用于诊断、治疗和预防与α-突触核蛋白的聚集相关的疾病的新颖化合物的制作方法

用于诊断、治疗和预防与
α-突触核蛋白的聚集相关的疾病的新颖化合物
1.发明概述
2.本发明涉及适合于对α-突触核蛋白(alpha-synuclein)成像和适合于诊断与α-突触核蛋白的聚集相关的疾病的新颖化合物。该化合物还可用于治疗和预防与α-突触核蛋白的聚集相关的疾病。
3.发明背景
4.已知大量神经疾病和神经退行性疾病，其中许多目前是无法治愈的并且难以诊断。所有常见的神经退行性疾病的特征在于特定蛋白质在脑中的错误折叠、聚集和沉积。这些疾病包括诸如以下的医学状况：帕金森病(pd)、路易体痴呆(dementia with lewy bodies)(dlb)、多系统萎缩(msa)、阿尔茨海默病、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性(corticobasal degeneration)、额颞痴呆、克-雅氏病(creutzfeldt-jakob disease)和许多其他疾病。
5.突触核蛋白病(synucleinopathy)是一组特征在于聚集的和错误折叠的α-突触核蛋白(αsyn)的积聚和沉积的疾病。突触核蛋白病包括帕金森病(pd)、路易体痴呆(dlb)和多系统萎缩(msa)。这些疾病在聚集的和错误折叠的α-突触核蛋白在中枢神经系统和外周神经系统中的积聚和沉积的分布方面不同。在神经病理学上，它们可以根据聚集的和错误折叠的α-突触核蛋白的疾病特异性积聚和沉积而与其他神经退行性疾病区分，而其他神经退行性疾病的特征在于其他聚集的和错误折叠的蛋白质的积聚和沉积。例如，阿尔茨海默病的特征在于聚集的和错误折叠的abeta(aβ)蛋白和τ蛋白，进行性核上性麻痹和皮质基底节变性的特征在于聚集的和错误折叠的τ蛋白，此外，额颞痴呆的一些病例的特征在于聚集的和错误折叠的τ蛋白。克-雅氏病的特征在于聚集的和错误折叠的朊病毒蛋白。
6.聚集的和错误折叠的蛋白质的疾病特异性积聚和沉积为通过与这些聚集的和错误折叠的蛋白质沉积物结合的化合物的治疗以及诊断两者提供了靶。
7.对于聚集的和错误折叠的蛋白质的疾病特异性积聚和沉积的诊断检测的一个选项是使用可检测地标记的化合物，该可检测地标记的化合物示出与聚集的蛋白质的所述沉积物结合的特异性和选择性的高亲和力。这可以例如通过使用用合适的放射性同位素标记的化合物以及通过使用用于检测的pet成像来实现。尽管化合物可用于aβ和τ的pet成像的临床使用，但迄今为止还没有发明可以用于突触核蛋白病中的α-突触核蛋白沉积物的诊断pet成像的化合物(kotzbauer,p.t.,tu,z.和mach,r.h.,current status of the development of pet radiotracers for imaging alpha synuclein aggregates in lewy bodies and lewy neurites.clin.transl.imaging,2017.5:第3-14页)。迄今为止，由其他小组开发和测试的化合物缺乏合适的性质组合，所述性质包括与聚集的和错误折叠的α-突触核蛋白的高结合亲和力；与聚集的和错误折叠的其他蛋白质特别是aβ和τ相比在结合亲和力方面足够的选择性(这对于特征在于聚集的和错误折叠的蛋白质的疾病特异性积聚和沉积的不同疾病的鉴别诊断，以及对于准确地检测聚集的和错误折叠的α-突触核蛋白也存在于同时患有多于一种疾病即路易体痴呆和阿尔茨海默病的患者的能力是所需
的)。此外，所需的性质包括通过血脑屏障并且与细胞内沉积物结合的能力，与脑组织的低的非特异性结合，以及从脑中快速清除未结合的化合物。
8.wo 2009/146343涉及某些吡唑类、1,2,4-噁二唑类和1,3,4-噁二唑类，它们是正电子发射断层扫描(pet)成像中的示踪剂，以研究在体内在脑中的淀粉样沉积物以允许阿尔茨海默病的诊断。阿尔茨海默病的特征在于aβ蛋白和τ蛋白的聚集，并且所提及的pet示踪剂与这些蛋白质的聚集体结合。相比之下，本发明将特征在于α-突触核蛋白的聚集的疾病作为目标。对于聚集的α-突触核蛋白的选择性诊断成像，需要与α-突触核蛋白的选择性结合，以及与聚集的aβ和τ没有结合至低结合。
9.wo 00/66578描述了特异性npy拮抗剂，其可用于治疗npy介导的疾病/状况，诸如肥胖。所提及的是，除了wo0066578的化合物对npy5亚型的“直接”影响之外，还存在将受益于重量减轻的疾病/状况，诸如胰岛素抵抗、受损的葡萄糖耐受(impaired glucose tolerance)、ii型糖尿病、高血压、高脂血症、心血管疾病、胆结石、某些癌症、睡眠呼吸暂停等。
10.wo 2010/000372涉及一种特异性化合物，其可用于治疗或预防与蛋白质聚集相关的疾病和/或神经退行性疾病。wo2010/000372的化合物特别适合于治疗与蛋白质聚集相关的疾病，包括帕金森病。已经示出它们与包括aβ和τ的若干种不同的聚集的蛋白质结合。因此，它们可以用于诊断与蛋白质聚集相关的紊乱，但可靠地区分与α-突触核蛋白聚集相关的紊乱和与淀粉样蛋白聚集相关的其他紊乱诸如滔蛋白病变(tauopathy)或阿尔茨海默病是不可能的。然而，这将是重要的，因为与蛋白质聚集相关的紊乱的临床表现非常相似，并且区分例如多种紊乱以便相应地调整治疗将是非常合意的。此外，wo 2010/000372中描述的分子与脂质和疏水性蛋白质具有高的非特异性结合，这导致在脑组织和其他组织中的强的非特异性结合。因此，它们没有达到pet示踪剂所需的与α-突触核蛋白的所需的特异性结合和信噪比。
11.鉴于前述内容，对于具有作为诊断剂(diagnostic)的改善性质的化合物存在需求。特别地，与α-突触核蛋白结合的特异性应当被改善。应当减少在脑组织和其他组织中的非特异性结合，应当增加结合亲和力，并且应当降低生理学半衰期(physiological half-life)。
12.us 2005/0075375公开了用于治疗丙型肝炎病毒的特异性杂环化合物。
13.附图简述
14.图1：使用[3h]-化合物1使用来自患有路易体痴呆的患者的人类脑组织的放射自显影。
[0015]
发明详述
[0016]
本发明涉及由通式ia、通式ib、通式iia或通式iib表示的化合物
[0017][0018]
x1、x2和x3独立地选自cr2、n和nr1，条件是x1、x2和x3中的至少两个是n或nr1。应理解，n和nr1根据化合价所允许的存在，即n可以仅存在于位置＝x
1-、＝x
2-或＝x
3-处并且nr1可以仅存在于位置-x
1-或-x
2-处。
[0019]
的实例包括
[0020]
的实例包括
[0021]
在优选的实施方案中，
[0022]
是(更优选地)，或者是(更优选地)。
[0023]
y1、y2、y3、y4、y5、y6、y7和y8独立地选自cr3和n，条件是y1、y2、y3、y4、y5、y6、y7和y8中的至少一个是n。
[0024]
在式ia或式ib的优选的实施方案中，y1、y2、y3、y4、y5和y6独立地选自cr3和n，条件是y1、y2、y3、y4、y5和y6中的至少一个是n。在更优选的实施方案中，y1、y2、y3、y4、y5和y6中的一个或两个或三个是n，甚至更优选地y1、y2、y3、y4、y5和y6中的一个或两个是n，仍更优选地y1、y2、y3、y4、y5和y6中的一个是n。在优选的实施方案中，y1是n。
[0025]
在式ia或式ib的优选的实施方案中，y1、y3、y4和y6中的至少一个是n。在式ia或式ib的另外优选的实施方案中，y1是n并且y3、y4和y6中的至少一个是n。
[0026]
在式ia或式ib的优选的实施方案中，y1、y3、y4和y6中的至少一个是n并且y1、y2、y3、y4、y5和y6中的其他是cr3(诸如ch)。在式ia或式ib的另外优选的实施方案中，y1是n，y3、y4和y6中的至少一个是n并且y2、y3、y4、y5和y6中的其他是cr3(诸如ch)。
[0027]
在式ia或式ib的优选的实施方案中，y1是n并且其他的y2、y3、y4、y5和y6是cr3，更优选地y1是n并且y2、y3、y4、y5和y6是ch。
[0028]
在式iia或式iib的优选的实施方案中，y1、y2、y3、y4、y5、y6、y7和y8独立地选自cr3和n，条件是y1、y2、y3、y4、y5、y6、y7和y8中的至少一个是n。在更优选的实施方案中，y1、y2、y3、y4、y5、y6、y7和y8中的一个或两个或三个是n，甚至更优选地y1、y2、y3、y4、y5、y6、y7和y8中的一个或两个是n，仍更优选地y1、y2、y3、y4、y5、y6、y7和y8中的一个是n。在优选的实施方案中，y1是n。
[0029]
在式iia或式iib的优选的实施方案中，y1、y3、y4、y5、y6、y7和y8中的至少一个是n。在式iia或式iib的优选的实施方案中，y1、y3、y4、y5和y7中的至少一个是n。在式iia或式iib
的另外优选的实施方案中，y1是n并且y3、y4、y5、y6、y7和y8中的至少一个是n。
[0030]
在式iia或式iib的优选的实施方案中，y1、y3、y4、y5、y6、y7和y8中的至少一个是n并且y1、y2、y3、y4、y5、y6、y7和y8中的其他是cr3(诸如ch)。在式iia或式iib的优选的实施方案中，y1、y3、y4、y5和y7中的至少一个是n并且y1、y2、y3、y4、y5、y6、y7和y8中的其他是cr3(诸如ch)。在式iia或式iib的另外优选的实施方案中，y1是n，y3、y4、y5、y6、y7和y8中的至少一个是n并且y2、y3、y4、y5、y6、y7和y8中的其他是cr3(诸如ch)。在式iia或式iib的优选的实施方案中，y1是n，y3、y4、y5和y7中的至少一个是n并且y2、y3、y4、y5、y6、y7和y8中的其他是cr3(诸如ch)。
[0031]
在式iia或式iib的优选的实施方案中，y1是n并且其他的y2、y3、y4、y5、y6、y7和y8是cr3，更优选地y1是n并且y2、y3、y4、y5、y6、y7和y8是ch。
[0032]
已经令人惊讶地发现，引入一个或更多个氮原子作为y1、y2、y3、y4、y5、y6、y7和y8强烈地增加与α-突触核蛋白结合的选择性，使得与α-突触核蛋白聚集相关的对应的紊乱诸如帕金森病、路易体痴呆和多系统萎缩可以与具有其他蛋白质的聚集的紊乱诸如其中主要是aβ和τ聚集的阿尔茨海默病相区分。此外，信噪比被改善。
[0033]
r1选自氢、c
1-4
烷基和-(ch2)-o-p(＝o)(or)(or)，其中c
1-4
烷基可以任选地被一个或更多个卤素取代。在优选的实施方案中，r1是氢、甲基或2-氟乙基。如果存在，优选的是，-(ch2)-o-p(＝o)(or)(or)附接至x1或x2。
[0034]
r是氢或阳离子。阳离子可以是药学上可接受的任何阳离子。优选地，阳离子是单价阳离子。实例是钠、锂、钾、铵以及乙醇胺、胆碱、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪和氨丁三醇的质子化形式。优选地，阳离子是钠。在本发明的化合物中，两个r均可以是氢，两个r均可以是阳离子(相同或不同的阳离子)，或者一个r可以是氢，并且另一个r可以是阳离子。优选地，两个r均是钠。二价阳离子诸如ca
2
、mg
2
和zn
2
或三价阳离子诸如al
3
是可能的，但不是优选的，因为所得到的盐是水溶性较差的。其中r1是-(ch2)-o-p(＝o)(or)(or)的化合物和它们的合成在wo 2017/102893中被描述，wo 2017/102893通过引用并入本文。
[0035]
r2独立地选自氢、卤素和c
1-4
烷基，其中c
1-4
烷基可以任选地被一个或更多个卤素取代。在优选的实施方案中，r2是氢。
[0036]
r3是氢、卤素、c
1-4
烷基、oh和c
1-4
烷氧基，其中c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基可以任选地被一个或更多个卤素取代。在优选的实施方案中，r3是氢或氟。甚至更优选地，r3是氢。
[0037]
r4和r5独立地选自h和c
1-4
烷基，其中c
1-4
烷基可以任选地被一个或更多个卤素取代，或者其中r4和r5与它们结合至的氮原子一起形成4元至6元的饱和杂环，所述4元至6元的饱和杂环除了r4和r5结合至的氮原子之外还任选地包含选自o和n的一个或更多个杂原子，其中4元至6元的饱和杂环可以任选地被一个或更多个r6取代。
[0038]
在一种实施方案中，r4和r5独立地选自h和c
1-4
烷基，其中c
1-4
烷基可以任选地被一个或更多个卤素取代。优选地，r4和r5独立地选自h和c
1-4
烷基。在优选的实施方案中，r4和r5中的至少一个是c
1-4
烷基，其中c
1-4
烷基可以任选地被一个或更多个卤素取代。在更优选的实施方案中，r4是氢并且r5是c
1-4
烷基，其中c
1-4
烷基可以任选地被一个或更多个卤素取代。在更优选的实施方案中，r4和r5中的至少一个是c
1-4
烷基。在更优选的实施方案中，r4是氢并且r5是c
1-4
烷基。
[0039]
在另外的实施方案中，r4和r5与它们结合至的氮原子一起形成4元至6元的饱和杂
环，所述4元至6元的饱和杂环除了r4和r5结合至的氮原子之外还任选地包含选自o和n的一个或更多个(例如，一个)杂原子，其中4元至6元的饱和杂环可以任选地被一个或更多个r6取代。在优选的实施方案中，4元至6元的饱和杂环选自氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基和哌嗪基，其中氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基和哌嗪基可以任选地被一个或更多个r6取代。更优选地，4元至6元的饱和杂环选自氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基和哌嗪基，其中哌嗪基的n原子可以任选地被r6取代。
[0040]
r6独立地选自卤素、c
1-4
烷基、oh和c
1-4
烷氧基，其中c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基可以任选地被一个或更多个卤素取代，优选地，r6是c
1-4
烷基或氟。
[0041]
hal是卤素，诸如br、cl和f，优选地，hal是br或f。
[0042]
m是在包含y1、y2、y3和y4的环中除氢以外的r3基团的数目。m是0至m
最大
的整数，其中m
最大
为包含y1、y2、y3和y4的环中碳原子的数目。优选地，m是0。
[0043]
n是在包含y5、y6、y7和y8的环(式iia和式iib)中除氢以外的r3基团的数目。n是0至n
最大
的整数，其中n
最大
为包含y5、y6、y7和y8的环中碳原子的数目。优选地，n是0。
[0044]
p是在包含y5和y6的环(式ia和式ib)中除氢以外的r3基团的数目。p是0至p
最大
的整数，其中p
最大
为包含y5和y6的环中碳原子的数目。优选地，p是0。
[0045]
本发明的化合物还可以以其前药、溶剂化物或盐的形式存在。
[0046]
本发明的化合物形成盐，该盐也在本发明的范围内。除非另有指示，否则在本文中对本发明的化合物的提及应被理解为包括对其盐的提及。例如，在制备期间或在体外方法中可以使用的分离步骤或纯化步骤中，药学上可接受的(即，无毒的，生理学上可接受的)盐是优选的，尽管其他盐也是有用的。本发明的化合物的盐可以例如通过在介质中(诸如在盐在其中沉淀的介质中)或者在含水介质中使化合物与一定量的酸(诸如等当量的酸)进行反应，随后冻干而形成。
[0047]
包含碱性部分的化合物可以与多种有机酸和无机酸形成盐。示例性的酸加成盐包括乙酸盐(诸如与乙酸或三卤代乙酸例如三氟乙酸形成的乙酸盐)、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、双葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、羟基乙磺酸盐(例如，2-羟基乙磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐(例如，2-萘磺酸盐)、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、苯基丙酸盐(例如，3-苯基丙酸盐)、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐(例如，与硫酸形成的硫酸盐)、磺酸盐(例如，本文提及的磺酸盐)、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐(toluenesulfonate)诸如甲苯磺酸盐(tosylate)、十一烷酸盐(undecanoate)，及类似的酸加成盐。
[0048]
本文中还预期本发明的化合物的前药和溶剂化物。如本文使用的术语“前药”表示这样的化合物：在施用至受试者后，该化合物通过代谢过程或化学过程经历化学转化，以产生本发明的化合物或其盐和/或溶剂化物。
[0049]
本发明的化合物的溶剂化物包括例如水合物。
[0050]
本文的化合物的所有立体异构体(例如，那些可能由于在多种取代基上的不对称碳而存在的立体异构体)，包括对映异构体形式和非对映异构体形式，都被预期在本发明的范围内。本发明的化合物的单独的立体异构体可以例如大体上不含其他异构体(例如，作为
具有特定活性的纯的或大体上纯的光学异构体)，或者可以例如作为外消旋体被掺混或与所有其他立体异构体或其他选定的立体异构体掺混。本发明的化合物的手性中心可以具有如由iupac 1974推荐(iupac 1974recommendations)所定义的s-构型或r-构型。
[0051]
外消旋形式可以通过物理方法诸如非对映异构体衍生物的分级结晶、分离或结晶或者通过手性柱色谱法的分离来拆分。单独的光学异构体可以通过任何合适的方法从外消旋体中获得，所述方法包括而不限于与光学活性酸形成盐，随后结晶。
[0052]
预期呈掺混物形式或呈纯的或大体上纯的形式的本发明的化合物的所有构型异构体。本发明的化合物的定义包括顺式(z)烯烃异构体和反式(e)烯烃异构体两者，以及环烃或杂环的顺式异构体和反式异构体。
[0053]
还可以提供所要求保护的化合物的氘化形式。氘化存在的位置不被特别限制，但是其可以例如在r4和r5的c
1-4
烷基中。
[0054]
贯穿本说明书，可以选择基团及其取代基以提供稳定的部分和化合物。
[0055]
本发明的化合物可以以诊断组合物或药物组合物的形式被提供，所述诊断组合物或药物组合物任选地包含药学上可接受的载体或赋形剂。
[0056]
根据本发明，术语“诊断组合物”涉及用于确定在与α-突触核蛋白聚集相关的疾病中聚集的α-突触核蛋白的存在的组合物。
[0057]
在优选的实施方案中，本发明的化合物是可检测的或被可检测地标记。根据本发明，应理解的是，如果化合物的存在可以通过诸如以下的常规技术被监测，则该化合物是可检测的或被可检测地标记：nmr光谱法、单光子发射计算机断层扫描(spect)、光学检测、正电子发射断层扫描(pet)、电子显微术、磁共振成像(mri)，光谱法(spectrometry)、色谱法、elisa测定、放射性发射的检测，优选地通过pet、闪烁计数或γ计数(gamma counting)，更优选地通过pet。
[0058]
当本发明的化合物被用作用于使聚集的α-突触核蛋白成像的探针时，它们应当被标记。标记的特定性质将取决于将被用于成像的方法。典型地，发射正电子(pet)并且具有短的半衰期的放射性标记，诸如
18
f、
11
c、
125
i、
123
i、
131
i、
77
br和
76
br，特别是
18
f和
11
c，将是有用的。由于其短的半衰期，本发明的标记的化合物应当在它们被用于测试之前不久被制备。因此，本发明的诊断组合物还可以以试剂盒的形式被提供，所述试剂盒由本发明的化合物的至少两种前体组成，所述至少两种前体发生反应以形成本发明的期望的化合物。
[0059]
技术人员将能够设计出可以将可检测的标记附接到本发明的化合物的方法。以下方案可以用作说明性实例。
[0060]
用
18
f标记：
[0061]
2-[
18
f]氟乙基甲苯磺酸酯是用于经由包含氮、氧和硫亲核体的化合物的氟乙基化而掺入
18
f的有用的前体，如在wo2010/000372，第32页，方案a，从化合物23开始制备化合物21和化合物22中描述的。化合物a和b可以以相同的方式制备。另一种方法包括合适的离去基团的直接亲核取代，如对于在方案1中c至d的转化(参见j.med.chem.2013,56,4568-4579，方案2)或化合物24至化合物12的转化所示出的。
[0062]
方案1
[0063][0064]
用
11
c标记：
[0065]
标记有
11
c的本发明的化合物可以通过用[
11
c]mei对合适的前体的直接亲核烷基化来制备，如wo 2010/000372，第32页，方案b，从化合物23开始制备化合物27和化合物28中描述的。本发明的化合物1可以类似地从化合物2开始来合成。以相同的方式，化合物18和化合物19可以从化合物9开始来合成，如方案2中所示出的。可选择地，用于通过在不损失比活性的情况下在温和条件下将[
11
c]甲基碘转化为[
11
c]甲醛以产生作为在二甲基甲酰胺中的溶液的[
11
c]甲醛的一种简单且可用的方法(j.m.hooker等人,angew.chem.int.ed.2008,47,5989-5992)可以被用于经由还原胺化将化合物2转化为化合物1。
[0066]
方案2：
[0067][0068]
本发明提供了一种使聚集的α-突触核蛋白的沉积物成像的方法，该方法包括以下步骤：
[0069]
(i)将可检测的量的包含可检测地标记的本发明的化合物的组合物引入到受试者中；
[0070]
(ii)允许足够的时间使该化合物与聚集的α-突触核蛋白缔合；以及
[0071]
(iii)检测与聚集的α-突触核蛋白缔合的化合物。
[0072]
包含可检测地标记的化合物的组合物可以通过下文描述的任何施用途径诸如例如口服或肠胃外地被引入到受试者中。可以将标记的化合物引入到患者中，并且在该化合物足以变得与聚集的α-突触核蛋白缔合的时间跨度之后，在患者内非侵入性地检测标记的化合物。可选择地，可以将标记的化合物引入到患者中，允许足够的时间使该化合物变得与聚集的α-突触核蛋白缔合，并且然后提取来自患者的组织的样品，并且在离开患者的组织中检测标记的化合物。还可以在将标记的化合物引入到组织样品中之前，从患者中取出组织样品。在允许足够量的时间使该化合物变得与聚集的α-突触核蛋白结合之后，可以检测该化合物。
[0073]
还可以定量地进行聚集的α-突触核蛋白的成像，使得可以确定聚集的α-突触核蛋白的量。
[0074]
本发明还涉及本发明的化合物以及其前药、溶剂化物或盐，用于在与α-突触核蛋白的聚集相关的疾病的治疗或预防中使用。
[0075]
另外的实施方案是本发明的化合物用于制备用于治疗或预防与α-突触核蛋白的聚集相关的疾病的药物组合物的用途，以及治疗或预防与α-突触核蛋白的聚集相关的疾病的方法，该方法包括向有相应需要的患者施用治疗有效量的本发明的化合物。这包括施加作为“药物组合物”的化合物，如下文描述的。
[0076]
根据本发明，术语“聚集”指的是α-突触核蛋白的低聚复合物或多聚复合物的形成，该聚集可以伴随着另外的生物分子如碳水化合物、核酸、脂质和/或金属离子整合到复合物中。
[0077]
如本文使用的术语“与α-突触核蛋白的聚集相关的疾病”指的是那些特征在于聚集的α-突触核蛋白的存在的疾病。这样的聚集的α-突触核蛋白可以在特定组织中，更优选地在神经组织或脑组织中形成沉积物。聚集的程度取决于特定的疾病。
[0078]
根据本发明，术语“药物组合物”涉及一种用于施用至患者，优选地哺乳动物，更优选地人类患者的组合物。本发明的药物组合物包含上文叙述的化合物和任选的能够改变本发明的化合物的特性从而例如稳定、调节和/或活化其功能的另外的分子。组合物可以呈固体形式、液体形式或气体形式，并且尤其可以呈粉末、片剂、溶液或气溶胶的形式。本发明的药物组合物可以任选地和另外地包含药学上可接受的载体或赋形剂。合适的药物载体和赋形剂的实例在本领域中是熟知的，并且包括磷酸盐缓冲的盐水溶液、水、乳液诸如油/水乳液、多种类型的润湿剂、无菌溶液、包括dmso的有机溶剂等。包含这样的载体的组合物可以通过熟知的常规方法配制。
[0079]
考虑到个体患者的临床状况、药物组合物的递送部位、施用的方法、施用的时间表和从业人员已知的其他因素，药物组合物将以与良好医疗实践一致的方式配制和给药。因此，用于本文目的的药物组合物的“有效量”由这样的考虑因素确定。技术人员知晓，施用至个体的药物组合物的有效量将尤其取决于化合物的性质。
[0080]
本发明的药物组合物可以口服、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(如通过粉末、软膏、滴剂或透皮贴剂)、含服(bucally)、或作为口喷雾剂或鼻喷雾剂施用。优选地，当用作pet示踪剂用于诊断时，它们将静脉内地施用，并且当用于治疗或预防疾病时，它们将口服地施用。
[0081]“药学上可接受的载体”意指无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、封装材料或任何类型的制剂助剂。
[0082]
如本文使用的术语“肠胃外”指的是包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的施用模式。
[0083]
为了治疗目的，药物组合物还可以通过持续释放系统合适地施用。持续释放组合物的合适的实例包括呈成形物品例如膜或微胶囊的形式的半渗透的聚合物基质。持续释放基质包括聚丙交酯(美国专利第3,773,919号，ep 58 481)、l-谷氨酸和γ-乙基-l-谷氨酸酯的共聚物(sidman,u.等人，biopolymers 22:547-556(1983))、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(r.langer等人，j.biomed.mater.res.15:167-277(1981)和r.langer,chem.tech.12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(r.langer等人，同前)或聚-d-(-)-3-羟基丁酸(ep 133 988)。持续释放药物组合物还可以包含脂质体包埋的化合物(liposomally entrapped compound)。包含药物组合物的脂质体通过本身已知的方法制备：de 32 18 121；epstein等人,proc.natl.acad.sci.(usa)82:3688-3692(1985)；hwang等人，proc.natl.acad.sci.(usa)77:4030-4034(1980)；ep 52 322；ep 36 676；ep 88 046；ep 143 949；ep 142 641；日本专利申请83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及ep 102324。通常，脂质体是小的(约200埃-800埃)单层类型，其中脂质含量大于约30mol％胆固醇，调节选定的比例用于最佳治疗。
[0084]
对于肠胃外施用，药物组合物通常通过将其以期望的纯度、以单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液或乳液)与药学上可接受的载体混合来配制，所述药学上可接受的载体即在所使用的剂量和浓度对接受者是无毒的并且与制剂的其他成分相容的载体。
[0085]
通常，通过使药物组合物的组分均匀地并且紧密地与液体载体或细分的固体载体或两者接触来制备制剂。然后，如果需要，产物被成形为期望的制剂。优选地，载体是肠胃外载体，更优选地是与接受者的血液等渗的溶液。这样的载体媒介物的实例包括水、盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。非含水媒介物诸如不挥发的油和油酸乙酯以及脂质体在本文也是有用的。载体合适地包含少量的添加剂，诸如增强等渗性和化学稳定性的物质。这样的材料在所使用的剂量和浓度对接受者是无毒的，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸和其他有机酸或其盐；抗氧化剂，诸如抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)的(多)肽，例如，聚精氨酸(polyarginine)或三肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖醇，诸如甘露糖醇或山梨糖醇；抗衡离子，诸如钠；和/或非离子型表面活性剂，诸如聚山梨醇酯、泊洛沙姆或peg。
[0086]
待用于治疗施用的药物组合物的组分必须是无菌的。通过经过无菌过滤膜(例如，0.2μm膜)的过滤容易地实现无菌。药物组合物的治疗组分通常被放置到具有无菌进入端口的容器中，例如，具有被皮下注射针(hypodermic injection needle)可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
[0087]
药物组合物的组分通常将作为水溶液或作为用于重构的冻干制剂被储存在单位剂量容器或多剂量容器中，例如密封的安瓿或小瓶。作为冻干制剂的实例，10ml小瓶被填充有5ml的无菌过滤的1％(w/v)水溶液，并且将所得到的混合物冻干。输注溶液通过使用抑菌
的注射用水重构冻干的化合物来制备。
[0088]
本发明还涉及一种治疗或预防与α-突触核蛋白聚集相关的疾病的方法，该方法包括向有相应需要的患者施用治疗有效量的本发明的化合物。
[0089]
如本文使用的，术语“治疗有效量”指的是足以引起期望的生物响应的量。在本发明中，期望的生物响应是抑制α-突触核蛋白聚集和/或减少组织中存在的聚集的α-突触核蛋白的量。
[0090]
本发明还涉及如上文定义的化合物用于在体外或离体抑制α-突触核蛋白聚集的用途。
[0091]
与α-突触核蛋白聚集相关的疾病不被特别限制，并且通常选自帕金森病、路易体痴呆和多系统萎缩。
[0092]
以下实施例意图说明本发明。然而，它们不应被解释为是限制性的。
实施例
[0093]
实施例1：合成和测试
[0094]
化学合成程序
[0095]
关于本发明的化合物的制备和说明性实施例，详细地呈现了以下方法。本发明的化合物可以由有机合成领域的技术人员从已知的或可商购的起始材料和试剂制备。
[0096]
所有起始材料和溶剂都是商业级的并且按原样使用，除非另外说明。
[0097]
薄层色谱法(tlc)使用macherey-nagel预涂布的片材，0.25mmsil g/uv254板进行，用uv检测和/或通过用10wt％乙醇磷钼酸试剂炭化随后在200℃加热来检测。
[0098]
快速柱色谱法使用merck硅胶60(0.063mm-0.100mm)进行。
[0099]
分析型高效液相色谱法(hplc)通过使用具有waters 996光电二极管阵列检测器的waters hplc系统进行。所有分离均涉及在水中的0.1％三氟乙酸(tfa)(v/v)和在乙腈中的0.1％tfa的流动相。hplc使用反相(rp)柱eurospher rp 18,5μm,250
×
4.6mm,以1ml
·
min-1
的流量来进行。
[0100]
电喷雾电离质谱法(esi-ms)和液相色谱法/质谱法(lc/ms)分析是通过使用waters micromass zq 4000质谱仪结合上文描述的waters hplc设备获得的。
[0101]
nmr光谱使用配备有txi hcn z-梯度探针的400mhz bruker avance光谱仪(bruker ag，rheinstetten，德国)来记录。所有光谱使用topspin 3.1(bruker ag,karlsruhe,德国)处理。1h nmr化学位移(δ)是相对于作为内标的chcl3、dmso-d5和tfa-d1以百万分率(ppm)报告的。数据报告如下：化学位移，多重性(s＝单峰，d＝双重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，qi＝五重峰，dd＝双重峰的双重峰，dt＝三重峰的双重峰，b＝加宽，m＝多重峰)，耦合常数(j，以hz给出)，积分。
13
c nmr化学位移(δ)是相对于作为内标的cdcl3、dmso-d6和tfa-d1以百万分率(ppm)报告的。以下实验用于记录化合物的共振：1h-1d，
13
c-1d nmr光谱和
13
c-apt(具有1/145s的单j演化时间的附接质子测试，处理光谱使得季铵基团和亚甲基基团具有正号，并且甲基基团和次甲基基团具有负号)。为了在1h和apt光谱中解析共振重叠和恢复不可检测的共振，针对一些化合物记录了2d-[
13
c,1h]-hsqc(异核单量子相干)、
2d-[
13
c,1h]-hmbc(异核多键相关)和2d-noesy。
[0102]
所选择的化合物(化合物1、化合物2、化合物12、化合物18)通过rc tritec ag,teufen,瑞士，使用采用99％氚气/克尔氏催化剂(kerr’s catalyst)的h/t交换标记被氚化用于结合测定。化合物作为乙醇溶液被递送，所述乙醇溶液具有185mbq包装、37mbq/ml的浓度以及在1.1gbq/mmol至2.3gbq/mmol的范围内的比活性。
[0103]
方法a：1h-吡唑类的合成
[0104]
本领域技术人员将认识到，下文描绘的化合物11a和化合物11b是相同化合物的两种互变异构形式。所有这样的互变异构形式被认为是本发明的一部分。作为说明，如例如对于下文的化合物11所描绘的吡唑部分的所有互变异构形式被包括在本发明内。以相关的方式，本领域技术人员将认识到，本文中包含的化合物名称是基于命名惯例，其中互变异构体构型被描绘为相对于下文的化合物11a。因此，1,3-苯并间二氧杂环戊烯取代基位于三位。可选择的命名惯例将基于下文的互变异构体化合物11b，并且在该惯例中，1,3-苯并间二氧杂环戊烯取代基位于五位。
[0105][0106]
说明性实施例：2-[3-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-1h-吡唑-5-基]-6-氟吡啶化合物11
[0107][0108]
将氢化钠(fw 24.00，60％在油中，3.9mmol，156mg)加入到1-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)乙酮(fw 164.16，492mg，3.00mmol)和6-氟吡啶-2-甲酸甲酯(fw 155.13，605mg，3.9mmol)在dmso(7.5ml)和thf(1.9ml)中的溶液，并且将反应混合物在20℃搅拌持续15h。将反应混合物倒入60ml的包含acoh(450μl)的冰和水中。将混合物搅拌持续1h。将所得到的沉淀物过滤出，用水(10ml)、己烷:etoh＝5:1(10ml)、己烷(10ml)洗涤，并且在空气中干燥，以获得作为黄色固体的粗制中间体1-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-3-(6-氟吡啶-2-基)丙烷-1,3-二酮(594mg)。向该粗制中间体在etoh(20ml)中的悬浮液加入水合肼(146μl，150mg，3mmol)。将反应混合物在70℃搅拌持续5h，冷却并且在真空中浓缩。将残余物悬浮在meoh(10ml)中，在搅拌下煮沸持续5min，冷却，过滤出，用meoh(10ml)洗涤，并且在20℃在高真空中干燥持续15h，以提供作为白色固体的纯产物化合物11(471mg，1.66mmol，经两个步骤55％)。
[0109]
方法b：1h-吡唑类的合成
[0110]
说明性实施例：4-[3-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-1h-吡唑-5-基]-2-溴吡啶化合物9
[0111]
[0112]
在氮气下，将叔丁醇钾(fw 112.21,281mg,2.5mmol)在干燥的thf(5ml)中的溶液加入到1-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)乙酮(fw 164.16,328mg,2mmol)和2-溴吡啶-4-甲酸甲酯(fw 216.03,518mg,2.4mmol)在干燥的thf(5ml)中的搅拌的溶液。将反应混合物在20℃搅拌持续15h。取样20μl等分试样，用1m磷酸盐缓冲液ph 7猝灭，用etoac萃取，并且通过tlc分析。观察到酮的完全转化。将混合物倒入1m磷酸盐缓冲液ph 7(15ml)和冰水(15ml)中，并且在0℃搅拌持续30min。将所得到的黄色固体过滤出，用水(5
×
10ml)洗涤并且空气干燥，以给出656mg(1.88mmol，94％)的粗制中间体1-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-3-(2-溴吡啶-4-基)丙烷-1.3-二酮，其不经纯化用于下一步骤。将该中间体与一水合肼(fw 50.06,d 1.03；274μl,282mg,5.64mmol)在thf(10ml)中的混合物在50℃搅拌持续15h。将冷却的混合物倒入水(40ml)中，并且在0℃搅拌持续30min。将所得到的沉淀物过滤出，用水洗涤并且空气干燥。粗制产物从n-buoh(10ml)和dmf(1ml)中结晶，以给出作为白色粉末的纯产物化合物9(458mg，1.33mmol，经2个步骤67％)。
[0113]
方法c：boc保护基团的去除
[0114]
说明性实施例：4-[5-(2-溴吡啶-4-基)-1h-吡唑-3-基]苯胺化合物7
[0115][0116]
将三氟乙酸(2ml，2.96g，26mmol)加入到根据方法b从n-(4-乙酰基苯基)氨基甲酸叔丁酯和2-溴吡啶-4-甲酸甲酯制备的粗制{4-[5-(2-溴吡啶-4-基)-1h-吡唑-3-基]苯基}氨基甲酸叔丁酯(fw 415.28,865mg,2.08mmol)的悬浮液。将混合物在室温搅拌持续15h并且在真空中浓缩。加入1m磷酸盐缓冲液ph 7(20ml)，将所得到的沉淀物过滤出，用水(2
×
10ml)洗涤并且空气干燥，以给出543mg(1.72mmol，经3个步骤69％)的作为黄橙色固体的期望的产物。
[0117]
方法d：1h-吡唑类的合成
[0118]
说明性实施例：4-[3-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-1h-吡唑-5-基]-2-氟吡啶化合物12
[0119][0120]
将ipr2net(1.79ml,1.33g,10.26mmol)加入到1-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)乙酮(561mg，3.42mmol)和mgbr2·
et2o(1.56g,6.04mmol)在ch2cl2(35ml)中的搅拌的混合物。将所得到的悬浮液搅拌持续5min，并且然后逐滴加入在ch2cl2(7ml)中的2-氟吡啶-4-甲酸五氟苯基酯(1.37g，4.45mmol)。将反应混合物搅拌持续48h。然后加入1n含水hcl(20ml)，并且继续搅拌持续5min。将含水层用ch2cl2(20ml)萃取，并且将合并的有机萃取物干燥(mgso4)并且在真空中浓缩。将残余物用et2o(10ml)磨碎并且过滤。将固体用et2o洗涤并且空气干燥，以给出粗制产物(1.14g，橙色固体)。将粗制产物从etoac(8ml)和己烷(4ml)中重结晶，以提供作为橙色固体的纯的中间体1-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-3-(2-氟吡啶-4-基)丙烷-1,3-二酮(900mg，3.13mmol，92％)。将该中间体悬浮在thf(20ml)中，并
且加入一水合肼(292μl，300mg，6mmol)。将反应混合物在70℃搅拌持续5h，冷却并且在真空中浓缩。将残余物悬浮在et2o(10ml)中，在搅拌下煮沸持续5min，冷却，过滤出，用et2o(2
×
10ml)洗涤，并且在20℃在高真空中干燥持续15h，以提供作为白色固体的产物化合物12(722mg，2.55mmol，经2个步骤76％)。
[0121]
方法e：五氟苯基酯的合成
[0122]
说明性实施例：2-氟吡啶-4-甲酸五氟苯基酯化合物59
[0123][0124]
将dcc(fw 206.33，2.27g，11mmol)加入到2-氟吡啶-4-甲酸(1.41g，10mmol)和五氟苯酚(1.84g，10mmol)在1,4-二氧六环(40ml)中的搅拌的悬浮液。继续搅拌持续15h，此时已经形成了无色沉淀物。将混合物通过过滤并且蒸发，以给出半固体。经硅胶的色谱法给出作为纯的无色油的酯化合物59(2.21g，7.2mmol，72％)。
[0125]
方法f：1h-吡唑类的合成
[0126]
说明性实施例：6-[3-(3-溴苯基)-1h-吡唑-5-基]-1,3-二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡啶化合物20
[0127][0128]
步骤1
[0129]
向1,3-二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡啶-6-甲醛(wo/2019/208509)(35mg，0.23mmol)和1-(3-溴苯基)乙酮(46mg，0.23mmol)在甲醇(0.7ml)中的悬浮液加入ba(oh)2*8h2o(5mg)和naoh(0.5mg)，并且将所得到的混合物在室温(rt)搅拌过夜。在真空中蒸发甲醇之后，将残余物在水(5ml)中磨碎，固体通过过滤收集，用冷的甲醇(0.5ml)洗涤并且干燥，产生作为白色固体的中间体化合物1-(3-溴苯基)-3-([1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡啶-6-基)丙-2-烯-1-酮(67mg，88％)。
[0130]
步骤2
[0131]
向1-(3-溴苯基)-3-([1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-c]吡啶-6-基)丙-2-烯-1-酮(67mg，0.2mmol)在dmso(0.8ml)中的剧烈搅拌的悬浮液加入h2o2的水溶液(30％,45mg,0.4mmol)，随后逐滴加入含水naoh(10％,16μl,0.04mmol)。将黄色混合物在rt搅拌持续1.5h，并且倒入冷的磷酸盐缓冲液(20ml，0.1m，ph 7)中。油状沉淀物通过乙酸乙酯(2*15ml)萃取，合并的有机级分经na2so4干燥，在真空中浓缩并且将残余物再悬浮在甲苯(0.8ml)中。在甲苯中的悬浮液用水合肼(35mg,0.7mmol)和ptsa水合物(5mg)处理，并且将混合物在回流下搅拌持续1.5h。在冷却之后，加入磷酸盐缓冲液(0.3m，20ml)，并且将产物用乙酸乙酯(2*20ml)萃取。将合并的有机级分用盐水(5ml)洗涤，经na2so4干燥并且在真空中浓缩。粗制残余物通过柱色谱法(15g,硅胶63-100,chcl3/meoh＝100/1)纯化，以提供黄色固体，该黄色固体用et2o(1ml)洗涤以提供作为白色固体的化合物20(25mg，36％)。
[0132]
方法g：1h-吡唑类的合成
[0133]
说明性实施例：4-[3-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-1h-吡唑-5-基]-3,6-二氯哒嗪化合物48
[0134][0135]
将1-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)乙酮(138mg，0.84mmol)、mgbr2·
et2o(542mg，2.1mmol)在dcm(5ml)中的混合物用dipea(323mg，426μl，2.5mmol)处理，并且在rt搅拌持续10分钟。接着，经5分钟逐滴加入1h-苯并三唑-1-基(3,6-二氯哒嗪-4-基)甲酮的粗制混合物，该粗制混合物通过在25℃搅拌在干燥的dcm(5ml)中的3,6-二氯哒嗪-4-甲酸(203mg,1.05mmol)、苯并三唑(125mg,1.05mmol)和dcc(216mg,1.05mmol)持续3h来单独地制备。将所得到的混合物在25℃搅拌持续12h，然后用0.5m含水hcl(2ml)处理，并且在25℃搅拌持续另外的10分钟。在加入水(20ml)之后，用dcm(2*15ml)萃取混合物。将合并的有机级分用盐水洗涤，经na2so4干燥并且在真空中浓缩。粗制产物通过柱色谱法纯化，以提供作为橙色固体的中间体1-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-3-(3,6-二氯哒嗪-4-基)丙烷-1,3-二酮(190mg,67％)，其不经进一步纯化用于下一步骤。将该中间体悬浮在thf(4ml)中，并且加入一水合肼(40mg,0.8mmol)。将反应混合物在40℃搅拌过夜，冷却并且在真空中浓缩。粗制产物通过柱色谱法(硅胶63-100,20g，氯仿/甲醇＝100/1)纯化，以提供作为淡黄色固体的化合物48(100mg，经两个步骤36％)。
[0136]
方法h：1h-咪唑类的合成
[0137]
说明性实施例：4-[4-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-1h-咪唑-2-基]-2-溴吡啶化合物33
[0138][0139]
步骤1
[0140]
将1-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-2-溴乙酮(729mg，3mmol)、2-溴吡啶-4-甲酸(606mg，3mmol)和k2co3(414mg，3mmol)在dmf(6ml)中的悬浮液在55℃至60℃搅拌持续6h。在冷却之后，将混合物倒入水(60ml)中，搅拌持续10分钟，并且所得到的沉淀物通过过滤收集，在过滤器上用水(20ml)洗涤，并且干燥以提供中间体化合物2-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-2-氧代乙基2-溴吡啶-4-甲酸酯(899mg，87％)，其不经进一步纯化用于下一步骤。
[0141]
步骤2
[0142]
将中间体化合物2-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2-氧代乙基2-溴吡啶-4-甲酸酯(364mg，1mmol)和aconh4(924mg，12mmol)在甲苯(7ml)中的悬浮液在100℃在强烈搅拌的情况下加热持续4h。在冷却之后，将反应混合物用磷酸盐缓冲液(50ml，0.25m，ph 7)处理，并且用乙酸乙酯(2*50ml)萃取。将合并的有机级分用盐水洗涤，经na2so4干燥并且在真空中浓缩。残余物通过柱色谱法(硅胶63-100，30g，chcl3/meoh＝100/1
→
100/3)纯化。纯化的产物从含水乙醇(90％)中重结晶，以提供作为灰白色固体的化合物33(140mg，41％)。
[0143]
方法i：1h-1,2,4-三唑类的合成
[0144]
说明性实施例4-[3-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-1h-1,2,4-三唑-5-基]-2-溴吡啶化合物30
[0145][0146]
在0℃向t-buok(84mg，0.75mmol)在n-buoh(2ml)中的溶液加入苯并[1,3]间二氧杂环戊烯-5-甲脒盐酸盐(100mg,0.5mmol)，并且将混合物在rt搅拌持续20分钟。在加入2-溴异烟酸酰肼(108mg，0.5mmol)之后，将黄色悬浮液在85℃搅拌持续3h。在冷却至室温之后，加入乙醇(4ml)并且将co2鼓泡进入悬浮液中持续5分钟。在真空中去除溶剂之后，将残余物在水(10ml)中磨碎，所得到的沉淀物通过过滤收集，用水(5ml)洗涤并且干燥，以提供作为灰色固体的化合物30(85mg，49％)。
[0147]
方法j：1h-1,2,4-三唑类的合成
[0148]
说明性实施例4-[3-(2-溴吡啶-4-基)-1h-1,2,4-三唑-5-基]-n,n-二甲基苯胺化合物44
[0149][0150]
将2-溴异烟酸酰肼(151mg，0.7mmol)、4-(二甲基氨基)苯甲腈(307mg，2.1mmol)和k2co3(48mg，0.5mmol)在n-buoh(2ml)中的混合物在145℃搅拌持续8h。将混合物在真空中浓缩并且粗制产物通过两次柱色谱法(硅胶63-100，20g，chcl3/meoh＝100/1)和(硅胶63-100，20g，丙酮/己烷＝1/5)纯化，以提供作为米色固体的化合物44(20mg，8％)。
[0151]
方法k：4-氯-1h-吡唑类的合成
[0152]
4-[3-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-4-氯-1h-吡唑-5-基]-2-溴吡啶，化合物28
[0153][0154]
将化合物9(100mg,0.29mmol)和ncs(80mg,0.6mmol)在水(3ml)中的悬浮液在70℃搅拌持续16h，tlc示出起始材料的消耗。在冷却至rt之后，沉淀物通过过滤收集，用水(2*5ml)洗涤并且从乙醇(8ml)中重结晶，以提供作为灰色固体的化合物28(52mg，47％)。
[0155]
方法l：1-[4-(4-r-哌嗪-1-基)苯基]乙酮类的合成
[0156]
说明性实施例1-{4-[4-(2-甲氧基乙基)哌嗪-1-基]苯基}乙烯酮
[0157][0158]
将1-[4-(哌嗪-1-基)苯基]乙酮(408mg，2mmol)、1-溴-2-甲氧基乙烷(417mg，3mmol)和cs2co3(1304mg，4mmol)在dmf(5ml)中的混合物在25℃搅拌过夜。在真空中蒸发dmf之后，将残余物在水(25ml)和乙酸乙酯(35ml)之间分配，将含水相用乙酸乙酯(25ml)萃取，
并且将合并的有机级分用盐水洗涤，经na2so4干燥并且在真空中浓缩。粗制产物通过柱色谱法(30g硅胶63-100，氯仿
→
氯仿/meoh＝100/2)纯化，以提供作为淡黄色固体的1-{4-[4-(2-甲氧基乙基)哌嗪-1-基]苯基}乙烯酮(525mg，99％)。
[0159]
2-甲氧基乙基2,6-二溴吡啶-4-甲酸酯和2-甲氧基乙基2,6-二氯吡啶-4-甲酸酯根据公布的方案(journal of medicinal chemistry(2012)，55，10564-10571)来制备。
[0160]
(4-乙酰基苯基)甲基氨基甲酸叔丁酯、(4-乙酰基苯基)-n-(2h3)甲基氨基甲酸叔丁酯、(4-乙酰基苯基)乙基氨基甲酸叔丁酯和(4-乙酰基苯基)(2-氟乙基)氨基甲酸叔丁酯根据公布的方案(organic letters(2020)，22，5522-5527)来制备。
[0161]
1-[4-(4-氟哌啶-1-基)苯基]乙酮和1-[4-(3-氟氮杂环丁-1-基)苯基]乙酮根据公布的方案(wo 2011071570 a1)来制备。
[0162]
根据方法e制备2-氟吡啶-4-甲酸五氟苯基酯和2-氯吡啶-4-甲酸五氟苯基酯。根据方法l制备1-{4-[4-(2-甲氧基乙基)哌嗪-1-基]苯基}乙烯酮和1-{4-[4-(2-氟乙基)哌嗪-1-基]苯基}乙烯酮。
[0163]
本发明的示例性化合物在表1和表2中示出。表1示出了特定的示例性化合物的名称、结构、iupac名称、用于制备的起始材料、合成的方法和化学收率。表2示出了特定的示例性化合物的高效液相色谱法(hplc)保留时间、使用低分辨率质谱法联用hplc发现的分子量以及质子核磁共振(1h-nmr)。
[0164]
表1：
[0165]
[0166]
[0167]
[0168]
[0169]
[0170]
[0171][0172]
表2：
[0173]
[0174]
[0175]
[0176]
[0177]
jolla,ca,usa)中使用非线性回归分析拟合数据点。
[0188]
2b)修改的饱和结合测定
[0189]
对于饱和结合测定，将在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中稀释的固定浓度的声处理的人类重组αsyn(15nm/孔)或τ46(250nm/孔)或aβ
1-42
(1μm/孔)原纤维在低结合板(96孔微型测试板，ratiolab gmbh,dreieich,德国)中与增加浓度(从0.05nm至12nm/24nm)的[3h]-化合物1或[3h]-化合物2在30mm tris hcl、10％乙醇、0.05％吐温20，ph 7.4(以下被称为孵育缓冲液)中以200μl/孔的总体积进行孵育。通过与400nm未标记的化合物1或化合物2的共孵育来确定放射性示踪剂的非特异性结合。使用浓度确定测定来确定最佳原纤维浓度。
[0190]
将用可去除的密封胶带(perkinelmer)覆盖的板在振荡器(maxq
tm 6000,轨道直径1.9cm，thermo fisher scientific inc.,marietta,oh,usa)上以45rpm在37℃孵育持续两小时。在孵育之后，使用filtermat收集器(perkinelmer)通过经由玻璃纤维filtermat b(perkinelmer)的真空过滤来分离结合的放射性配体和游离的放射性配体。为了收集包含αsyn和aβ
1-42
原纤维的板，在收集之前，将filtermat另外与5mg/ml聚乙烯亚胺在4℃孵育持续30分钟。将过滤器用100ml(约1ml/孔)的冰冷的孵育缓冲液洗涤三次，并且随后在微波烘箱中以中等功率干燥持续2.5分钟。将熔化闪烁器片(meltilex
tm b/hs,perkinelmer)使用设置为120℃的加热板熔化到过滤器中。在室温硬化之后，将过滤器密封在塑料样品袋(perkinelmer)中。氚的积聚立即在wallactrilux液体闪烁计数器(perkinelmer)中计数。将放射性相对于3h标记的化合物浓度绘制。在graphpad prism(graphpad software,inc.,版本7.03,la jolla,(ca),usa)中使用非线性回归分析拟合数据点。
[0191]
3a)竞争结合测定
[0192]
将在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中稀释的固定浓度的声处理的人类重组αsyn(200nm/孔)或τ46(208nm/孔)原纤维在低结合板(96孔微型测试板，ratiolab gmbh,dreieich,德国)中连同1nm[3h]-化合物1和从1μm开始稀释的感兴趣的冷的化合物的1:4系列稀释液在50mm tris-碱、10％etoh、0.05％吐温20，ph 7.4中孵育。为了计算ki值，化合物1对声处理的人类重组αsyn原纤维的kd值被设定为3nm。
[0193]
将测定板在37℃在搅拌下孵育持续2h，用塑料箔(可再密封胶带，perkinelmer，waltham，ma，usa)覆盖。在收集之前，将过滤器(printed filtermat b,perkinelmer,waltham,ma,usa)与5mg/ml聚乙烯亚胺(pei,聚(乙烯亚胺)溶液，sigma aldrich chemie gmbh,taufkirchen,德国)在4℃孵育持续30min。在孵育之后，使用收集器(filtermate收集器,perkinelmer,waltham,ma,usa)通过真空过滤来分离结合的配体和游离的配体。将过滤器用冷却至4℃的缓冲液洗涤三次，并且随后在微波烘箱中以中等功率干燥持续2min。过滤器连同加入的闪烁器(betaplate scint,perkinelmer,waltham,ma,usa)一起被密封在塑料袋(的样品袋,perkinelmer,waltham,ma,usa)中。氚的积聚立即在液体闪烁计数器(wallactrilux,1450lsc&luminescence counter,perkinelmer,waltham,ma,usa)中计数。将放射性相对于增加的氚标记的化合物或冷化合物的浓度绘制。在graphpad prism(graphpad software,inc.,版本7.03,la jolla,ca,usa)中使用非线性回归分析拟合数据点。
[0194]
3b)修改的竞争结合测定
[0195]
对于竞争结合实验，将固定浓度的重组αsyn原纤维(声处理的，15nm/孔)与1nm[3h]-化合物1或[3h]-化合物2和降低浓度的未标记的竞争物的系列稀释液(系列稀释液1:4或1:3.5或1:3，分别提供未标记的竞争物1μm-1pm或1μm-4nm或1μm-17pm的浓度范围)在30mm tris-hcl，10％乙醇，0.05％吐温20，ph 7.4，以200μl/孔的总体积进行孵育。板在rt孵育持续4.5h，用可去除的密封胶带(perkinelmer，waltham，ma，usa)覆盖。
[0196]
如对于饱和结合测定所描述的进行过滤和读出。将[3h]-标记的配体结合[在cmp中]相对于增加的竞争物浓度绘制，并且使用非线性回归分析拟合数据点以计算ic
50
和ki值(graphpad software,inc.,版本7.03,la jolla(ca),usa)。在采用声处理的重组αsyn原纤维的竞争结合测定中，ki值的计算基于化合物1和化合物2分别为0.6nm和0.2nm的kd值来完成。
[0197]
原纤维结合饱和测定提供kd值。这种测定采用直接放射性标记的化合物(例如3h标记)来进行。kd值在表3a和表3b中示出。使用分别从重组人类α-突触核蛋白、aβ
1-42
和τ46产生的原纤维聚集体作为靶结构来进行饱和结合测定。
[0198]
结果示出了对于α-突触核蛋白原纤维的高亲和力。化合物1、化合物2和化合物12示出了非常高的亲和力，其中kd值低于10nm。化合物1和化合物2还被测试了关于与aβ和τ46原纤维的结合，并且示出了良好至优秀的选择性，这证明这些化合物对于聚集的α-突触核蛋白的诊断检测的适用性。
[0199]
表3a：根据方案2a的饱和测定
[0200][0201]
表3b：根据方案2b的饱和测定
[0202]
化合物编号对于聚集的α-突触核蛋白的kd[nm]10.620.2
[0203]
原纤维竞争测定提供了ki值。ki是表示替代50％的与靶结构(1nm)结合的参考化合物所需的非放射性测试化合物(竞争物配体)的浓度的定量量度，在这种情况下，所述参考化合物是[3h]-化合物1(1nm)或[3h]-化合物2(1nm)，在我们的案例中所述靶结构是重组α-突触核蛋白和τ46原纤维。该测定适合于非放射性配体的筛选。对于测试的化合物获得的ki值在表4a、表4b和表5中示出。
[0204]
表4a：根据方案3a的竞争测定(参考配体[3h]-化合物1(1nm))
[0205][0206]
*重复
[0207]
表4b：根据方案3b的竞争测定(参考配体[3h]-化合物1(1nm))
[0208][0209]
表5：根据方案3b的竞争测定(参考配体[3h]-化合物2(1nm))
[0210]
[0211]
[0212][0213]
多种竞争测定的结果指示了α-突触核蛋白原纤维对于测试的化合物的高结合亲和力(较低的ki值指示较高的结合亲和力)。在相对于化合物1的竞争测定的情况下(表4a)，对于α-突触核蛋白和τ46原纤维的相似ki值指示与化合物1相似的选择性，对于那些τ46原纤维的ki值比α-突触核蛋白原纤维的ki值更高的化合物，数据表明进一步改善的选择性。
[0214]
此外，化合物63、化合物64和化合物65与在苯环中的一个中带有氮原子的对应化合物以直接比较的方式进行了测试。然而在表6中关于化合物1获得了0.4nm的ki值，化合物65(其在苯环中缺少氮原子)的ki值高得多(1.9nm)，这表明化合物1的显著改善的结合亲和力。基于ki值的结合性质的分析揭示了含n化合物的显著改善的结合亲和力。在采用参考配体[3h]-化合物1(1nm)的竞争结合测定中对于测试的化合物获得的ki值在表6中示出。
[0215]
表6：根据方案3b的竞争测定(参考配体[3h]-化合物1(1nm))
[0216][0217]
*声处理的α-突触核蛋白原纤维
[0218]
实施例3：在细胞培养中的治疗作用
[0219]
为了确定潜在的治疗上有用的作用，在h4细胞中的聚集的α-突触核蛋白依赖性毒性的两种细胞模型中对化合物进行测试。这些细胞模型允许α-突触核蛋白半-venus融合构建体(v1s sv2)或全长α-突触核蛋白(该模型详细地描述于：bartels m,weckbecker d,kuhn ph,ryazanov s,leonov a,griesinger c,lichtenthaler sf, k,giese a:iron-mediated aggregation and toxicity in a novel neuronal cell culture model with inducible alpha-synuclein expression,sci.rep.2019年6月24日；9(1):9100)的可诱导的过表达。此外，dmso和fecl3的加入促进α-突触核蛋白的聚集，这与细胞毒性的增加有关。细胞培养测定通过确定细胞数目的变化和指示凋亡的浓缩细胞核(condensed nuclei)的百分比的变化来使用这些作用，以便获得关于哪些化合物示出最有前景的作用并且因此可能在治疗上有用的信息。
[0220]
数据总结在下文的表7中。在这些实验中，在作为阳性对照的10μm anle138c、化合物1至化合物19(10μm)或作为阴性对照的dmso的存在下，细胞与100μm fecl3和0.75％dmso一起孵育。在48h之后，将细胞用opera高通量成像系统进行成像，并且使用acapella软件(perkin elmer)进行分析。该表示出了相对于dmso对照的细胞数目的变化和具有浓缩细胞
核的细胞(即凋亡细胞)的分数的变化。浓缩细胞核的分数的降低(在不存在细胞数目的强烈减少的情况下)指示有益的治疗作用。
[0221]
表7：在细胞模型中的治疗化合物作用
[0222][0223]
实施例4：[
11
c]-标记的化合物1和化合物2的体内生物分布
[0224]
[
11
c]-标记的化合物1和化合物2分别在小鼠的尾静脉中被静脉内地注射。然后在小动物pet仪器中对小鼠进行成像。对于两种化合物，均观察到良好的血脑屏障渗透，其中suv值》1.5。此外，发现了从脑中的快速清除(washout)。[
11
c]-标记的化合物1和化合物2的清除半衰期(clearance half-life)分别是12分钟和9分钟。
[0225]
实施例5：使用人类脑组织的放射自显影
[0226]
对使用氚化的化合物1的冷冻脑组织和源自患有路易体痴呆的患者的扣带回的脑组织的组织学切片进行放射自显影。当使用浓度3nm的[3h]-化合物1用于组织的孵育随后进行洗涤步骤时，可以观察到与灰质的优先结合，这是与聚集的α-突触核蛋白的已知分布相同的模式(图1，左图)。当特异性结合被过量的非氚化的(即“冷的”)化合物1阻断时，可以看到化合物1与脑组织没有非特异性结合至非常低的非特异性结合(图1，右图)。
[0227]
这些发现指示，化合物1特异性地并且以高亲和力与存在于人类突触核蛋白病患者中的病理学聚集的α-突触核蛋白结合，并且允许聚集的α-突触核蛋白的诊断检测。