和martin et al(1988)中已有描述。许多可用于蛋白质生产的杆状病毒株和变异体以及相应的被许可的昆虫宿主细胞在luckow et al(1988)，miller et al(1986)；maeda et al(1985)and mckenna(1989)中已有描述。重组aavs生产方法
[0110]
本发明提供了在昆虫或哺乳动物细胞中生产重组aavs的材料和方法。在一些实施例中，病毒构建体进一步包含启动子和启动子下游的限制性位点，以便插入编码一种或多种目的蛋白质的多核苷酸，其中启动子和限制性位点位于5'aav itr的下游和3'aav itr的上游。在一些实施例中，病毒构建体进一步包含限制性位点下游和3'aav itr上游的转录后调节元件。在一些实施例中，病毒构建体还包含插入限制性位点的多核苷酸，可操作连接到启动子，其中多核苷酸包含目的蛋白质的编码区。如本领域技术人员将理解的，本发明中公开的任何一种aav载体都可以在该方法中用作病毒构建体以生产重组aav。
[0111]
在一些实施例中，辅助功能由一种或多种包含腺病毒或杆状病毒辅助基因的辅助质粒或辅助病毒提供。腺病毒或杆状病毒辅助基因的非限制性例子包括但不限于e1a、e1b、e2a、e4和va，它们可以为aav包装提供辅助功能。
[0112]
aav的辅助病毒是本领域已知的并且包括，例如，来自腺病毒科和疱疹病毒科的病毒。aav的辅助病毒的例子包括但不限于，在公开号为20110201088的美国专利(其公开内容以引用方式并于此)中描述的sadv-13辅助病毒和sadv-13样辅助病毒、辅助载体phelp(应用病毒学)。本领域技术人员将理解，在本发明中可以使用任何可以为aav提供足够辅助功能的辅助病毒或aav辅助质粒。
[0113]
在一些实施例中，aav cap基因存在于质粒中。质粒可以进一步包含对应于或不对应于与cap基因相同血清型的aav rep基因。来源于任何aav血清型(包括但不限于aav1、aav2、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13及其任何变异体)的cap基因和/或rep基因可以在本发明中用于生产重组aav。在一些实施例中，aav cap基因可以编码来自于血清型1、血清型2、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9、血清型10、血清型11、血清型12、血清型13或其变异体的衣壳。
[0114]
在一些实施例中，可以用辅助质粒或辅助病毒、病毒构建体和编码aav帽基因的质粒转染昆虫或哺乳动物细胞；并且共转染后可在不同时间点采集重组aav病毒。例如，重组
aav病毒可在共转染后约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约96小时、约120小时或上述任何两个时间点之间的时间收集。
[0115]
重组aav也可以使用本领域已知的适用于生产感染性重组aav的任何常规方法来生产。在一些情况下，重组aav可以通过使用可以稳定表达aav颗粒生产所需的一些必要成分的昆虫或哺乳动物细胞来生产。例如，包含aav rep和cap基因和一个可选标志物例如新霉素抗性基因的一个质粒(或多个质粒)可以整合到细胞的基因组中。然后昆虫或哺乳动物细胞可以用辅助病毒(例如，提供辅助功能的腺病毒或杆状病毒)和包含5'和3'aav itr(以及编码异源蛋白质的核苷酸序列，如需)的病毒载体共同转染。该方法的优点是细胞具有选择性，适合大规模生产重组aav。作为另一个非限制性实例，腺病毒或杆状病毒而不是质粒可用来介导rep和cap基因到包装细胞。作为又一个非限制性例子，含有5'和3'aav ltrs的病毒载体和rep-cap基因都可以稳定地整合到生产细胞的dna中，并且野生型腺病毒可以提供辅助功能用于生产重组aav。用于aav生产的细胞类型
[0116]
包含所公开的aav载体的病毒颗粒可以使用任何能够生产aav或生物制品并且可以在培养基中维持生长的无脊椎动物细胞类型来生产。例如，所使用的昆虫细胞系可以来自草地贪夜蛾，如sf9、sf21、sf900 、果蝇细胞系、蚊子细胞系如白纹伊蚊衍生细胞系、家蚕细胞系如bombyx mori细胞系、trichoplusia ni细胞系如high five细胞或鳞翅目细胞系如ascalapha odorata细胞系。优选的，昆虫细胞是来自对杆状病毒感染敏感的昆虫物种的细胞，包括high five、sf9、se301、seizd2109、seucr1、sf9、sf900 、sf21、bti-tn-5b1-4、mg-1、tn368、hzaml、bm-n、ha2302、hz2e5和ao38。
[0117]
杆状病毒是节肢动物的包膜dna病毒，其中两个成员是众所周知的用于在细胞培养物中生产重组蛋白的表达载体。杆状病毒具有环状双链基因组(80-200kbp)，可对其进行工程改造以允许将大量基因组内容递送至特定细胞。用作载体的病毒通常是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(acmnpv)或家蚕核多角体病毒(bm-npv)(kato et al.,2010)。
[0118]
杆状病毒通常用于感染昆虫细胞以表达重组蛋白。特别地，在昆虫中可以完成异源基因的表达，例如在美国专利号为4,745,051；friesen et al(1986)；ep 127,839；ep 155,476；vlak et al(1988)；miller et al(1988)；carbonell et al(1988)；maeda et al(1985)；lebacq-verheyden et al(1988)；smith et al(1985)；miyajima et al(1987)；and martin et al(1988)中已有描述。许多可用于蛋白质生产的杆状病毒株和变异体以及相应的被许可的昆虫宿主细胞在luckow et al(1988)，miller et al(1986)；maeda et al(1985)and mckenna(1989)中已有描述。
[0119]
另一方面，所公开的方法可在任何能够复制aav或生产生物制品并且可以在培养基中维持生长的哺乳动物细胞类型中开展。优选的，所用哺乳动物细胞可以是hek293、hela、cho、nso、sp2/0、per.c6、vero、rd、bhk、ht 1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5细胞。重组慢病毒颗粒
[0120]
本发明提供了慢病毒基因治疗载体病毒与能够转导造血干细胞的包膜蛋白结合的重组病毒，例如人cd34 细胞。在一个实施例中，本发明提供了一种重组慢病毒，由包裹在包含弹状病毒包膜蛋白的结合域或来自于其的氨基酸序列的异源包膜中的慢病毒基因载体组成。所公开的慢病毒载体，至少包含慢病毒5'长末端重复(ltr)序列、用于递送至宿主
细胞的分子和慢病毒3'ltr序列的功能部分。任选地，该载体还可以包括ψ(psi)衣壳化序列、rev响应元件(rre)序列或提供等效或相似功能的序列。载体上携带的用于递送至宿主细胞的异源分子可以是任何所需物质，包括但不限于多肽、蛋白质、酶、碳水化合物、化学基团，或核酸分子可以包括寡核苷酸、rna、dna和/或rna/dna杂交体。在一个实施例中，异源分子是将特定的遗传修饰介导入人类染色体的核酸分子，例如，用于校正突变基因。在另一个理想的实施例中，异源分子包含具有编码所需蛋白质、肽、多肽、酶或另一种产物的核酸序列和指导被编码产物在宿主细胞中转录和/或翻译的调节序列以使被编码产物能够在宿主细胞中表达的转基因。合适的产品和调控序列将在下面进行更详细的讨论。然而，载体上携带并由公开病毒递送的异源分子的选择不是对本发明的限制。
[0121]
在选择本发明所述的用于慢病毒载体和重组病毒构建的慢病毒元件时，人们可以很容易从任何合适的慢病毒和任何合适的慢病毒血清型或毒株中选择序列。合适的慢病毒包括例如人类免疫缺陷病毒(hiv)、猿免疫缺陷病毒(siv)、山羊关节炎和脑炎病毒(caev)、马传染性贫血病毒(eiav)、维斯纳病毒和猫免疫缺陷病毒(fiv)、牛免疫缺陷病毒(biv)。本发明提供的实施例说明了使用来源于hiv的载体。然而，fiv和其他非人类来源的慢病毒也可能是特别需要的。在所公开的构建体中使用的序列可以来自学术的、非营利的(例如，美国典型培养物保藏中心，manassas,virginia)或商业来源的慢病毒。可替代地，序列可以使用基因工程技术重组产生，或参考已发布的病毒序列使用常规技术合成(例如，g.barony and r.b.merrifield，the peptides:analysis,synthesis&biology,academic press,pp.3-285(1980))，包括可公开访问的电子数据库中包含的序列。
[0122]
慢病毒载体包含足量的慢病毒长末端重复(ltr)序列，以允许基因组逆转录、生成cdna并允许慢病毒载体中存在的rna序列表达。适当地，这些序列包括位于载体5'最末端的5'ltr序列和位于载体3'最末端的3'ltr序列。这些ltr序列可以是对选定的慢病毒或交叉反应性慢病毒天然的完整ltrs，或更理想地，可以是修饰的ltrs。
[0123]
已经描述了对慢病毒ltrs的各种修饰。一种特别理想的修饰是自失活ltr，例如在h.miyoshi et al,j.virol.,72:8150-8157(oct.1998)中描述的用于hiv。在这些hiv ltrs中，5'ltr的u3区域被强异源启动子(例如cmv)取代，并且3'ltr的u3区域缺失133bp。因此，在逆转录时，3'ltr的缺失被转移到5'ltr，导致ltr的转录失活。hiv的完整核苷酸序列是已知的，参见l.ratner et al.nature.313(6000):277-284(1985)。然而另一个合适的修饰涉及u3区域的完全缺失，因此5'ltr仅包含强异源启动子、r区域和u5区域；并且3'ltr仅包含r区域，其中包括一个polya。在又一个实施例中，5'ltr的u3和u5区都被删除并且3'ltr仅包含r区。这些和其他合适的修饰便于本领域技术人员在hiv和/或另一种选定的慢病毒的类似区域中进行工程改造。
[0124]
任选地，慢病毒载体可以在5'慢病毒ltr序列下游包含ψ(psi)包装信号序列。任选地，一个或多个的剪接供体位点可以位于ltr序列之间和ψ序列的紧邻上游。根据本发明，ψ序列可以修饰以去除与gag序列的重叠并改进包装。例如，可以在gag编码序列的上游插入终止密码子。本领域技术人员可涉及对ψ序列的其他合适的修饰。这样的修饰不是对本发明的限制。
[0125]
在一个合适的实施例中，慢病毒载体包含位于ltr和ψ序列下游的慢病毒rev应答元件(rre)序列。合适地，rre序列包含最少约275至约300nt的天然慢病毒rre序列，更优选
地，至少约400至约450nt的rre序列。任选地，rre序列可以被另一种合适的有助于gag/pol的表达及其向细胞核的转运的元件替代。例如，其他合适的序列可以包括曼森-辉瑞病毒的ct元件，或土拨鼠肝炎病毒后调控元件(wpre)。可替代地，可以改变gag和gag/pol的编码序列从而修饰核定位而不改变gag和gag/pol多肽的氨基酸序列。合适的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。
[0126]
转基因或另一种核酸序列的设计需要在细胞和宿主中转录、翻译和/或表达以获得所需基因产物，该设计可以包含可操作连接到目的编码序列的适当序列，以促进编码产物的表达。“可操作连接”序列包括与目的核酸序列邻接的表达控制序列和通过反式或远距离作用控制目的核酸序列表达的控制序列。
[0127]
表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；高效的rna处理信号，如剪接和多聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mrna的序列；提高翻译效率的序列(即kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；并且当需要时，增强蛋白质分泌的序列。大量的表达控制序列——天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的——在本领域中是已知的并且可以用于驱动基因的表达，这取决于所需的表达类型。对于真核细胞，表达控制序列通常包括启动子、增强子，如来自免疫球蛋白基因、sv40、巨细胞病毒等，以及可以包含剪接供体和受体位点的多聚腺苷酸化序列。多腺苷酸化(polya)序列通常插入在转基因序列之后和3'慢病毒ltr序列之前。最合适地，携带转基因或其他分子的慢病毒载体含有的polya来自于提供ltr序列的慢病毒，例如hiv。然而，可以很容易选择其他来源的多聚腺苷酸以包含在所公开的构建体中。在一个实施例中，选择牛生长激素polya。慢病毒载体还可以包含内含子，最好位于启动子/增强子序列和转基因之间。一种可能的内含子序列也源自sv-40，称为sv-40t内含子序列。可用于载体的另一个元件是内部核糖体进入位点(ires)。ires序列用于从单个基因转录物中产生一个以上的多肽。ires序列将用于产生包含一条多肽链以上的蛋白质。这些和其他常见载体元件的选择是常规的，并且许多这样的序列是可用的(参见，例如，sambrook et al.,以及其中引用的参考文献，例如，pages 3.18-3.26and 16.17-16.27and ausubel et al.,current protocols in molecular biology.john wiley&sons,new york,1989)。
[0128]
在一个实施例中，需要高水平的组成型表达。可用的组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(rsv)ltr启动子(任选地带有rsv增强子)、巨细胞病毒(cmv)启动子(任选地带有cmv增强子)(参见例如boshart et al,cell,41:521-530(1985))、sv40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(pgk)启动子和efla启动子(invitrogen)。由外源性提供的化合物调节的诱导型启动子同样有用，包括锌诱导型绵羊金属硫氨酸(mt)启动子、地塞米松(dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、t7聚合酶启动子系统(wo 98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(no et al,proc.natl.acad.sci.usa.93:3346-3351(1996))，四环素抑制系统(gossen et al.proc.natl.acad.sci.usa,89:5547-5551(1992))，四环素诱导系统(gossen et al,science.268:1766-1769(1995)，另见harvey et al,curr.opin.chem.biol.2:512-518(1998))、ru486-诱导系统(wang et al.nat.biotech.15:239-243(1997)和wang et al,gene ther.4:432-441(1997))和雷帕霉素-诱导系统(magari et al,j.clin.invest.100:2865-2872(1997))。可用于本发明的其他类型的诱导型启动子受特定生理状态调节，例如
温度、急性期、细胞的特定分化状态，或仅在复制细胞中。
[0129]
在另一个实施例中，使用转基因的天然启动子。当转基因的表达需要模拟天然表达时，可能优选天然启动子。当必须暂时或发育或以组织特异性方式或响应特定转录刺激来调节转基因的表达时，可以使用天然启动子。在进一步实施例中，其他天然表达控制元件，例如增强子元件、多聚腺苷酸化位点或kozak共有序列也可用于模拟天然表达。转基因的另一个实施例包括可操作连接到组织特异性启动子的转基因。
[0130]
并非所有的表达控制序列都能很好地表达所有可能的转基因。然而，本领域技术人员可以在这些表达控制序列中进行选择而不脱离本发明公开的范围。本领域技术人员可以使用本发明提供的指导来选择合适的启动子/增强子序列。这样的选择是常规问题，并不是分子或构建体的限制。例如，人们可以选择一个或多个表达控制序列可操作地连接到目的编码序列，并插入到转基因、载体和所公开的重组病毒中。在遵循本说明书中教导的或本领域中教导的包装慢病毒载体的方法之一后，可以在体外或体内感染合适的细胞。细胞中载体的拷贝数可以通过southern印迹或定量pcr监测。rna表达水平可以通过northern印迹或定量rt-pcr监测。表达水平可以通过western印迹、免疫组织化学、elisa、ria或基因产物的生物活性测试来监测。因此，人们可以很容易分析出特定的表达控制序列是否适合转基因编码的特定产物，并选择最合适的表达控制序列。可替代地，当用于递送的分子不需要表达时，例如碳水化合物、多肽、肽等，表达控制序列不需要成为慢病毒载体或其他分子的一部分。
[0131]
任选地，慢病毒载体可以包含其他慢病毒元件，例如本领域熟知的那些，其中许多在下文结合慢病毒包装序列进行了描述。然而，值得注意的是，慢病毒载体缺乏组装慢病毒包膜蛋白的能力。这样的慢病毒载体可以包含对应于rre的一部分包膜序列，但缺少其他包膜序列。然而，更理想地，慢病毒载体缺少编码任何功能性慢病毒包膜蛋白的序列，以从根本上消除重组成为具有复制能力病毒的可能性。
[0132]
因此，所公开的慢病毒载体至少包含慢病毒5’长末端重复(ltr)序列、(任选地)ψ(psi)包壳序列、用于递送至宿主细胞的分子和慢病毒3’ltr序列的功能部分。理想地，该载体还包含rre序列或其功能等价物。合适地，慢病毒载体可通过任何合适的方式包装到病毒中以递送至宿主细胞，例如通过转染包含慢病毒载体的“裸”dna分子，或通过可能包含其他慢病毒和调节元件的上述载体以及载体上常见的任何其他元件等方式。“载体”可以是能够将其上携带的序列或分子递送至细胞的任何合适的运输工具。例如，载体可以很容易选自但不限于质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒等。质粒特别适用在所公开的产生慢病毒的方法中。选择的载体可以通过任何合适的方法递送，包括转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速dna-包装的小球、病毒感染和原生质体融合。根据本发明，慢病毒载体通过下述方法包装在异源(即非-慢病毒)包膜中以形成重组病毒。lve包膜蛋白
[0133]
适合用作包装慢病毒载体的包膜不含慢病毒包膜蛋白，而包含至少一种异源包膜蛋白的结合结构域。在一个实施例中，包膜可以完全衍生自弹状病毒糖蛋白或可以包含弹状病毒包膜(弹状病毒多肽或肽)的片段，该片段包含的结合结构域可以与第二病毒的包膜蛋白、多肽或肽框内融合。可替代实施例中，包膜可以包含具有下文讨论的来自于cd34 细胞转导决定簇的序列的病毒包膜蛋白。在另一个实施例中，包膜可以完全来自于沙粒病毒
糖蛋白或其片段。
[0134]
提供包膜蛋白或其多肽或肽(例如，结合结构域)的编码序列的弹状病毒可以衍生自水疱病毒亚科的任何合适的血清型，例如vsv-g(印第安纳州)、莫雷顿、马拉巴、科卡尔、阿拉戈亚、卡拉哈斯、vsv-g(亚利桑那州)、伊斯法罕、vsv-g(新泽西州)或皮里。包膜蛋白的编码序列可以通过任何合适的方式获得，包括将基因工程技术应用于病毒来源、化学合成技术、重组生产或其组合。所需病毒序列的合适来源是本领域熟知的，并且包括各种学术、非盈利、商业来源，以及电子数据库来源。获得序列的方法不是对本发明内容的限制。在一个理想的实施例中，异源包膜序列来自于存在于所有可以介导人cd34 细胞转导的包膜蛋白中而不存在于不介导人cd34 细胞转导的那些包膜蛋白中的31个氨基酸的人cd34 细胞转导决定簇。
[0135]
因此，在一个实施例中，包膜蛋白是完整的弹状病毒糖蛋白。可替代性地，可能需要利用至少包含弹状病毒包膜糖蛋白的结合结构域的所选弹状病毒片段，其位于31个氨基酸的人cd34 细胞转导决定簇内。适当地，该弹状病毒蛋白片段通过接头直接或间接融合到第二非慢病毒包膜蛋白或其片段中。这种融合蛋白可用于改进所得包膜蛋白的包装、产量和/或纯化。第二非慢病毒包膜蛋白或其片段至少包含膜结构域。在一个理想的实施例中，31个氨基酸的人cd34 细胞转导决定簇的截断片段与vsv-g包膜蛋白融合。本领域技术人员可根据本发明产生其它融合(嵌合)蛋白。
[0136]
在另一个实施例中，包膜蛋白是至少含有沙粒病毒包膜糖蛋白的结合结构域的完整的沙粒病毒包膜蛋白或所选沙粒病毒包膜蛋白的片段。适当地，该沙粒病毒蛋白片段通过接头直接或间接融合到第二、非-慢病毒、包膜蛋白或其片段中。这种融合蛋白可用于改进所得包膜蛋白的包装、产量和/或纯化。第二、非-慢病毒包膜蛋白或其片段至少包含膜结构域。
[0137]
针对沙粒病毒包膜糖蛋白(gp)所产生的保护性中和抗体免疫是最小的，表明感染导致的针对再感染的抗体介导保护最小(如果有的话)。该特征允许使用包含沙粒病毒包膜蛋白的载体进行重复免疫。针对沙粒病毒的预存免疫力在人群中很低或可以忽略不计。此外，沙粒病毒通常是非-溶细胞性的(不是细胞破坏性)，并且在某些条件下可以在动物体内维持长期抗原表达而不会引起疾病。
[0138]
沙粒病毒包膜蛋白可能来自lassa病毒、luna病毒、lujo病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)、mobala病毒、mopeia病毒、ippy病毒、amapari病毒、flexal病毒、guanarito病毒、junin病毒、latino病毒、machupo病毒、oliveros病毒、parana病毒、pichinde病毒、pirital病毒、sabia病毒、tacaribe病毒、tamiami病毒、bear canyon病毒、whitewater arroyo病毒、merino walk病毒、menekre病毒、morogoro病毒、gbagroube病毒、kodoko病毒、lemniscomys病毒、mus minutoides病毒、lunk病毒、giaro病毒、和温州病毒、patawa病毒、pampa病毒、tonto creek病毒、allpahuayo病毒、catarina病毒、skinner tank病毒、real de catorce病毒、big brushy tank病毒、catarina病毒和ocozocoautla de espinosa病毒。重组慢病毒产生方法
[0139]
重组慢病毒具有复制缺陷，因此该病毒是在“生产细胞系”中生产的，该生产细胞系的单个细胞提供了必要的成分。如本发明所用，术语“生产细胞系”是指能够生产重组逆
转录病毒颗粒的细胞系，包括包装细胞系和包含包装信号的转移载体构建体。感染性病毒颗粒和病毒原液的生产可以使用常规技术进行。制备病毒原液的方法在本领域中是已知的并且在例如y.soneoka et al.(1995)nucl.acids res.23:628-633,andn.r.landau et al.(1992)j.virol.66:5110-5113中进行了说明。可以使用常规技术从包装细胞中收集感染性病毒颗粒。例如，如本领域已知的，感染性颗粒可以通过细胞裂解或细胞培养物上清液收集液来收集。任选地，如果需要，可以纯化收集的病毒颗粒。合适的纯化技术为本领域技术人员所熟知。
[0140]
生产细胞系的产生可使用三个或四个独立的质粒系统。四质粒系统包括三个辅助质粒和一个转移载体质粒。例如，gag-pol表达盒编码结构蛋白和酶。另一个盒编码作为载体基因组核输出所必需的辅助蛋白的rev。第三个盒编码允许慢病毒颗粒进入靶细胞的异源包膜蛋白，例如囊泡病毒或沙粒病毒包膜蛋白。转移载体盒编码携带用于融合进入颗粒的信号和驱动转基因表达的内部启动子的载体基因组本身。转移载体携带异源转基因，是唯一被转移到靶细胞的遗传物质，例如：cd34 细胞。三质粒系统包括编码gag-pol和包膜功能的两个辅助质粒以及转移载体盒。参见merten et al.,mol.ther.methods clin.dev.3:16017,2016。
[0141]
多组分表达盒在生产细胞中瞬时或稳定转染。在一个实施例中，连续性地和组成性地产生生产细胞系中的必需成分。生产细胞可以是hek293细胞、hek293t细胞、293ft、293sf-3f6、sodk1细胞、cv-1细胞、cos-1细胞、htta-1细胞、star细胞、rd-molpack细胞、win-pac、cho细胞、bhk细胞、mdck细胞、c3h 10t1/2细胞、fly细胞、psi-2细胞、bosc 23细胞、pa317细胞、wehi细胞、cos细胞、bsc 1细胞、bsc 40细胞、bmt 10细胞、vero细胞、w138细胞、mrcs细胞、a549细胞、ht1080细胞、b-50细胞、3t3细胞、nih3t3细胞、hepg2细胞、saos-2细胞、huh7细胞、hela细胞、w163细胞、211细胞和211a细胞。有商品化的慢病毒包装系统，例如lentisuite kit(systems biosciences,palo alto,ca)、lenti-x packaging system(takara bio,mountain view,ca),virasafe packaging system(cell biolabs,inc.san diego,ca)、viropower lentiviarl packaging mix(invitrogen)和mission lentiviral packaging mix(millapore sigma,burlington,ma)。
[0142]
在另一个实施例中，生产细胞系包含可诱导的表达盒以表达包装功能。例如，四环素诱导表达系统用于生产细胞的生成，包括tet-off系统和tet-on系统。此外，使用了蜕皮激素诱导系统。
[0143]
使用在petri dishes、t-flask、多托盘系统(cell factories,cell stacks)或hyperflask中生长的表面贴壁细胞进行慢病毒生产。在最佳融合度(confluence)(《50％)时，使用传统的磷酸钙方案或最近开发的聚乙烯亚胺(pei)方法转染细胞。其他使用的有效阳离子转染剂包括lipofectamine(thermo-fisher)、fugene(promega)lv-max(thermo-fisher)、transit(mirus)或293fectin(thermo-fisher)。
[0144]
可替代地，慢病毒生产通过使用摇瓶、玻璃生物反应器、不锈钢生物反应器、波浪袋和一次性搅拌罐的悬浮培养进行。使用磷酸钙或阳离子聚合物和线性聚乙烯亚胺转染悬浮培养物。还使用电穿孔转染细胞。
[0145]
慢病毒的纯化使用膜工艺步骤进行，例如过滤/澄清、使用切向流过滤(tff)或基于膜的色谱法浓缩/渗滤、和/或离子交换色谱法(iex)等色谱工艺步骤、亲和层析和基于尺
截距为1/m。方程式3通过对18个sls探测器获得的数据进行全局分析后用于获得由方程式4和5定义的aav衣壳的重均分子量(mw)和rg：mw＝∑(cimi)/∑ci(4)rg＝∑(cirgi)/∑ci(5)其中ci是蛋白质浓度，mi是观察到的摩尔质量，rgi是在洗脱曲线内第i个切面上观察到的回转半径。
[0159]
aav载体的每种洗脱物质的流体动力学半径(rh)由位于相对于入射激光束90
°
方向的wyattqels检测器确定。通过使用非线性最小二乘法分析astra中的内置方程式(6)，测量和迭代拟合动态光散射(dls)强度波动的时间和浓度的关系获得rh数据。方程式6中获得的г值用于使用内置方程式(7)计算每个洗脱衣壳物质的平移扩散系数(dt)，最终用于拟合stokes-einstein方程式(8)计算rh。(wang,feng,etal.medicalsciencemonitorbasicresearch19(2013):187,koppel，j.chem.phys.57,4814-4820(1972)，berne,dynamiclightscattering,wiley,newyork,ny(1976))。g(τ)＝αexp(-2гτ) β(6)dt＝[(гλ2)/(16π2n2sin2θ/2)](7)rh＝[(kbt)/(6πηd
t
)](8)
[0160]
g(τ)是dls强度波动i的自相关函数，α是零延迟时间时自相关函数的初始幅值，γ是自相关函数的衰减率常数，τ是自相关函数的延迟时间，β是基线偏移量(无限大延迟时的自相关函数值)。λ为溶液中的激光波长(658nm)，n为溶剂的折射率，θ为散射角(90
°
)。最后，kb为玻尔兹曼常数(1.38
×
10-23
jk-1
)，t为绝对温度，η是溶剂粘度。
[0161]
这里的rh代表方程式9定义的加权平均值(weighted-averagevalue)：rh＝∑(c
irh,i
)/∑ci(9)其中ci是蛋白质浓度，r
h,i
是在洗脱曲线内第i个切面观察到的流体动力学半径。
[0162]
使用方程式10通过wyattoptilabrex检测器测量关于溶剂的折射率(δn)变化，在astra中自动量化沿每个衣壳种类的洗脱曲线的衣壳浓度(c)：c＝(δn)/(dn/dc)(10)其中dn/dc是aav载体在溶液中的折射率增量。
[0163]
由于载体是aav衣壳蛋白和包裹dna的组合，因此直接从mals获得的摩尔质量和浓度代表组合的蛋白质-dna复合物。为了分别计算衣壳蛋白和包裹dna的贡献，将astra中内置的蛋白偶联方法应用于所有数据集。该方法改编自m.kunitani等人并进一步修改，使用来自两个不同浓度检测器的ri和uv在280nm的信息，使用方程式系统确定来自衣壳蛋白的蛋白质-dna复合物的总浓度。(kunitani,michael,etal.,journalofchromatographya588.1-2(1991)；125-137,chu,benjamin.lasertightscattering:basicprinciplesandpractice.couriercorporation,2007)。该方法假设ri(和uv)反应是蛋白质衣壳和包裹dna反应的总和。方程式11计算蛋白质-dna复合物(v)的组合dn/dc与衣壳蛋白(x)质量分数的函数关系：其中下标cp和dna表示衣壳蛋白和包裹dna的内在dn/dc值分别为0.185和0.170。
然后使用方程式12根据折射率(δn)的变化计算蛋白质-dna复合物((c
dri
)的浓度：
[0164]
同样，方程式13用于计算蛋白质-dna复合物的组合消光系数(εv)与衣壳蛋白质量分数(x)的函数关系。εv＝ε
cp
·
x ε
dna
·
(1-x)
ꢀꢀ
(13)
[0165]
其中ε
cp
和ε
dna
表示衣壳蛋白和包裹dna的固有消光系数分别为1.790ml/mg
·
cm和17.000ml/mg
·
cm。对于衣壳蛋白，假设vp蛋白的比率为1:1:10确定系数。然后方程式14基于a280吸光度计算蛋白质-dna复合物浓度：
[0166]
最后，由于通过uv和ri计算的蛋白质-dna复合物的浓度相等，因此astra可以使用方程式15求解衣壳蛋白的质量：
[0167]
了解衣壳蛋白的质量分数可以独立测量aav衣壳和包裹dna的物理属性。bsa(thermo scientific,waltham,ma)[2mg/ml]用于在aav样品分析之前对光散射检测器进行标准化。分析超速离心
[0168]
装有吸光度和瑞利干涉(ri)光学件的beckman coulter proteomelab xl-iauc(beckman,brea,ca)用于样品分析。样品进样到包含epon中心件的2扇区样品池中。然后将样品池装载到8孔转子中。样品在20℃温度下平衡不少于2小时。温度平衡后，以10,000rpm的沉降速度离心样品10-12小时，并以设备的最大检测速率收集扫描。
[0169]
使用在程序sedfit中实施的c(s)方法分析数据，之前已用于aav衣壳分析。(kunitani,michael,et al.,journal of chromatography a 588.1-2(1991):125-137,schuck,peter.,biophysicaljournal 78.3(2000):1606-1619)。简而言之，sedfit使用描述扇形隔间中的扩散和沉降的基本方程的数值解对数据直接建模，即lamm方程式(12)：其中c是总aav浓度，t是时间，d是扩散常数，r是半径，s是沉降系数，ω是转子速度。方程式右侧的两项描述了两个竞争力：扩散力和沉降力。扩散力由分子运动驱动，向均匀的溶质溶液移动；沉降力由施加的重力场驱动，将溶质输送到样品池底部。数据分析
[0170]
使用graphpad prism 8.2.1版生成所有数据图。结果通过尺寸排阻色谱法表征aav和估计滴度
[0171]
aav样品通过sec分离，并通过由uv(260和280nm)、mals和ri检测器组成的多检测器系统监测获得洗脱曲线。该色谱柱有效地分离单体aav衣壳物质(洗脱约11.5分钟)与二聚体(洗脱约10.5分钟)、高阶多聚体(洗脱《10分钟)和较小的核苷酸杂质和缓冲液组分(洗脱》12分钟)(图1a和1b)。通过监测280和260nm处的吸光度，根据其a260/a280比率对应的蛋
白质和dna含量，每个洗脱峰对应的不同衣壳种类被表征。单体重衣壳具有一致的a260/a280比率，约为1.34，而轻衣壳的比率约为0.6。在显示a260/a280比率》1.7的早期洗脱峰中检测到完整衣壳外的dna(图1a和1b)。
[0172]
变性aav2衣壳的cp和vg滴度先前已使用基于uv的体积光密度的方法进行了估计
11
。在这里，sec方法被评估为一种更先进的滴度估计方法，不需要高度纯化或变性的衣壳。通过chemstation中单体和二聚体峰面积的垂线积分(drop-line integration)获得280和260nm处的aav吸光度值。如表a所示，a280和a260峰面积测量值显示出高重现性[cv
a280
＝0.36％,cv
a260
＝0.41％]，并且发现分别随cp和vg加样量呈线性趋势(数据未显示)。表a a280峰面积a260峰面积平均3377.772527.42标准差12.0410.28cv(％)0.360.41
[0173]
由于sec检测的高重现性和线性，使用经elisa和qpcr测得的已知cp和qpcr滴度的aav衣壳材料生成标准曲线(图3a和3b)，以用来计算未知样品的cp和vg滴度。这些标准曲线，其中y等于吸光度，x等于滴度载量，可以根据已知吸光度值和线性趋势线的斜率计算未知滴度。具体来说，计算未知样品的cp滴度只需将样品的a280单体和二聚体峰面积除以趋势线的斜率(2.527e09，图3a)并乘以进样量(方程式13)。
[0174]
同样，vg滴度使用a260峰面积和斜率(3.378e09，图3b)(方程式14)确定。
[0175]
使用这种方法，计算含有0-100％轻衣壳的aav样品的cp和vg滴度。虽然sec检测将单体aav衣壳与高阶或低阶杂质分开，但它没有将轻衣壳与重衣壳分开。因此，观察到两种滴度与轻衣壳含量的函数关系呈线性下降，r2》0.999(图2c和2d)。虽然随着轻衣壳的增加，预计vg滴度会线性下降，但cp滴度的类似下降表明包裹载体基因组对a280峰面积的影响。这种基因组对280nm处的重衣壳吸光度的贡献导致明显更高的cp滴度，并强调了一个错误假设，即蛋白质衣壳和包裹的dna分别仅对a280和a260峰区域有贡献。尽管在当前形式中这种方法受到a280和a260卷积的限制，但当样品含有达10％的轻衣壳(图2e)时两种构建体的cp和vg滴度误差分别小于7％(低估)和3％(高估)。仅当样品分别含有超过16％和36％的轻衣壳时cp和vg滴度的误差达到10％(图2e)。考虑到sec检测的高精密度，在含有高达约50％轻衣壳的样品中，误差仍在广泛使用的pcr和elisa滴度测定方法的可变范围内。(fagone et al.,hum gene ther methods 23,1-7(2012),kuck et al.,j virol methods 140,17-24(2007),dorange and le bec,cell gene ther.insights,119-129(2018))。此外，使用uv吸光度，从a260/a280峰面积比估计轻衣壳与重衣壳的相对百分比。计算含有0-100％轻衣壳的aav样品的a260/a280比率，并绘制为与轻衣壳含量的函数关系图(图2f)。结果图最符合三阶多项式模型。该多项式回归模型可以简单地通过aav样品的a260/a280值来计算轻
衣壳百分比。虽然a260和a280卷积可以通过将校正因子应用于滴度计算来减轻，本发明发现将mals与sec联合提供了一种更直接的方法来规避这个缺点，如下所述。使用尺寸排阻色谱法和多角度光散射表征aav和估计滴度
[0176]
mals之前已与sec和其他分离技术联合以提供病毒颗粒的直接定量和补充表征。(koppel,j.chem.phys.57,4814-4820(1972))。与sec不同，mals是一种绝对方法并且不受a280和a260卷积的限制。简而言之，mals涉及检测物质散射的光与溶液中浓度和大小的函数关系。然后astra软件使用散射光的角度来量化散射物质的物理属性。利用蛋白质和dna的内在特性，astra的蛋白质偶联物分析计算重和轻aav样品的衣壳和包裹dna的质量和摩尔质量(图4a和4b)。因此，实现了衣壳完整性、聚集和物理特征的详细总结。使用蛋白质偶联物特征，测量含有0-100％轻衣壳的aav样品的衣壳和包裹dna的质量和摩尔质量。正如假设的那样，衣壳质量恒定在6微克(μg)左右，而dna质量与轻衣壳含量的函数关系从大约1.7线性下降到0.14μg，r2》0.999(图4c)。同样，衣壳摩尔质量保持在3650千道尔顿(kda)左右，而包裹dna的摩尔质量从大约1000到100kda线性下降(r2》0.997)(图4d)。来自于malsm的衣壳和包裹dna的质量和摩尔质量通过方程式15和16用于计算cp和vg滴度，其中na是阿伏伽德罗数(6.023e23)。德罗数(6.023e23)。
[0177]
使用这些方程式计算构建体1重衣壳材料的cp和vg滴度分别为1.908el3 cp/ml和1.906el3 vg/ml，cp/vg比率为1.00。这些值与之前使用方程式13和14得到的值相当(分别为1.99e13 cp/ml和2.01e13 vg/ml)。虽然方程式15与轻衣壳含量无关，但方程式16假设aav样品包含0％的轻衣壳。因此，计算含有轻和中间衣壳的样品的准确vg滴度需要计算和校正相对衣壳含量。轻和中间衣壳的sec-mals估计和校正
[0178]
sec色谱柱中轻质和重质衣壳的共洗脱需要确定它们的相对百分比以实现准确的滴度。sec-mals允许以多种方式计算相对衣壳含量。除了a260/a280峰面积外，来自于mals的蛋白质占比(相对蛋白质dna复合物质量的衣壳蛋白质量)能够估计轻衣壳含量。蛋白质占比与0％至100％的轻衣壳含量呈线性趋势，结果是从0.77增加至0.98(两种结构的r2》0.99)(图5a)，可用于校正轻衣壳对vg滴度的贡献。即使没有轻衣壳的纯化后aav载体制剂也不仅仅包含重衣壳。(schuck,peter.biophysical journal 78.3(2000):1606-1619)。已知aav制剂由具有不同大小基因组的衣壳组成，当通过auc监测时，衣壳沉积介于重衣壳和轻衣壳之间(图1)。这些中间衣壳的存在导致测量的包裹dna的摩尔质量(1.03e06kda，图4d)低于理论值为了在sec-mals滴度计算中考虑轻衣壳和中间衣壳，衣壳的包装效率通过0％轻aav5样品中包裹的dna摩尔质量的测量值除以其理论值来确定(等式17)。
[0179]
然后方程式18使用包装效率(pe)来确定重衣壳比率。
[0180]
使用这些方程式计算含有0-100％轻衣壳的aav样品中的的重衣壳含量。重衣壳百分比测量值与已知轻衣壳含量的函数关系拟合为线性回归模型(r2》0.99)(图5b)。在已知重衣壳含量的情况下，通过将cp滴度乘以重衣壳的比率可以获得更准确的vg滴度。然而，这个计算仍然假设样品中的轻衣壳不含有任何基因组。由于轻衣壳不是完全空的(图4c和4d)，它们包裹的dna会使vg滴度值产生偏差。为防止这种情况，用方程式19计算轻aav样品的vg滴度。
[0181]
然后使用方程式20用已知的轻衣壳比率校正轻衣壳基因组对vg滴度值的贡献。轻衣壳比率＝1-重衣壳比率
ꢀꢀ
(20)
[0182]
最后，将这些计算放在一起，使用方程式21实现了vg滴度校正以反映重衣壳和轻衣壳相对含量。校正的vg滴度(vg/ml)＝(cp滴度*重衣壳比率)-(轻avv样品的vg滴度*轻衣壳比率)(21)
[0183]
将来自于mals的cp和校正的vg滴度绘制为两种构建体的轻衣壳的函数。虽然cp值保持不变，但vg滴度随着轻衣壳含量的增加呈线性下降(图5c)。使用校正的vg滴度，计算样品cp/vg比率并绘制为预期值的函数(图5d)。cp/vg的测量值和预期值显示出r2》0.99的线性相关性。图5a和5b总结了根据每个样品计算出的cp和vg滴度与预期值的平均误差。与仅来自于sec-uv的滴度相比，sec-mals提高了滴度准确度，与添加高达80％轻衣壳的样品的预期值相比误差小于4％。在具有90-100％轻衣壳的样品中观察到vg滴度误差较大。引起这些差异的原因可能是难以估计大小可变的轻衣壳基因组的绝对消光系数和dn/dc值。使用整个理论基因组的消光系数和dn/dc值进行代替计算，这对于含有90-100％轻衣壳的样品不太适用。使用sec-mals进行深入的aav衣壳分析
[0184]
为了证明sec-mals的实际应用，分析了在25℃-95℃温度范围内孵育的重和轻aav样品。在进样到sec柱之前，样品在各个温度下直接孵育30分钟。使用重物质(图7a)和轻物质(图7b)的sec a260(数据未显示)和a280的洗脱曲线，观察到各种衣壳形式(例如单体、二聚体等)和外部蛋白质和核酸杂质。还计算重衣壳和轻衣壳的单体峰面积与温度的函数关系(图7c)。与样品中的生物物理变化相关的峰面积变化可用于评估衣壳的完整性和稳定性。对于重衣壳，温度升高导致aav单体峰减少，6.5分钟处的核酸峰增加(a260/a280》1.7)。与此同时，轻衣壳被发现在较高温度下的热稳定性更高，支持了来自包裹dna的内部压力导致衣壳不稳定性的观点。(horowitz et al.,j virol87,2994-3002(2013),ivanovska et al.,proc natl acad sci usa 104,9603-9608(2007))。mals洗脱曲线反映了在轻衣壳和重衣壳uv曲线中观察到的趋势(数据未显示)。为了评估观察到的sec洗脱曲线的变化是否代表衣壳不稳定和基因组释放，监测a260/a280比率与温度的函数关系。在25℃时，重衣壳
和轻衣壳的a260/a280比率分别为1.34和0.6(图7d)。随着温度的升高，重衣壳的a260/a280比率降至0.8，拐点在55至65℃之间，但轻衣壳的a260/a280比率保持不变。a260/280比值的降低表明包裹dna的量减少，这进一步被3分钟处游离dna峰的a260/a280比率增加到约为2这一现象所支持(图7a)。为了进一步探索这一点，mals被用来监测衣壳随温度的大小分布和可能的降解。评估了单体重和轻衣壳物质随温度升高的流体动力学半径(rh)和回转半径(rg)。虽然轻衣壳的rh和rg保持不变，但发现重衣壳的两个半径都随着温度的升高而增加(图7e)。通过mals测量的大小和可变性的增加进一步支持了a280和a260/280观察到的不稳定性。有趣的是，蛋白质偶联物分析证实重衣壳和轻衣壳的衣壳蛋白的摩尔质量保持不变，而重衣壳中包裹的dna的摩尔质量随着与温度的函数关系而降低(图7f)。这些结果与a280观察到的外部dna一起支持了45℃以上的衣壳结构破坏和dna泄露的情况。此外，他们证明了sec-mals在阐明aav的生物物理变化方面的作用，例如与重颗粒相比，轻aav衣壳的热稳定性增加。讨论
[0185]
sec-mals是一种用于表征aav衣壳的宽范围物理属性的简单的、高保真方法。它提供了一种直接的、单一的方法来测量aav的cp和vg滴度，无需标准曲线，并提供多种方法来确定轻和重衣壳比率。通过利用衣壳和其包裹的dna的吸光度、光散射和折射的固有属性(properties inherent)，sec-mals原始数据可以提取出有意义的衣壳属性量化信息。sec-mals易用性、可重复性和它所提供的丰富信息，使其成为可用于表征aav的最通用工具之一。
[0186]
aav衣壳的cp和vg滴度通常使用衣壳elisa和qpcr独立测量，这可能是时间密集型和高度可变的，因而突出了对更准确和精确的滴度测定的需求。(fagone et al.,hum gene thermethods 23,1-7(2012),kuck et al.,j virolmethods 140,17-24(2007),dorange and le bee,cell gene ther.insights,119-129(2018))。使用光密度报告的vg滴度的可变性比qpcr低了1-log。(sommer et al.,mol ther 7,122-128(2003))。虽然光密度是一种简单的检测方法可以同时测量cp和vg滴度，结果可能会因蛋白质和核酸杂质而出现偏差。作为另一种紫外分光光度法，sec保留了光密度的优势，并具有将衣壳与色谱柱上的杂质分离的额外优势。因此，aav样品可以无需高度纯化即可通过sec获得准确的滴度。此外，与qpcr中批间精密度约为16％相比，sec的批间精密度显著提高至《1％。(lock et al.,hum gene ther methods 25,115-125(2014),pavsic et al.,anal bioanal chem 408,67-75(2016),pacouret et al.,mol ther 25,1375-1386(2017))。sec的局限性是轻和重衣壳从柱中的共洗脱。因此，来自a260和a280卷积的滴度误差随着轻衣壳含量的增加而增加。然而，只有在含有轻衣壳超过50％的样品中sec vg滴度的误差才达到了qpcr的常规可变性这些方法也有共同的局限性需要标准曲线来计算滴度。虽然存在轻衣壳时校正因子可用于说明它们的吸光度贡献并提高来自于sec滴度的准确性，但其工作超出了当前研究的范围。目前的研究表明，将sec与mals结合可以消除这些局限性。mals测量不受a260和a280卷积的影响，并且作为绝对方法，mals不需要标准曲线。与qpcr的5.35％和16.5％相比，ddpcr也被证明可以将批内和批间的精密度分别提高到小于2.21％和8％，而无需标准曲线。(lock et al.,hum gene ther methods 25,115-125(2014),pavsic et al.,anal bioanal chem 408,67-75(2016),pacouret et al.,mol ther 25,1375-1386
(2017))。然而，与sec-mals不同，ddpcr方法不能同时测量cp和vg滴度以及衣壳的其他物理属性。sec-mals在20分钟运行内提供准确的且更高精密度的cp和vg滴度，无需样品操作、标准曲线或劳动密集型方案。此外，还可以通过相同的方法监测衣壳完整性和稳定性等生物物理特性。
[0187]
sec-mals有点像瑞士军刀方法，是一种表征aav的多功能方法。它已成为aav产品开发和过程分析的强大工具。本研究强调了sec-mals跨行业和学术平台开发和应用于生物物理表征病毒载体的潜力。
[0188]
实施例2：通过尺寸排阻色谱和/或多角度光散射(sec-mals)技术改进腺相关病毒颗粒的分布分析和量化材料和方法样品制备
[0189]
分析尺寸排阻色谱：使用来自sepax技术的sepax sec 1000柱(7.8mm id x 300mm l)进行sec分析。该色谱柱采用sepax专有的表面技术形成均匀的亲水性，并在高纯度和增强机械稳定性的硅胶上化学键合中性纳米厚膜。sepax专有的表面技术可以很好地控制薄膜形成的化学过程，从而实现柱间高重现性。化学键合的性质和薄膜的最大键合密度有利于srt sec相的高稳定性。均匀的表面涂层可实现高效分离。用于sec-100、sec-150、sec300、sec-500、sec-1000和sec-2000的srt填料的窄分散球形二氧化硅颗粒分别具有100a、150a、300a、500a、1,000a和2,000a的标称孔径。它们特别设计的大孔体积(例如srt sec-150、300和500约为1.35ml/g，srt sec-100、1000和2000约为1.0ml/g)可实现高分离能力，从而实现高分离度。srt sec色谱柱采用专有的浆料技术填充以实现均匀稳定的填充床密度，从而实现最大的色谱柱效率。
[0190]
将50μl样品进样到sepax srt sec-1000色谱柱(称为固定相)，并用pbs(2
×
) 10％etoh的等度洗脱缓冲液(称为流动相)以1ml/min的流速洗脱。固定相和流动相包含在agilent1260系列infinity iilc系统(agilent，waldbronn，germany)中，该系统由自动热控1290样品瓶进样器和二元泵组成。通过多波长二极管阵列检测器检测柱洗脱液在260nm和280nm处的紫外吸光度，并使用chemstation openlab lc系统软件控制hplc系统和分析紫外吸光度数据。进样后的所有步骤均在22-25℃下进行。
[0191]
多角度光散射(mals)：使用dawn heleos 18角度检测器(wyatt，santa barbara，ca，usa)和optilab rex折射率检测器(wyatt，santa barbara，ca，usa)进行多角度光散射分析。astra软件用于获取和分析mals数据。
[0192]
分析超速离心(auc)：使用装有吸光度和瑞利干涉(ri)光学器件的beckman coulter proteomelab xl-iauc分析所有样品。使用sedfit程序中实行的c(s)方法分析数据。在sedfit中，对c(s)分布进行积分以建立各个峰的沉降系数、信号平均沉降系数和物质的相对数量。
[0193]
衣壳和载体基因组含量的计算：衣壳和载体基因组基于以下方程式计算浓度：
[0194][0195]
通过mals和ri信号计算蛋白质和dna质量。通过mals和ri信号使用以下已知参数计算衣壳蛋白和包裹dna的mw：ε280nm(aav5衣壳)＝1.79 ε280nm(载体dna)＝17.0结果通过sec和sec-mals表征和量化aav颗粒
[0196]
sec-mals系统：sec-mals系统包括hplc系统、尺寸排阻柱、uv检测器、mals检测器和示差ri检测器。
[0197]
sec系统(即sec-hplc系统)的示例包括一个与溶剂和样品源流体连接的尺寸排阻柱、能够使溶剂和样品流过尺寸排阻柱的泵，以及能够测量来自尺寸排阻柱流出物的光吸收的吸光度检测器。
[0198]
sec-mals系统的一个示例，其中带有尺寸排阻柱的sec-hplc系统与uv检测器、mals检测器和示差ri检测器流体连接。在操作中，样品首先流过包括尺寸排阻柱的sec-hplc系统。来自sec-hplc系统的流出物随后流入uv检测器、mals检测器和示差ri检测器。
[0199]
在使用sec或sec-mals分析含有aav颗粒的样品时，可以在短时间内(例如20分钟)表征aav颗粒的特性并量化aav颗粒的滴度。此外，sec和sec-mals都是用于多重分析的正交技术，可变性最小，并以高通量的方式快速有效地提供过程和长期稳定性信息，并允许分别收集和分析不同的级分。通过sec-mals分析可以表征的样品的特性包括可视化aav颗粒的聚集曲线、估计完整衣壳外或未包裹在完整衣壳内的核酸浓度、检查衣壳的结构完整性、估计样品中aav颗粒(即重衣壳)和空衣壳(即轻衣壳)的百分比，确定aav颗粒的粒度分布(例如，基于体积的颗粒大小或球体的直径/半径)，计算衣壳和载体基因组的重均分子量。样品的滴度量化包括量化衣壳滴度和载体基因组滴度。为了获得相同的信息，必须使用大量的常规技术，如分析超速离心(auc)、电子显微镜(em)、动态光散射分析(dls)、荧光分析、酶联免疫吸附试验(elisa)、定量聚合酶链反应(qpcr)和微滴式数字pcr(ddpcr)。
[0200]
aav制剂的sec-hplc分析：sec，顾名思义，按大小分离溶液中的分子。使用sepax srt sec-1000色谱柱分离aav5衣壳颗粒是通过将50μl样品进样到色谱柱(称为固定相)进行监测并用pbs(2
×
) 10％etoh的等度洗脱缓冲液(称为流动相)以1ml/min流速洗脱。固定相和流动相包含在agilent1260系列infinity iilc系统(agilent，waldron，germany)中，该系统由自动热控1290样品瓶进样器和二元泵组成。使用uv、mals和ri检测器监测柱洗脱液。如图8a所示，不同的检测器捕获了由此产生的异质性、分布和聚集曲线。
[0201]
图8a显示了在260nm波长处测量的样品的代表性sec-hplc曲线。该曲线显示了许多吸光度单位(au)峰，每个峰代表不同的产品或组分。例如，如图8a所示，主峰(即峰#4)代表样品中的单体衣壳。衣壳聚集体如三聚体和二聚体衣壳由峰#2和#3表示。峰#1代表来自细胞的高分子量核酸，峰#5代表小核苷酸和缓冲液成分。
[0202]
样品从色谱柱中洗脱后，记录260和280nm处的紫外吸光度用来获得洗脱曲线(图8a)。一个明显的主峰被洗脱出来，随后是主峰左侧和右侧的较小峰。这些洗脱曲线的特点是在约11.5分钟处有一个明显的主峰，而主峰左侧和右侧有小峰。很明显，溶液中的物质按大小递减的顺序从柱子中洗脱出来，aav5单体衣壳物质与更高阶的物质和其他外部蛋白质
和dna杂质分离。sec色谱柱能够对峰进行级分收集。每个峰单独分离，并通过各种技术(如auc、pcr和mals)进行表征，以确定洗脱峰的特性。如图8a所示，数据证实存在包裹目的基因的占主导的单体衣壳群以及进一步的衣壳二聚体和多聚体形式和外部dna和小核苷酸片段。
[0203]
图8b显示了在260nm和280nm波长处测量的样品的另一个代表性sec-hplc曲线。
[0204]
在该方法中监测260和280nm的洗脱曲线提供了一个很好的工具来观察样品中各种形式的衣壳(单体和更高的聚集体)以及任何外部蛋白质或dna杂质的存在(图8b)。观察到单体衣壳种类的260/280比率在批次间保持恒定，约为1.34，并且还发现其他物质(如dna或dna蛋白复合物)的比率一致性高于单体衣壳。
[0205]
图8b的曲线与图8a的相似，因为图8b的曲线显示了一个代表单体衣壳的主峰。此外，在260nm波长处的吸光度测量可量化峰的核酸浓度，并且在280nm波长处的吸光度测量可量化峰的蛋白质浓度。通过确认260nm/280nm au比率，可以表征峰代表的产物。例如，图8b的主峰260nm/280nm au比率为1.34，并代表单体aav颗粒。图8b还显示了聚集的aav颗粒(例如二聚体aav颗粒)的260nm/280nm au比率为1.13，外源核酸显示260nm/280nm au比率为1.75和2，小核苷酸和缓冲液组分显示260nm/280nm au比率为2.4。因此，单体aav粒子可以显示出260nm/280nm au比率的范围在1.13到1.75之间。
[0206]
衣壳结构完整性和稳定性分析：图9a、9b和9c显示了aav样品衣壳稳定性的分析，其中每个样品经过修饰，具有与其他样品不同的特性。
[0207]
例如，该方法可以用作稳定性指示实验，因为人们可以监测主要峰面积与时间的函数关系并跟踪样品稳定性。在25℃下进行为期1个月的小型加速稳定性研究以提供主要数据证明，从而支持该方法的稳定性应用。数据显示，随时间的变化，外部dna峰增加两倍，而单体峰面积相应下降。特别是，aav样品在25℃下保存0、1、3、5、7、10、14、21和28天，并分别用sec-hplc分析。相对于较长的储存时间，如图9a所示的单体aav颗粒的％峰面积减少，并且如图9c所示的外来核酸的％峰面积增加。特别地，外来脱氧核糖核酸(dna)峰的％峰面积线性增加约2倍。这表明衣壳的稳定性发生了变化。如图9b所示的二聚体aav颗粒的％峰面积没有随着储存时间的延长而发生实质改变。
[0208]
aav制剂的mals分析：通过mals分析来自aav制剂的样品。如上所述，来自sec-hplc系统的流出液流向uv检测器、mals检测器和示差ri检测器。
[0209]
紫外和示差ri检测器用于检测核酸和蛋白质浓度。
[0210]
蛋白质和核酸(即dna)的折射率增量(dn/dc)用来通过示差ri检测器的测量值计算样品中蛋白质和核酸的浓度。下面提供了蛋白质和核酸的折射率增量。
[0211]
衣壳和载体的消光系数(s)用来通过紫外检测器测量样品在280nm处的吸光度测量值计算浓度。消光系数来源于空衣壳和未包裹的载体基因组的多次吸光度测量。例如，下面提供了aav5衣壳和载体基因组的消光系数。ε(aav5衣壳)＝1.79 ε(载体dna)＝17.0
[0212]
通过使用折射率和紫外吸收测量值，可以计算样品中衣壳和载体基因组的质量。
[0213]
以下方程式适用于根据折射率的变化计算衣壳和载体基因组的质量。
[0214]
δn是由示差ri检测器检测到的折射率变化。
[0215]
(dn/dc)v是aav载体的折射率增量。
[0216]
(dn/dc)
cp
是衣壳的折射率增量。
[0217]
(dn/dc)
dna
是载体基因组的折射率增量。
[0218]
x是衣壳的质量分数。
[0219]
以下方程式适用于根据吸光度的变化计算衣壳和载体基因组的质量。εv＝ε
cp
·
x ε
dna
·
(1-x)
[0220]a280
是紫外检测器检测到的吸光度。
[0221]
εv是aav载体的消光系数。
[0222]
l是路径长度。
[0223]
ε
cp
是衣壳的消光系数。
[0224]
ε
dna
是载体基因组的消光系数。
[0225]
x是衣壳的质量分数。
[0226]
如以下方程式所示，从折射率和紫外吸收率进行的计算相互关联。
[0227]
mals检测器采用静态光散射来测量aav粒子的摩尔质量和浓度。如下面方程式所示，0
°
散射的光与aav粒子的摩尔质量和质量浓度成正比。
[0228]
i(θ)
散射
是光散射的强度。
[0229]
m是aav颗粒的摩尔质量。
[0230]
c是aav颗粒的浓度。
[0231]
dn/dc是aav颗粒的折射率增量。
[0232]
mals检测器还可以通过动态光散射测量颗粒的平均大小。对于动态光散射，散射光随散射角的变化与散射分子的平均大小成正比。颗粒的平均大小包括流体动力学半径(rh)和回转半径(rg)的测量值。rh被理解为与所观察分子相同速率扩散的等效硬球的半径。rg被理解为从分子核心到分子中每个质量单元(mass element)的质量加权平均距离。
[0233]
图10的(a)和(b)显示了衣壳和包裹dna的摩尔质量。图10(a)和(b)中所示的峰与图8a和8b中所示的峰相关，其中主峰代表单体aav颗粒，较小的峰代表aav颗粒聚集体。图10
的(a)和(b)还显示单体aav颗粒的颗粒大小基本均匀。图10的(c)和图11显示了aav颗粒的颗粒大小和分子量。除了表征aav颗粒的特性外，该信息还可用于量化aav制剂的滴度。同样如图11所示，样品中轻衣壳的百分比通过分析超速离心证实为0％。
[0234]
用sec-mals分析量化制剂中aav的滴度：假设样品不包含空衣壳，则可以使用以下方程式计算衣壳和载体浓度。方程式计算衣壳和载体浓度。
[0235]
图12显示了来自如图11中所示的mals分析的滴度计算。通过分析超速离心确认样品中轻衣壳的百分比为0％。
[0236]
量化含有空衣壳的制剂中的aav滴度：图13a、13b和13c突出显示，样品中核酸的总质量随着空衣壳浓度的增加呈线性下降。图13c特别显示了核酸级分的总质量随着空衣壳浓度的增加而线性降低，而图13a和13b显示了蛋白质占比的增加，并且蛋白质级分的总质量随着空衣壳数量的增加和完整衣壳数量减少而保持不变。由于空衣壳的浓度影响核酸的总质量，因此应在起始材料中确定空衣壳的百分比。载体基因组的重量加上衣壳的重量等于aav颗粒的总分子量。例如，含有衣壳mw为3.73x106千道尔顿(kda)和包含4.9千碱基(kb)的载体基因组mw为1.53
×
106kda的aav颗粒的理论mw为5.23
×
106kda。但如图14a所示，测得的aav颗粒mw为4.71
×
106kda。同样如图14b和14c所示，衣壳和4.9kb载体基因组的mw测量值为3.73
×
106kda和0.96
×
106kda。
[0237]
图15和16显示的示例突出显示了具有不同浓度的衣壳和不同mw载体基因组的样品。
[0238]
为了解决mw理论值和计算值之间的差异，可以查看aav颗粒的包装效率。例如，下面提供了一个方程式基于4.9kb载体基因组的mw计算值(即0.96兆道尔顿(mda))和aav颗粒的理论包装限制(即4.7kb载体基因组的理论mw或1.44mda)来确定包装效率。
[0239]
鉴于由sec-mals确定的非预期包装效率，以下方程式提供了样品中空衣壳的校正。mw
dna
计算值＝mw
pldna
理论值xpe
[0240]
衣壳和载体浓度由以下方程式计算。
载体浓度(vg/ml)：
[0241]
图17a突出了样品中完整衣壳(即aav颗粒)的总浓度随着空衣壳浓度的增加而线性下降。图17c特别显示了载体基因组浓度随着空衣壳浓度的增加而线性降低，而图17b显示衣壳浓度随着空衣壳浓度的增加而保持不变。
[0242]
不同样品大小分布的mw分析：图18a突出显示衣壳的mw保持不变，但被包裹的载体基因组的mw随空衣壳的变化而变化。图18b突出了衣壳的rh是恒定的，rg取决于样品中空衣壳的百分比浓度。
[0243]
基于这些计算，如图19所示可以确定空衣壳的估计百分比浓度。如图20a、20b、20c和20d所示，这些估计值与传统测定法相当。
[0244]
实施例3：用于基因治疗的病毒衣壳的生物物理稳定性研究材料和方法
[0245]
所有缓冲液成分均购自j.t.baker(center valley,pa,usa)。用来自emd millipore系统(burlington，ma，usa)的纯化水制备缓冲液，并通过0.2μm聚醚砜膜(nalgene，rochester，ny，usa)过滤。
[0246]
病毒样品：内部慢病毒(lv)ph研究样品用含300mm nacl和2mm mgcl2的柠檬酸盐(ph 4.00)、磷酸盐(ph 6.00和ph 8.00)、tris(ph 7.40)或碳酸盐(ph10.00)的缓冲液进行透析，而慢病毒盐研究样品在所需盐浓度(0-1m)下用含有2mm mgcl2的tris缓冲液(ph 7.40)进行透析。所有透析均使用规格为0.1ml、20kda分子量截留的slide-a-lyzer
tm
迷你透析杯(thermo fisher scientific，waltham，ma，usa)透析15分钟。虽然这r种方法稍微稀释了样品，但未发现透析装置改变lv颗粒的大小或结构(数据未显示)。腺相关病毒(aav)样品从内部流程开发运行中获得，以下称为“来源a”，或从vigene biosciences(rockville，md，usa)获得，称为“来源b”。
[0247]
lv生物物理表征方法开发：对于初步sec实验，将100μl lv样品进样到tskgel g5000pwxl柱(300.0mm x 7.8mm i.d.)上使用2xpbs、ph 7.40缓冲液以0.300ml/min流速进行等度洗脱。使用chemstation openlab lc系统软件根据时间自动收集洗脱级分，在17-41分钟内以2分钟为间隔收集每个级分。方法优化包括对两根色谱柱、三种流速和九种缓冲液的评估，总结在表b中。初步实验中使用的tskgel g5000pwxl色谱柱选择tris缓冲液流动相(20mm tris，300mm nacl，2mm mgc12,ph 7.40)，流速为0.300ml/min。所有实验均在22-25℃下进行。表b.lv色谱方法优化评估的色谱柱、流速和洗脱缓冲液汇总。选定的方法参数以粗体表示。色谱柱tskgel g5000pwxltskgel g-dna-pw流速0.300ml/min0.500ml/min1.000ml/min
缓冲液2xpbs,ph 7.402xpbs,10％etoh,ph 7.4020mm tris,150mm nacl,ph 7.4020mm tris,150mm nacl,2mm mgcl2,ph 7.4020mm tris,150mm nacl,2mm mgcl2,2％sucrose,ph 7.4020mm tris,300mm nacl,ph 7.4020mm tris,300mm nacl,2mm mgcl2,ph 7.4020mm tris,300mm nacl,2mm mgcl2,2％sucrose,ph 7.40
[0248]
尺寸排阻色谱法与多角度光散射(sec-mals)联合：se-hplc实验在包括自动热控1290样品瓶取样器和二元泵的agilent 1260系列infinity iilc系统(agilent，waldbronn，德国)上进行。通过多波长二极管阵列检测器检测280nm和260nm处的紫外吸光度，并使用chemstation openlab lc系统软件控制hplc系统和分析紫外吸光度数据。与我们的lc系统相结合，通过dawn heleos 18角度检测器(wyatt，santa barbara，ca，usa)和optilab rex折射率检测器(wyatt，santa barbara，ca，usa)检测mals信号。astra 7.1.2软件用于获取和分析mals数据。对于慢病毒实验，采用tris缓冲流动相以0.3ml/min的流速将25μl样品进样到tskgel g5000pwx色谱柱上(如上所述)。所有样品在进样前直接在25℃下从冰箱中解冻。进样后的所有操作均在22-25℃下进行。对于腺相关病毒颗粒实验，进样25μl样品，使用2xpbs 10％etoh以1ml/min的流速进行等度洗脱。所有样品在进样前从冰箱中取出于37℃解冻。进样后的所有操作都在22-25℃下进行。
[0249]
远紫外圆二色(cd)光谱：使用jasco j-1500分光偏振计收集远紫外圆二色光谱，该分光偏振计配备六位比色皿支架(jasco，oklahoma city，ok，usa)，控制在25℃恒温。对于慢病毒实验，将30μl样品加样到0.1mm路径长度的比色皿中，而将170μl样品加样到1mm路径长度的比色皿中进行腺相关病毒实验。所有数据均在190至250nm波长范围内收集，分辨率为0.2nm，扫描速度为50nm/min，响应时间为4s，带宽为2nm。所呈现的光谱是10次连续测量的平均值。
[0250]
动态光散射(dls)：使用uncle一体化生物稳定性筛选平台(unchained labs，pleasanton，ca，usa)来记录在自由模式下设计的阶梯式温度-梯度过程中的dls测量值。这种自由模式的方法旨在尽可能短的时间内实现从25-95℃以2℃为增量的测量。在测量之前将8.8μl样品直接加样到uni孔中。对每个样品进行4次dls测量，每次5秒。所有样品一式三份测量。
[0251]
内在衣壳荧光：uncle仪器“带有可选dls的tm&tagg”的应用程序用于记录暴露的色氨酸或酪氨酸衣壳蛋白残基的内在荧光。使用波长为473nm的激光激发光，在500和700nm之间的波长处记录荧光发射光谱。将8.8μl样品加样到uni孔中，并从25℃到95℃以2.5℃为增量阶梯式热梯度加热。所有样品一式三份测量。
[0252]
外部衣壳荧光：uncle仪器的“tm with sypro”应用程序用于记录样品外部荧光。将sybr gold nucleic acid染料(invitrogen，carlsbad，ca，usa)在磷酸盐缓冲液中稀释至推荐工作浓度，立即加入到每个样品中，然后将样品加样到8.8μl uni孔中。随后使用内在荧光实验中相同的激发/发射波长和温度程序。所有测量操作一式三份。将荧光强度与温
度的函数关系拟合为玻尔兹曼方程用来确定最低展开温度。转变温度值对应于转变的中点或拐点。
[0253]
碱性琼脂糖凝胶电泳：包裹的基因组的大小分布通过0.8％琼脂糖凝胶电泳、用gelred核酸凝胶染色剂(biotium)染色以及使用chemidoc成像系统在紫外光下可视化来确认。将0.8g seakem le琼脂糖溶解在100ml l
×
碱性缓冲液(50mm naoh，1mm edta)中制备琼脂糖凝胶。电泳前，将1.0e 11vg样品加入1.5μl 10％sds(ambion)和7.5μl 6
×
碱性凝胶进样染料(alfa aesar)中，并加入1
×
碱性缓冲液至25μl。将7.8μl的1kb分子量大小标记(ladder)(new england biolabs)加入6.3μl 10％sds、30μl 6x碱性进样染料和30.95μl 1x碱性缓冲液中，一式三份运行。将18μl样品和分子量大小标记(ladder)加样到凝胶上，使用52v/cm分离3.5小时，然后在中和缓冲液(1mtris-hcl，1m nacl，ph 7.40)中洗涤3次，每次10分钟。凝胶上的dna用gelred溶液(30μl gelred、20ml中和缓冲液、180ml milli-q h2o)染色30分钟，然后在milli-q纯化的水中洗涤3次，每次10分钟。dna在chemidoc成像系统上使用gelred读取设置进行可视化。结果尺寸排阻色谱法与多角度光散射联合定性和定量表征慢病毒颗粒
[0254]
使用先前steppert等人概述的方法(j.chromatogr.1487:89-99,2017)，以病毒样颗粒的表征为起点，开发了一种生物物理分析lv颗粒的sec-mals方法。这种方法允许对lv颗粒进行定性和定量评估，并提供了一种新的、可重复的方法来快速估计lv颗粒滴度。
[0255]
将100μl粗制和纯化lv样品进样到tskgel g5000pwxl色谱柱(图21)来进行初步sec实验。使用ph 7.40的2
×
pbs作为洗脱缓冲液，流速为0.3ml/min。sec洗脱曲线通过280nm处的紫外吸光度检测。在纯化的lv样品进样后收集级分1-12，并选择圆圈标记的级分进行p24和ddpcr分析。这些分析证实了在色谱柱的空隙体积中存在洗脱的lv颗粒，表现为19分钟标记附近的峰。25到45分钟之间的剩余峰代表蛋白质或核酸样品杂质。
[0256]
对粗lv sec曲线的初始检查显示样品存在显著异质性，在25到40分钟洗脱时间之间的峰分辨率最小。然而，在纯化的lv sec曲线中，这些峰显著降低。鉴于lv量级，在兆道尔顿尺寸范围内，lv颗粒预计将在色谱柱的空隙体积内洗脱，其中洗脱的是大的、未保留的分子，表现为19分钟标记处附近的初始峰。实际上，通过对纯化的lv加样液(表c)的各种洗脱级分(f1-3、6和9)进行p24和微滴式数字pcr(ddpcr)分析来确认此时洗脱的lv颗粒的存在。表c.选定的纯化lv洗脱级分的p24和ddpcr分析结果。
[0257]
选定级分的p24 elisa分析显示对应于空隙体积峰的第二级分中p24的最高浓度(图21和表c)。根据这些结果，ddpcr级分分析证实了第二和第三级分中lv rna的最高浓度
(表d)，进一步支持了lv颗粒在空隙体积峰中的洗脱。25到45分钟之间的剩余uv峰被认为代表残留蛋白质和核酸杂质的洗脱。经识别lv洗脱表现为在洗脱约19分钟后的第一个峰，随后的方法开发重点是提高分辨率和该峰与其余杂质峰的分离度。
[0258]
为了优化lv色谱方法，评估了各种色谱柱、流速和缓冲液(总结在表b，实施例1中)。尽管进行了色谱柱筛选，但最终还是选择了初步实验中使用的原始tskgel g5000pwxl色谱柱，因为在空隙体积中有效地将lv与其他样品杂质分离。此外，发现将流速提高到超过0.300ml/min可以减少lv载体和杂质洗脱之间的时间，最大限度地减少峰分离(数据未显示)。因此，继续选择使用在初步实验中应用的初始流速0.300ml/min。缓冲液筛选的目的是最大限度地提高lv载体的稳定性，同时最大限度地减少柱对载体的吸附。找到这种平衡对病毒载体色谱优化提出了重要挑战。虽然lv样品添加剂可能起到稳定载体结构的作用，但它们也可以对载体-柱的疏水相互作用产生影响，由此影响柱对载体的吸附。
[0259]
在本研究中，nacl、mgcl2和蔗糖被评估为缓冲液成分。不同的ph值没有被筛选，因为优选与细胞溶质ph相对应的ph7.40。鉴于磷酸盐易于与金属离子等样品添加剂相互作用，tris也被评估为缓冲液，而不是初步实验中使用的pbs。这个缓冲液筛选过程强调了三个值得注意的观察结果。首先，在流动相中加入乙醇，即使是最低限度的(～10％)，也会大大降低lv紫外峰信号(数据未显示)，表明lv载体在酒精存在的情况下可能容易降解、聚集或沉淀。其次，至少需要300mm nacl才能防止lv载体吸附到色谱柱上(图22)，当nacl浓度低于300mm时，lv uv峰信号的损失和样品峰的保留增加就证明了这一点。第三，虽然mgcl2不影响紫外吸收信号，但流动相中蔗糖的存在导致大量吸附和峰保留(数据未显示)。鉴于这些观察结果，以下所有lv色谱实验选择的参数是20mm tris缓冲液(含有300mm nacl和2mm mgcl2，ph7.40)以0.300ml/min的流速通过tskgel g5000pwxl色谱柱。
[0260]
开发一种lv生物物理表征方法，sec与mals的联合被评估为扩大可访问数据范围的一种手段。按照之前概述的色谱参数，在不同天一式三份进样40μl纯化的lv，以获得平均sec-mals曲线(图23a和23b)。虽然在sec uv曲线中观察到四个可区分的峰(图23a)，但在mals洗脱曲线中仅观察到一个主要峰，这与lv sec洗脱峰显著对应(图23b)。
[0261]
由于lv颗粒巨大的兆道尔顿大小，其预计会显著散射光。正因为如此，lv颗粒的洗脱理论上将由一个大的mals峰代表(大约17分钟标记处)。实际上，与sec洗脱曲线中的空隙体积峰相对应的这种峰的存在进一步支持了先前报道的p24和ddpcr结果，表明lv颗粒在此时洗脱。此外，在sec洗脱曲线中缺少与杂质峰(峰2-4)相对应的mals峰，表明这些杂质是不能散射大量光的小蛋白质或核酸杂质。
[0262]
主要mals峰的摩尔质量分析表明在柱的空隙体积中存在与lv载体颗粒一起洗脱的高阶物质，如mals峰前半部分的摩尔质量下降所示。该数据与p24和ddpcr分析一致，该分析检测到第二个洗脱级分中的大部分p24和lv rna拷贝，由空隙体积峰的后半部分表示(图21和表c)。重要的是，对主要mals峰后半部分的初始定量分析显示此时洗脱的颗粒具有与lv颗粒尺寸的文献值一致的平均分子量和半径(表d)。sec、p24、ddpcr和mals分析结果均表明lv颗粒在空隙体积峰的后半部分洗脱，随后的方法开发重点是利用mals数量密度程序来实现在此时间范围内洗脱的lv颗粒的滴度估计。表d.mals检测到的lv颗粒的平均大小
[0263]
随着lv洗脱峰的确定，通过线性研究评估了mals对lv颗粒的量化。10μl、20μl、40μl和80μl的lv样品体积在不同天一式三份进样，并使用mals数量密度程序进行评估。mals峰与进样量成正比(图24a)，并且与初始mals分析和文献值一致，在17分钟左右洗脱的lv颗粒的平均分子量和半径分别为1.27e 08
±
0.06da(n＝10)和62.50
±
3nm(n＝12)。虽然mals检测器分析的lv颗粒大小在每次进样过程中保持一致，但检测到的颗粒数量随样品体积线性增加(表e)。对lv样品的进样量为10μl至80μl通过f-检验统计的95％置信区间得以确认线性模型，平均斜率为1.0x105，平均截距为1.1x10-5
，平均相关系数为0.9947(图24b)。因此，进一步，sec-mals被确立为一种有用的生物物理工具以用来获得定性样品信息，例如样品异质性和分子量分布，以及溶液中病毒颗粒的定量信息，即直径、分子量和数量密度。值得注意的是，mals数量密度程序允许直接量化病毒颗粒而无需校准曲线，表明是一种快速估计病毒颗粒滴度的新的、可靠的方法。表e.使用mals数量密度程序估算lv大小和滴度的总结慢病毒ph稳定性研究
[0264]
已开发的一种基于sec-mals的方法被证明是定性和定量评估lv颗粒的一种有价值的方法，它被应用于随后的lv ph稳定性研究。在与上述线性研究相同的条件下，在进样前将lv样品直接用相应的ph缓冲液透析。监测lv在ph4.00、7.40和10.00的sec洗脱曲线以涵盖较宽的ph范围。如前所述，内部ddpcr和p24分析证实lv在进样后约17分钟从该柱洗脱。值得注意的是，在ph 4.00的lv颗粒的se洗脱曲线中，主lv 280nm紫外峰几乎完全消失(图25a)。此外，与ph 7.00时的lv颗粒的洗脱曲线相比，该峰在ph 10.00时的lv颗粒的洗脱曲线中扩大了(图25a)。同样的趋势反映在mals曲线中(图25b)，显著的lv mals峰在ph 10.00曲线中扩大，在ph 4.00曲线中急剧下降。根据这些观测结果，mals颗粒数量和大小分析(表f)揭示了与ph 7.40和10.00的颗粒数量相比，ph 4.00的颗粒数量分别减少了约15至约20倍。此外，虽然颗粒在ph 4.00下的流体动力学半径保持一致，但ph 4.00时颗粒的分子量比文献值小了约3倍(表f)。虽然lv颗粒在ph 7.40和10.00的大小是一致的，但在ph 10.00的颗粒数量增加了约1倍，这与在ph10.00 sec-mals曲线中观察到的增加的峰大小一致(表f，图25a和25b)。这些结果表明不仅载体在低ph值下分解，而且可能在高ph值下保持载体完整性。表f lv大小和滴度随ph变化的估计总结
[0265]
为了全面评估ph值对lv颗粒解体的影响，采用圆二色性(cd)确定ph值对lv二级结构的影响。cd光谱来自光与手性分子的累积相互作用。每种蛋白质都有一个在很大程度上受蛋白质的整体3d结构影响的特定的cd特征。这使得cd成为分析蛋白质二级结构的有用工具。此外，蛋白质二级结构元件如α螺旋和β折叠具有特征性cd信号。主要为α-螺旋的结构以210nm和220nm附近的两个最小值为特征，而主要由β-折叠组成的结构以220nm附近的一个最小值为特征。lv颗粒在ph 7.40的cd数据表明主要是α螺旋构象(图26)。与lv ph样品的sec-mals分析一致，这种α-螺旋构象在ph 4.00时在lv颗粒中完全丢失，表明载体完全分解。然而，载体蛋白构象在ph值为10.00时保留在lv颗粒中，这支持了高ph值有助于保护lv载体完整性的观点。
[0266]
由于sec-mals和cd数据的一致结果表明ph值和lv颗粒完整性之间存在正相关，通过监测lv颗粒随温度升高的动态光散射(dls)评估lv颗粒的热稳定性与ph值的函数关系。dls测量悬浮在溶液中的颗粒扩散的速率。这些颗粒经历布朗运动表明较大的颗粒将比较小的颗粒扩散得更慢。dls基于颗粒扩散速率来近似颗粒大小。由于蛋白质的展开与其聚集有关，dls熔解曲线可用于确定lv颗粒的熔点。换句话说，随着lv颗粒的蛋白质展开，这些颗粒将聚集并共同散射光，被dls装置感知为一个大颗粒。因此，颗粒大小的急剧增加表明蛋白质随温度展开。值得注意的是，在dls评估之前直接透析至ph 4.00的颗粒已经聚集超过了dls仪器的检测限(》1000nm直径)。因此，报告了透析至ph 6.00、7.40和10.00的lv颗粒的dls熔解曲线(图27a和27b)。这些结果表明lv颗粒在ph 6.00的热稳定性最差，熔解温度约为47℃，其次是ph 7.40的颗粒，熔解温度约为53℃，最后，ph 10.00的颗粒的熔解温度约61℃(图27b)。有趣的是，虽然ph值6.00和7.40的lv颗粒在熔化后迅速达到dls仪器的检测上限，但ph值10.00的lv颗粒从未达到此限制(图27a)。因此，正如sec-mals、cd和dls所评估的那样，lv颗粒的完整性似乎与ph值直接相关，因为从所有三种技术获得的结果表明载体在低ph值下解体，在高ph值下保存。慢病毒盐稳定性研究
[0267]
除了ph值外，还使用相同的基于sec-mals的方法和生物物理工具评估lv颗粒稳定性与ph值的关系。在与上述线性和ph研究相同的色谱条件下，在进样前将lv样品直接透析到相应的盐缓冲液中。监测0mm、300mm和1m nacl下lv的sec洗脱曲线。有趣的是，与ph稳定性研究不同，未观察到与盐浓度相关的lv样品sec-mals曲线的主要差异(图28a和21b)。类似地，主要mals峰的分子量趋势在离子条件下是一致的(图28b)。此外，虽然在所有三种离子条件下通过mals测定的lv颗粒大小与文献值一致，但lv颗粒的数量随着盐浓度的增加而略有增加。表g评估lv大小和滴度与盐关系的总结
[0268]
尽管使用sec-mals时，盐浓度对lv颗粒分解的影响不明显，使用cd来观察lv二级结构是否随离子强度而改变。与sec-mals结果一致，在所有三种离子条件下观察到lv颗粒的主要α螺旋结构(图29)，进一步表明盐浓度对lv颗粒完整性没有任何直接影响。
[0269]
尽管sec-mals和cd观察到离子条件对lv颗粒完整性没有任何直接影响，还是使用dls热梯度评估它们对lv颗粒热稳定性的影响。有趣的是，发现lv颗粒的热稳定性随着盐浓度的增加而增加。报道了透析至0mm、300mm和1m nacl的lv颗粒的dls熔解曲线(图30a)。这些结果表明lv颗粒在0mm nacl下的热稳定性最差，熔解温度约为50℃，其次是300mm nacl下的熔解温度约为53℃，最后是1m nacl时的熔解温度约为63℃(图30b)。因此，lv颗粒在低离子条件下显得不太稳定，高盐浓度可增加lv颗粒的稳定性，同时降低聚集倾向。腺相关病毒类型5的热稳定性研究
[0270]
差示扫描荧光法(dsf)用于研究包裹基因组大小对aav衣壳热稳定性的作用。在这种技术中，衣壳在可与展开蛋白的疏水区域结合的荧光染料(通常是sypro-orange
tm
)的存在下加热。随着衣壳蛋白展开，它们的疏水口袋暴露出来，从而结合染料并产生更大的荧光。因此，荧光的增加表明蛋白质随温度的展开。使用这种技术，无论包裹的基因组大小如何，aav5衣壳的熔解温度据报道约为89℃。事实上，使用类似的方法，空(无包裹基因组)和完整(封装基因组)raav5衣壳的熔解温度与这些报道一致(图31a)。这些结果通过测量衣壳蛋白的色氨酸和酪氨酸残基的内在荧光而获得。随着蛋白质展开，它们的色氨酸和酪氨酸残基暴露于溶剂中，从而增加了它们的荧光。因此，与dsf类似，内在荧光的增加表明蛋白质随温度展开。虽然这些初步结果似乎支持基因组大小在确定衣壳热稳定性方面的重要性，但随后不久使用cd获得相反支持结果。空衣壳和完整衣壳的初始代表性远紫外cd光谱在210nm和270nm处显示出差异(图31b)。空衣壳cd光谱显示出一条曲线，表明主要为α-螺旋构象，与完整衣壳相比最小值为210nm，而完整衣壳的曲线在220nm最小值处更能表明β-折叠。毫不奇怪，完整衣壳cd光谱在270nm即dna吸收光处显示吸收，这在空衣壳中没有观察到。值得注意的是，虽然空衣壳和完整衣壳通过cd得到的熔解温度与之前的报道一致，但观察到了完整衣壳的双相熔解曲线，而在空衣壳中未观察到(图31c和31d)。当在220nm(图31c)和270nm(图31d)处监测cd椭圆率时观察到该双相曲线。这些结果确保了完整衣壳相较于轻衣壳的热完整性的进一步研究。
[0271]
为确定高温暴露时空衣壳和完整衣壳完整性之间的任何差异，将两种类型的衣壳在25℃-95℃下以10℃为间隔进行孵育后使用sec-mals进行评估。在用2
×
pbs 10％etoh流动相以1.0ml/min流速进样之前，衣壳样品在各个温度下直接孵育30分钟。在25℃孵育后，两种衣壳类型均显示出一致的sec曲线，在进样后约11分钟具有主要的280nm紫外峰(图32a和32b)和相应的mals峰(未显示)。虽然在35℃下孵育后空衣壳和完整衣壳的这一曲线保持不变，但随着随后进样的温度增加，观察到两个非常明显的趋势(图32a、32b和32c)。对于空
衣壳，观察到从45℃到75℃的主要衣壳峰逐渐减少约15％(图32a和32c)。在85℃孵育后，主峰的百分比下降到原来的65％，然后在95℃孵育后骤降到接近0％(图32a和32c)。与此形成鲜明对比的是，在45℃孵育后，完整衣壳的主峰下降约20％，然后在65℃时骤降至原来的约10％(图32b和32c)。mals洗脱曲线反映了在空衣壳和完整衣壳uv曲线中观察到的趋势(数据未显示)。由于核酸在260nm处吸收光，而蛋白质在280nm处吸收光，因此比较260nm与280nm紫外洗脱曲线下的面积而得到的260:280比率可能是表征蛋白质-dna衣壳复合物的有用工具。对这个比率与温度的函数关系的监测突出了完整衣壳中一个有趣的转变，而空衣壳中没有这种转变。正如预期的那样，在25℃时，完整衣壳的初始260:280比率远高于轻衣壳这是由于它们包裹的基因组(图32d)。然而，虽然空衣壳的260:280比率在75℃之前保持不变，但在60℃左右观察到完整衣壳的这一比率下降(图32d)。这些结果表明，在此温度下，完整衣壳中包裹的dna量减少，这表明衣壳结构可能发生破坏和随后的dna泄露。为了进一步探索这一点，mals蛋白偶联程序用于监测空衣壳和完整衣壳的蛋白质和包裹dna的分子量分别与温度的函数关系。该分析证实虽然空衣壳和完整衣壳的蛋白质衣壳的分子量在25℃至65℃之间保持恒定(图33a)，但重衣壳中包裹的dna的分子量随温度而降低(图33b)。这些结果支持了这样一种观点，即含有基因组的衣壳在比1)空衣壳分解和2)衣壳蛋白熔解的温度之前更早分解并泄露其包裹的dna。重要的是，通过sec-mals评估的完整衣壳热稳定性中观察到的趋势与在cd熔解曲线中观察到的双相结果一致，表明在约90℃发生衣壳蛋白熔解之前很久就存在衣壳降解的转变温度。有证据支持包裹基因组的存在影响衣壳稳定性的观点，评估了覆盖一系列单链基因组大小的raav5衣壳，以更密切地监测基因组大小对热完整性的影响。如果衣壳蛋白在90℃熔解之前衣壳完整性确实受到损害，则dna应释放到溶液中。因此，为了监测衣壳分解，使用sybr金核酸染料监测外部衣壳荧光。该方法的前提是sybr gold染料与从衣壳排出到溶液中的dna结合(图34a)。随着衣壳分解，更多的dna能够结合sybr金，荧光曲线的强度增加。因此，外部荧光曲线可用于监测衣壳的分解，而不是衣壳的熔解温度(通过dsf和内部荧光评估)。为了测试该方法，在25℃至95℃范围内测量了与sybr金染料混合的完整和空raav5衣壳的荧光。正如预期的那样，完整衣壳的荧光曲线随温度增加(图34b)，表明sybr金染料与排出的dna结合，而空衣壳的荧光曲线因为缺乏与sybr金结合的dna可以忽略不计(数据未显示)。通过将荧光曲线下的面积绘制成与温度的函数关系的图，观察到重衣壳的明显趋势和转变温度，与在cd热熔体中观察到的趋势一致(图34c)。没有观察到空衣壳的趋势(图34c)。这些结果进一步表明存在衣壳分解发生的转变温度约55℃。使用这种方法，评估了覆盖一系列单链基因组大小的raav5衣壳，以确定衣壳随包裹基因组大小变化的转变温度中任何可感知差异。衣壳样品1-7按照基因组大小增加的顺序包被一系列单链基因组(图35a)，与sybr金染料混合，然后评估其外部荧光与温度的函数关系。引人注意的是，衣壳转变温度与基因组大小成反比(图36a和36b)。也就是说，在衣壳样品1-7中观察到转变温度的线性趋势，即样品1中的衣壳具有最高的转变温度，而样品7中的衣壳具有最低的转变温度。这些结果表明，包被较大基因组的衣壳的热稳定性低于包被较小基因组的衣壳。
[0272]
为了进一步评估基因组大小对raa5衣壳完整性的影响，通过sec-mals评估了来自样品2、4和6(包括各种基因组大小)的衣壳的热稳定性。衣壳样品在25℃、55℃和75℃下直接孵育30分钟，然后进样到sec-1000sepax柱上，流速为1.0ml/min，流动相为2
×
pbs 10％
etoh。在25℃孵育后，所有衣壳均显示出一致的sec曲线，在进样后约11分钟具有主要的280nm uv峰(图37a、37b和37c)和相应的mals峰(未显示)。然而，三个衣壳样品在55℃孵育后，观察到每个样品之间的主要uv峰面积差异(图37a、37b和37c)。虽然观察到样品2衣壳(包被最小的基因组)的主uv峰减少了约29％，但样品4衣壳观察到减少约38％，样品6衣壳观察到减少约73％(包被最大的基因组)(图37d)。在75℃下孵育后，所有三种衣壳的主要uv峰均降至原始值的约10％以下。虽然这些结果表明所有三种衣壳结构都在75℃之前降解，但受其包裹基因组大小的调节，所有三种衣壳裂解的开始都不同。
[0273]
虽然上面描述了示例性实施例，但这些实施例并不旨在描述本发明的所有可能形式。相反，说明书中使用的词语是描述性词语而不是限制性词语，并且应当理解在不背离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变。此外，可以组合各种实施的实施例的特征以形成本发明的进一步实施例。