一种调控原癌基因MYB的长链非编码RNA及其应用的制作方法

一种调控原癌基因myb的长链非编码rna及其应用
技术领域
1.发明涉及分子生物学和医药领域，具体为一种调控原癌基因myb的长链非编码rna。


背景技术：

2.myb是一种广泛存在于真核生物中，并在进化上高度保守的原癌基因，其主要的生物学效应为调节细胞增殖分化。已有较多的研究表明，myb在白血病中高度表达，能够作为转录因子，调控癌细胞的增殖、分化、侵袭等过程，是白血病发生的驱动因素。因此，myb在白血病的检测和治疗中发挥着重要作用。
3.目前白血病的治疗主要以化疗和骨髓移植为主，化疗副作用大，临床易复发，而骨髓移植费用较高，骨髓来源少，导致白血病的总生存率仍然较低。因此，临床上需要寻找早期而敏感的治疗靶点并探索有效的治疗方法，以更好地降低白血病的死亡率。长链非编码rna(long non-coding rna，lncrna)是指转录本长度大于200个核苷酸，且不具备蛋白质编码功能的一类rna。研究表明，lncrna 可以在表观遗传、转录以及转录后水平调控基因的表达。此外，lncrna还参与多种重要的生命调控过程，包括基因组印记、染色质修饰、rna代谢、蛋白质功能活性以及染色质重塑等。且已被证实，lncrna与人类疾病的发生发展密切相关，参与多种肿瘤的发生发展过程，但lncrna在白血病中的研究仍处于起步阶段。
4.已有研究发现，远端调控元件在myb表达调控中具有非常重要的作用，myb 上游区域的dna序列可以与myb启动子形成dna-loop，并募集转录因子 hoxa9、pu.1和结构蛋白ctcf和cohesin等远端调控myb基因的转录。而lncrna 在白血病的发生和发展过程中可通过多种机制调控细胞增殖、凋亡等过程，发挥促癌或抑癌作用。近年来，虽然关于lncrna的研究进展迅猛，但是绝大部分的 lncrna的功能仍然是不清楚的，本发明在myb上游96k区域的位置发现了转录生成的lncrna，这种lncrna对myb基因的作用以及对白血病的影响未有人研究。


技术实现要素：

5.本发明旨在针对目前白血病检测和治疗的缺陷和不足，提供一种调控原癌基因myb的长链非编码rnamyb-96ks并将其用于调控myb的表达和肿瘤细胞尤其是白血病细胞的增殖。
6.所述的长链非编码rna全长序列可通过race技术获取，步骤包括：
7.(1)获取总rna作为模板合成race第一链cdna；优选的，从k562 细胞中获取总rna；
8.(2)以race第一链cdna为模板，进行第一轮race-pcr；所采用的引物为通用引物upm和5
′‑
末端或3
′‑
末端基因特异性引物；
9.第一轮race-pcr的5
′‑
末端基因特异性引物(5
′
race-gsp)序列为：5
′‑ꢀ
gtgcctttaaggcaccctgcatacatgat-3
′
：
10.第一轮race-pcr的3
′‑
末端基因特异性引物(3
′
race-gsp)序列为：5
′‑ꢀ
gtattgcagacttgggaactcacctcatg-3
′
；
11.(3)以第一轮race-pcr产物为模板，进行第二轮race-pcr，得到cd na序列；所采用的引物为通用引物upm和5
′‑
末端或3
′‑
末端基因特异性引物；
12.第二轮race-pcr的5
′‑
末端基因特异性引物5
′
race-ngsp序列为：5
′‑
g cctgttttccccattacatgaggtgagt-3
′
；
13.第二轮race-pcr的3
′‑
末端基因特异性引物3
′
race-ngsp序列为：5
′‑
c gcctcagtctctcaaagtaatccttcag-3
′
。
14.经过测序鉴定，上述序列位于人的第六号染色体上。
15.步骤(1)中，从白血病细胞中获得总rna，优选为白血病细胞系k562。通过上述方法可以获得长链非编码rna的序列。
16.本发明的技术方案如下：
17.一种调控原癌基因myb的长链非编码rna(myb-96ks)，其cdna序列包含如seq id no.1所示的序列；优选的，其cdna序列如seq id no.1所示。
18.一种调控原癌基因myb的长链非编码rna的cdna，其序列包含如seq idno.1所示的序列；优选的，其序列如seq id no.1所示。
19.该长链非编码rna由myb上游96kb区域转录生成，能够调控原癌基因 myb的表达，尤其是调控白血病细胞中myb基因的表达；同时还能够调控白血病细胞的增殖，可以作为肿瘤尤其是白血病的检测和治疗靶点，作为肿瘤尤其是白血病的生物标志物。
20.可用于扩增所述长链非编码rna或者其cdna序列的引物，其上游引物序列包括如seq id no.2所示的序列，其下游引物包括seq id no.3所示的序列；优选的，其上游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，其下游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示。
21.seq id no.2：5
′‑
gaagcatcagatgaagagggaagg-3
′
22.seq id no.3：5
′‑
ttcttttttctttttttttctttttttttttgccatggtctagtc-3
′
23.一种用于检测上述长链非编码rna、或者其表达丰度、或者其cdna的试剂或者试剂盒，含有前述的引物。
24.一种重组载体，为含有上述非编码长链rna的cdna序列的重组表达载体，能够过表达或者敲降上述长链非编码rna或者其cdna。
25.一种转染载体，含有上述重组载体，且转染载体为病毒或重组菌；优选的，所述的病毒为慢病毒。
26.所述重组载体通过以下方法构建：将上述非编码长链rna的cdna序列连接到表达载体上。
27.重组表达载体为过表达重组载体或敲降重组载体。
28.构建过表达重组载体时，优选的，过表达载体为plvx-ires-neo，构建方法为：将所述非编码长链rna的cdna序列连接到t载体上，经过测序验证后，进行酶切位点pcr反应将非编码长链rna的cdna全长序列从t载体上转移到过表达载体plvx-ires-neo上。优选的，以ecori和agei为限制性内切酶位点；用于构建重组过表达载体的引物，其序列如下：
29.myb-96ks-ecori-f:5
′‑
ggaattcgaagcatcagatgaagagggaagg-3
′
30.myb-96ks-xbai-r:5
′‑
gactagtttcttttttctttttttttctttttttttttgccatggtctagtc-3
′
blot分析；
45.图5为实施例5中lncrnamyb-96ks过表达/敲降对白血病细胞系增殖的影响。
具体实施方式
46.实施例1 race技术克隆长链非编码rna全长序列
47.(1)总rna提取
48.使用trizol法提取k562细胞总rna，加入rnase-free h2o，55℃下水浴10 min使rna完全溶解，-80℃冷冻保存。
49.(2)race第一链cdna合成
50.采用takara公司提供的race 5’/3’kit试剂盒进行合成。
51.将合成的3
’‑
race-ready cdna和5
’‑
race-ready cdna产物用一倍体积蒸馏水稀释，-20℃保存。
52.(3)race-pcr反应
53.race-pcr第一轮反应，利用通用引物upm分别和5
′‑
末端或3
′‑
末端基因特异性引物(gene-specific primer，gsp)进行pcr扩增。
54.所述长链非编码rna(以下简称lncrnamyb-96ks)的pcr引物序列：
[0055]5′
race-myb-96ks-gsp：5
′‑
gtgcctttaaggcaccctgcatacatgat-3
′
；
[0056]3′
race-myb-96ks-gsp：5
′‑
gtattgcagacttgggaactcacctcatg-3
′
；
[0057]
反应体系：15.5μlpcr-grade h2o，25.0μl 2
×
seqamp buffer，1.0μlseqamp dna polymerase，2.5μl 5
’‑
or 3
’‑
race-ready cdna，5.0μl 10
×
u pm，1.0μl 5'gsp或3'gsp(10μm)，总体积50μl，充分混匀后，短暂离心。
[0058]
race-pcr第一轮反应程序：94℃30s，72℃2min，5个循环；94℃3 0s，72℃30s，72℃2min，5个循环；94℃30s，65℃30s，72℃2mi n，30个循环。
[0059]
第二轮反应，以第一轮的pcr产物稀释50倍为模板，以universal primershort(upm short)为通用引物进行扩增。
[0060]
所用引物的核苷酸序列如下：
[0061]5′
race-myb-96ks-ngsp：5
′‑
gcctgttttccccattacatgaggtgagt-3
′
；
[0062]3′
race-myb-96ks-ngsp：5
′‑
cgcctcagtctctcaaagtaatccttcag-3
′
。
[0063]
反应体系：15.5μl pcr-grade h2o，25.0μl 2x seqamp buffer，1.0μlseqamp dna polymerase，5.0μl一轮pcr产物，1.0μl upm short，1.0μl 5'or3'ngsp，总体积50μl，充分混匀后，短暂离心。
[0064]
反应程序：94℃30s，60℃30s，72℃2min，40个循环。
[0065]
pcr产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。
[0066]
(4)目的片段凝胶回收及纯化
[0067]
使用qiagen公司的凝胶回收试剂盒qiaquick gel extraction kit进行目的片段的回收。
[0068]
用刀片小心切下含有目的片段的凝胶，放到ep管中回收。回收得到的目的片段用nanodrop 2000测定其浓度和纯度，并将回收的目的片段于-20℃保存。
[0069]
(5)目的片段与载体连接
[0070]
使用全式金公司的peasy-blunt zero cloning kit试剂盒进行t载体连接。
[0071]
克隆反应体系：
[0072][0073][0074]
反应条件：25℃15min。
[0075]
(6)转化
[0076]
trans1-t1感受态细胞冰上解冻，将步骤(5)的连接产物加入到50μl的感受态细胞中，冰浴30min。
[0077]
42℃水浴热激30s，立即置于冰上2min，加250μl lb液体培养基，200rpm、 37℃培养1h。
[0078]
1500g离心1min，弃掉部分上清，均匀涂抹到含抗生素的lb固体培养基上。
[0079]
37℃恒温培养箱，培养过夜12-14h。
[0080]
(7)鉴定
[0081]
取出培养基，挑取单克隆进行pcr验证，并选取阳性菌扩大培养后进行测序。
[0082]
反应体系：菌液1μl，2
×
taq plus master mix 10μl，m13f 0.5μl，m13r 0.5 μl，ddh2o 8μl，总体积20μl。
[0083]
反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环；72℃ 10min。
[0084]
(8)lncrna的全长克隆
[0085]
通过前述步骤的race方法得到lncrna的5’端和3’端片段信息后，在两端设计引物，特异性引物的上下游序列为：
[0086]
seq id no.2(lncrna myb-96ks-f)：5
′‑
gaagcatcagatgaagagggaagg-3
′
[0087]
seq id no.3(lncrna myb-96ks-r)：5
’‑
ttcttttttctttttttttctttttttttttgccatggtct agtc-3’[0088]
用上述引物对拼接好的lncrna全长cdna序列进行pcr扩增，并测序验证。pcr反应程序为：95℃，30s预变性。95℃，5s变性，60℃，30s扩增，共35个循环。克隆获得的调控原癌基因myb的长链非编码rna全长cdna序列，该序列全长2142个核苷酸，位于人6号染色体，myb基因正义链上游96k 区域，用myb-96ks表示。
[0089]
测序结果，其核苷酸序列如seq id no.1。
[0090]
lncrna myb-96ks在人6号染色体上的位置如图2所示。
[0091]
seq id no.1：
[0092]
gaagcatcagatgaagagggaaggcagagcagtgagaagtctttgaatgagacctttgagcttgtattgcagacttgggaa ctcacctcatgtaatggggaaaacaggctgattatttagttcttttttattaaaaaaactctataattataataaaaccctttttaattt atttacctaatatccccttgcctgaaatgtcttttttttttttgtttttgttttttgagacagggtctggctctgttgcccaggctggag cttggctcactgcaacctccacctcccggcctcaaattatcctcccacctcagtctcctgagtagctgggactacaggcatga ggcaccacacccaggtaatttttgtatttttggtagaaacaaggtttcaccatgttggccagctggtctcaaactcctggcctca agcaatcctcccgc
ctcagtctctcaaagtaatccttcagtctaatcaccaaaagtaatagcttgtttctgctgtgaaggaaatc tacaataataattatattgagtgttttcatacatttgattagtataaccaaataatttcaataagtataaagatttaaaatgaacatttc cttaatgttgtttaacctgcattataggttttatttacaactcaacccttatccataaataatagtctcaaatatttactaaaagtcaat atattttgtgtatgatatcacagccataaaaacaatcaaattagaagtagcatttacagtattagtcacagataggaaaccataa tttagtgaagaataacaaaaataaataaatatagattgacagatacatagttagattctgaaatttaactttggctttacccaacct tgttgagaatgaaatcatgtatgcagggtgccttaaaggcacttttttcctaaaaattgtatatattggaaataattcaccaagaa aatcctaagaaagaaaaagagtttatgtgattgactttgggttatcaaagcaaagactatccagggtaaataacaggcagag gatagtgattacagctcatttattaaaatagcaacattggtacatatctgagtcaagcctggaactccccctccctctcaactag acaagttaggctttaaaattactgtaaaaattaagtcaaattgcctgtgaaggtaagctcttagaagaattttttaggtagatgat ctacataacaagacatgcaccaaccaaatctgcagtcaaatattgggggaaaaaagcaacaacagtaggtttgtgtttattgc gatgtctggaatattttaaaaattaagctcctggcctcagcctagggatttctaatcaattccaggaaatgtactgtatctttcctt gaggccagcaggaaagccccttggcaagggtgtctggaatggccacttgacatccccagcacacctcttgccaaagttac ccatggctgctgacagagagactgatgtgctgccacagattgactttagggatgaacagatcaagatcaactaatctgggc agatgcattaaagtgtttctgtgtatttaagcataccatagaaagacaaattcaacagctttcactttgctttcatacaacgttgtt ctcttacgtgttttctatttttgtttatatactaatttcctctagattgactgggttctaaatttattatgaatttggtaaagcctctgaac tttgtgtttctatattacacaccttgtgtctgtgactactgttgtggttatacactcgggattttgaagtctcaacgataatcaccata agtcatttttagcagctctgtttaaaagattccatcagtagaaattcagcacgggtaactttcacttaaacattccagaccctcag aatcctttacatttaagtgatgtgttaaaaacaatggcacctctttttacttaatttcagtcacatttggaagaagataagaaagttt attctgaactccatcactcactattactgagtttgcttcattgttgaaactagggaaaattagtccgaggtttcaaaaaagcagct aaacaattttttttccaaattcttatccaccatgactagaccatggcaaaaaaaaaaagaaaaaaaaagaaaaaagaa
[0093]
(8)质粒提取
[0094]
提取t载质粒，使用omega公司的ezna endo-free plasmid dna mini kit 试剂盒。
[0095]
实施例2 lncrna myb-96ks在白血病细胞系中的表达水平检测
[0096]
(1)细胞培养
[0097]
人红白血病k562细胞、人急性髓系白血病u937细胞、人早幼粒急性白血病hl60细胞、hela细胞以及293t细胞均购买自atcc(american type culturecollection)。k562、u937、hl60细胞用rpmi 1640basic(gibco,#c11875500bt) 培养基培养，添加终浓度10％的胎牛血清(gibco,#10099-141c)和终浓度1％的链霉素和青霉素(hyclone,#sv30010)。hela和293t细胞用dmem(gibco, #c11965500bt)培养基加10％胎牛血清和1％链霉素和青霉素进行培养。接种好的细胞置于温度为37℃、co2体积分数为5％的细胞培养箱中培养。
[0098]
(2)总rna提取
[0099]
细胞培养于10cm细胞培养皿中，k562、u937、hl60细胞为悬浮细胞，长满后，取对数生长期的细胞，800rpm离心5min，弃上清，加入1ml的trizol 试剂，裂解5min。hela和293t细胞为贴壁细胞，长满后，倒掉培养基，加入1 ml的trizol试剂，裂解5min。把裂解液转移到rnase-free的ep管中，液体澄清且无团块,颠倒混匀。
[0100]
加入总体积1/5的氯仿，将溶液充分混合，室温放置3min；
[0101]
预冷离心机，4℃，12,000rpm，离心15min；
[0102]
转上层水相于另一1.5mlep管中，加0.5ml异丙醇，孵育10min；
[0103]
4℃，12,000rpm，离心10min。弃上清；
[0104]
加入75％乙醇(depc水配制)1ml，漩涡混悬样品。4℃，7500g，离心5min。
[0105]
重复洗涤2次；
[0106]
弃乙醇，收集rna(白色物质)，ep管内rna空气晾干10min；
[0107]
加于rnase-freeh2o50μl，55℃，10min水浴使rna完全溶解，冻存到-80℃。
[0108]
(3)逆转录反应
[0109]
使用takara公司的反转录试剂盒primescript
tm
rtreagentkitwithgdnaeraser(#rr047a)进行反转录反应。
[0110]
a.去除基因组dna反应：按下表于冰上配制反应混合液，将装有反应液的pcr管放置于pcr仪中，42℃、2min，反应产物于4℃保存；
[0111][0112]
b.反转录反应：将下表中的成分按照相应的使用量加到pcr管中配制反应液，于冰上进行实验操作，反应体系配好后混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
[0113][0114]
cdna合成反应条件：37℃、15min，85℃、5s，4℃保存。
[0115]
(4)rt-qpcr反应
[0116]
实时荧光定量pcr使用itaquniversalsybrgreensupermix试剂在bio-radcfx96平台上进行。反应体系如下所示：
[0117][0118]
lncrna特异性引物序列为：
[0119]
seqidno.2(lncrnamyb-96ks-f)：5
′‑
gaagcatcagatgaagagggaagg-3
′
[0120]
seqidno.3(lncrnamyb-96ks-r)：5
′‑
ttcttttttctttttttttctttttttttttgccatggtctagtc-3
′
[0121]
pcr反应程序为：95℃，30s预变性。95℃，5s变性，60℃，30s扩增，共35个循环。采用2-δδct
方法计算目的片段的相对表达量，每个样品3个生物学重复。结果显示，这种长链非编码rna(用myb-96ks表示)在白血病相关细胞如k562、u937和hl-60中有特异性表达，如图3所示。
[0122]
实施例3lncrnamyb-96ks过表达和敲降载体构建
[0123]
使用从实施例1中所获得的lncrnamyb-96ks全长序列，构建过表达和敲降载体。将实施例1中t载体质粒稀释至1ng/μl，以此为模板进行亚克隆pcr。
[0124]
1、plvx-myb-96ks过表达载体的构建
[0125]
(1)使用plvx-ires-neo质粒构建plvx-myb-96ks过表达载体。首先根据plvx-ires-neo质粒和myb-96ks的序列选取两个限制性内切酶位点，分别为ecori和xbai。然后设计加酶切位点的亚克隆引物，序列如下：
[0126]
myb-96ks-ecori-f:
[0127]5′‑
ggaattcgaagcatcagatgaagagggaagg-3
′
[0128]
myb-96ks-xbai-r:
[0129]5′‑
gactagtttcttttttctttttttttctttttttttttgccatggtctagtc-3
′
[0130]
(2)加酶切位点pcr
[0131]
反应体系：
[0132][0133]
反应条件：98℃变性10s，55℃5s、72℃1min，循环30次。
[0134]
待反应完毕后，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr产物并回收。
[0135]
(3)目的片段与plvx-ires-neo质粒双酶切
[0136]
双酶切体系(50μl)：
[0137][0138]
反应条件为37℃、4h，65℃、20min。双酶切完成以后将双酶切产物切胶回收。
[0139]
(4)连接
[0140]
连接体系(20μl)：
[0141][0142]
反应条件为16℃、20h，65℃、10min。
[0143]
连接完成后，转化、鉴定、质粒提取参照实施例1的相应方法进行，最终得到plvx-myb-96ks质粒。
[0144]
2、sh-myb-96ks敲降质粒的构建
[0145]
(1)使用plko.1-trc cloning质粒构建sh-myb-96ks敲降载体。分别以 ecori和agei为限制性内切酶位点。
[0146]
(2)特异性shrna设计，构建载体的shrna序列如下所示：
[0147]
myb-96ks-shrna-f：5
′‑
ccggctagacaagttaggctttaaactcgagtttaaagcctaacttgtctagtt tttg-3
′
[0148]
myb-96ks-shrna-r：5
′‑
aattcaaaaactagacaagttaggctttaaactcgagtttaaagcctaacttgt ctag-3
′
[0149]
(3)引物退火
[0150]
如下配置退火体系(50μl)：
[0151][0152]
95℃、5min，随后70℃、10min，让其温度缓慢降至室温。
[0153]
(4)plko.1-trc cloning vector双酶切
[0154]
双酶切反应体系：
[0155][0156][0157]
设置酶切条件为：37℃、4h；65℃、20min。双酶切完成以后将双酶切产物切胶回收。
[0158]
(5)连接
[0159]
连接体系(20μl)：
[0160][0161]
反应条件为16℃、20h，65℃、10min。
[0162]
连接完成后，转化、鉴定、质粒提取参照实施例1的相应方法进行，最终得到sh-myb-96ks质粒。
[0163]
实施例4 lncrna myb-96ks过表达/敲降对myb表达的影响
[0164]
(1)慢病毒包装
[0165]
293t细胞种植到10cm细胞培养皿中，传2-3代后，待细胞汇合度达70-80％时，转染质粒。
[0166]
使用病毒包装质粒(pcmv-dr8.91)、包膜蛋白质粒(pcmv-vsvg)和plvx-myb-96ks或sh-myb-96ks共18.9μg进行转染，质粒比例为 pcmv-dr8.91：pcmv-vsvg：plvx-myb-96ks/sh-myb-96ks＝10：1：10。
[0167]
将上述质粒加入到720μl无血清无双抗的dmem培养基中，并加入40μl 转染试剂turbofect transfection reagent，涡旋混匀后，短暂离心，室温孵育15-20 min。
[0168]
将孵育好的混合物轻轻滴加到293t细胞中。轻轻混匀后置于37℃、5％co2条件的培养箱中培养12h。之后更换8ml新鲜培养基。
[0169]
转染48h和72h后，分别收集细胞培养液，1500g离心10min去除细胞碎片，将得到的病毒上清分装存于-80℃或4℃临时保存。
[0170]
(2)慢病毒感染k562细胞
[0171]
将k562细胞接种于6cm细胞培养皿中，当细胞汇合度达到70-80％后用病毒上清进行感染，加入终浓度8μg/ml的polybrene来增强病毒的感染效率。混匀后37℃、5％co2培养箱中培养12h，连续感多次后，吸掉病毒上清，加入新鲜培养液继续培养36h。
[0172]
(3)蛋白质提取
[0173]
k562细胞800rpm离心5min，弃上清。加入2ml dpbs洗2次细胞，并弃掉dpbs，加入200μl细胞裂解液(ripa：50xpi：100mm pmsf＝97:2:1)，冰上裂解20-30min后超声,超声条件为超声5s，间隔10s后再次超声5s，重复进行4次。超声完成后，4℃12000g，离心10min，取最上层上清2μl用于测浓度，剩余上清转移至新的1.5ml离心管中。
[0174]
(4)蛋白浓度测定(bradford法测蛋白浓度)
[0175]
使用1
×
pbs稀释bsa蛋白标准液(5mg/ml)至200μg/ml，按下表配制一定浓度梯度的标准蛋白。
[0176][0177]
将步骤(3)获得的蛋白样品用1*pbs 40倍稀释。在96孔板上分别加入上表中1-8号管中各浓度的蛋白质溶液和样品稀释液各20μl，每个样3个重复。再在各孔中加入200μl的bradford试剂，迅速震荡均匀。室温静置5min。以1 号管为空白对照，在酶标仪上测各孔的a595吸光值，再根据标准曲线计算稀释浓度。
[0178]
(5)western blot实验
[0179]
配制sds-page凝胶：配制8％分离胶，先在15ml管中加入灭菌的ddh2o，再依次加入30％丙烯酰胺、1.5m tris-hcl(ph 8.8)和10％sds，混匀后加入10％过硫酸铵和temed，轻轻摇匀。将分离胶加到玻璃板中，加入ddh2o补齐液面，使胶平整。室温静置约30min后凝固，将水倒掉，用吸水纸吸干多余的水分。接下来开始配制5％浓缩胶，依次加入灭菌的ddh2o、30％丙烯酰胺、0.5m tris-hcl (ph 6.8)和10％sds，混匀后再加入10％过硫酸铵和temed。浓缩胶加入后，垂直缓慢地将孔梳插入到夹层中，待胶凝固后拔出。
[0180]
sds-page电泳：把电泳装置放到电泳槽中，在两个玻璃板之间倒满电泳缓冲液，在电泳槽中倒指定高度的电泳缓冲液。上样前将蛋白样品加封口膜，沸水煮5min，12000g离心1min，每个泳道加30μg蛋白。电泳条件：第一阶段80 v，30min；第二阶段150v，40min。
[0181]
转膜：大小合适的nc膜，放入ddh2o中活化。用4℃预冷的转膜液充分浸润滤纸和海绵，将转膜夹黑色面置于最下方，依次放入海绵和三张叠加的滤纸。切除浓缩胶后，将下层胶轻轻放在滤纸上，再继续覆盖nc膜，叠加三层滤纸和海绵垫，赶出滤纸中的气泡后，关上夹子。将转膜夹放入转膜槽中，整个转膜装置置于冰中，100v转膜1h。转膜结束后用1
×
丽春红染液染5min。
[0182]
封闭：将nc膜用5％脱脂牛奶在摇床上封闭2h。
[0183]
免疫反应：5％的脱脂牛奶稀释抗体，myb一抗(1:2000)，β-actin抗体 (1:4000)，将抗体与nc膜在摇床上4℃孵育过夜。tbst漂洗滤膜3次，每次 10min。将带有辣根过氧化酶的二抗，用5％脱脂牛奶稀释(1:2000)，将二抗加到nc膜上后，室温孵育1～2h。孵育结束后，tbst清洗3次，每次10min。
[0184]
化学显影：按peroside solution:luminol/enhancer＝1:1在棕色管中配制显影
液，将nc膜正面向上，均匀滴加显影液后孵育5min，曝光拍照进行检测。
[0185]
结果如图4所示。
[0186]
实施例5 lncrna myb-96ks过表达/敲降对白血病细胞系k562增殖和迁移的影响
[0187]
(1)细胞培养和转染
[0188]
k562细胞分别转染plvx-myb-96ks和sh-myb-96ks质粒。参照实施例4 的方法进行k562细胞培养与转染。
[0189]
(2)cck-8实验
[0190]
转染的k562细胞计数后，向96孔板中每孔加入100μl细胞悬液(2000个细胞)。分别在转染0、24、48、72、96h后，每孔加入cck-8 10μl，不含细胞的孔作为空白对照。继续孵育2h。酶标仪测定450nm处的吸光度。
[0191]
结果如图5所示，其中图5左图是转染了过表达质粒(plvx-myb-96ks) 及空白plvx质粒(vector)的结果；图5右图是转染了敲降质粒(用 sh-myb-96ks)及空白sh质粒(sh nc)的结果。