用于递送活性剂或治疗剂的水包油乳剂制剂的制作方法

用于递送活性剂或治疗剂的水包油乳剂制剂
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年10月16日提交的美国临时专利申请号62/915,696的权益和优先权。
技术领域
3.本发明涉及用于在水包油乳剂中递送至少两种活性剂、治疗剂或药剂的方法和组合物，其中至少一种药剂在乳剂的疏水相中递送并且至少一种药剂在乳剂的水相中递送。
技术背景
4.在制药领域，活性剂、治疗剂和药剂的有效递送常常带来困难和挑战。尽管具体试剂可能在体外有效，但试剂在受试者体内的有效性将进一步取决于递送方法、施用途径和体内药代动力学。例如，试剂的体内有效性可能取决于其靶向具体组织或细胞类型的能力，或者取决于其遍及身体全身性递送的能力。此外，药剂在体内的有效性还可能取决于其从施用部位的释放速率：缓释或即时释放。考虑因素将取决于具体试剂的性质(例如大小、稳定性、溶解性、电荷)及其所期望的效果和/或靶标。
5.试剂的靶向受施用途径的影响。需要全身性递送的药剂可以静脉内注射以立即通过血液循环或口服递送以通过消化系统吸收到血液中。相反，可以通过直接注射到具体器官或组织中，或通过注射入引流到具体器官或组织中的部位中，将试剂靶向具体组织。例如，可以皮下注射试剂以将试剂靶向引流淋巴结。可选地，可以通过将试剂连接到靶向分子来修饰试剂然后全身性递送试剂，然后试剂经由靶向分子在靶组织中或靶细胞上积累。然而，这需要对试剂进行化学修饰，可能会改变其性质，并增加疗法的成本和复杂性。
6.试剂的释放速率可以通过其在药物组合物中的制剂来控制。例如，可以在具有化学包衣的口服片剂中提供试剂，以确保在消化期间试剂的缓释。注射的试剂可以在水溶液中配制，其在注射后通过溶解到间质液或血液中或引流到淋巴系统中而迅速分散，从而提供试剂的即时释放。相反，注射的试剂可以在提供贮库效应的油基组合物中递送，从而提供试剂的缓释。
7.通常，对疾病、紊乱或感染的疗法需要施用一种以上的试剂。然而，当试剂具有不同的性质和/或期望的靶标时，则会出现挑战。例如，可能希望疗法中的第一试剂具有缓释，而第二试剂具有更快或即时释放。在另一个实例中，可能期望疗法中的第一试剂靶向具体组织，例如淋巴组织，而第二试剂全身性释放。常见的解决方案是分开提供试剂。这种方法有几个缺点。通过不同方法和利用不同方案施用多种试剂使治疗方案复杂化并且可能导致施用错误。此外，如果方法需要多次注射以分开递送试剂，则会增加患者的不适感，并可能增加不必要的注射部位反应的风险。
8.因此，需要在单一组合物或施用中将多种试剂递送至受试者的新颖且有效的方法，该方法适应多种试剂的不同性质及其所期望的靶标和释放速率。这种组合物或施用可以简化需要多种试剂的疗法并提高患者的舒适度。此外，这样的组合物或施用还可以通过
提高试剂的功效并因此提高受试者的治疗来提高疗法的有效性。
9.因此，本文提供了用于将在水包油乳剂的不同相中的多种试剂递送至受试者的方法和组合物。本发明的方法和组合物能够共同递送水相试剂和疏水相试剂，提高所递送试剂的功效，并在受试者中产生较低滴度的不需要的抗药物抗体。如实施例7和8中所证明的，与其他组合物相比，用根据本发明的乳剂组合物(包含疏水相中的dpx抗癌组合物和水相中的免疫调节性抗ctla-4抗体)治疗受肿瘤攻击的小鼠提高了存活率和肿瘤控制，并生成了较低滴度的针对抗ctla4抗体的不需要的抗药物抗体(ada)。


技术实现要素：

10.在一个实施方式中，本公开内容涉及用于将至少两种试剂递送至受试者的组合物，其包含：i)疏水相；和ii)水相；其中该组合物是疏水相在水相中的乳剂，其中疏水相包含至少一种疏水相试剂，并且其中水相包含至少一种水相试剂。
11.在一个实施方式中，本公开内容涉及用于将至少两种试剂递送至受试者的组合物，其包含：i)疏水相，其包含矿物油中的二缩甘露醇油酸酯、dopc、胆固醇、seq id no:1的肽抗原、seq id no:30的t辅助表位和基于dna的聚肌胞；和ii)水相，其包含水和/或水溶液、聚山梨醇酯20和与ctla-4结合的抗体；其中组合物是疏水相在水相中的乳剂。
12.在一个实施方式中，本公开内容涉及用于将至少两种试剂递送至受试者的组合物，其包含：i)疏水相，其包含矿物油中的二缩甘露醇油酸酯、dopc、胆固醇、seq id no:18的肽抗原、seq id no:20的肽抗原、seq id no:22的肽抗原、seq id no:23的肽抗原、seq id no:24的肽抗原、seq id no:28的t辅助表位和基于dna的聚肌胞；和ii)水相，其包含水和/或水溶液、聚山梨醇酯20和与ctla-4结合的抗体；其中组合物是疏水相在水相中的乳剂。
13.在一个实施方式中，本公开内容涉及用于将至少两种试剂递送至受试者的组合物，其包含：i)疏水相，其包含矿物油中的二缩甘露醇油酸酯、dopc、胆固醇、seq id no:34的融合肽和基于dna的聚肌胞；和ii)水相，其包含水和/或水溶液、聚山梨醇酯20和与ctla-4结合的抗体；其中组合物是疏水相在水相中的乳剂。
14.在一个实施方式中，本公开内容涉及用于将至少两种试剂递送至受试者的组合物，其包含：i)疏水相，其包含矿物油中的二缩甘露醇油酸酯、dopc、胆固醇、seq id no:35的肽抗原、seq id no:36的肽抗原、seq id no:37的肽抗原、seq id no:38的肽抗原、seq id no:20的肽抗原、seq id no:23的肽抗原、seq id no:28的t辅助表位和基于dna的聚肌胞；和ii)水相，其包含水和/或水溶液、聚山梨醇酯20和与ctla-4结合的抗体；其中组合物是疏水相在水相中的乳剂。
15.在一个实施方式中，本公开内容涉及制备用于将至少两种试剂递送至受试者的组合物的方法，所述方法包括：i)提供包含至少一种疏水相试剂的疏水相；ii)提供包含至少一种水相试剂的水相；iii)将疏水相和水相混合以产生疏水相在水相中的乳剂。在一个实施方式中，本公开内容涉及通过本文描述的方法产生的组合物。
16.在一个实施方式中，本公开内容涉及用于将至少两种试剂递送至受试者的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的组合物。
17.在一个实施方式中，本公开内容涉及用于在受试者中诱导免疫应答的方法，包括
向受试者施用如本文所述的组合物。
18.在一个实施方式中，本公开内容涉及用于治疗、防止或诊断受试者中的疾病、紊乱或病症的方法，包括向受试者施用如本文所述的组合物。
19.在一个实施方式中，本公开内容涉及用于调节受试者中的免疫应答的方法，包括向受试者施用如本文所述的组合物。
20.在一个实施方式中，本公开内容涉及治疗或防止在受试者中由细胞介导的免疫应答或体液免疫应答改善的疾病和/或紊乱的方法，包括向受试者施用如本文所述的组合物。
21.在一个实施方式中，本公开内容涉及用于治疗和/或防止在受试者中由病毒、细菌或原生动物引起的感染病的方法，包括向受试者施用使用如本文所述的组合物。
22.在一个实施方式中，本公开内容涉及治疗和/或防止受试者中的癌症的方法，包括向受试者施用如本文所述的组合物。
23.在一个实施方式中，本公开内容涉及在受试者中用抗体中和毒素、病毒、细菌或过敏原的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的组合物。
24.在一个实施方式中，本公开内容涉及试剂盒，其包括：a)第一容器，其包含至少一种疏水相试剂的干燥的制品；b)第二容器，其包含一种或多种疏水物质；和c)第三容器，其包含包括至少一种水相试剂的水溶液。
25.在一个实施方式中，本公开内容涉及试剂盒，其包括：a)第一容器，其包含至少一种疏水相试剂的干燥的制品；b)第二容器，其包含一种或多种疏水物质；c)第三容器，其包含至少一种水相试剂的干燥的制品；和d)第四容器，其包含水、水溶液或其组合。
26.在结合附图阅读以下描述后，本发明的其他方面和特征对于本领域普通技术人员将变得显而易见。
附图说明
27.构成本说明书一部分的附图仅以实例的方式说明本发明的实施方式。
28.图1显示了以天为单位的研究时间表以及施用治疗或采集样本的研究天数。
29.图2显示了来自治疗组1-9(a)和组5-8(b)的小鼠随时间的存活率百分比。mcpa＝节拍环磷酰胺(metronomic cyclophosphamide)(口服施用)；ip＝腹膜内(注射)。使用mantel-cox检验进行生存统计分析，***p《0.001，*p《0.05。
30.图3显示了来自治疗组1-9(a)和组5-8(b)的小鼠随时间的肿瘤体积。mcpa＝节拍环磷酰胺(口服施用)；ip＝腹膜内(注射)。通过线性回归比较进行肿瘤体积统计分析，***p《0.0001。
31.图4显示了示例性水包油乳剂制剂的示意图。使用连接器将包含疏水相试剂的疏水相(注射器1)与包含水相试剂的水相(注射器2)混合以形成o/w乳剂。
32.图5显示了在用多种组合物治疗的小鼠中针对抗ctla4抗体的抗药物抗体(ada)的滴度。通过桥接elisa与抗ctla-4包被和检测抗体(a)、igg2b同种型对照包被抗体和抗cla-4检测抗体(b)，以及igg1同种型对照包被抗体和抗ctla-4检测抗体(c)来检测ada形成。使用tukey多重比较检验通过单向anova评估统计显著性，*p《0.05。
33.图6显示了示例性水包油乳剂制剂的hplc色谱图，其中疏水相包含dpx-油中空，和水相包含寡核苷酸水相试剂。(a)寡核苷酸标准品色谱图，(b)疏水相(顶层-油)色谱图，(c)
水相(底层-水)色谱图。
34.图7显示了示例性水包油乳剂制剂的hplc色谱图，其中疏水相包含dpx-油中空，和水相包含环磷酰胺水相试剂。(a)环磷酰胺标准品的色谱图，(b)水相(底层-水)的色谱图。
35.图8显示了示例性水包油乳剂制剂的hplc色谱图，其中疏水相包含dpx-油中空，和水相包含抗-ctla4抗体水相试剂。(a)抗ctla4标准品的色谱图，(b)疏水相(顶层-油)色谱图，(c)水相(底层-水)色谱图。
具体实施方式
36.本发明内容涉及用于在疏水相在水相中的乳剂中递送至少两种活性剂、治疗剂和/或试剂的方法和组合物，其中至少一种试剂在乳剂的疏水相中递送(疏水相试剂)和至少一种试剂在乳剂的水相中递送(水相试剂)。乳剂包含疏水相，该疏水相提供至少一种疏水相试剂的缓释并提供至淋巴组织中的免疫细胞、淋巴结或淋巴样细胞的靶向递送。乳剂进一步包含水相，与至少一种疏水相试剂的释放速率相比，该水相提供至少一种水相试剂的更快释放，以及从施用部位的更广泛的分散。
37.为了提供用于在受试者中治疗疾病、紊乱或感染的疗法，可能需要提供多于一种的活性剂、治疗剂或试剂。在这种情况下，在同一组合物中提供多于一种试剂以用于对受试者的单次施用可能是有利的。试剂可以具有彼此不同的期望释放速率和/或期望体内靶标。因此，本发明提供了用于在水包油乳剂中递送至少两种试剂的方法和组合物，该乳剂由分散在水相中的疏水相组成。可将待递送至受试者的试剂并入疏水相中以用于缓释和靶向递送，或并入水相中以用于在受试者体内更快释放和更广泛分散，同时也可并入在单次施用中提供的单一组合物中。
38.乳剂包含提供至少一种疏水相试剂的缓释的疏水相，其中至少一种疏水相试剂靶向淋巴组织中的免疫细胞、淋巴结或淋巴样细胞。
39.如本文所用，“缓释”是指试剂可在延长的时间段内被免疫细胞从施用部位摄取。在一个实施方式中，术语“缓释”是指相当大的比例(例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％)的试剂保持定位在施用部位至少约36小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、168小时、192小时或384小时。在一个实施方式中，在施用后24小时内，免疫细胞从施用部位摄取小于1％、2％、3％、4％或5％的试剂。在一个实施方式中，至少80％的试剂在施用后保持定位在注射部位至少约48小时。在一个实施方式中，至少60％的试剂在施用后保持定位在施用部位至少约72小时。
40.如本文所用，“靶向的”或“靶向”是指将至少一种疏水相试剂优先递送至淋巴组织中的免疫细胞、淋巴结或淋巴样细胞。如本文所用，“优先递送”是指将至少一种疏水相试剂递送至淋巴组织中的免疫细胞、淋巴结或淋巴样细胞而不是递送至身体的其他区域或全身性递送的事实。在一个实施方式中，“优先递送”是指至少一种疏水相试剂在淋巴组织中的免疫细胞、淋巴结或淋巴样细胞中的浓度或量相对于至少一种疏水相试剂在身体其他部分中的浓度或量增加。
41.如本文所用且不受理论约束，术语“靶向递送”包括通过上游事件实现对淋巴组织中免疫细胞、淋巴结或淋巴样细胞的靶向的实施方式，由此至少一种疏水相试剂更有效地被免疫细胞吸收(例如通过吞噬作用或内吞作用)或递送至抗原呈递细胞，所述抗原呈递细
胞能够将至少一种疏水相试剂运输至淋巴组织中的淋巴结或淋巴样细胞。在一个实施方式中，疏水相试剂被免疫细胞吸收，例如但不限于单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、t细胞和/或b细胞。在一个实施方式中，疏水相试剂被递送至抗原呈递细胞，例如但不限于单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和/或b细胞，并且抗原呈递细胞将至少一种疏水相试剂运输至淋巴组织中的淋巴结或淋巴样细胞。因此，在一个实施方式中，“靶向递送至淋巴组织中的淋巴结或淋巴样细胞”包括将至少一种疏水相试剂优先递送至体内的非淋巴液或组织中的细胞，从而该细胞然后将至少一种疏水相试剂运输至淋巴组织中的淋巴结或淋巴样细胞。
42.如本文所用，“淋巴结”是指存在于动物(例如人类)全身的任何一个或多个淋巴结。在一个实例中，淋巴结是基于解剖位置的以下类型中的任何一种或多种：腹股沟(鼠蹊部)、股骨(大腿内侧上部)、肠系膜(胸腔下方的下半身)、纵隔(胸骨后面的上半身)、锁骨上(锁骨)；腋生(腋窝)；和颈椎(颈部)。至少一种疏水相试剂优先靶向的淋巴结可能取决于施用途径(例如注射)和施用位置。在一个实施方式中，淋巴结是引流注射部位的淋巴结。
43.如本文所用，术语“淋巴组织”是指构成淋巴系统的细胞和器官。它包括但不限于淋巴结、脾脏、胸腺和粘膜相关淋巴组织(例如，在肺中、肠壁固有层、小肠的潘氏斑、或舌、腭和咽扁桃体，或韦氏(waldeyer's)颈环)。淋巴组织的淋巴样细胞包括例如粒细胞(白细胞)、t细胞(t-淋巴细胞)、b细胞(b淋巴细胞)、巨噬细胞、树突细胞和网状细胞。在一个实施方式中，本文公开的至少一种疏水相试剂的靶向递送是至淋巴结或淋巴组织中的t淋巴细胞和/或b淋巴细胞。
44.不受理论的束缚，据信根据本发明的组合物的疏水相提供通过以下一种或多种将至少一种疏水相试剂靶向递送至淋巴组织中的免疫细胞、淋巴结或淋巴样细胞：(i)由于乳剂在施用部位处的分离，在施用部位处或其附近促进免疫细胞(例如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、t细胞和/或b细胞)对至少一种疏水相试剂的有效摄取，将疏水相留在吸引免疫细胞并提供对至少一种疏水相试剂的延长暴露的施用部位；(ii)促进此类免疫细胞迁移至淋巴结；和(iii)促进淋巴组织中的淋巴结或淋巴样细胞中的细胞对至少一种疏水相试剂的摄取。
45.在一些实施方式中，至少一种疏水相试剂包含用于引发免疫应答的抗原和/或佐剂。在一些实施方式中，疏水相是包含用于引发免疫应答的抗原和/或佐剂的组合物。
46.在疏水相包含用于引发免疫应答的抗原和/或佐剂的实施方式中，将疏水相试剂靶向淋巴组织中的免疫细胞、淋巴结或淋巴样细胞允许活化免疫细胞以便引发免疫应答。在遇到外来抗原之前，免疫细胞(例如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、t细胞和/或b细胞)处于未成熟状态。在可呈递抗原的吞噬作用后，抗原呈递免疫细胞(例如单核细胞、巨噬细胞、b细胞和树突细胞)被活化，导致mhc i/ii类分子的表达上调并成熟为成熟的抗原呈递细胞，这些细胞迁移至通过受体介导的相互作用与淋巴细胞(例如t细胞和b细胞)相互作用的淋巴结。这导致淋巴细胞本身的活化和适应性免疫应答的诱导。在免疫疗法的情况下，免疫细胞的适当活化通常还需要施用佐剂以提高路径选择(routing)和适应性免疫应答。
47.在一些实施方式中，至少一种疏水相试剂包括不是抗原和/或佐剂的试剂，而是靶向淋巴组织中的淋巴结或淋巴样细胞的其他试剂(例如小分子药物、抗体、免疫调节剂、过敏原或多核苷酸)。在一些实施方式中，疏水相是包含用于调节免疫应答的试剂的药物组合物。在一些实施方式中，疏水相是包含抗体的药物组合物。
48.在疏水相包含用于调节免疫应答的试剂的实施方式中，将疏水相试剂靶向淋巴组织中的免疫细胞、淋巴结或淋巴样细胞允许调节免疫细胞和/或免疫应答。即使在不存在可呈递抗原和免疫细胞活化的情况下，在疏水相中提供的试剂也可以被免疫细胞吸收和/或运输到淋巴组织中的淋巴结或淋巴样细胞以进行靶向递送，如例如在pct/ca2019/050328中所述。
49.乳剂包含水相，与至少一种疏水相试剂的释放速率相比，水相提供至少一种水相试剂的更快释放，和从施用部位更广泛的分散。如本文所用，“更广泛的分散”是指水相和至少一种水相试剂从施用部位分散，而不是在施用部位形成不显著分散的沉积。例如，水相和/或至少一种水相试剂可以溶解到周围的间质液中并扩散到整个组织或器官。在另一个实例中，水相和/或至少一种水相试剂可以溶解到淋巴液或血液中并进入循环以提供全身性递送。如本文所用，“全身性递送”是指将至少一种水相试剂递送至全身，使得多个组织、多个器官或整个身体暴露于治疗有效量的试剂。全身性递送的试剂通常直接或间接地进入循环系统，在那里它们经由血流在全身循环。如本文所用，“全身性递送”包括其中至少一种水相试剂从施用部位分散并直接或间接地进入循环以将治疗有效量的试剂提供至多个组织、多个器官或整个身体。与至少一种疏水相试剂的释放速率相比，水相提供了至少一种水相试剂的更快释放。在一些实施方式中，与常规水性制剂相比，本发明的乳剂提供了至少一种水相试剂的较慢释放。
50.不受理论的束缚，据信，与至少一种疏水相试剂的释放速率相比，根据本发明的组合物的水相提供了至少一种水相试剂的更快释放，并且通过溶解到间质液中，使至少一种水相试剂溶解到间质液中提供了从施用部位更广泛的分散，由此它可以：(i)分散到周围的组织或器官中；(ii)通过毛细管壁弥散到循环中；(iii)和/或进入淋巴循环，随后通过淋巴管进入血流。
51.本发明的方法和组合物有利于提供用于递送至少两种具有不同靶标、性质和释放速率的试剂的单一组合物。当需要至少一种试剂以缓释的方式靶向淋巴组织中的免疫细胞、淋巴结或淋巴样细胞，而至少一种其他试剂可以更广泛且更迅速地分散在受试者体内时，本发明可用于将至少两种试剂递送至受试者。作为非限制性实例，本发明的乳剂组合物可提供疏水相中的抗原和水相中的免疫调节剂，以便在受试者中诱导提高的免疫应答。以这种方式，乳剂组合物提供抗原向免疫细胞的缓释、靶向释放，同时提供免疫调节剂的更快释放以提高对抗原的免疫应答。此外，本发明的方法和组合物还可以提高递送试剂的功效。如实施例7所证明的，与单独接受dpx抗癌组合物和抗ctla-4抗体、或者在缺乏o/w乳剂的组合物中一起的小鼠相比，接受用根据本发明的乳剂组合物(包含疏水相中的dpx抗癌组合物和水相中的免疫调节性抗ctla-4抗体)治疗受肿瘤攻击的小鼠提高了存活率和肿瘤控制。本发明的进一步的优点在实施例8中证明，这表明与缺乏本发明的o/w乳剂的不同组合物相比，根据本发明的乳剂组合物生成了较低滴度的针对抗ctla4抗体的不需要的抗药物抗体(ada)。
52.乳剂
53.如本文所用，“乳剂”是指通常不混溶的两种或更多种液体的混合物，其中一种液体的液滴分散在另一种中。例如，疏水物质(例如油)和水性物质(例如水)是不混溶的液体，当其中一种的液滴分散在另一种中时可能会形成乳剂。水滴在油中的分散体是油包水(w/
o)乳剂，其中水(水相)形成不连续相，油(疏水相)形成连续相。如本文所用，“油包水乳剂”或“w/o”是指疏水相在水相中的乳剂。油滴在水中的分散体是水包油(o/w)乳剂，其中油(疏水相)形成不连续相，水(水相)形成连续相。如本文所用，“水包油乳剂”或“o/w”是指疏水相在水相中的乳剂。疏水相或疏水物质也可称为亲脂性。水相或水性物质也可以称为亲水性或疏脂性。
54.如果不连续相在长时间段保持分散在连续相中，则可以将乳剂描述为稳定的。如本文所述，如果在乳剂形成后不连续相保持分散在连续相中1小时、2小时、3小时、4小时或大于4小时，则乳剂可被描述为稳定的。乳剂的相可能随着时间而分离。相分离可能是由于分散相的浮力，这导致液滴在连续相中下沉或漂浮；由于液滴聚结成逐渐更大的液滴；或由于相互吸引的液滴的絮凝。乳剂的相分离可以通过观察乳剂是否呈现均匀或是否存在可检测到的一个相与另一个相的分离来目测确定。
55.在一些实施方式中，乳化剂可以包含在乳剂的一个或多个相中。如本文所用，“乳化剂”是指能够形成乳剂和/或提高乳剂稳定性的物质或化合物。乳化剂可以是例如脂质、表面活性剂、洗涤剂或乳化盐。乳化剂可以通过分散和/或稳定不连续相的液滴来形成乳剂和/或提高乳剂的稳定性，从而防止相分离。乳化剂可以是两亲性的，具有极性或亲水区域和非极性或疏水(即亲脂)区域，使它们能够与疏水相和水相相互作用。乳化剂对水或油的亲和力通过其亲水-亲油平衡(hlb)来测量。hlb为0-20等级：hlb值低于10表示对油和对形成o/w乳剂的亲和力更大；hlb值高于10表明对水和形成o/w乳剂的亲和力更大。根据离子基团的存在，乳化剂可进一步分为离子型或非离子型。用于稳定乳剂的乳化剂(一种或多种)的选择将取决于乳剂的所期望的性质，例如o/w对w/o、密度、粘度、在水或油中的分散速率以及稳定性。可用于配制根据本发明的o/w乳剂的乳化剂包括但不限于聚山梨醇酯20(例如tween
tm 20)、聚山梨醇酯40(例如tween
tm 40)、聚山梨醇酯60(例如tween
tm 60)、聚山梨醇酯80(例如tween
tm 80)、卵磷脂、二缩甘露醇油酸酯、脱水山梨醇单月桂酸酯(例如span
tm 20)、脱水山梨醇三硬脂酸酯(例如span
tm 65)、脱水山梨醇单油酸酯(例如span
tm 80)、脱水山梨糖醇三油酸酯(例如span
tm 85)、壬苯醇醚(nonoxynols)triton
tm x-100、八乙二醇单十二烷基醚、戊乙二醇单十二烷基醚、泊洛沙姆、单硬脂酸甘油酯、单月桂酸甘油酯、癸基葡糖苷、月桂基葡糖苷、辛基葡糖苷、月桂基二甲基氧化胺、二甲基亚砜、氧化膦、聚乙氧基化牛脂胺(polyethoxylated tallow amine)、椰油酰胺单乙醇胺、椰油酰胺二乙醇胺montane
tm 20、80和85ppi乳化剂和montanox
tm 20、80ppi和montanox
tm 80api增溶剂、阴离子表面活性剂(例如月桂基硫酸铵、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、月桂基醚硫酸钠、肉豆蔻醇聚醚硫酸钠、二辛基硫化琥珀酸钠(dioctyl sodium sulfosuccinate)、全氟辛烷磺酸盐、全氟丁烷磺酸盐、烷基芳基醚磷酸盐(alkyl-aryl ether phosphates)和烷基醚磷酸盐)、羧酸盐表面活性剂(例如硬脂酸钠、月桂酰肌氨酸钠、全氟壬酸盐和全氟辛酸盐)、阳离子表面活性剂(例如奥替尼啶二盐酸盐、西曲溴铵、氯化十六烷吡啶、苯扎氯铵、苄索氯铵、二甲基双十八烷基氯化铵和双十八烷基二甲基溴化铵)、两性离子表面活性剂(例如月桂基-n,n-(二甲基铵)丁酸盐、月桂基-n,n-(二甲基)-甘氨酸甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐、3-([3-胆酰胺丙基]二甲基铵)-2-羟基-1-丙磺酸盐、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐、月桂基-n,n-(二甲基铵)丁酸、月桂基-n,n-(二甲基)-丙磺酸盐、3-(4-叔丁基-1-吡啶)-1-丙磺酸盐、3-(1-吡啶)-1-丙磺
酸盐、3-(苄基5-二甲基铵)丙磺酸盐和二棕榈酰磷脂酰胆碱。
[0056]
根据本发明的组合物包含疏水相(例如油)在水相(例如水)中的o/w乳剂。根据本发明的乳剂可以使用一定范围的疏水相与水相的比率来形成，该比率定义为体积与体积的比率(v/v)。在一些实施方式中，疏水相与水相的比率可以是90：10、80：20、70：30、60：40、50：50、40：60、30：70、20：80或10：90。形成o/w乳剂所需的比率取决于疏水相和水相的各自组成(例如两亲化合物的存在)以及乳化剂的存在与否。普通技术人员可以通过使用本文公开的技术乳化所期望的疏水相和水相，然后通过进行如本文公开的水滴测试或油滴测试来确定乳剂是否为o/w来确定合适的比率。在能够形成o/w乳剂的比率范围内，可以进一步调整比率以实现所期望的性质，例如粘度、密度和在水中的分散速率。
[0057]
根据本发明的乳剂可以通过本领域已知的多种技术形成。例如，可以通过在器皿中混合水相和疏水相然后搅拌器皿以将疏水相作为液滴分散在水相中来形成乳剂。可以通过任何物理方式搅拌器皿，例如用涡流混合器进行涡流混合。可选地，可以通过使相反复地通过孔来形成乳剂。例如，疏水相可以放置在一个器皿中，水相可以放置在另一个器皿中，这两个器皿经由具有孔的连接器连接，施加压力以使相在器皿之间来回通过孔。在一个更具体的实例中，疏水相被放置在第一注射器中，水相被放置在第二注射器中，两个注射器通过连接器连接，并且向注射器施加交替压力以使相反复地通过连接器。选择注射器应基于所期望的乳剂体积(例如体积为0.5ml、1ml、2ml、5ml或更大的注射器)及其附接到连接器(例如鲁尔锁(luer lock)注射器或螺纹注射器)的能力。用于连接注射器的合适连接器包括但不限于鲁尔至鲁尔(luer-to-luer)连接器、鲁尔至螺纹(luer-to-threaded)连接器、螺纹连接器、三通旋塞和vygon
tm
连接器/适配器。
[0058]
疏水相
[0059]
根据本发明的o/w乳剂包含不连续的疏水相。疏水相在水相中是不混溶的。疏水相通过在水相中形成液滴的分散体而在水相中形成乳剂。可以使用本文公开的技术将疏水相分散在水相中以形成乳剂。如本文所用，“疏水相”是指包含一种或多种疏水物质和至少一种试剂(疏水相试剂)的混合物。疏水相可以进一步包含其他成分，包括但不限于本文所述的脂质、胆固醇、聚合物、糖苷、纤维素、缓冲盐、冷冻保护剂、表面活性剂和乳化剂。
[0060]
疏水物质
[0061]
疏水相可包含基本上纯的疏水物质或疏水物质的混合物。可用于疏水相的疏水物质是药学上可接受的那些。疏水物质在室温下(例如约18-25℃)通常是液体，但在室温下不是液体的某些疏水物质可以液化，例如通过加热，并且也可能是有用的。
[0062]
油或油的混合物是用于形成疏水相的具体合适的疏水物质。油应该是药学上可接受的。合适的油包括例如矿物油(尤其是轻质或低粘度矿物油，例如6vr)、植物油(例如大豆油、葵花油、玉米油)、坚果油(例如花生油、蓖麻油、椰子油)或其混合物。因此，在一个实施方式中，疏水物质是植物油、坚果油或矿物油。也可以使用动物脂肪和人工疏水聚合物材料，具体是在大气温度下为液体或相对容易液化的那些。
[0063]
在一些实施方式中，疏水物质是不完全弗氏佐剂(incomplete freund’s adjuvant)(ifa)或改良弗氏佐剂(modified freund’s adjuvant)(mfa)，一种基于矿物油的疏水运载体。在另一个实施方式中，疏水物质是矿物油中的二缩甘露醇油酸酯，例如可商购的montanide
tm isa 51(seppic,france)。montanide
tm isa 51是高纯度矿物油(
6vr)和二缩甘露醇单油酸酯的混合物，当与水相以1:1的比率混合时，形成油包水(w/o)乳剂(van doorn 2016)。在另一个实施方式中，疏水物质是在非矿物油中的二缩甘露醇油酸酯，例如可商购的montanide
tm isa 720(seppic，france)。在另一个实施方式中，疏水相是ms80油，它是矿物油(sigma aldrich)和脱水山梨醇单油酸酯(例如spantm 80)(fluka)的混合物，其组分可以单独购买并在使用前混合。
[0064]
疏水物质可以包括油与一种或多种脂质的混合物。术语“脂质”在本领域中具有其共同含义，因为它是任何可溶于非极性溶剂，但通常不溶于极性溶剂(例如水)的有机物质或化合物。脂质是一组不同的化合物，其包括但不限于脂肪、蜡、甾醇、脂溶性维生素、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯和磷脂。脂质可以是成膜脂质。“成膜脂质”是指脂质单独或与其他脂质和/或稳定分子一起能够形成脂质膜。脂质膜可以形成封闭的脂质囊泡或任何其他结构，例如脂质片。脂质可能是两亲性的。“两亲性脂质”是指脂质同时具有亲水性和疏水性(亲脂性)性质。两亲性脂质可充当乳化剂。具体合适的脂质可包括具有含有至少4个碳，通常约4至28个碳的至少一个脂肪酸链的那些脂质。脂肪酸链可以含有任何数量的饱和和/或不饱和键。脂质可以是天然脂质或合成脂质。脂质的非限制性实例可包括磷脂、鞘脂、鞘磷脂、脑苷脂类(cerobocides)、神经节苷脂、醚脂质、甾醇、心磷脂、阳离子脂质和用聚(乙二醇)和其他聚合物改性的脂质。合成脂质可包括但不限于以下脂肪酸成分：月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、花生酰基(arachidoyl)、油酰基、亚油酰基、芥酰基(erucoyl)或这些脂肪酸的组合。
[0065]
在一些实施方式中，脂质是磷脂或磷脂混合物。从广义上讲，“磷脂”是在水解磷酸、醇、脂肪酸和含氮碱基时产生的一组脂质化合物中的成员。可以使用的磷脂包括，例如但不限于，具有至少一个选自磷酸甘油、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸、磷酸胆碱(例如dopc；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱)(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)和磷酸肌醇(phosphoinositol)的头基的那些磷脂。在一个实施方式中，磷脂可以是磷脂酰胆碱或包含磷脂酰胆碱的脂质的混合物。在一个实施方式中，脂质可以是dopc(lipoid gmbh,germany)或lipoid s100卵磷脂。另一种常见的磷脂是鞘磷脂。鞘磷脂含有鞘氨醇，一种具有长不饱和烃链的氨基醇。脂肪酰基侧链通过酰胺键与鞘氨醇的氨基连接，以形成神经酰胺。鞘氨醇的羟基基团被酯化为磷酸胆碱。像磷酸甘油酯一样，鞘磷脂是两亲性的。也可以使用卵磷脂，它是磷脂的天然混合物，通常源自鸡蛋、羊毛、大豆和其他植物来源。在本发明的实践中可以使用所有这些和其他磷脂。磷脂可以例如从avanti脂质(alabastar,al,usa)、lipoid llc(newark,nj,usa)和lipoid gmbh(germany)以及多个其他供应商处购买。成膜脂质、两亲性脂质和磷脂可用于疏水相中以增强试剂在疏水相中的溶解性或悬浮。
[0066]
在一些实施方式中，脂质和胆固醇的混合物与疏水物质混合以形成疏水相。在一些实施方式中，将dopc和未酯化胆固醇的混合物与疏水物质混合以形成疏水相。在其他实施方式中，将lipoid s100卵磷脂和未酯化胆固醇的混合物与疏水物质混合以形成疏水相。在一些实施方式中，胆固醇的使用量等于磷脂重量的约10％(例如，dopc：胆固醇比率为10:1w/w)。胆固醇可以稳定磷脂囊泡颗粒的形成。
[0067]
在一些实施方式中，疏水相包含dopc和胆固醇的混合物，其被冻干并然后在矿物油、矿物油中的二缩甘露醇油酸酯(例如montanide
tm isa 51)或ms80油中重构。在一些实施方式中，疏水相包含至少一种疏水相试剂、dopc和胆固醇的混合物，其被冻干并然后在矿物
油、在矿物油中的二缩甘露醇油酸酯(例如montanide
tm isa 51)或ms80油中重构。
[0068]
基于脂质的结构
[0069]
在包含脂质的疏水相中，可以形成多种基于脂质的结构，并且本文公开的疏水相可以包含单一类型的基于脂质的结构或包含不同类型的基于脂质的结构的混合物。基于脂质的结构可以是脂质囊泡颗粒。
[0070]
在一个实施方式中，基于脂质的结构可以是封闭的囊状结构。它们的形状通常为球形或基本上球形，但也可以形成并且不排除其他形状和构型。“基本上球形”是指基于脂质的结构接近球形，但可能不是完美的球形。封闭的囊状结构的其他形状包括但不限于椭圆形、长圆形(oblong)、正方形、矩形、三角形、长方体、新月形、菱形、圆柱或半球形状。可以形成任何规则或不规则的形状。封闭的囊状结构的示例性实施方式包括但不限于单层囊状结构(例如胶束或反胶束)和双层囊状结构(例如单层或多层囊泡)或其多种组合。
[0071]“单层”是指脂质不形成双层，而是保留在一层中，其中疏水部分定向在一侧，亲水部分定向在另一侧。“双层”是指脂质形成两层片，例如每一层的疏水部分在内部定向朝向双层的中心，而亲水部分在外部定向。预计在疏水物质中形成相反的配置，即每一层的亲水部分在内部定向朝向双层的中心，而疏水部分在外部定向。术语“多层”旨在涵盖单层和双层结构的任何组合。采用的形式可能取决于所使用的具体脂质，以及组合物是否无水。
[0072]
封闭的囊状结构可以由单层脂质膜、双层脂质膜和/或多层脂质膜形成。脂质膜主要由脂质组成并由脂质形成，但也可包含另外组分。例如但不限于，脂质膜可以包括稳定分子以帮助维持结构的完整性。可以使用任何可用的稳定分子。
[0073]
在一个实施方式中，一种或多种基于脂质的结构由单层脂质组装体组成。可以形成多种类型的这些基于脂质的结构，并且本文公开的疏水相可以包括具有单层脂质组装体的单一类型的基于脂质的结构或包括不同的这种基于脂质的结构的混合物。
[0074]
在一个实施方式中，具有单层脂质组装体的基于脂质的结构部分或完全围绕疏水相试剂。例如，基于脂质的结构可以是围绕疏水相试剂的封闭的囊状结构。在一个实施方式中，囊状结构中脂质的疏水部分朝向疏水物质向外定向。
[0075]
作为另一个实例，具有单层脂质组装体的一种或多种基于脂质的结构可以包含脂质的聚集体，其中脂质的疏水部分朝向疏水物质向外定向，并且脂质的亲水部分作为核心聚集或围绕疏水相试剂。这些结构不一定形成连续的脂质层膜。在一个实施方式中，它们是单体脂质的聚集体。
[0076]
在一个实施方式中，具有单层脂质组装体的一种或多种基于脂质的结构包含反胶束。疏水物质中的典型胶束形成逆/反胶束，其中疏水部分与周围的疏水物质接触，将亲水部分隔绝在胶束中心。反胶束可以在其核心(即内部环境)内包装具有亲水亲和力的疏水相试剂。
[0077]
非限制性地，具有单层脂质组装体的基于脂质的结构的大小为直径在2nm(20a)至20nm(200a)的范围内。在一个实施方式中，具有单层脂质组装体的基于脂质的结构的大小为直径在约2nm至约10nm之间。在一个实施方式中，具有单层脂质组装体的基于脂质的结构的大小为直径在约2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、约7nm、约8nm、约9nm或约10nm。在一个实施方式中，基于脂质的结构的最大直径为约4nm或约6nm。在一个实施方式中，这些大小的基于脂质的结构是反胶束。
[0078]
在一个实施方式中，一种或多种疏水相试剂在溶解在疏水物质中之后位于基于脂质的结构内。“在基于脂质的结构内”是指疏水相试剂基本上被脂质包围，使得疏水相试剂的亲水组分不暴露于疏水物质。在一个实施方式中，基于脂质的结构内的疏水相试剂主要是亲水性的。
[0079]
在一个实施方式中，一种或多种疏水相试剂在溶解在疏水物质中之后位于基于脂质的结构外。“在基于脂质的结构外”是指疏水相试剂不隔绝在脂质膜或组装体内部的环境中。在一个实施方式中，基于脂质的结构外的疏水相试剂主要是疏水性的。
[0080]
制备疏水相
[0081]
疏水相可由溶解或悬浮在疏水物质中的至少一种疏水相试剂组成。在其中至少一种疏水相试剂是疏水性的一些实施方式中，试剂可以简单地与疏水物质混合以形成溶液。在其中至少一种疏水相试剂是亲水性的一些实施方式中，试剂可以用有机溶剂和/或脂质溶解或悬浮在疏水物质中。例如，至少一种疏水相试剂可以在与疏水物质混合之前与溶解在有机溶剂中的脂质混合。在另一个实例中，可以将至少一种疏水相试剂与溶解在有机溶剂中的脂质混合，通过冻干，然后在疏水物质中重构。
[0082]
疏水相可以由在疏水物质中重构的组合物组成，其中组合物包含在疏水物质中的一种或多种抗原和/或一种或多种佐剂的混合物，其目的用于活化免疫应答。组合物可以进一步包含脂质和/或胆固醇以稳定一种或多种抗原和/或一种或多种佐剂，以促进它们在疏水物质中的溶解/悬浮、和/或促进它们被免疫细胞吸收。组合物中的脂质和/或胆固醇可以形成如本文所述的脂质结构以促进一种或多种抗原和/或一种或多种佐剂在疏水物质中的溶解性和/或悬浮。优选地，组合物可溶于疏水物质或容易悬浮在疏水物质中。在一些实施方式中，根据本发明用作o/w乳剂中的疏水相的组合物包含一种或多种抗原、一种或多种佐剂、一种或多种脂质和胆固醇的干燥混合物，然后在疏水物质或疏水运载体中重构以形成疏水相。此类组合物和制备它们的方法已在wo/2009/146523和wo/2013/049941中描述。
[0083]
疏水相可以由在疏水物质中重构的组合物组成，其中组合物包含在疏水物质中的一种或多种药物、治疗剂或免疫调节剂。组合物可进一步包含脂质和/或胆固醇以稳定一种或多种试剂和/或促进其在疏水物质中的溶解/悬浮。组合物中的脂质和/或胆固醇可以形成如本文所述的脂质结构以促进一种或多种试剂在疏水物质中的溶解性和/或悬浮。优选地，组合物可溶于疏水物质或容易悬浮在疏水物质中。在一些实施方式中，根据本发明的用作o/w乳剂中的疏水相的组合物包含一种或多种疏水相试剂、一种或多种脂质和胆固醇的干燥混合物，然后在疏水物质或疏水运载体中重构以形成疏水相。此类组合物及其制备方法已在pct/ca2019/050328中描述。
[0084]
在一些实施方式中，疏水相是包含至少一种疏水相试剂、脂质和胆固醇的在疏水物质中重构的组合物。为了在这些实施方式中制备疏水相，脂质制品通过在合适的溶剂中轻轻摇动溶解或水合脂质或脂质混合物来制备。然后可以将至少一种疏水相试剂，直接(例如添加干燥的疏水相试剂)或者通过首先制备溶解在合适溶剂中的至少一种疏水相试剂的储备液二者之一，添加到脂质制品中。通常，将至少一种疏水相试剂添加到脂质制品中或与脂质制品组合，同时轻轻摇动。然后将疏水试剂/脂质组合物干燥以形成干燥的组合物，并且将干燥的组合物在疏水物质中重构。“合适的溶剂”是能够溶解相应组分(例如脂质、疏水相试剂或两者)的溶剂，并且可以由普通技术人员确定。对于至少一种疏水相试剂，合适的
溶剂可以是例如磷酸钠溶液、醋酸钠溶液、氢氧化钠溶液、二甲亚砜(dmso)或水。普通技术人员可以根据要使用的疏水相试剂确定其他合适的溶剂。对于脂质，合适的溶剂可以是例如极性质子溶剂，例如醇(例如叔丁醇、正丁醇、异丙醇、正丙醇、乙醇或甲醇)、水、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、甲酸或氯仿。在一个实施方式中，合适的溶剂是40％的叔丁醇。普通技术人员可以根据要使用的脂质确定其他合适的溶剂。
[0085]
在另一个实施方式中，为了制备疏水相，可以通过在室温下以300rpm摇动直至溶解，将含有比率为10:1(w:w)的dopc和胆固醇(lipoid gmbh,germany)的脂质混合物溶解在40％叔丁醇中。可以在dmso或水中制备至少一种疏水相试剂的储备液，并在与溶解的脂质混合物混合之前用40％叔丁醇稀释。然后可以在以300rpm摇动约5分钟将疏水相试剂储备液添加到溶解的脂质混合物中以制备组合物。然后可以将组合物冷冻干燥以产生干燥的组合物用于储存，随后用疏水物质重构以产生疏水相。任选地，组合物可以与冷冻保护剂/填充剂一起冷冻干燥。可以使用的冷冻保护剂/填充剂包括但不限于糖/多糖，例如海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、麦芽糖、棉子糖、麦芽糊精、支链淀粉、菊粉、聚蔗糖、羧甲基纤维素和羟乙基淀粉；氨基酸，例如精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；牛血清白蛋白；缓冲盐，例如醋酸钠、磷酸钠、tris hcl、hepes、碳酸钠、柠檬酸钠、tris醋酸；和聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羟丙基-β-环糊精、聚丙烯酰胺和然后可以将干燥的组合物在疏水物质例如isa 51vg(seppic,france)中重构以获得澄清溶液。通常，将干燥的组合物储存(例如在-20℃下)直到施用时，此时干燥的组合物在疏水物质中重构以产生用于形成如本文所述的乳剂组合物的疏水相。
[0086]
在另一个实施方式中，为了制备疏水相，将至少一种疏水相试剂溶解在具有s100脂质和胆固醇(lipoid,germany)的磷酸钠缓冲液中。然后将这些组分冻干以形成干燥的组合物。在使用之前，将干燥的组合物在isa51 vg油(seppic,france)中重构以制备用于制备如本文所述的乳剂组合物的疏水相。
[0087]
在另一个实施方式中，为了制备疏水相，将至少一种疏水相试剂溶解在具有dopc和胆固醇(lipoid,germany)的磷酸钠缓冲液中。然后将这些组分冻干以形成干燥的组合物。在使用之前，将干燥的组合物在isa51 vg油(seppic,france)中重构以制备用于制备如本文所述的乳剂组合物的疏水相。
[0088]
在一些实施方式中，疏水相由使用定制大小的脂质囊泡颗粒形成的组合物制备。制备此类组合物的方法已在wo/2019/090411和wo/2019/010560中描述。如本文所用，术语“脂质囊泡颗粒”可以与“脂质囊泡”互换使用并且指如本文所述的基于脂质的结构。
[0089]
在一些实施方式中，疏水相由使用定制大小的脂质囊泡颗粒形成的冷冻干燥的组合物制备，其中：(a)提供了平均颗粒大小≤120nm和多分散性指数(pdi)≤0.1的脂质囊泡颗粒；(b)将脂质囊泡颗粒与至少一种溶解的疏水相试剂混合以形成混合物；和(c)将混合物干燥以形成干燥的组合物。
[0090]
在一些实施方式中，疏水相由使用定制大小的脂质囊泡颗粒形成的干燥组合物制备，其中：(a)脂质囊泡颗粒制品包含脂质囊泡颗粒和至少一种溶解的疏水相试剂；(b)将脂质囊泡颗粒制品定制大小以形成包含定制大小的脂质囊泡颗粒和至少一种溶解的疏水相试剂的定制大小的脂质囊泡颗粒制品，其中定制大小的脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小≤120nm，并且多分散性指数(pdi)≤0.1；和(c)将混合物干燥以形成干燥的组合物。
[0091]
在一些实施方式中，疏水相由使用定制大小的脂质囊泡颗粒形成的干燥的组合物制备，其中：(a)脂质囊泡颗粒制品包含脂质囊泡颗粒和至少一种溶解的第一疏水相试剂；(b)将脂质囊泡颗粒制品定制大小以形成包含定制大小的脂质囊泡颗粒和至少一种溶解的第一疏水相试剂的定制大小的脂质囊泡颗粒制品，其中定制大小的脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小≤120nm，并且多分散性指数(pdi)≤0.1；(c)将定制大小的脂质囊泡制品与至少一种第二疏水相试剂混合，其中至少一种第二疏水相试剂溶解在混合物中；和(d)将混合物干燥以形成干燥的组合物。
[0092]
在疏水相由使用定制大小的脂质囊泡颗粒形成的组合物制备的实施方式中，“溶解的疏水相试剂”是指将至少一种疏水相试剂溶解在溶剂中。用于制备脂质囊泡颗粒/疏水相试剂混合物的溶剂必须不仅适用于在含水环境中用脂质溶解至少一种疏水相试剂，而且还必须适用于形成干燥的脂质/疏水相试剂组合物，该组合物与疏水物质相容(例如任何盐和/或非挥发性溶剂应优选与疏水物质相容)。可用于溶解至少一种疏水相试剂的示例性溶剂包括两性离子溶剂。两性离子溶剂的非限制性实例包括hepes(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、mops(3-(n-吗啉代)丙磺酸)和mes(2-(n-吗啉代)乙磺酸)。用于溶解至少一种疏水相试剂的进一步的示例性溶剂是盐水溶液。盐在溶解疏水相试剂中提供有用的性质，并且还认识到某些盐为干燥的脂质/疏水相试剂组合物提供稳定性。这种溶剂的非限制性实例包括醋酸钠、磷酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钾、磷酸钾、碳酸钾和碳酸氢钾。在一个实施方式中，溶剂是醋酸钠水溶液。在一个实施方式中，醋酸钠可以是具有6.0-10.5范围内的ph的25-250mm的醋酸钠。在一个实施方式中，溶剂是磷酸钠水溶液。在一个实施方式中，磷酸钠可以是具有6.0-8.0范围中的ph的25-250mm的磷酸钠。取决于至少一种疏水试剂的特性，最初将至少一种疏水相试剂溶解在温和/弱酸性溶剂(例如对于碱性试剂)或温和/弱碱性溶剂(例如对于酸性试剂)中可能是有利的。可以使用的示例性酸性溶剂包括但不限于盐酸、醋酸。可以使用的示例性碱性溶剂包括但不限于氢氧化钠、碳酸氢钠、醋酸钠和碳酸钠。对于中性疏水相试剂，示例性溶剂可以是二甲亚砜(dmso)。在一个实施方式中，一种或多种疏水相试剂最初溶解在温和/弱碱性溶剂中。在一个实施方式中，至少一种疏水相试剂最初溶解在50-250mm氢氧化钠中。基于本公开内容，本领域技术人员还可鉴别表现出与本文所述的那些相似特性的可使用的其他溶剂。
[0093]
在疏水相由使用定制大小的脂质囊泡颗粒形成的组合物制备的实施方式中，定制大小的脂质囊泡颗粒通过定制非定制大小的脂质囊泡颗粒的大小来制备。为了提供非定制大小的脂质囊泡颗粒制品，可以将干粉形式的脂质添加到含有至少一种溶解的疏水相试剂的溶液中。在这样的实施方式中，在至少一种疏水相试剂存在下形成非定制大小的脂质囊泡颗粒以提供非定制大小的脂质囊泡颗粒制品。在另一个实施方式中，可以将干粉形式的脂质与一种或多种干燥的疏水相试剂组合，并且可以将干燥的组合物一起溶解在合适的溶剂中。这些实施方式可以通过摇动和/或混合进行(例如以300rpm持续约1小时)。在另一个实施方式中，为了提供非定制大小的脂质囊泡颗粒制品，可以首先将脂质在有机溶剂中溶解并混合。在使用不同类型脂质的实施方式中，该步骤将允许形成脂质的均匀混合物。在一个实施方式中，这些步骤可以在氯仿、氯仿:甲醇混合物、叔丁醇或环己烷中进行。在一个实施方式中，脂质以10-20mg脂质/ml有机溶剂制备；然而，也可以使用更高或更低的浓度。在混合后，除去有机溶剂(例如通过蒸发)以产生脂质膜。然后可以将脂质膜冷冻并冻干以产
生干燥的脂质膜。然后可以用含有至少一种溶解的疏水相试剂的水溶液使干燥的脂质膜水合，以提供非定制大小的脂质囊泡制品。水合步骤可以通过摇动和/或混合(例如以300rpm持续约1小时)来进行。在仍另一个实施方式中，为了提供非定制大小的脂质囊泡颗粒制品，可以将脂质水溶液与含有至少一种溶解的疏水相试剂的溶液组合。在另一个实施方式中，可以将一种或多种干燥的疏水相试剂添加到并溶解在脂质水溶液中以提供非定制大小的脂质囊泡制品。这些实施方式可以通过摇动和/或混合(例如以300rpm持续约1小时)来进行。可以使用本领域已知的多种方法来干燥定制大小的脂质囊泡颗粒制品。在一个实施方式中，干燥通过冻干、喷雾冷冻干燥或喷雾干燥进行。普通技术人员熟知这些干燥技术以及它们可以如何进行。
[0094]
在其中疏水相由使用定制大小的脂质囊泡颗粒形成的组合物制备的实施方式中，可以采用用于制备任何大小的脂质囊泡颗粒的标准程序。例如，可以使用常规的脂质体形成方法，例如溶剂溶解的脂质的水合。制备脂质体的示例性方法在例如gregoriadis 1990和frezard1999中进行了讨论。制备脂质囊泡颗粒后，对非定制大小的脂质囊泡颗粒制品进行定制大小程序以获得平均颗粒大小≤120nm和pdi≤0.1的脂质囊泡颗粒。有多种技术可用于定制脂质囊泡颗粒的大小(参见例如akbarzadeh 2013)。例如，在一个实施方式中，可以通过高压均质化(高压微射流均质机(microfluidizers))、超声处理或基于膜的挤出来对非定制大小的脂质囊泡颗粒制品进行定制大小。例如，可通过将脂质加入合适的溶剂(例如磷酸钠，50mm，ph 7.0)、摇动和/或搅拌脂质混合物(例如，以300rpm约1小时)和使用基于膜的挤出来获得定制大小的脂质囊泡颗粒，以制备定制大小的脂质囊泡颗粒。
[0095]
在疏水相由使用定制大小的脂质囊泡颗粒形成的组合物制备的实施方式中，使用脂质囊泡颗粒的基于膜的挤出进行脂质囊泡颗粒的定制大小以获得平均颗粒大小为≤120nm和pdi≤0.1的定制大小的脂质囊泡颗粒。基于膜的挤出的示例性、非限制性实施方式包括使非定制大小的脂质囊泡颗粒制品通过0.2μm聚碳酸酯膜，然后通过0.1μm聚碳酸酯膜，然后任选地通过0.08μm聚碳酸酯膜。示例性的、非限制性方案可以包括：(i)使非定制大小的脂质囊泡颗粒制品通过0.2μm聚碳酸酯膜20-40次，然后通过0.1μm聚碳酸酯膜10-20次；或(ii)使非定制大小的脂质囊泡颗粒制品通过0.2μm聚碳酸酯膜20-40次，然后通过0.1μm聚碳酸酯膜10-20次，然后通过0.08μm聚碳酸酯膜10-20次。普通技术人员会很清楚可用于获得所需的≤120nm的平均颗粒大小和≤0.1的pdi的不同的膜和不同的方案。在具体实施方式中，可以通过使非定制大小的脂质囊泡颗粒制品通过0.2μm聚碳酸酯膜25次，然后通过0.1μm聚碳酸酯膜10次来进行定制大小。在另一个具体实施方式中，可以通过使非定制大小的脂质囊泡颗粒制品通过0.2μm聚碳酸酯膜25次，然后通过0.1μm聚碳酸酯膜10次，然后通过0.08μm聚碳酸酯膜15次来进行定制大小。
[0096]
在疏水相由使用定制大小的脂质囊泡颗粒形成的组合物制备的实施方式中，定制大小的脂质囊泡颗粒可以由天然形成所需大小的脂质囊泡颗粒的脂质前体制备。例如，但不限于，可使用(nippon fine chemical,japan)制备定制大小的脂质囊泡颗粒。是由不同脂质组合组成的干粉前体。已准备好在合适的缓冲液中润湿以制备脂质体。由形成的脂质体平均颗粒大小约为93nm，可使用定制大小程序(例如膜挤出、高压均质化等)以达到所需的≤120nm的平均颗粒大小和≤0.1的pdi。在一个实施方式中，可以例如在ph 9.0
±
0.5的醋酸钠中润湿以形成脂质体。在一个实
施方式中，散装干粉可以由dopc/胆固醇(10:1(w/w))或单独的dopc制成。
[0097]
如本文所用，多分散性指数(pdi)是脂质囊泡颗粒的大小分布的量度。本领域已知术语“多分散性”可以与“分散性”互换使用。pdi可以通过确定脂质囊泡颗粒的平均颗粒大小和与该大小的标准偏差来计算。有一些技术和仪器可用于测量脂质囊泡颗粒的pdi。例如，dls是一种成熟的技术，其用于测量亚微米大小范围内的颗粒大小和颗粒大小分布，现有技术可测量小于1nm的颗粒大小(ls instruments,ch；malvern instruments,uk)。
[0098]
在疏水相由使用定制大小的脂质囊泡颗粒形成的组合物制备的实施方式中，至少一种疏水相试剂在与定制大小的脂质囊泡颗粒混合之前溶解在溶剂中或至少一种疏水相试剂在与定制大小的脂质囊泡颗粒混合后溶解。在后一种实施方式中，可以将至少一种疏水相试剂作为干粉添加到含有定制大小的脂质囊泡颗粒的溶液中，或者可以将定制大小的脂质囊泡颗粒和干燥的疏水相试剂在新鲜溶剂中混合在一起。当至少一种疏水相试剂在与定制大小的脂质囊泡颗粒混合之前溶解时，在使用多于一种疏水相试剂的实施方式中，单独的疏水相试剂可以一起溶解在同一溶剂中或在不同的溶剂中彼此分开。当使用多种疏水相试剂时，一些试剂可以一起溶解，而另一些可以单独溶解。
[0099]
在一些实施方式中，本文公开的疏水相是无水的。如本文所用，“无水”是指完全或基本上无水，即疏水相本身不是乳剂。“完全无水”是指疏水相根本不含水。相反，术语“基本上无水”旨在涵盖疏水相仍可包含少量水的实施方式。例如，疏水相的单个组分(例如本文所述的脂质和/或试剂)可能具有少量结合的水，这些结合的水可能无法通过例如冻干或蒸发的方法完全去除，并且某些疏水物质可能含有少量溶解于其中的水。通常，本文公开的“基本上无水”的组合物含有例如以基于组合物的运载体组分的总重量的重量/重量，少于约5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％的水。
[0100]
疏水相可进一步包括一种或多种乳化剂，例如表面活性剂。在疏水相中，表面活性剂可用于帮助稳定疏水相中的基于脂质的结构和/或疏水相试剂。例如，表面活性剂的使用可以通过降低表面张力来促进疏水相试剂的更均匀分布。在一个实施方式中，当疏水相含有几种不同的疏水相试剂(例如五种或更多种不同的肽抗原)或相对高浓度的疏水相试剂(例如≥5mg/mg试剂总量)时，可以使用表面活性剂。表面活性剂可以是两亲性的，因此，表面活性剂可以包括广泛范围的化合物。可以使用的表面活性剂的实例包括聚山梨醇酯(其是源自聚乙二醇化山梨醇的油性液体)和脱水山梨醇酯。聚山梨醇酯可以包括例如脱水山梨醇单油酸酯。典型的表面活性剂是本领域众所周知的，包括但不限于二缩甘露醇油酸酯(arlacel
tm
a)、卵磷脂、tweens
tm
20和80(聚山梨醇酯20和80)，以及spans
tm 20、80、83和85(脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇倍半油酸酯和山梨糖醇三油酸酯)。在一个实施方式中，用于疏水相的表面活性剂可以是二缩甘露醇油酸酯。在一个实施方式中，用于疏水相的表面活性剂可以是脱水山梨醇单油酸酯(span
tm 80)。
[0101]
表面活性剂通常与一种或多种用于形成疏水相的疏水物质预混合。在一些实施方式中，可以使用已经包含表面活性剂的疏水物质。例如，montanide
tm isa 51的疏水物质已经含有表面活性剂二缩甘露醇油酸酯。在其他实施方式中，疏水物质可以在与疏水相的其他组分组合之前与表面活性剂混合。
[0102]
水相
[0103]
根据本发明的o/w乳剂包含连续水相。水相与疏水相不混溶。水相形成包含疏水相
液滴在水相中的分散体的乳剂。疏水相可以使用本文公开的技术分散在水相中以形成乳剂，并且可以进一步使用乳化剂分散。如本文所用，“水相”是指包含水和/或一种或多种水溶液和至少一种试剂(水相试剂)的混合物。水相可进一步包含其他成分，其包括但不限于有机溶剂、乳化剂、表面活性剂、脂质、聚合物、糖、缓冲盐和两亲性物质。
[0104]
水相由水或水溶液组成。如本文所用，术语“水溶液”是指其中溶剂为水或其中水为主要溶剂的溶液。水相可由水、无菌水、去离子水、水溶液或其组合组成。在一些实施方式中，水相包括水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水(pbs)；葡萄糖溶液；生理盐水；或缓冲溶液，其含有醋酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、乙酸钾、磷酸钾、碳酸钾、碳酸钙、碳酸氢钾、hepes(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、mops(3-(n-吗啉代)丙磺酸)、mes(2-(n-吗啉代)乙磺酸)、牛血清白蛋白、糖醇和/或聚乙二醇。
[0105]
在一些实施方式中，水相可进一步包括如本文所述的多种乳化剂的一种。将乳化剂添加到水相中(在与疏水相混合之前)。在一个实施方式中，水相包含聚山梨醇酯20(例如tween
tm 20)和/或聚山梨醇酯80(例如tween
tm 80)作为乳化剂。在一个实施方式中，水相包含浓度为按重量计0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％或更多的聚山梨醇酯20(例如tween
tm 20)和/或聚山梨醇酯80(例如tween
tm 80)。在一个实施方式中，水相包含按重量计0.25％或0.5％的聚山梨醇酯(例如tween
tm 20)。在另一个实施方式中，水相包含按重量计0.25％或0.5％的聚山梨醇酯80(例如tween
tm 80)。
[0106]
在一些实施方式中，水相可包含一种或多种有机溶剂。有机溶剂可包含在水相中以促进一种或多种水相试剂的溶解性，所述水相试剂是疏水性的或以其他方式难溶于水溶液中。例如，可以将一种或多种水相试剂溶解在有机溶剂中，然后将含有一种或多种水相试剂的有机溶剂与更大体积的水和/或水溶液混合以形成水相。
[0107]
在包含脂质的水相中，可以形成多种基于脂质的结构，并且本文公开的水相可以包含单一类型的基于脂质的结构或包含不同类型的基于脂质的结构的混合物。在一些实施方式中，水相包含脂质和/或基于脂质的结构，以促进一种或多种水相试剂在水相中的溶解/悬浮。
[0108]
在一个实施方式中，基于脂质的结构是双层囊状结构，例如脂质体。脂质体是完全封闭的脂质双层膜。脂质体可以是单层囊泡(具有单个双层膜)、多层囊泡(特征在于多膜双层，其中每个双层可以或可以不通过水层与下一层分开)或多囊囊泡(在囊泡内具有一个或多个囊泡)。水相试剂可以包含在脂质体的内部环境中或脂质体的双层内以促进其在水相中的溶解/悬浮。脂质体的一般性讨论可以在gregoriadis 1990；和frezard 1999中找到。
[0109]
在一个实施方式中，基于脂质的结构是单层脂质组装体。可以形成多种类型的这些基于脂质的结构，并且本文公开的水相可以包括具有单层脂质组装体的单一类型的基于脂质的结构或包括不同的这类基于脂质的结构的混合物。在一个实施方式中，具有单层脂质组装体的基于脂质的结构部分或完全围绕水相试剂。例如，基于脂质的结构可以是围绕水相试剂的封闭的囊状结构。在一个实施方式中，囊状结构中脂质的亲水部分朝向水相向外定向。
[0110]
在一个实施方式中，具有单层脂质组装体的一种或多种基于脂质的结构包含胶束。水溶液中的典型胶束形成如此胶束，其中亲水部分与周围的水溶液接触，将疏水部分隔绝在胶束中心。胶束可以在其核心(即内部环境)内包装具有力的水相试剂。
[0111]
在一些实施方式中，水相可包含至少一种水相试剂的干燥的制品，其重悬浮于水或水溶液中。在一些实施方式中，水相可包含至少一种水相试剂、脂质和胆固醇的干燥的组合物，其重悬浮于水或水溶液中。
[0112]
试剂
[0113]
根据本发明的组合物用于将至少两种试剂递送至受试者；至少一种试剂在组合物的疏水相中(疏水相试剂)和至少一种试剂在组合物的水相中(水相试剂)。
[0114]
如本文所用，“疏水相试剂”是指溶解或悬浮在乳剂的疏水相中的试剂。疏水相试剂本身可以是疏水性的(即亲脂的)，在这种情况下疏水相试剂可以溶于疏水物质中。疏水性的疏水相试剂可以在不使用脂质、乳化剂或两亲性物质的情况下溶解或悬浮在疏水物质中。通过将所述试剂与疏水物质混合，可以将疏水性的疏水相试剂并入疏水相中。可选地，疏水相试剂可以是亲水性的(即疏脂的)，在这种情况下疏水相试剂将不溶于疏水物质。亲水性的疏水相试剂可能需要使用脂质、乳化剂或两亲性物质以将所述试剂溶解或悬浮在疏水物质中。作为非限制性实例，一种或多种亲水性的疏水相试剂可以在有机溶剂中与磷脂和胆固醇混合，然后将混合物冻干，然后将冻干的混合物与疏水物质混合，使得磷脂和胆固醇形成本文所述的基于脂质的结构，其促进试剂在疏水物质中的悬浮。
[0115]
如本文所用，“水相试剂”是指溶解或悬浮在乳剂的水相中的试剂。水相试剂可以是亲水性的(即疏脂的)，在这种情况下，水相试剂可以溶于水或水溶液中。亲水性的水相试剂可以不使用脂质、乳化剂或两亲性物质而溶解或悬浮在水或水溶液中。亲水性的水相试剂可以通过将所述试剂与水或水溶液混合而并入水相中。可选地，水相试剂可以是疏水性的(即亲脂的)，在这种情况下，水相试剂将不溶于水或水溶液。疏水性的水相试剂可能需要使用脂质、乳化剂、有机溶剂或两亲性物质以将所述试剂溶解或悬浮在水溶液中。作为非限制性实例，一种或多种疏水性的水相试剂可以与含有磷脂和胆固醇的水溶液混合，并且搅拌溶液以形成如本文所述的基于脂质的结构，使得基于脂质的结构隐藏水相试剂的疏水区域并促进试剂在水溶液中的悬浮。可选地，可以将一种或多种疏水性的水相试剂溶解在有机溶剂中，例如dmso、乙醇、叔丁醇、dmf或聚乙二醇，然后可以将含有一种或多种水相试剂的有机溶剂与水和/或水溶液混合以形成水相。
[0116]
一些试剂可能是两亲性的，这意味着它们同时具有极性或亲水区域和非极性或疏水区域，使它们能够与疏水相和水相二者相互作用。因此，两亲性试剂可以溶解或悬浮在疏水相或水相中。完全包含在根据本发明的乳剂的疏水相中的两亲性试剂是疏水相试剂。完全包含在根据本发明的乳剂的水相中的两亲性试剂是水相试剂。
[0117]
术语“试剂”包括旨在递送至受试者的任何物质、药物、分子、元素、化合物或其组合。如果试剂包含在组合物的疏水相中，则试剂可以作为疏水相试剂并入本发明的组合物中，或者如果试剂包含在组合物的水相中，则试剂作为水相试剂并入本发明的组合物中。试剂可以是天然产物、合成化合物或两种或更多种物质的组合。试剂可以是药学或治疗活性剂或诊断剂。试剂可能是小分子药物；抗体、抗体模拟物或其任何一种的功能性等同物或功能性片段；免疫调节剂；抗原；t辅助表位；佐剂；过敏原；dna多核苷酸；或rna多核苷酸。在本文中更详细地描述了可以在疏水相或水相中并入根据本发明的组合物的具体试剂。
[0118]
小分子药物
[0119]
在一些实施方式中，至少一种试剂是小分子药物。小分子药物可以作为疏水相试
剂和/或水相试剂并入根据本发明的组合物中。术语“小分子药物”是指可用于治疗、治愈、防止或诊断疾病、紊乱或病症的有机或无机化合物。
[0120]
如本文所用，术语“小分子”是指可以合成生产或从天然来源获得的低分子量化合物，其分子量小于2000道尔顿(da)、小于1500da、小于1000da、小于900da、小于800da、小于700da、小于600da或小于500da。
[0121]
在一个实施方式中，小分子药物具有以下之间的分子量：约100da至约2000da；100da至约1500da；约100da至约1000da；约100da至约900da；约100da至约800da；约100da至约700da；约100da至约600da；或约100da至约500da。在一个实施方式中，小分子药物的分子量为约100da、约150da、约200da、约250da、约300da、约350da、约400da、约450da、约500da、约550da、约600da、约650da、约700da、约750da、约800da、约850da、约900da、约950da、约1000da或约2000da。在一个实施方式中，小分子药物可以具有1nm量级的大小。
[0122]
在一个实施方式中，小分子药物是化学制造的活性物质或化合物(即，它不是通过生物过程产生的)。通常，这些化合物是通过不同有机和/或无机化合物之间的化学反应以经典方式合成的。如本文所用，术语“小分子药物”不包括由生物过程制成的较大结构，例如多核苷酸、蛋白质和多糖。
[0123]
在一个实施方式中，如本文所用，术语“小分子”是指选择性结合特异性生物大分子并充当效应物、改变靶标的活性或功能的化合物或分子。因此，在一个实施方式中，小分子药物是调节受试者体内，更具体地是细胞内的生物过程的物质或化合物。小分子药物可以以其施用形式发挥其活性，或者小分子药物可以是前药。在这方面，如本文所用，术语“小分子药物”包括活性形式和前药。
[0124]
术语“前药”是指在生理条件下转化为治疗活性剂的化合物或物质。在一个实施方式中，前药是在施用后在受试者体内代谢成药学活性形式(例如通过受试者体内的酶活性)的化合物或物质。制备前药的常用方法是包括选定的部分，其在生理条件下水解以显示药物活性形式。
[0125]
在一个实施方式中，非限制性地，小分子药物是细胞毒剂、抗癌剂、抗瘤剂(an anti-tumor agent)、化疗剂、抗肿瘤剂(an anti-neoplastic agent)、抗病毒剂、抗菌剂、抗炎剂、免疫调节剂(例如免疫增强剂或抑制子)、免疫应答检查点试剂、生物反应调节剂、前药、细胞因子、趋化因子、维生素、类固醇、配体、镇痛剂、放射性药物、放射性同位素或用于视觉检测的染料。
[0126]
小分子药物可以是任何本文所述的那些，或者可以是其药学上可接受的盐。如本文所用，术语“一种或多种药学上可接受的盐”是指本文所述的活性剂和/或免疫调节剂的任何盐形式，其对于向目标受试者施用是安全和有效的，并且具有所期望的生物学、药物和/或治疗活性。药学上可接受的盐包括酸性或碱性基团的盐。药学上可接受的酸加成盐可包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、醋酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐(glucaronate)、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即，1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。合适的碱盐可以包括但不限于铝、钙、锂、镁、钾、钠、锌和二乙醇胺盐。例如，可在berge,1977中找到对药学上
可接受的盐的综述。
[0127]
在一个实施方式中，小分子药物是干扰dna复制的试剂。如本文所用，表述“干扰dna复制”旨在涵盖防止、抑制或延迟拷贝(即复制)细胞dna的生物学过程的任何作用。普通技术人员将理解存在用于防止、抑制或延迟dna复制的多种机制，例如dna交联、dna甲基化、碱基取代等。本公开内容包括使用任何干扰dna复制的试剂。可以使用的此类试剂的示例性、非限制性实施方式在例如wo2014/153636和wo2017/190242中描述。在一个实施方式中，干扰dna复制的试剂是烷化剂，例如氮芥烷化剂，例如环磷酰胺。
[0128]
在一个实施方式中，小分子药物是环磷酰胺、异环磷酰胺、afosfamide、美法仑、苯达莫司汀、尿嘧啶氮芥、帕利伐米(palifosfamide)、苯丁酸氮芥、白消安、4-羟基环磷酰胺、双氯乙基亚硝基脲(bcnu)、丝裂霉素c、曲贝替定(yondelis)、甲基苄肼、达卡巴嗪、替莫唑胺、顺铂、卡铂、奥沙利铂、阿昔洛韦、吉西他滨、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、更昔洛韦、喜树碱、拓扑替康、伊立替康、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、依托泊苷、替尼泊苷、米托蒽醌或匹克生琼(pixantrone)、或其任何一种的药学上可接受的盐。
[0129]
在一个实施方式中，小分子药物是异环磷酰胺。异环磷酰胺是一种氮芥烷化剂。异环磷酰胺的iupac名称是n-3-双(2-氯乙基)-1,3,2-氧杂氮杂磷杂环己烷-2-酰胺-2-氧化物(n-3-bis(2-chloroethyl)-1,3,2-oxazaphosphinan-2-amide-2-oxide)。异环磷酰胺通常称为
[0130]
在一个实施方式中，小分子药物是帕利伐米。帕利伐米是异环磷酰胺的活性代谢物，它与氨基酸赖氨酸共价连接以保持稳定性。帕利伐米通过gc碱基对不可逆地烷基化和交联dna，导致不可修复的7原子链间交联；抑制dna复制和/或细胞死亡。帕利伐米也称为
[0131]
在一个实施方式中，小分子药物是苯达莫司汀。苯达莫司汀是另一种氮芥烷化剂。苯达莫司汀的iupac名称是4-[5-[双(2-氯乙基)氨基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]丁酸(4-[5-[bis(2-chloroethyl)amino]-1-methylbenzimidazol-2-yl]butanoic acid)，通常称为acid)，通常称为和
[0132]
在一个实施方式中，小分子药物是免疫应答检查点试剂。如本文所用，“免疫应答检查点试剂”是指完全或部分调节(例如活化或抑制)一种或多种检查点分子(例如蛋白质)的活性或功能的任何化合物或分子。检查点分子负责t细胞应答的共刺激或抑制性相互作用。检查点分子调节和维持自身耐受性以及生理免疫应答的持续时间和幅度。通常，存在两种类型的检查点分子：刺激检查点分子和抑制性检查点分子。
[0133]
刺激检查点分子在增强免疫应答中发挥作用。许多刺激检查点分子是已知的，例如但不限于：cd27、cd28、cd40、cd122、cd137、cd137/4-1bb、icos、il-10、ox40、tgfβ、tor受体和糖皮质激素诱导的tnfr-相关蛋白gitr。在一个实施方式中，小分子药物是一种或多种刺激检查点分子的激动剂或拮抗剂。在一个实施方式中，小分子药物是一种或多种刺激检查点分子的激动剂或超激动剂。普通技术人员将非常了解可用于调节刺激检查点分子的小分子药物。
[0134]
抑制性检查点分子在减少或阻断免疫应答中发挥作用(例如负反馈回路)。许多抑制性检查点蛋白质是已知的，例如ctla-4及其配体cd80和cd86；pd-1及其配体pd-l1和pd-l2。其他抑制性检查点分子包括但不限于腺苷a2a受体(a2ar)；b7-h3(cd276)；b7-h4
(vtcn1)；btla(cd272)；杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)；淋巴细胞活化基因-3(lag3)；t细胞活化v结构域ig抑制子(vista)、t细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(tim-3)；和吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)，以及它们的配体和/或受体。在一个实施方式中，小分子药物是一种或多种抑制性检查点分子的激动剂或拮抗剂。在一个实施方式中，小分子药物是一种或多种抑制性检查点分子的拮抗剂(即抑制剂)。普通技术人员将非常了解可用于调节抑制性检查点分子的小分子药物。
[0135]
在一个实施方式中，小分子药物是免疫应答检查点试剂，它是以下的抑制剂：程序性死亡配体1(pd-l1——也称为b7-h1、cd274)、程序性死亡1(pd-1、cd279)、ctla-4(cd154)、pd-l2(b7-dc、cd273)、lag3(cd223)、tim3(havcr2、cd366)、41bb(cd137)、2b4、a2ar、b7h1、b7h3、b7h4、b-和t-淋巴细胞衰减因子(btla)、cd2、cd27、cd28、cd30、cd33、cd40、cd70、cd80、cd86、cd160、cd226、cd276、dr3、gal9、gitr、hvem、ido1、ido2、icos(诱导型t细胞共刺激因子)、杀伤细胞抑制性受体(kir)、lag-3、lair1、light、marco(具有胶原结构的巨噬细胞受体)、磷脂酰丝氨酸(ps)、ox-40、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(siglec)5、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素7、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素9、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素11、slam、tigit、tim3、tnf-α、vista、vtcn1或其任意组合。
[0136]
在一个实施方式中，小分子药物可以是艾卡哚司他(epacadostat)、雷帕霉素、多柔比星、丙戊酸、米托蒽醌、伏立诺他、环磷酰胺、伊立替康、顺铂、甲氨蝶呤、他克莫司或其任何一种的药学上可接受的盐。
[0137]
在一个实施方式中，小分子药物是环磷酰胺或其药学上可接受的盐。环磷酰胺(n,n-双(2-氯乙基)-1,3,2-氧杂氮杂磷杂环己烷-2-胺2-氧化物)(n,n-bis(2-chloroethyl)-1,3,2-oxazaphosphinan-2-amine 2-oxide)。环磷酰胺也是已知的，并以商标oxide)。环磷酰胺也是已知的，并以商标和命名。环磷酰胺是一种前药，可通过p450酶的氧化转化为其活性代谢物4-羟基-环磷酰胺和醛磷酰胺。细胞内4-羟基-环磷酰胺自发分解成磷酰胺芥，这是最终的活性代谢物。
[0138]
在一个实施方式中，小分子药物是梭子，例如分子梭。如本文所用，术语“梭子”是指可以将其他分子或离子从一个位置运输到另一个位置的化合物或分子。不限于，梭子可以是能够将货物运输至细胞的肽，例如细胞穿透肽(cpp)、肽转导结构域(ptd)和/或树突细胞肽(dcpep)。例如，delcroix,2010；zhang,2016；zahid,2012；和curiel,2004b中描述了这些类型的梭子。普通技术人员将非常了解可用于本发明实践的其他梭子。
[0139]
普通技术人员将非常了解可用于本发明实践的其他小分子药物。作为实例而非限制，参考drugbank
tm
(wishart,2017)。drugbank
tm
5.0.11版于2017年12月20日发布，含有10,990个药物条目，其包括超过2,500种获批的小分子药物。
[0140]
抗体、抗体模拟物或功能性等同物或片段
[0141]
在一些实施方式中，至少一种试剂是抗体、抗体的功能性等同物或抗体的功能性片段。抗体、抗体的功能性等同物或抗体的功能性片段可以作为疏水相试剂和/或水相试剂并入根据本发明的组合物中。
[0142]
广义上，“抗体”是指由抗体结构域组成或包含其的多肽或蛋白质，该抗体结构域被理解为免疫球蛋白的重链和/或轻链的恒定和/或可变结构域，具有或不具有接头序列。在一个实施方式中，如果多肽包含由通过环序列连接的抗体结构域结构的至少两条β链组
成的β桶状序列，则将多肽理解为抗体结构域。抗体结构域可以是天然结构或通过诱变或衍生化修饰的，例如以修改结合特异性或任何其他性质。
[0143]
术语“抗体”是指完整的抗体。在一个实施方式中，“抗体”可以包含完整的(即全长)免疫球蛋白分子，包括例如免疫球蛋白分子。具有全长重链和/或轻链的多克隆、单克隆、嵌合、人源化和/或人类版本。术语“抗体”涵盖任何和所有同种型和亚类，其包括但不限于iga、igd、ige、igg和igm的主要类别，以及亚类igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。在一个实施方式中，抗体是igg。抗体可以是天然存在的抗体或通过普通技术人员可用的任何方式制备的抗体，例如通过使用动物或杂交瘤，和/或通过免疫球蛋白基因片段重组过程。抗体通常在例如，greenfield,2014中描述。
[0144]
在一个实施方式中，抗体是分离的形式，这意味着该抗体基本上不含针对不同抗体靶抗原和/或包含不同结构排列的抗体结构域的其他抗体。在一个实施方式中，抗体可以是从哺乳动物的血清样品中分离的抗体。在一个实施方式中，抗体是纯化的形式，例如以仅包含分离和纯化的抗体的制品作为试剂提供。该制品可用于制备本发明的组合物。在一个实施方式中，抗体是亲和纯化的抗体。
[0145]
抗体可以是任何来源，包括天然、重组和/或合成来源。在一个实施方式中，抗体可以是动物来源的。在一个实施方式中，抗体可以是哺乳动物来源的，其包括但不限于人、鼠、兔和山羊。在一个实施方式中，抗体可以是重组抗体。
[0146]
在一个实施方式中，抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或完全人抗体。应用于这些术语的含义和其中包含的抗体类型将被普通技术人员充分理解。
[0147]
简言之，而非限制性地，如本文所用的术语“嵌合抗体”是指一种重组蛋白，其含有源自一个物种(例如啮齿动物)的抗体的可变结构域(包括互补决定区(cdr))，而抗体的恒定结构域源自不同的物种，例如人类。对于兽医应用，嵌合抗体的恒定结构域可以源自动物例如猫或狗的恒定结构域。
[0148]
非限制性地，如本文所用的“人源化抗体”是指重组蛋白，其中来自一个物种(例如，啮齿动物)的抗体的cdr从啮齿动物抗体的重链和轻链可变链转移到人重链和轻链可变结构域，包括人框架区(fr)序列。人源化抗体的恒定结构域同样源自人抗体。
[0149]
非限制性地，如本文所用的“人抗体”可以指从转基因动物(例如小鼠)获得的抗体，所述转基因动物(例如小鼠)已经被基因工程改造以产生响应抗原攻击的特异性人抗体。在该技术中，人类重链和轻链基因座的元件被引入源自胚胎干细胞系的小鼠品系，这些胚胎干细胞系包含内源性重链和轻链基因座的靶向破坏。转基因动物可以合成对人抗原特异性的人抗体，并且该动物可用于产生分泌人抗体的杂交瘤。例如green,1994；lonberg,1994；和taylor，1994描述了从转基因小鼠获得人抗体的方法。还可以通过遗传或染色体转染方法以及噬菌体展示技术构建完全人抗体，所有这些都是本领域已知的。(参见，例如，mccafferty,1990，用于从未免疫供体的免疫球蛋白可变结构域基因库中体外生产人抗体及其片段)。在该技术中，抗体可变结构域基因被框内克隆到丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面上。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链dna拷贝，基于抗体功能性质的选择也会导致选择编码展现这些性质的抗体的基因。以这种方式，噬菌体模仿了b细胞的一些性质。噬菌体展示可以以多种形式进行，
参见，例如johnson和chiswell，1993以供审查。人抗体也可以由体外活化的b细胞生成(参见，例如，美国专利号5,567,610和5,229,275)。
[0150]
如本文所用，关于抗体的术语“功能性片段”是指抗体的抗原结合部分。在本文中，“功能性”是指片段维持其结合靶抗原的能力。在一个实施方式中，结合亲和力可以等于或大于亲本抗体的结合亲和力。在一个实施方式中，结合亲和力可能低于亲本抗体，但功能性片段仍然维持对靶抗原的特异性和/或选择性。在一个实施方式中，除了功能性片段维持其结合亲本抗体的靶抗原的能力之外，如果适用的话，功能性片段还维持抗体的效应器功能(例如经典补体途径的活化；抗体依赖性细胞毒性(adcc)；其他下游信号传导过程)。
[0151]
抗体的功能性片段包括但不限于抗体的一部分，例如f(ab')2、f(ab)2、fab'、fab、fab2、fab3、单结构域抗体(例如dab或vhh)等，其包括半分子igg4(van der neut kolfschoten,2007)。无论结构如何，抗体的功能性片段都与完整抗体识别的相同抗原结合。与抗体相关的术语“功能性片段”还包括由可变区组成的分离片段，例如由重链和轻链可变区组成的“fv”片段和其中轻链和轻链重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scfv蛋白”)。如本文所用，术语“功能性片段”不包括不包含抗原结合位点的片段，例如fc片段。
[0152]
抗体片段，例如本文所述的那些，可以并入单结构域抗体(例如纳米抗体)、单链抗体、大抗体(maxibody)、evibody、微型抗体、内抗体(intrabody)、双抗体、三抗体、四抗体、vnar、双-scfv和其他类似结构(参见例如hollinger和hudson,2005)。包括纤连蛋白多肽单体(monobody)在内的抗体多肽也在美国专利号6,703,199中公开。其他抗体多肽在美国专利公开号20050238646中公开。
[0153]
功能性片段的另一种形式是包含抗体的一个或多个cdr或cdr的一个或多个部分的肽，条件是所得肽保留结合靶抗原的能力。
[0154]
功能性片段可以是合成的或基因工程改造的蛋白质。例如，功能性片段包括由轻链可变区组成的分离片段、由重链和轻链可变区组成的“fv”片段、以及轻链和重链通过肽接头连接的重组单链多肽分子(scfv蛋白)。
[0155]
如本文所用，术语“抗体”和抗体的“功能性片段”包括其任何衍生物。“衍生物”是指对抗体或功能性片段的任何修饰，其包括自然发生的修饰(例如体内)或人工引入的修饰(例如通过实验设计)。这些修饰的非限制性实例包括例如序列修饰(例如氨基酸取代、插入或缺失)、翻译后修饰(例如磷酸化、n-连接糖基化、o-连接糖基化、乙酰化、羟基化、甲基化、泛素化、酰胺化等)、或异源分子(例如多肽、定位信号、标记、靶向分子等)的任何其他共价附接或并入。在一个实施方式中，可以对抗体或其功能性片段进行修饰以生成双特异性抗体或片段(即具有多于一种抗原结合特异性)或双功能抗体或片段(即具有多于一种效应器功能)。
[0156]
如本文所用，抗体上下文中的“功能性等同物”是指具有与针对具体靶标的抗体相似的结合特性的多肽或其他化合物或分子，但不一定是可识别的抗体“片段”。在一个实施方式中，功能性等同物是对具体靶标具有10-7
至10-12
范围内的平衡解离常数(kd)的多肽。在一个实施方式中，功能性等同物对具体靶标具有10-8
或更低的kd。在一个实施方式中，功能性等同物对具体靶标具有10-10
或更低的kd。在一个实施方式中，功能性等同物对具体靶标具有10-11
或更低的kd。在一个实施方式中，功能性等同物对具体靶标具有10-12
或更低的kd。
如本文所定义的平衡常数(kd)是化合物与其靶标的解离速率(k-off)和缔合速率(k-on)之比。
[0157]
在一个实施方式中，抗体、其功能性片段或其功能性等同物是优先靶向淋巴组织中的淋巴结或淋巴样细胞以发挥其药理学和/或治疗活性的抗体。例如但不限于，抗体、其功能性片段或其功能性等同物可以是与淋巴结或淋巴组织中的免疫细胞结合、与在淋巴结或淋巴组织中表达或发现的所期望的靶标结合(例如免疫刺激性或抑制性分子)和/或与细胞、蛋白质、多肽或可能被隔绝或递送至淋巴结或淋巴组织的其他靶标结合的抗体。
[0158]
在一个实施方式中，抗体、其功能性片段或其功能性等同物是结合免疫细胞上的靶标、结合由免疫细胞产生的蛋白质或多肽、或结合与免疫细胞相互作用或对免疫细胞发挥功能的蛋白质或多肽的抗体(例如配体)。
[0159]
在一个实施方式中，抗体、其功能性片段或其功能性等同物是具有免疫调节活性或功能的抗体。“免疫调节活性或功能”是指抗体、其功能性片段或其功能性等同物可以增强(上调)、压制(下调)、指导、重定向或重编程免疫应答。
[0160]
在一个实施方式中，抗体、其功能性片段或其功能性等同物是与刺激检查点分子和/或抑制性检查点分子结合的抗体，例如但不限于本文所述的那些。在一个实施方式中，抗体、其功能性片段或其功能性等同物是刺激检查点分子和/或抑制性检查点分子的激动剂或拮抗剂。在一个实施方式中，抗体、其功能性片段或其功能性等同物是抑制性检查点分子的拮抗剂。在一个实施方式中，抗体、其功能性片段或其功能性等同物是刺激检查点分子的激动剂或超级激动剂。
[0161]
在一个实施方式中，抗体是抗-ctla-4抗体、其功能性片段或其功能性等同物、或其任何组合。ctla-4(cd152)是作为免疫检查点，下调免疫应答的蛋白质受体。在一个实施方式中，抗ctla-4抗体抑制ctla-4活性或功能，从而增强免疫应答。在一个实施方式中，抗-ctla-4抗体是伊匹木单抗(bristol-myers squibb)、替西木单抗(pfizer；astrazeneca)或bn-13(bioxcell)。在另一个实施方式中，抗ctla-4抗体是uc10-4f10-11、9d9或9h10(bioxcell)或其人或人源化对应物。
[0162]
在一个实施方式中，抗体是抗pd-1抗体、其功能性片段或其功能性等同物、或其任何组合。pd-1(cd279)是作为免疫检查点，下调免疫应答并促进自身耐受性的细胞表面受体。在一个实施方式中，pd 1抗体是纳武利尤单抗(opdivo
tm
；bristol-myers squibb)。在一个实施方式中，pd-1抗体是派姆单抗(keytruda
tm
；merck)。在一个实施方式中，pd-1抗体是匹地利珠单抗(cure tech)。在一个实施方式中，抗pd-1抗体是amp-224(medimmune&gsk)。在一个实施方式中，抗pd-1抗体是rmp1-4或j43(bioxcell)或其人或人源化对应物。
[0163]
在一个实施方式中，抗体是抗pd-l1抗体、其功能性片段或其功能性等同物、或其任何组合。pd-l1是pd-1受体的配体，并且与其受体结合传递减少cd8 t细胞增殖的抑制性信号，还可诱导细胞凋亡。在一个实施方式中，pd l1抗体是bms-936559(bristol myers squibb)。在一个实施方式中，pd-l1抗体是阿特珠单抗(mpdl3280a；roche)。在一个实施方式中，pd-l1抗体是阿维单抗(merck&pfizer)。在一个实施方式中，pd l1抗体是德瓦鲁单抗(medi4736；medimmune/astrazeneca)。
[0164]
在其他实施方式中，和非限制性地，抗体、其功能性片段或其功能性等同物可以是抗pd-1或抗pd-l1抗体，例如wo2015/103602中公开的那些。
[0165]
在一个实施方式中，活性剂是抗体模拟物、抗体模拟物的功能性等同物或抗体模拟物的功能性片段。
[0166]
如本文所用，术语“抗体模拟物”是指与抗体一样可以特异性和/或选择性结合抗原或其他靶标但在结构上与抗体不相关的化合物。抗体模拟物通常是人工肽或蛋白质，但它们不限于此类实施方式。通常，抗体模拟物比抗体小，摩尔质量约为3-20kda(而抗体通常约为150kda)。抗体模拟物的非限制性实例包括肽适体、affimer、affilin、亲合体(affibody)、affitin、alphabody、抗运载蛋白(anticalin)、亲和多聚体(avimer)、darpin
tm
、fynomer、kunitz结构域肽、nanoclamp
tm
、亲和试剂和支架蛋白。核酸和小分子也可以是抗体模拟物。
[0167]
如本文所用，术语“肽适体”是指设计用于干扰细胞内其他蛋白质相互作用的肽或蛋白质。它们由两端附接到蛋白质支架上的可变肽环组成。这种双重结构限制极大地增加了肽适体的结合亲和力至与抗体相当的水平(纳摩尔范围)。可变肽环通常包含10至20个氨基酸，并且支架可以是具有良好溶解性质的任何蛋白质。目前，细菌蛋白硫氧还蛋白-a是常用的支架蛋白，可变肽环插入氧化还原活性位点内，即野生蛋白中的-cys-gly-pro-cys-环，两条半胱氨酸侧链能够形成二硫键。可以使用不同的系统进行肽适体选择，但目前使用最广泛的是酵母双杂交系统。
[0168]
如本文所用，术语“affimer”代表肽适体的进化。affimer是小型、高度稳定的蛋白质，其经过工程改造以展示肽环，为具体靶蛋白或抗原提供高亲和力结合表面。affimer可以具有与抗体相同的特异性优势，但更小，可以化学合成或化学修饰，并且具有不含细胞培养污染物的优势。affimer是低分子量的蛋白质，通常为12至14kda，其源自胱抑素的半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族。affimer支架是基于胱抑素蛋白折叠的稳定蛋白。它展示了两个肽环和n端序列，其可以随机化来以高亲和力和特异性结合不同的靶蛋白。
[0169]
如本文所用，术语“affilin”是指通过使用γ-b结晶或泛素作为支架并通过随机诱变修饰这些蛋白质表面上的氨基酸而开发的抗体模拟物。例如，通过噬菌体展示或核糖体展示技术来选择实现所期望靶标特异性的affilin。根据支架，affilin的分子量约为10kda(泛素)或20kda(γ-b结晶)。如本文所用，术语affilin也指affilin的二聚化或多聚化形式(weidle,2013)。
[0170]
如本文所用，术语“亲合体”是指源自葡萄球菌蛋白a的z结构域的抗体模拟物家族。在结构上，亲合体分子基于三螺旋束结构域，该结构域也可以并入融合蛋白中。亲合体本身的分子量约为6kda，并且在高温和酸性或碱性条件下是稳定的。靶特异性是通过随机化位于参与亲本蛋白结构域的结合活性的两个α螺旋中的13个氨基酸获得的(feldwisch和tolmachev,2012)。在一个实施方式中，它是来自瑞典斯德哥尔摩的affibody ab的affibody
tm
。
[0171]“affitin”(也称为nanofitin)是抗体模拟蛋白，其源自酸热硫化叶菌的dna结合蛋白sac7d。affitin通常具有约7kda的分子量，并且被设计为通过随机化结合表面上的氨基酸来特异性结合靶分子(mouratou,2012)。在一个实施方式中，affitin如wo2012/085861中描述。
[0172]
如本文所用，术语“alphabody”是指经过工程改造以结合多种抗原的小的10kda蛋白质。alphabody被开发为具有一组氨基酸残基的支架，其可以被修饰以结合蛋白质靶标，
同时保持正确的折叠和热稳定性。alphabody支架是基于卷曲螺旋结构计算设计的，但它在自然界中没有已知的对应物。最初，支架由三个肽组成，它们非共价结合以形成平行卷曲螺旋三聚体(美国专利公开号20100305304)，但后来被重新设计为含有通过接头区域连接的三个α-螺旋的单肽链(desmet,2014)。
[0173]
如本文所用，术语“抗运载蛋白”是指源自脂质运载蛋白的工程改造的蛋白质(beste,1999；gebauer和skerra,2009)。抗运载蛋白具有八链β桶，其在脂质运载蛋白中形成高度保守的核心单元，并通过开放端的四个结构可变环自然形成配体的结合位点。抗运载蛋白虽然不与igg超家族同源，但显示出迄今为止被认为是典型的抗体结合位点的特征：(i)由于序列变异而导致的高度结构可塑性和(ii)提高的构象灵活性，允许诱导适合不同形状的靶标。
[0174]
如本文所用，术语“亲和多聚体”(亲合性多聚体(avidity multimers))是指一类抗体模拟物，其由两个或更多个肽序列组成，每个肽序列具有30至35个氨基酸，它们源自多种膜受体的a结构域并且其通过接头肽连接。靶分子的结合经由a结构域发生，并且可以选择具有所期望的结合特异性的结构域，例如，通过噬菌体展示技术。亲和多聚体中包含的不同a结构域的结合特异性可以但不必是相同的(weidle,2013)。
[0175]
如本文所用，术语“darpin
tm”是指设计的锚蛋白重复结构域(166个残基)，其提供由通常三个重复的β-转角产生的刚性界面。darpin通常携带与人工共有序列相对应的三个重复序列，其中每个重复的六个位置是随机的。因此，darpin缺乏结构灵活性(gebauer和skerra,2009)。
[0176]
如本文所用，术语“fynomer
tm”是指源自人fyn sh3结构域的非免疫球蛋白衍生的结合多肽。fyn sh3衍生的多肽在本领域中是众所周知的并且已经例如在grabulovski,2007；wo 2008/022759；bertschinger,2007；gebauer和skerra,2009；和schlatter,2012中描述。
[0177]“kunitz结构域肽”源自kunitz型蛋白酶抑制剂例如牛胰蛋白酶抑制剂(bpti)、淀粉样前体蛋白(app)或组织因子途径抑制因子(tfpi)的kunitz结构域。kunitz结构域的分子量约为6kda，并且可以通过例如噬菌体展示的展示技术选择具有所需靶特异性的结构域(weidle,2013)。
[0178]
如本文所用，术语“单体”(也称为“adnectin”)涉及基于人纤连蛋白iii的第10个细胞外结构域(10fn3)的分子，其采用94个残基的ig样β-夹心折叠，具有2到3个暴露的环，但缺少中央二硫桥(gebauer和skerra,2009)。通过在蛋白质的具体环中引入修饰，可以对具有所期望的靶标特异性的单体进行基因工程改造。在一个实施方式中，单体是adnectin
tm
(bristol-myers squibb,new york,new york)。
[0179]
如本文所用，术语“nanoclamp”(梭状芽孢杆菌抗体模拟物蛋白(clostridal antibody mimetic proteins))是指亲和试剂，其是与靶分子具有紧密、选择性和温和可逆结合的15kda蛋白质。nanoclamp支架基于产气荚膜梭菌透明质酸酶(mu毒素)的igg样、热稳定碳水化合物结合模块家族32(cbm32)。nanoclamp的形状近似于长约4nm、直径约2.5nm的圆柱体，与纳米体的大小大致相同。通过改变氨基酸序列和有时改变溶剂暴露的三个连接β链的相邻环的长度产生针对具体靶标的nanoclamp，这些相邻环构成β夹心折叠、赋予靶标结合亲和力和特异性(suderman,2017)。
[0180]
如本文所用，术语“亲和试剂”是指与更大的靶分子结合以鉴别、跟踪、捕获或影响其活性的任何化合物或物质。尽管抗体和肽适体是常见的实例，但普通技术人员可以使用许多不同类型的亲和试剂。在一个实施方式中，亲和试剂是提供可经工程改造以特异性结合靶标的可行支架的亲和试剂(例如，top7是经工程改造以特异性结合cd4的支架；boschek,2009)。
[0181]
如本文所用，术语“支架蛋白”是指与信号传导途径的多个成员相互作用和/或结合的多肽或蛋白质。它们是许多关键信号传导途径的调节剂。在这些途径中，它们调节信号转导并帮助定位途径组分。在本文中，它们被包括在术语“抗体模拟物”中，因为它们具有特异性和/或选择性结合靶蛋白的能力，很像抗体。除了它们的结合功能和特异性外，支架蛋白还可能具有酶活性。示例性支架蛋白包括但不限于ras1的激酶抑制子(kns)、mek激酶1(mekk1)、b细胞淋巴瘤/白血病10(bcl-10)、a-激酶锚定蛋白(akap)、成神经细胞分化-相关蛋白anhak、homer1、pellino蛋白、nlrp家族、盘状大同源物1(dlg1)和树突棘素(spinophillin)(ppp1r9b)。
[0182]
抗体模拟物的其他实施方式包括但不限于蛋白质a的z结构域、γb结晶、泛素、胱抑素、来自酸热硫化叶菌的sac7d、脂质运载蛋白、膜受体的a结构域、锚蛋白重复基序、fyn的sh3结构域、蛋白酶抑制剂的kunis结构域、纤连蛋白的第10个iii型结构域、3或4螺旋束蛋白、犰狳重复结构域，富含亮氨酸的重复结构域、pdz结构域、sumo或sumo样结构域、免疫球蛋白样结构域、磷酸酪氨酸结合结构域、普列克底物蛋白(pleckstrin)同源结构域或src同源2结构域。
[0183]
如本文所用，关于抗体模拟物的术语“功能性片段”是指抗体模拟物的任何部分或片段，其维持与其靶分子结合的能力。抗体模拟物的功能性片段可以是例如本文所述的任何抗体模拟物的一部分。在一个实施方式中，结合亲和力可以等于或大于亲本抗体模拟物的结合亲和力。在一个实施方式中，结合亲和力可能低于亲本抗体模拟物，但功能性片段仍然维持对靶抗原的特异性和/或选择性。
[0184]
在一个实施方式中，除了抗体模拟物的功能性片段维持其结合亲本抗体模拟物的靶分子的能力之外，如果适用(例如下游信号传导)，功能性片段还维持抗体模拟物的效应器功能。
[0185]
如本文所用，抗体模拟物上下文中的“功能性等同物”是指与抗体模拟物具有相似的结合特征的多肽或其他化合物或分子，但不一定是抗体模拟物的可识别的“片段”。在一个实施方式中，功能性等同物是对具体靶标具有10-7
至10-12
范围内的平衡解离常数(kd)的多肽。在一个实施方式中，功能性等同物对具体靶标具有10-8
或更低的kd。在一个实施方式中，功能性等同物对具体靶标具有10-10
或更低的kd。在一个实施方式中，功能性等同物对具体靶标具有10-11
或更低的kd。在一个实施方式中，功能性等同物对具体靶标具有10-12
或更低的kd。如本文所定义的平衡常数(kd)是化合物与其靶标的解离速率(k-off)和缔合速率(k-on)之比。
[0186]
在一个实施方式中，抗体模拟物、其功能性片段或其功能性等同物是优先靶向淋巴组织中的淋巴结或淋巴样细胞以发挥其药理学和/或治疗活性的抗体模拟物。例如但不限于，抗体模拟物、其功能性片段或其功能性等同物可以是与淋巴结或淋巴组织中的免疫细胞结合、与在淋巴结或淋巴组织中表达或发现的所期望的靶标结合(例如免疫刺激性或
抑制性分子)和/或与细胞、蛋白质、多肽或可能被隔绝或递送至淋巴结或淋巴组织的其他靶标结合的抗体模拟物。
[0187]
在一个实施方式中，抗体模拟物、其功能性片段或其功能性等同物是结合免疫细胞上的靶标、结合由免疫细胞产生的蛋白质或多肽、或结合与免疫细胞相互作用或对免疫细胞发挥功能的蛋白质或多肽的抗体模拟物(例如配体)。
[0188]
在一个实施方式中，抗体模拟物、其功能性片段或其功能性等同物是具有免疫调节活性或功能的抗体模拟物。在一个实施方式中，抗体模拟物、其功能性片段或其功能性等同物是结合刺激检查点分子和/或抑制性检查点分子的抗体模拟物，例如但不限于本文所述的那些。在一个实施方式中，抗体模拟物、其功能性片段或其功能性等同物是刺激检查点分子和/或抑制性检查点分子的激动剂或拮抗剂。在一个实施方式中，抗体模拟物、其功能性片段或其功能性等同物是抑制性检查点分子(例如ctla-4、pd-1或pd l1)的拮抗剂。在一个实施方式中，抗体模拟物、其功能性片段或其功能性等同物是刺激检查点分子的激动剂或超级激动剂。
[0189]
免疫调节剂
[0190]
在一些实施方式中，至少一种试剂是免疫调节剂。可以将免疫调节剂作为疏水相试剂和/或水相试剂并入根据本发明的组合物中。如本文所用，“免疫调节剂”是调节免疫应答的活性和/或有效性的化合物或分子。如本文所用，“调节”意指增强(上调)、压制(下调)、指导、重定向或重编程免疫应答。术语“调节”并不意味着活化或诱导。这意味着免疫调节剂调节(增强、减少或指导)由具体物质(例如抗原)活化、引发或诱导的免疫应答，但免疫调节剂本身不是免疫应答定向所针对的物质，免疫调节剂也不源自该物质。
[0191]
在一个实施方式中，免疫调节剂是调节骨髓细胞(单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、巨核细胞和粒细胞)或淋巴细胞(t细胞、b细胞和自然杀伤(nk)细胞)的免疫调节剂。在具体实施方式中，免疫调节剂是仅调节淋巴样细胞的免疫调节剂。在一个实施方式中，免疫调节剂是治疗剂，其在施用时刺激免疫细胞增殖或变得活化。
[0192]
在一个实施方式中，免疫调节剂是增强免疫应答的免疫调节剂。免疫应答可以是先前被活化或启动的免疫应答，但其功效不足以提供适当或所期望的治疗益处。可选地，可以预先提供免疫调节剂以启动免疫系统，从而增强随后活化的免疫应答。
[0193]
在一个实施方式中，增强免疫应答的免疫调节剂可以选自细胞因子(例如某些白介素和干扰素)、干细胞生长因子、淋巴毒素、共刺激分子、造血因子、集落刺激因子、红细胞生成素、血小板生成素等，以及这些分子的合成类似物。
[0194]
在一个实施方式中，增强免疫应答的免疫调节剂可以选自：淋巴毒素，例如肿瘤坏死因子(tnf)；造血因子，例如白细胞介素(il)；集落刺激因子，例如粒细胞集落刺激因子(g-csf)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)；干扰素，例如干扰素-α、-β或-λ；和干细胞生长因子，例如指定的“si因子”。
[0195]
细胞因子中包括生长激素，例如人生长激素、n-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原(prorelaxin)；糖蛋白激素，例如促卵泡激素(fsh)、促甲状腺激素(tsh)和促黄体激素(lh)；肝生长因子；前列腺素，成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素，ob蛋白；肿瘤坏死因子-α和-β；缪勒管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素
(tpo)；神经生长因子，例如ngf-β；血小板生长因子；转化生长因子(tgfs)，例如tgf-α和tgfβ；胰岛素样生长因子-i和-ii；促红细胞生成素(epo)；骨诱导因子；干扰素，例如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(csf)，例如巨噬细胞csf(m-csf)；白细胞介素(il)，例如il-1、il-1α、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-21、il25、lif、kit配体或flt-3、血管抑制素、血小板反应蛋白、内皮抑素和肿瘤坏死因子。
[0196]
在一个实施方式中，免疫调节剂可以是调节检查点抑制剂的试剂。免疫检查点蛋白是在调整免疫应答中发挥作用的信号传导蛋白。一些检查点抑制剂是位于细胞表面的受体，其响应细胞外信号传导。例如，许多检查点是由配体-受体相互作用引发的。当被活化时，抑制性检查点蛋白会产生抗炎应答，其可包括活化调节性t细胞和抑制细胞毒性或杀伤性t细胞。癌细胞已被显示表达抑制性检查点蛋白作为避免被免疫细胞识别的方式。因此，抑制性检查点蛋白的抑制剂(即“免疫检查点抑制剂”)可用于活化个体中的免疫系统以杀死癌细胞(参见例如pardoll,2012)。
[0197]
在一个实施方式中，免疫调节剂是作为免疫检查点抑制剂的任何化合物、分子或物质，其包括但不限于选自以下的免疫检查点蛋白的抑制剂：程序性死亡配体1(pd-l1，也称为b7-h1、cd274)、程序性死亡1(pd-1、cd279)、ctla-4(cd154)、pd-l2(b7-dc、cd273)、lag3(cd223)、tim3(havcr2、cd366)、41bb(cd137)、2b4、a2ar、b7h1、b7h3、b7h4、b-和t-巴细胞衰减因子(btla)、cd2、cd27、cd28、cd30、cd33、cd40、cd70、cd80、cd86、cd160、cd226、cd276、dr3、gal9、gitr、hvem、ido1、ido2、icos(诱导型t细胞共刺激因子)、杀伤抑制性受体(kir)、lag-3、lair1、light、marco(具有胶原结构的巨噬细胞受体)、磷脂酰丝氨酸(ps)、ox-40、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素5、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素7、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素9、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素11、slam、tigit、tim3、tnf-α、vista、vtcn1或其任意组合。
[0198]
在一个实施方式中，免疫调节剂是抑制或阻断ctla-4的任何化合物、分子或物质。ctla-4信号传导抑制t细胞活化，特别是在强烈的t细胞应答期间。使用ctla-4抑制剂(例如抗ctla-4单克隆抗体)阻断ctla-4具有很大的吸引力，因为压制抑制性信号会导致抗肿瘤t细胞应答的产生。临床和临床前数据均表明ctla-4阻断导致cd4 和cd8 效应细胞的直接活化，抗ctla-4单克隆抗体疗法已在许多癌症中显示出前景。
[0199]
在一个实施方式中，免疫调节剂是抑制或阻断pd-1的任何化合物、分子或物质。与ctla-4信号传导一样，pd-1/pd-l1调节t细胞应答。已显示表达pd-1的treg具有免疫抑制剂反应，因此认为pd-1/pd-l1表达在自我耐受中发挥作用。在癌症的背景下，肿瘤细胞过度表达pd-1和pd-l1以逃避免疫系统的识别。阻断pd-l1/pd-1的抗癌疗法增加效应t细胞活性并降低抑制性treg活性，这允许个体免疫系统识别和破坏肿瘤。
[0200]
在一个实施方式中，免疫调节剂是检查点抑制剂。例如，检查点抑制剂可以是结合并拮抗抑制性检查点蛋白的抗体。示例性抗体包括抗pd1抗体(派姆单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、amp-224、rmp1-4或j43)、抗pd-l1抗体(阿特珠单抗、阿维单抗、bms-936559或德瓦鲁单抗)、抗ctla-4抗体(伊匹木单抗、替西木单抗、bn-13、uc10-4f10-11、9d9或9h10)等。在一些实施方式中，检查点抑制剂可以是靶向抑制性检查点蛋白的小分子或rnai。在一些实施方式中，检查点抑制剂可以是肽模拟物或多肽。
[0201]
在一个实施方式中，免疫调节剂可以是免疫共刺激分子激动剂。免疫共刺激分子是在调节免疫应答中发挥作用的信号传导蛋白。一些免疫共刺激分子是位于细胞表面的受体，它们对细胞外信号传导作出应答。当被活化时，免疫共刺激分子会产生促炎性反应，其可包括压制调节性t细胞和活化细胞毒性或杀伤性t细胞。因此，免疫共刺激分子激动剂可用于活化个体的免疫系统以杀死癌细胞。示例性免疫共刺激分子包括cd27、cd28、cd40、cd122、cd137、cd137/4-1bb、icos、il-10、ox40、tgfβ、tor受体和糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白gitr中的任一种。例如，ox40刺激压制treg细胞功能，同时增强效应t细胞的存活和活性，从而增加抗肿瘤免疫。在一个实施方式中，免疫调节剂是作为共刺激免疫分子激动剂的任何化合物、分子或物质，包括但不限于选自cd27、cd28、cd40、cd122、cd137、cd137/4-1bb、icos、il-10、ox40、tgf-β、tor受体和糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白gitr的共刺激免疫分子。可以使用多种免疫共刺激分子激动剂。例如，免疫共刺激分子激动剂可以是结合并活化免疫共刺激分子的抗体。在进一步的实施方式中，免疫共刺激分子激动剂可以是靶向和活化免疫共刺激分子的小分子。
[0202]
在一个实施方式中，免疫调节剂是作为免疫抑制性试剂的任何化合物、分子或物质。“免疫抑制性试剂”是指化合物、分子或物质降低(下调)免疫应答的活性和/或功效，或以减轻不期望的结果(例如自身免疫应答或过敏反应)的方式指导、重定向或重编程免疫应答。存在许多不同类型的免疫抑制性试剂，包括但不限于钙调神经磷酸酶抑制剂、白细胞介素抑制剂、选择性免疫抑制剂和thf-α抑制剂。
[0203]
在一个实施方式中，但非限制性地，免疫调节剂可以是选自以下的免疫抑制剂：5-氟尿嘧啶、6-硫鸟嘌呤、阿达木单抗、阿那白滞素、抗胸腺细胞丙种球蛋白(atgam)、阿巴西普、阿法西普、硫唑嘌呤、巴利昔单抗、贝拉西普、贝利木单抗、贝那利珠单抗、布罗达单抗、卡那单抗、赛妥珠单抗、苯丁酸氮芥、环孢菌素、达利珠单抗、富马酸二甲酯、度普利尤单抗(dupilumab)、依库珠单抗、依法珠单抗、依那西普(ethanercept)、依维莫司、芬戈莫德、戈利木单抗、古塞奇尤单抗(guselkumab)、咪喹莫特、英夫利昔单抗、伊西贝单抗(ixekizumab)、来氟米特、来那度胺、氮芥、美泊利单抗、甲氨蝶呤、莫罗莫那单抗-cd3(muromonab-cd3)、霉酚酸酯、霉酚酸、那他珠单抗、奥马珠单抗、泊马度胺、吡美莫司、瑞利珠单抗、利纳西普(rilonacept)、sarilumab、苏金单抗、西妥昔单抗、西罗莫司、他克莫司、特立氟胺、沙利度胺、胸腺球蛋白、托珠单抗、优特克单抗和维多珠单抗。
[0204]
在一个实施方式中，免疫调节剂是作为免疫抑制性细胞毒性药物的任何化合物、分子或物质。在一个实施方式中，免疫抑制性细胞毒性药物是糖皮质激素、细胞抑制剂(例如烷化剂、抗代谢物)、抗体、作用于免疫亲和素的药物、干扰素、阿片样物质或tnf结合蛋白。免疫抑制性细胞毒性药物包括但不限于氮芥(例如环磷酰胺)、亚硝基脲、铂化合物、叶酸类似物(例如甲氨蝶呤)、嘌呤类似物(例如硫唑嘌呤和巯基嘌呤)、嘧啶类似物(例如氟尿嘧啶)、蛋白质合成抑制剂、细胞毒性抗生素(例如更生霉素、蒽环类、丝裂霉素c、博来霉素和光神霉素)、环孢菌素、他克莫司、西罗莫司/雷帕霉素、依维莫司、强的松、地塞米松、氢化可的松、氮芥、苯丁酸氮芥、霉酚酸、芬戈莫德、多球壳菌素、英夫利昔单抗、依那西普或阿达木单抗。
[0205]
在一个实施方式中，免疫调节剂是抗炎剂。在一个实施方式中，抗炎剂是非甾体抗炎剂。在一个实施方式中，非甾体抗炎剂是cox-1和/或cox-2抑制剂。在一个实施方式中，抗
炎剂包括但不限于阿司匹林、双水杨酸酯、二氟尼柳、布洛芬、非诺洛芬、氟比洛芬、芬那酯、酮洛芬、萘丁美酮、吡罗昔康、萘普生、双氯芬酸、消炎痛、舒林酸、托美汀、依托度酸、酮咯酸、奥沙普秦或塞来昔布。在一个实施方式中，抗炎剂是甾体抗炎剂。在一个实施方式中，甾体抗炎剂是皮质类固醇。
[0206]
在一个实施方式中，免疫调节剂是抗风湿剂。在一个实施方式中，抗风湿剂是非甾体抗炎剂。在一个实施方式中，抗风湿剂是皮质类固醇。在一个实施方式中，皮质类固醇是强的松或地塞米松。在一个实施方式中，抗风湿剂是改善疾病的抗风湿药。在一个实施方式中，改善疾病的抗风湿药包括但不限于氯喹、羟氯喹、甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、环孢菌素、硫唑嘌呤、环磷酰胺、硫唑嘌呤、柳氮磺吡啶、青霉胺、金硫葡萄糖、硫代苹果酸金钠或金诺芬。在一个实施方式中，抗风湿剂是免疫抑制性细胞毒性药物。在一个实施方式中，免疫抑制性细胞毒性药物包括但不限于甲氨蝶呤、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥或硫唑嘌呤。
[0207]
普通技术人员将充分了解上述包含的其他免疫调节剂。值得注意的是，如本文所用，术语“免疫调节剂”不包括通过延长抗原对免疫细胞的暴露(即通过递送平台，例如freund's
tm
完全或不完全佐剂、montanide
tm isa或其他油基物质)来起作用增强抗原的免疫原性的化合物或组合物。
[0208]
抗原
[0209]
在一些实施方式中，至少一种试剂是抗原。抗原可以作为疏水相试剂和/或水相试剂并入根据本发明的组合物中。如本文所用，术语“抗原”是指可以特异性结合免疫系统组分的任何物质或分子。在一些实施方式中，合适的抗原是能够在受试者中诱导或生成免疫应答的那些抗原。认为能够诱导免疫应答的抗原是免疫原性的，也可称为免疫原。因此，如本文所用，术语“抗原”包括免疫原，除非另有明确说明，否则这些术语可以互换使用。
[0210]
如本文所用，术语“肽抗原”是如上定义的抗原，其是蛋白质或多肽。在一个实施方式中，肽抗原可以源自微生物，例如活的、减毒的、灭活的或杀死的细菌、病毒或原生动物，或其部分。在一个实施方式中，肽抗原可以源自动物，例如人，或与其基本上相关的抗原。
[0211]
如本文所用，术语“源自”包括但不限于：从原始来源(例如受试者)直接分离或获得的肽抗原；与原始来源的肽抗原相同或基本上相关的合成或重组产生的肽抗原；或由原始来源的肽抗原或其片段制成的肽抗原。当陈述肽抗原“来自”来源时，术语“来自”可以等同于“源自”。在本文中，术语“基本上相关”是指肽抗原可能已经通过化学、物理或其他方式(例如序列修饰)进行了修饰，但所得产物仍然能够对原始肽抗原和/或与原始抗原相关的疾病或病症生成免疫应答。“基本上相关”包括天然肽抗原的变体和/或衍生物。“源自”生物体的抗原也可以认为与所述生物体“相关联”。
[0212]
在一个实施方式中，肽抗原可以从天然来源中分离。在一些实施方式中，肽抗原可纯化为从约90％至约95％纯度、从约95％至约98％纯度、从约98％至约99％纯度或大于99％纯度。
[0213]
在一个实施方式中，肽抗原可以重组生成，例如通过体外或体内表达。
[0214]
在一个实施方式中，肽抗原是基于天然靶蛋白的氨基酸序列合成产生的多肽。肽抗原可以使用在本领域中是众所周知的化学方法(参见例如caruthers 1980,horn 1980,banga 1995)全部或部分合成。例如，可以使用多种固相技术(参见例如roberge 1995,merrifield 1997)进行肽合成，并且可以例如，根据制造商提供的说明书，使用abi 431a肽
合成仪(perkin elmer)来实现自动化合成。
[0215]
在肽抗原的背景下，许多不同类型的肽修饰是本领域已知的并且可以用于本发明的实践中。例如，但非限制性地，可以修饰肽抗原以改善其溶解性、稳定性和/或免疫原性。可以进行的修饰的非限制性实例包括n-末端修饰、c-末端修饰、酰胺化、乙酰化、通过产生二硫键的肽环化、磷酸化、甲基化、与其他分子(例如bsa、klh、ova)的缀合、聚乙二醇化和包含非天然氨基酸。
[0216]
在一个实施方式中，修饰可以是氨基酸序列修饰，例如缺失、替换或插入。取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。在进行此类改变时，可基于侧链取代基的相对相似性(例如，它们的大小、电荷、疏水性、亲水性等)进行类似氨基酸残基的取代，并且可以通过常规测试来测定这些取代对肽功能的影响。
[0217]
在一个实施方式中，肽抗原可以是5至120个氨基酸长度、5至100个氨基酸长度、5至75个氨基酸长度、5至50个氨基酸长度、5至40个氨基酸长度、5至30个氨基酸长度、5至20个氨基酸长度或5至10个氨基酸长度。在一个实施方式中，肽抗原的长度可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。在一个实施方式中，肽抗原的长度为8至40个氨基酸长度。在一个实施方式中，肽抗原的长度为9或10个氨基酸。
[0218]
在一个实施方式中，肽抗原包含至少一个b细胞表位、至少一个ctl表位或其任何组合。
[0219]
b细胞表位是b细胞和抗体识别的表位。b细胞肽表位通常是至少五个氨基酸、更经常是至少六个氨基酸、仍更经常是至少七个或八个氨基酸长度，并且可以是连续的(“线性的”)或不连续的(“构象的”)；后者的形成，例如，通过折叠蛋白质以使一级氨基酸序列的非邻接部分物理接近。
[0220]
ctl表位是细胞毒性t淋巴细胞识别的分子。ctl表位通常呈递在抗原呈递细胞的表面上，与mhc分子复合。如本文所用，术语“ctl表位”是指与抗原的天然ctl表位基本相同的肽。ctl表位与其天然对应物相比可被修饰，例如被一个或两个氨基酸修饰。除非另有说明，本文提及的ctl表位是指能够被细胞吸收并呈递在抗原呈递细胞表面上的未结合分子。
[0221]
ctl表位通常应该是可修改以被t细胞受体识别的表位，以便可以发生细胞介导的免疫应答。对于肽，ctl表位可能与i类或ii类mhc分子相互作用。mhc i类分子呈递的ctl表位通常是长度在8到15个氨基酸之间的肽，更常见的是长度在9到11个氨基酸之间的肽。mhc ii类分子呈递的ctl表位通常是长度在5到24个氨基酸之间的肽，更常见的是长度在13到17个氨基酸之间的肽。如果抗原大于这些大小，则它将被免疫系统加工成更适合与mhc i类或ii类分子相互作用的大小的片段。因此，ctl表位可能是比上述那些更大的肽抗原的一部分。
[0222]
许多ctl表位是已知的。本领域公认了几种鉴别另外的ctl表位的技术。通常，这些涉及制备可能提供ctl表位的分子并表征对该分子的免疫应答。
[0223]
在一个实施方式中，肽抗原可以是与癌症、感染病、成瘾疾病或任何其他疾病或紊乱相关的抗原。
[0224]
肽抗原可源自的病毒或其部分包括例如但不限于牛痘病毒、痘苗病毒(vaccinia virus)、假牛痘病毒、疱疹病毒、人疱疹病毒1、人疱疹病毒2、巨细胞病毒、人腺病毒a-f、多
瘤病毒、人乳头瘤病毒(hpv)、细小病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(hiv)、塞内卡谷病毒(svv)、正呼肠孤病毒、轮状病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、流感病毒(例如h5n1流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、肺炎病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、狂犬病病毒、加利福尼亚脑炎病毒、日本脑炎病毒、汉坦病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、冠状病毒、肠道病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、诺如病毒、黄病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、水痘、严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(sars-cov)、严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(sars-cov-2)和中东呼吸系统综合征相关冠状病毒(mers-cov)。
[0225]
在一个实施方式中，肽抗原源自hpv。在一个实施方式中，hpv肽抗原是与hpv相关的宫颈癌或hpv相关的头颈癌相关联的抗原。在一个实施方式中，肽抗原是包含序列rahynivtf的肽(hpv16e7(h 2db)肽49-57；r9f；seq id no:1)。在一个实施方式中，肽抗原是包含序列ymlnlgpet的肽(hpv y9t肽；seq id no:2)。
[0226]
在一个实施方式中，肽抗原源自hiv。在一个实施方式中，hiv肽抗原可以源自hiv-1gp120的v3环。在一个实施方式中，hiv肽抗原可以是rgp10(rgpgrafvti；seq id no:3)。rgp10可以从genscript(piscataway,nj)购买。在另一个实施方式中，肽抗原可以是amq9(amqmlketi；seq id no:4)。amq9肽是h-2kd单倍型小鼠gag的免疫显性mhc i类表位。amq9也可以从genscript购买。
[0227]
在一个实施方式中，肽抗原源自rsv。rsv病毒体是副粘病毒科属的成员，由单链负义rna组成，有15,222个核苷酸。核苷酸编码三种跨膜表面蛋白(f、g和小疏水蛋白或sh)、两种基质蛋白(m和m2)、三种核衣壳蛋白(n、p和l)和两种非结构蛋白(ns1和ns2)。在一个实施方式中，肽抗原可以源自任何一种或多种rsv蛋白。在具体实施方式中，肽抗原可以源自rsv或任何其他副粘病毒的sh蛋白，或其片段。rsv肽抗原可以是wo2012/065997中描述或公开的任何一种或多种rsv肽。
[0228]
sh蛋白存在于许多副粘病毒中(collins 1990)，是一种具有胞外域或“细胞外”组分的跨膜蛋白。人rsv sh蛋白含有64个氨基酸(a亚组；seq id no:5)和65个氨基酸(b亚组；seq id no:6)并且是高度保守的。
[0229]
在一个实施方式中，肽抗原包含副粘病毒的sh蛋白(she)的胞外域或其片段或修饰变体或由其组成。在一个实施方式中，she源自牛rsv。在另一个实施方式中，she源自a亚组人rsv毒株或b亚组人rsv毒株。在一个实施方式中，肽抗原是a亚组人rsv she(nklceynvfhnktfelprarvnt；seq id no:7)。在一个实施方式中，肽抗原是b亚组人rsv she(nklsehktfcnktleqgqmyqint；seq id no:8)。
[0230]
在一个实施方式中，rsv肽抗原可以是单体形式、二聚体形式或另一种寡聚体形式、或其任何组合。在一个实施方式中，包含she a和/或she b的肽抗原是单体(例如，单个多肽)。在另一个实施方式中，包含she a和/或she b的肽抗原是二聚体(例如，二聚化的两个单独的多肽)。二聚化方法是本领域已知的。一个示例性程序是将rsv she肽抗原溶解在10％dmso/0.5％醋酸水溶液(w/w)的混合物中，并在37℃下加热过夜。
[0231]
在一个实施方式中，源自rsv的肽抗原可以包含以下任何一种或多种或由其组成：
[0232][0233]
如例如在wo 2012/065997中所述，she肽抗原可以遗传或化学地连接至运载体。适用于呈递肽抗原的运载体的示例性实施方式是本领域已知的，其中一些描述于wo2012/065997中。在另一个实施方式中，she肽抗原可以连接至如本文所述的定制大小的脂质囊泡颗粒或由其形成或由于制造方法而由其产生的结构。
[0234]
在另一个实施方式中，肽抗原源自流感病毒。流感是正粘病毒科的单链rna病毒，其通常基于病毒颗粒外部的两种大糖蛋白，即血凝素(ha)和神经氨酸苷酶(na)表征。已经鉴别了甲型流感的许多ha亚型(kawaoka 1990；webster 1983)。在一些实施方式中，抗原可源自ha或na糖蛋白。在具体实施方式中，抗原可以是重组ha抗原(h5n1,a/vietnam/1203/2004；protein sciences；usa)，例如源自在genbank登录号ay818135下发现的序列或其任何合适的序列变体。
[0235]
肽抗原可源自的细菌或其部分包括例如但不限于炭疽(炭疽杆菌)、布鲁氏菌、百日咳博德特氏菌、念珠菌、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、霍乱、肉毒杆菌、球孢子菌(coccidioides immitis)、隐球菌、白喉、大肠杆菌o157:h7、肠出血性大肠杆菌、产肠毒素性大肠杆菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、军团杆菌、钩端螺旋体、李斯特菌、脑膜炎球菌、肺炎支原体、分枝杆菌、百日咳、肺炎、沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、肺炎链球菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌。
[0236]
在一个实施方式中，肽抗原源自炭疽杆菌。非限制性地，肽抗原可以例如源自炭疽重组保护性抗原(rpa)(list biological laboratories,inc.；campbell,ca)或炭疽突变体重组保护性抗原(mrpa)。rpa的分子量约为83,000道尔顿(da)，并对应于炭疽杆菌产生的三蛋白外毒素的细胞结合组分。保护性抗原介导炭疽致死因子和水肿因子进入靶细胞。在一些实施方式中，抗原可源自在genbank登录号p13423下发现的序列，或其任何合适的序列变体。
[0237]
肽抗原可源自的原生动物或其部分包括例如但不限于引起疟疾的疟原虫属(恶性疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫或诺氏疟原虫)。
[0238]
在一个实施方式中，肽抗原源自疟原虫种类。例如但不限于，肽抗原可以源自环子孢子蛋白(circumsporozoite protein)(csp)，其是疟原虫(疟原虫属某种)的子孢子阶段的分泌蛋白。csp的氨基酸序列由免疫显性中心重复区组成，两侧是n和c末端的保守基序，当寄生虫从蚊子传播到哺乳动物载体时，这些基序与蛋白质加工有关。csp的结构和功能在感染人类、非人类灵长类动物和啮齿动物的多种疟疾菌株中高度保守。在一个实施方式中，源自csp的肽抗原是疟疾病毒样颗粒(vlp)抗原，其包含在土拨鼠肝炎病毒核心抗原上展示的环子孢子t和b细胞表位。
[0239]
在另一个实施方式中，肽抗原可以源自癌症或肿瘤相关蛋白，例如膜表面结合的癌症抗原。
[0240]
在一个实施方式中，癌症可以是由病原体例如病毒引起的癌症。与癌症发展相关的病毒是普通技术人员已知的并且包括但不限于人乳头瘤病毒(hpv)、约翰坎宁安病毒(john cunningham virus)(jcv)、人疱疹病毒8、爱泼斯坦巴尔病毒(ebv)、默克尔细胞多瘤病毒、丙型肝炎病毒和人类t细胞白血病病毒-1。因此，在一个实施方式中，肽抗原可以源自与癌症发展相关的病毒。
[0241]
在一个实施方式中，肽抗原是癌症相关抗原。许多癌症或肿瘤相关蛋白是本领域已知的，例如但不限于wo2016/176761中描述的那些。本文所公开的方法、制品、组合物、用途和试剂盒可以使用或包含癌症相关抗原的任何肽抗原、或其片段或修饰变体。
[0242]
在具体实施方式中，肽抗原是一种或多种存活蛋白抗原。生存素，又称杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列包含蛋白5(birc5)，是参与细胞凋亡负调控的蛋白质。它已被归类为凋亡蛋白抑制剂家族(iap)的成员。生存素是16.5kda的细胞质蛋白，其含有单个bir基序和高度带电的羧基末端卷曲区域，而不是ring指。编码生存素的基因与效应细胞蛋白酶受体-1(epr-1)的序列几乎相同，但以相反的方向定向。生存素(智人)的编码序列为429个核苷酸长度，包括终止密码子(seq id no:15)。编码的蛋白质生存素(智人)为142个氨基酸长度(seq id no:16)。
[0243]
在一个实施方式中，肽抗原是源自生存素蛋白或其片段的任何肽、多肽或其变体。在一个实施方式中，肽抗原可以是生存素抗原，例如但不限于wo2016/176761中公开的那些。
[0244]
在一个实施方式中，生存素肽抗原可以包含全长生存素多肽。可选地，生存素肽抗原可以是包含任何长度的生存素蛋白片段的生存素肽。示例性实施方式包括包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基的生存素肽。在具体实施方式中，生存素肽由七肽、八肽、九肽、十肽或十一肽组成，分别由生存素蛋白(例如seq id no:
16)的7、8、9、10、11个连续氨基酸残基组成。生存素抗原的具体实施方式包括约9或10个氨基酸的生存素肽。
[0245]
生存素肽抗原还包括天然生存素肽的变体和功能性等同物。生存素肽的变体或功能性等同物包括与生存素蛋白的具体序列相比显示具有差异的氨基酸序列的肽，例如一个或多个氨基酸取代、缺失或添加或其任何组合。差异可以测量为生存素蛋白序列和生存素肽变体或生存素肽功能性等同物之间同一性的降低。在一个实施方式中，肽抗原可以包括在wo2004/067023；wo2006/081826或wo2016/176761中公开的任何一种或多种生存素肽、生存素肽变体或生存素肽功能性等同物。在具体实施方式中，生存素肽抗原可以是以下中的任何一种或多种：feeltlgef(seq id no:17)；fteltlgef(seq id no:18)；ltlgeflkl(seq id no:19)；lmlgeflkl(seq id no:20)；ristfknwpf(seq id no:21)；ristfknwpk(seq id no:22)；stfknwpfl(seq id no:23)；lppawqpfl(seq id no:24)。
[0246]
在一个实施方式中，肽抗原是自身抗原。如本领域公知的，自身抗原是来源于受试者体内的抗原。在正常稳态条件下，免疫系统通常对自身抗原无反应。因此，这些类型的抗原给靶向免疫疗法的开发带来了困难。在一个实施方式中，肽抗原是自身抗原或其片段或修饰变体。
[0247]
在一个实施方式中，肽抗原是新抗原。如本文所用，术语“新抗原”是指由表达的蛋白质中的肿瘤特异性突变产生的一类肿瘤抗原。新抗原可以源自任何癌症、肿瘤或其细胞。在新抗原的上下文中，本文使用的术语“源自”包括但不限于：从原始来源(例如受试者)直接分离或获得的新抗原；合成或重组产生的新抗原，其序列与来自原始来源的新抗原相同；或由原始来源的新抗原或其片段制成的新抗原。产生新抗原的表达蛋白质中的突变可能是患者特异性的。“患者特异性”是指一种或多种突变对于个体受试者是独特的。然而，有可能不止一名受试者将共享相同的一种或多种突变。因此，“患者特异性”突变可能由一小部分或大量受试者亚群共享。
[0248]
新抗原可以包含一个或多个新表位。如本文所用，术语“表位”是指可以被免疫系统，具体是被抗体、b细胞或t细胞识别的肽序列。“新表位”是与天然氨基酸序列相比包含肿瘤特异性突变的新抗原的表位。一般而言，新表位可通过筛选新抗原以寻找有潜力结合患者hla的锚定残基来鉴别。新表位通常使用可以预测肽与hla结合的算法(例如netmhc)进行归类。
[0249]“t细胞新表位”应理解为突变的肽序列，其可以与i类或ii类mhc分子结合——以呈递肽的mhc分子或mhc复合物的形式。t细胞新表位通常应该是一种易于被t细胞受体识别的新表位，以便可以发生细胞介导的免疫应答。“b细胞新表位”应理解为表示可以被b细胞和/或抗体识别的突变肽序列。
[0250]
在一些实施方式中，新抗原的至少一个新表位是患者特异性新表位。如本文所用，“患者特异性新表位”是指新表位中的一种或多种突变对于个体受试者是独特的。然而，有可能不止一名受试者将共享相同的一种或多种突变。因此，“患者特异性新表位”可能由一小部分或大量的受试者亚群共享。
[0251]
在一个实施方式中，可以使用例如netmhc的选择算法从癌症的突变体细胞蛋白中选择新抗原，该算法寻找预计与mhc i类和/或mhc ii类蛋白结合的基序。在一个实施方式中，新抗原可以源自先前与癌症表型相关的突变基因或蛋白质，例如肿瘤抑制基因(例如
p53)；dna修复途径蛋白(例如brca2)和癌基因。经常包含引起癌症表型的突变的基因的示例性实施方式在例如castle 2012中描述。普通技术人员将充分了解与癌症相关联的其他突变基因和/或蛋白质，并且这些可从其他文献来源获得。在一些实施方式中，新抗原可以包含castle 2012公开中的新抗原或由其组成。castle 2012不提供新抗原的实际序列，但确实提供突变肽的基因id和位置，由其可以使用例如从国家生物技术信息中心(ncbi)在线可获取的pubmed数据库鉴别实际序列。
[0252]
在一个实施方式中，新抗原可以是castle 2012的表1中公开的一种或多种mut1-50新抗原，或相同或相关蛋白(例如人同源物)的新抗原。在一个实施方式中，新抗原可以是以下中的一种或多种，或相同或相关的蛋白(例如人同源物)的新抗原：mut25(stanyntshlnndvwqifenpvdwkek；seq id no:25)、mut30(pskpsfqefvdwenvspelnstdqpfl；seq id no:26)和mut44(efkhikafdrtfannpgpmvvfatpgm；seq id no:27)。
[0253]
在一个具体实施方式中，肽抗原是一种或多种黑素瘤相关抗原9(mage-a9)抗原。mage-a9是属于在多种恶性肿瘤中表达的黑色素瘤相关抗原(mage)蛋白质组的蛋白质。在一些实施方式中，肽抗原是源自mage-a9蛋白或其片段的任何肽、多肽或其变体。在一个实施方式中，mage-a9肽抗原可以包含全长mage-a9多肽。可选地，mage-a9肽抗原可以是包含mage-a9蛋白片段的mage-a9肽。在具体实施方式中，mage-a9肽抗原可以是以下中的任何一种或多种：kvaelvhfl(seq id no:35)；glmgaqept(seq id no:36)；alsvmgvyv(seq id no:37)；flwgskaha(seq id no:38)。
[0254]
t辅助表位
[0255]
在一些实施方式中，至少一种试剂是t辅助表位。t辅助表位可以作为疏水相试剂和/或水相试剂并入根据本发明的组合物中。在一些实施方式中，当至少一种其他试剂是抗原时使用t辅助表位。
[0256]
t辅助表位是具有t辅助活性的氨基酸序列(天然或非天然氨基酸)。t辅助表位被t辅助淋巴细胞识别，t辅助淋巴细胞在建立和最大化免疫系统的能力中起重要作用，并参与活化和指导其他免疫细胞，例如细胞毒性t淋巴细胞。t辅助表位可以由连续或不连续的表位组成。因此，并非t辅助的每个氨基酸都必须是表位的一部分。
[0257]
因此，t辅助表位，包括t辅助表位的类似物和区段，能够增强或刺激免疫应答。免疫显性t辅助表位在具有广泛不同mhc类型的动物和人群中具有广泛的反应性(celis 1988,demotz 1989,chong 1992)。主题肽的t辅助结构域可具有约10至约50个氨基酸，更具体地约10至约30个氨基酸。当存在多个t辅助表位时，每个t辅助表位独立地起作用。
[0258]
在另一个实施方式中，t辅助表位可以是t辅助表位类似物或t辅助区段。t辅助表位类似物可包括t辅助表位中1至约10个氨基酸残基的取代、缺失和插入。t辅助区段是足以增强或刺激免疫应答的t辅助表位的邻接部分。t辅助区段的实例是一系列重叠的肽，这些肽源自单个较长的肽。
[0259]
在具体实施方式中，t辅助表位可以是修饰的破伤风毒素肽a16l(氨基酸830至844；aqyikanskfigitel；seq id no:28)，其氨基末端添加了丙氨酸残基以增强稳定性(slingluff 2001)。
[0260]
可以使用的t辅助表位的其他来源包括，例如，乙型肝炎表面抗原辅助t细胞表位、百日咳毒素辅助t细胞表位、麻疹病毒f蛋白辅助t细胞表位、沙眼(trachomitis)衣原体主
1981)。此外，通过每12个重复胞苷酸残基引入尿苷残基而错配的聚肌胞分子的干扰素诱导潜能(hendrix 1993)表明12个残基的最小双链聚肌胞分子足以促进干扰素产生。其他人还提出，与双链多核苷酸的0.5-1个螺旋转角相对应的小至6-12个残基的区域能够触发诱导过程(greene 1978)。如果合成制备，则聚肌胞多核苷酸的长度通常约为20个或更多残基(通常长度为22、24、26、28或30个残基)。如果半合成制备(例如使用酶)，则链的长度可以是500、1000或更多个残基。
[0272]
因此，如本文所用，“聚肌胞”、“聚肌胞多核苷酸”或“聚肌胞多核苷酸佐剂”是双链或单链多核苷酸分子(rna或dna或dna和rna的组合)，其每条链含有至少6个邻接的肌苷酸或胞苷酸残基，或6个以任意顺序(例如iiciic或icicic)选自肌苷酸和胞苷酸的邻接残基，并且其能够诱导或增强至少一种哺乳动物受试者中的炎性细胞因子例如干扰素的产生。聚肌胞多核苷酸通常具有约8、10、12、14、16、18、20、22、24、25、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、500、1000或更多个残基。优选的聚肌胞多核苷酸可具有约6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30个核苷酸的最小长度和约1000、500、300、200、100、90、80、70、60、50、45或40个核苷酸的最大长度。
[0273]
双链聚肌胞多核苷酸的每条链可以是肌苷酸或胞苷酸残基的均聚物，或者每条链可以是含有肌苷和胞苷酸残基二者的杂聚物。在任一情况下，聚合物可以被一个或多个非肌苷酸或非胞苷酸残基(例如尿苷)中断，前提是存在至少一个如上所述的6i、6c或6i/c残基的邻接区域。通常，聚肌胞多核苷酸的每条链将每6个i/c残基含有不超过1个非i/c残基，更优选每8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30个i/c残基中不超过1个非i/c残基。
[0274]
聚肌胞多核苷酸中的肌苷酸或胞苷酸(或其他)残基可以如本领域已知的那样被衍生或修饰，前提是保留聚肌胞多核苷酸促进炎性细胞因子例如干扰素的产生的能力。衍生物或修饰的非限制性实例包括例如叠氮基修饰、氟修饰或使用硫酯(或类似)键代替天然磷酸二酯键以增强体内稳定性。聚肌胞多核苷酸也可以被修饰为例如通过使分子与带正电荷的聚赖氨酸和羧甲基纤维素或带正电荷的合成肽复合以例如增强其对体内降解的抗性。
[0275]
在一个实施方式中，聚肌胞多核苷酸可以是含有肌苷酸残基(i)和胞苷酸残基(c)的单链分子。作为示例但非限制性地，单链聚肌胞可以是重复didc的序列。在具体实施方式中，单链多聚肌胞的序列可以是(ic)
13
的26-mer序列，即icicicicicicicicicicicicic(seq id no:32)。如本领域技术人员将理解的，由于它们的性质(例如互补性)，预计重复didc的这些单链分子将自然地形成同源二聚体，因此它们在概念上类似于polyi/polyc二聚体。
[0276]
在一个实施方式中，聚肌胞多核苷酸佐剂是传统形式的聚肌胞，其具有大约989,486道尔顿的分子量，含有不同链长度的数百个碱基对的polyi和polyc的混合物(thermo scientific；usa)。
[0277]
在一个实施方式中，佐剂可以是活化或增加tlr2活性的佐剂。如本文所用，“活化”tlr2或“增加”tlr2的“活性”的佐剂包括任何佐剂，在一些实施方式中是用作tlr2激动剂的基于脂质的佐剂。此外，活化tlr2或增加tlr2的活性包括其以任何单体、同源二聚体或异源二聚体形式的活化，和具体包括作为与tlr1或tlr6的异源二聚体(即tlr1/2或tlr2/6)的tlr2的活化。活化tlr2或增加tlr2活性的佐剂的示例性实施方式包括基于脂质的佐剂，例如在wo2013/049941中描述的那些。
[0278]
在一个实施方式中，佐剂可以是基于脂质的佐剂，例如在wo2013/049941中公开
的。在一个实施方式中，基于脂质的佐剂是包含棕榈酸部分例如二棕榈酰-s-甘油基-半胱氨酸(pam2cys)或三棕榈酰-s-甘油基-半胱氨酸(pam3cys)。在一个实施方式中，佐剂是脂肽。示例性脂肽包括但不限于pam2cys-ser-(lys)4(seq id no:33)或pam3cys-ser-(lys)4(seq id no:33)。
[0279]
在一个实施方式中，佐剂是pam3cys-skkkk(emc microcollections,germany；seq id no:33)或其变体、同源物和类似物。脂肽的pam2家族已被证明是脂肽的pam3家族的有效替代。
[0280]
在一个实施方式中，佐剂可以是脂质a模拟物或类似物佐剂，例如在wo2016/109880和其中引用的参考文献中公开的那些。在具体实施方式中，佐剂可以是如wo2016/109880中所公开的jl-265或jl-266。
[0281]
可以使用的佐剂的进一步的实例包括但不限于趋化因子、集落刺激因子、细胞因子、1018iss、铝盐、amplivax、as04、as15、abm2、adjumer、algammulin、as01b、as02(sbasa)、aso2a、bcg、骨化三醇、壳聚糖、霍乱毒素、cp-870、893、cpg、聚肌胞、cyaa、detox(ribi immunochemicals)、二甲基二(十八烷基)溴化铵(dda)、邻苯二甲酸二丁酯(dbp)、dslim、γ菊粉、gm-csf、gmdp、甘油、ic30、ic31、咪喹莫特、imufact imp321、is patch、iscom、iscomatrix、juvimmune、lipovac、lps、脂质核心蛋白、mf59、单磷酰脂质a及其类似物或模拟物、montanide
tm ims1312、基于montanide
tm
的佐剂(例如montanide
tm isa-51、-50、-70和-720)、ok-432、om-174、om 197-mp-ec、ontak、peptel载体系统、其他基于棕榈酰的分子、plg微粒、雷西莫特、鲨烯、slr172、yf-17dbcg、qs21、quila、p1005、泊洛沙姆、皂苷、合成多核苷酸、酵母聚糖、百日咳毒素。
[0282]
过敏原
[0283]
在一些实施方式中，至少一种试剂是过敏原。过敏原可以作为疏水相试剂和/或水相试剂并入根据本发明的组合物中。过敏原、其片段、类似物或变体可以从天然来源获得或合成制备。
[0284]
如本文所用，“过敏原”是指可引起过敏的任何物质。过敏原可以源自但不限于植物、动物、真菌、昆虫、食物、药物、灰尘和螨虫的细胞、细胞提取物、蛋白质、多肽、肽、多糖、多糖缀合物、多糖和其他分子的肽和非肽模拟物、小分子、脂质、糖脂和碳水化合物。过敏原包括但不限于环境气源性过敏原；植物花粉(例如豚草/花粉热)；杂草花粉过敏原；草花粉过敏原；约翰逊草；树花粉过敏原；黑麦草；蛛形纲动物过敏原(例如房尘螨过敏原)；储存螨过敏原；日本雪松花粉/花粉热；霉菌/真菌孢子过敏原；动物过敏原(例如狗、豚鼠、仓鼠、沙鼠、大鼠、小鼠等过敏原)；食物过敏原(例如甲壳类动物；坚果；柑橘类水果；面粉；咖啡)；昆虫过敏原(例如跳蚤、蟑螂)；毒液：(膜翅目、胡峰、蜜蜂、黄蜂、大黄蜂、火蚁)；细菌过敏原(例如链球菌抗原；寄生虫过敏原，例如蛔虫抗原)；病毒过敏原；药物过敏原(例如青霉素)；激素(例如胰岛素)；酶(例如链激酶)；以及能够充当不完全抗原或半抗原的药物或化学品(例如酸酐和异氰酸酯)。
[0285]
dna或rna多核苷酸
[0286]
在一些实施方式中，至少一种试剂是dna多核苷酸或rna多核苷酸。dna或rna多核苷酸可以作为疏水相试剂和/或水相试剂并入根据本发明的组合物中。在一些实施方式中，dna或rna多核苷酸编码多肽。在一些实施方式中，dna或rna多核苷酸编码一种或多种本文
所述的肽抗原。在一些实施方式中，dna或rna多核苷酸编码在受试者体内表达的多肽。
[0287]
如本文所用，“dna或rna多核苷酸”包括任何长度(例如9、12、15、18、21、24、27、30、60、90、120、150、300、600、1200、1500个或更多个核苷酸)或链数(例如单链或双链)的核苷酸链。多核苷酸可以是dna(例如基因组dna、cdna、质粒dna)或rna(例如mrna)或其组合。多核苷酸可以是天然存在的或合成的(例如化学合成的)。预期多核苷酸可在核苷酸链中含有一种或多种含氮碱基、戊糖或磷酸基团的修饰。这样的修饰在本领域中是众所周知的并且可以出于例如改善多核苷酸的稳定性、溶解性或转录/翻译活性的目的。
[0288]
多核苷酸可以以多种形式使用。在一个实施方式中，可以以线性形式，或者插入到质粒(例如表达质粒)中使用裸露的多核苷酸。在其他实施方式中，可以使用活载体如病毒载体或细菌载体。
[0289]
取决于多核苷酸的性质和预期用途，可以存在一种或多种调节性序列，其有助于dna转录成rna和/或rna翻译成多肽。例如，如果预期或不需要转录或翻译多核苷酸，则可以不存在此类调节性序列。在某些情况下，例如在多核苷酸是信使rna(mrna)分子的情况下，不需要与转录过程相关的调节性序列(例如启动子)，并且可以在不存在启动子的情况下实现蛋白质表达。普通技术人员可以根据情况需要包括合适的调节性序列。
[0290]
在一些实施方式中，多核苷酸存在于表达盒中，其中它可操作地连接至允许多核苷酸在受试者中表达的调节性序列。表达盒的选择取决于受试者以及表达的多肽所期望的特征。通常，表达盒包括在受试者中起作用并且可以是组成型或诱导型的启动子；核糖体结合位点；如有必要，起始密码子(atg)；编码目标多肽的多核苷酸；终止密码子；和任选的3'末端区域(翻译和/或转录终止子)。可以包括另外的序列，例如编码信号肽的区域。编码目标多肽的多核苷酸可以与表达盒中的任何其他调节性序列同源或异源。待与目标多肽一起表达的序列，例如信号肽编码区，通常位于编码待表达的蛋白质的多核苷酸附近，并位于适当的阅读框中。由编码待表达的蛋白质的多核苷酸单独或与任何其他待表达的序列(例如信号肽)一起构成的开放阅读框位于启动子的控制下，以便在施用组合物的受试者中进行转录和翻译。
[0291]
适用于在广泛的宿主系统中表达多核苷酸的启动子是本领域众所周知的。适用于在哺乳动物中表达多核苷酸的启动子包括组成型、普遍存在或组织特异性起作用的那些启动子。非组织特异性启动子的实例包括病毒来源的启动子。病毒启动子的实例包括小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、人类免疫缺陷病毒长末端重复(hiv ltr)启动子、莫洛尼病毒、禽白血病病毒(alv)、巨细胞病毒(cmv)即刻早期启动子/增强子、劳斯肉瘤病毒(rsv)、腺相关病毒(aav)启动子；腺病毒启动子和爱泼斯坦巴尔二氏病毒(ebv)启动子。病毒启动子与某些多肽的相容性是一个考虑因素，因为它们的组合可能会影响表达水平。可以使用合成启动子/增强子来优化表达(参见例如美国专利公开2004/0171573)。组织特异性启动子的实例是驱动在肌细胞中表达的结蛋白启动子(li 1989；li&paulin 1991；和li&paulin 1993)。其他实例包括人工启动子，例如合成肌肉特异性启动子和嵌合肌肉特异性/cmv启动子(li 1999；hagstrom 2000)。
[0292]
如上所述，目标多核苷酸连同任何必要的调节性序列可以裸递送，例如单独或作为质粒的一部分递送，或者可以在病毒或细菌或细菌载体中递送。无论使用质粒型载体，还是细菌载体或病毒载体，都可能期望载体不能在受试者体内复制或基本上整合。此类载体
包括其序列不含与受试者基因组具有基本上同一性的区域的那些，以使宿主-载体重组的风险最小化。一种方法是使用并非源自受体基因组的启动子来驱动目标多肽的表达。例如，如果受体是哺乳动物，则启动子优选是非哺乳动物来源的，尽管它应该能够在哺乳动物细胞中起作用，例如，病毒启动子。
[0293]
可用于递送多核苷酸的病毒载体包括例如腺病毒和痘病毒。有用的细菌载体包括例如志贺氏菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、乳杆菌、卡介菌(bacille bilie de calmette-guerin)(bcg)和链球菌。美国专利号4,920,209中描述了腺病毒载体的实例，以及构建能够表达多核苷酸的腺病毒载体的方法。痘病毒载体包括牛痘病毒和金丝雀痘病毒，其分别在美国专利号4,722,848和美国专利号5,364,773中描述。另见，例如，tartaglia 1992描述了牛痘病毒载体，taylor 1995参考了金丝雀痘。如kieny 1984所述，可以通过同源重组获得能够表达目的多核苷酸的痘病毒载体，从而在适当的条件下将多核苷酸插入病毒基因组中，以在哺乳动物细胞中表达。
[0294]
关于细菌载体，可用于在宿主中表达外源多核苷酸的非毒性霍乱弧菌突变体菌株是已知的。mekalanos 1983和美国专利号4,882,278描述了两个ctxa等位基因中的每一个的大量编码序列缺失的菌株，因此不产生功能性霍乱毒素。wo 92/11354描述了如此菌株，其中irga基因座因突变而失活；这种突变可以与ctxa突变结合在单个菌株中。wo 94/01533描述了缺乏功能性ctxa和attrs1 dna序列的缺失突变体。如wo 94/19482中所述，这些突变体菌株经基因工程改造以表达异源蛋白质。在nakayama 1988和wo 92/11361中描述了减毒的鼠伤寒沙门氏菌菌株，其经基因工程改造用于异源蛋白的重组表达。描述了可用作载体以在受试者中表达外源蛋白质的其他细菌菌株：high 1992和sizemore 1995中的福氏志贺氏菌；medaglini 1995中的戈氏链球菌；和flynn 1994、wo 88/06626、wo 90/00594、wo91/13157、wo 92/01796和wo 92/21376中的卡介苗。在细菌载体中，目标多核苷酸可以插入细菌基因组或作为质粒的一部分保持游离状态。
[0295]
在一些实施方式中，rna多核苷酸不编码多肽并且是反义rna。如本文所用，“反义rna”是与信使rna(mrna)互补的任何单链rna。只要反义rna仍然能够通过与mrna碱基配对从而阻碍翻译机器来抑制mrna的翻译，反义rna可以表现出与mrna的100％互补性或小于100％的互补性。在一个实施方式中，反义rna是高度结构化的，由一个或多个茎环二级结构组成，其侧接单链(未配对)区域或被其隔开。在一些实施方式中，三级结构，例如假结，可以在两个或更多个二级结构元件之间形成。
[0296]
在一些实施方式中，rna多核苷酸不编码多肽并且是干扰rna，例如小干扰rna(sirna)、微小rna(mirna)或小发夹rna(shrna)。rna干扰(rnai)是一种生物学过程，其中rna分子通过中和靶向mrna分子来抑制基因表达或翻译。两种类型的小核糖核酸(rna)分子——microrna(mirna)和小干扰rna(sirna)——是rna干扰的核心。sirna是一类双链rna分子，其通常长度为20-25个碱基对。它通过在转录后降解mrna从而阻止翻译来干扰具有互补核苷酸序列的特定基因的表达。sirna的天然结构通常是一个短的20-25双链rna，每端具有两个悬垂的核苷酸。dicer酶催化从长dsrna和小发夹rna(shrna)产生sirna。shrna是具有紧密发夹转角的人工rna分子。sirna分子的设计和产生以及作用机制是本领域已知的。mirna类似于sirna，除了mirna源自rna转录物的区域，这些区域自身折叠形成短发夹，而sirna源自更长的双链rna。在一个实施方式中，治疗剂可以是这些干扰rna(sirna、mirna或
shrna)中的任何一种或多种。干扰rna应该是能够减少或沉默(防止)其内源性细胞对应物的基因/mrna表达的rna。在一个实施方式中，干扰rna源自天然存在的干扰rna。在一个实施方式中，干扰rna是合成产生的。在一个实施方式中，治疗剂可以是antagomir。antagomirs(也称为抗-mir或blockmir)是合成工程改造的寡核苷酸，其沉默内源性mirna。目前尚不清楚antagomirization(antagomir抑制mirna活性的过程)是如何运作的，但据信它是通过不可逆地结合mirna抑制的。由于microrna的混杂性，antagomir可以影响许多不同mrna分子的调节。antagomir被设计成具有与作为microrna结合位点的mrna序列互补的序列。
[0297]
组合物
[0298]
本发明的组合物包含疏水相的乳剂，所述疏水相包含至少一种疏水相试剂，其中疏水相在包含至少一种水相试剂的水相中乳化。
[0299]
本文公开的组合物可以以治疗有效量施用于受试者。如本文所用，“治疗有效量”是指有效地为受试者提供治疗、预防或诊断益处的组合物或其中所含试剂的量，和/或足以活化或调节受试者中免疫应答的量。如本文所用，“活化”或“诱导”免疫应答意指引发和/或加强免疫应答。诱导免疫应答包括相对于先前免疫应答状态启动、增强、提高、改善或强化免疫应答以使宿主受益的情况。如本文所用，“调节”免疫应答是独特的并且不同于活化免疫应答。“调节”是指本文中的活性剂和/或免疫调节剂增强或压制由其他机制或化合物(例如，由抗原或免疫原)活化的免疫应答。
[0300]
在一些实施方式中，组合物的治疗有效量是能够在治疗具体疾病或紊乱的受试者中诱导临床反应的量。确定组合物的治疗有效量完全在本领域技术人员的能力范围内，具体是根据本文提供的公开内容。治疗有效量可以根据多种因素而变化，例如受试者的状况、体重、性别和年龄。
[0301]
在一些实施方式中，乳剂组合物的一种或多种组分作为干燥的制品或干燥的组合物提供，用于在水溶液或疏水物质中重构。可以使用多种方法来生产本领域已知的干燥的制品或干燥的组合物。在一个实施方式中，干燥通过冻干、喷雾冷冻干燥或喷雾干燥进行。本领域技术人员熟知这些干燥技术以及它们可以如何进行。在一个实施方式中，干燥通过冻干进行。如本文所用，“冻干”、“冻干的”和“冷冻干燥”可互换使用。如本领域公知的，冻干通过冷冻材料然后降低环境压力以允许材料中的挥发性溶剂(例如水)直接从固相升华到气相来进行。
[0302]
如本文所用，术语“干燥的制品”或“干燥的组合物”不一定意味着该制品或组合物是完全干燥的。例如，取决于本文公开的方法中使用的一种或多种溶剂，挥发性和/或非挥发性材料的小组分将会保留在干燥的制品或干燥的组合物中。在一个实施方式中，非挥发性材料将保留。“干燥的制品”或“干燥的组合物”是指制品或组合物不再含有大量的水。用于干燥制品或组合物的方法应当能够从经定制大小的脂质囊泡颗粒/治疗剂混合物中除去基本上所有的水。因此，在一个实施方式中，干燥的制品或干燥的组合物完全不含水。在另一个实施方式中，基于干燥过程(例如冻干)的限制，干燥的制品或干燥的组合物可以含有残留水分含量。残留水分含量通常按干燥的制品的重量计小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.25％、小于0.1％、小于0.05％或更少。该残留水分含量将不超过干燥的制品重量的5％，因为这将导致产品不澄清。
[0303]
当需要时，干燥的制品或干燥的组合物可以在合适的溶剂、运载体或液体中重构。
如本文所用，“重构”是指通过向干燥的制品或干燥的组合物中添加合适的溶剂、溶液、运载体或液体，使干燥的制品或干燥的组合物成为溶液或悬浮液。如本文所用，术语“重构的”和“重悬浮的”可以互换使用。例如，可以将合适体积的疏水物质(例如矿物油中的二缩甘露醇油酸酯)添加到脂质、胆固醇和至少一种疏水试剂的干燥的组合物中以重构干燥的组合物。在另一个实例中，可以将合适体积的水添加到至少一种水相试剂的干燥的制品中以重构干燥的制品。在重构期间，可以将干燥的制品或干燥的组合物在溶剂、运载体或液体中浸泡一段时间和/或通过搅拌混合直到干燥的制品或干燥的组合物完全溶解或完全悬浮。
[0304]
试剂盒
[0305]
本文公开的组合物任选地作为试剂盒提供给用户。在一个实施方式中，试剂盒用于制备用于治疗、防止和/或诊断疾病、紊乱或病症的组合物。在一个实施方式中，试剂盒用于制备用于诱导抗体和/或ctl免疫应答的组合物。在一个实施方式中，试剂盒用于制备用于递送至少两种活性剂、药物剂或治疗剂的组合物。在一个实施方式中，试剂盒用于制备用于提供治疗性组合疗法的组合物。
[0306]
在一些实施方式中，组合物的成分作为用于在本文公开的疏水物质或水溶液中重悬浮的干燥的制品或干燥的组合物在试剂盒中提供。提供干燥的制品或干燥的组合物可能有利于成分的储存和/或稳定性。
[0307]
在一个实施方式中，本公开内容的试剂盒包含容器，该容器包含至少一种疏水相试剂的干燥的制品。在一个实施方式中，本公开内容的试剂盒包含容器，该容器包含至少一种疏水相试剂、脂质和胆固醇的干燥的组合物。在这样的实施方式中，需要疏水物质来重悬浮干燥的制品或干燥的组合物。疏水物质可以在单独供应的单独容器中的试剂盒中提供，或者最终用户已经拥有。
[0308]
在一个实施方式中，本公开内容的试剂盒包含含有水相的容器，其中所述水相包含水和/或水溶液，以及至少一种水相试剂。
[0309]
在一个实施方式中，本公开内容的试剂盒包含容器，该容器包含至少一种水相试剂的干燥制品。在这样的实施方式中，需要水和/或水溶液来重悬浮干燥的制品。水和/或水溶液可以在单独供应的单独容器中的试剂盒中提供，或者最终用户已经拥有。
[0310]
试剂盒可进一步包含一种或多种另外的试剂、包装材料和详细说明使用试剂盒组件的优选方法的说明书集或用户手册。在一些实施方式中，试剂盒包括一个或多个注射器，用于混合和/或施用组合物。在这样的实施方式中，试剂盒可以进一步含有用于连接注射器的连接器。在一个实施方式中，容器是小瓶。
[0311]
方法和用途
[0312]
本文所公开的组合物可用于其中期望向受试者施用至少两种活性剂、药物剂或治疗剂的任何情况。受试者可以是脊椎动物，例如鱼、鸟或哺乳动物。在一个实施方式中，受试者是哺乳动物。在一个实施方式中，受试者是人。
[0313]
在一个实施方式中，组合物可用于治疗、防止或诊断疾病、紊乱或病症的方法中。在一个实施方式中，方法包括向受试者施用如本文所述的组合物。
[0314]
在一个实施方式中，组合物可用于调节受试者中免疫应答的方法中。如本文所用，术语“调节”旨在指代免疫刺激(例如增强免疫应答)和免疫抑制(例如防止或减少免疫应答)二者。通常，方法将涉及免疫刺激或免疫抑制中的一种或另一种，但方法可能涉及两者。
如本文所述，“免疫应答”可以是细胞介导的(ctl)免疫应答或抗体(体液)免疫应答。
[0315]
在一些实施方式中，本文公开的组合物可用于诱导对组合物中提供的抗原(例如肽抗原)的细胞介导的免疫应答的方法中。在一些实施方式中，组合物进一步包含增强对抗原的免疫应答的试剂(例如抗-ctla-4抗体)。
[0316]
如本文所用，术语“细胞介导的免疫应答”、“细胞免疫”、“细胞免疫应答”或“细胞毒性t淋巴细胞(ctl)免疫应答”(在本文中可互换使用)是指以响应抗原活化巨噬细胞和自然杀伤细胞、产生抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞和/或释放多种细胞因子为特征的免疫应答。细胞毒性t淋巴细胞是t淋巴细胞的亚群(一种类型的白细胞)，其能够诱导受感染的体细胞或肿瘤细胞死亡；它们杀死被病毒(或其他病原体)感染的细胞，或者以其他方式受损或功能失调的细胞。大多数细胞毒性t细胞表达可以识别与i类mhc分子结合的具体肽抗原的t细胞受体。通常，细胞毒性t细胞也表达cd8(即cd8 t细胞)，它被吸引至i类mhc分子的部分。这种亲和力使细胞毒性t细胞和靶细胞在抗原特异性活化期间紧密结合在一起。细胞免疫通过例如活化抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞(例如抗原特异性cd8 t细胞)来保护身体，这些细胞能够裂解在其表面上展示外来或突变抗原表位的身体细胞，例如展示肿瘤-特异性抗原(例如新抗原)的癌细胞；活化巨噬细胞和自然杀伤细胞，使它们能够破坏细胞内病原体；并刺激细胞分泌多种细胞因子，这些细胞因子影响参与适应性免疫应答和先天免疫应答的其他细胞的功能。
[0317]
细胞免疫是适应性免疫应答的重要组成部分，细胞通过与抗原呈递细胞(如树突细胞、b淋巴细胞和较小程度的巨噬细胞)相互作用识别抗原后，通过以下多种机制保护身体，例如：
[0318]
1.活化抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞，这些细胞能够诱导在其表面上展示外来或突变抗原表位的身体细胞的凋亡，例如展示肿瘤特异性抗原的癌细胞；
[0319]
2.活化巨噬细胞和自然杀伤细胞，使其能够破坏细胞内病原体；和
[0320]
3.刺激细胞分泌多种细胞因子，这些细胞因子影响参与适应性免疫应答和先天免疫应答的其他细胞的功能。
[0321]
细胞介导的免疫在去除病毒感染的细胞方面最有效，但也参与防御真菌、原生动物、癌症和细胞内细菌。它还在移植排斥中起主要作用。
[0322]
由于细胞介导的免疫涉及多种细胞类型的参与并由不同的机制介导，因此可以使用数种方法来证明疫苗接种后免疫的诱导。这些可大致分为检测：i)特异性抗原呈递细胞；ii)特异性效应细胞及其功能和iii)可溶性介质例如细胞因子的释放。
[0323]
i)抗原呈递细胞：树突细胞和b细胞(以及较小程度的巨噬细胞)配备有允许增强t细胞活化的特定免疫刺激受体，并且被称为专业抗原呈递细胞(apc)。这些免疫刺激分子(也称为共刺激分子)在感染或疫苗接种后，在抗原呈递给效应细胞(如cd4和cd8细胞毒性t细胞)期间在这些细胞上被上调。此类共刺激分子(如cd40、cd80、cd86、mhc i类或mhc ii类)可以例如通过使用流式细胞术利用针对这些分子的荧光染料缀合抗体连同特异性鉴别apc的抗体(例如用于树突细胞的cd11c)进行检测。
[0324]
ii)细胞毒性t细胞：(也称为tc、杀伤性t细胞或细胞毒性t淋巴细胞(ctl))是t细胞的亚群，其诱导感染病毒(和其他病原体)或表达肿瘤抗原的细胞死亡。这些ctl直接攻击在其表面携带某些外来或异常分子的其他细胞。可以使用体外溶细胞测定法(铬释放测定
法)检测这种细胞毒性的能力。因此，适应性细胞免疫的诱导可以通过这种细胞毒性t细胞的存在来证明，其中，当抗原负载的靶细胞被疫苗接种或感染后体内产生的特异性ctl裂解时。
[0325]
原始细胞毒性t细胞在其t细胞受体(tcr)与肽结合的mhc i类分子强烈相互作用时被活化。这种亲和力取决于抗原/mhc复合物的类型和定向，是使ctl和被感染细胞结合在一起的原因。一旦被活化，ctl就会经历被称为克隆扩张的过程，在这个过程中它获得功能，并迅速分裂，以产生大批“武装的”效应细胞。然后，活化的ctl将在全身各处行进寻找带有独特mhc i类 肽的细胞。这可用于通过在流式细胞术测定中使用肽-mhc i类四聚体在体外鉴别此类ctl。
[0326]
当暴露于这些受感染或功能失调的体细胞时，效应ctl会释放穿孔素和粒溶素：在靶细胞质膜中形成孔的细胞毒素，这允许离子和水流入受感染的细胞，并导致其破裂或裂解。ctl释放颗粒酶(一种丝氨酸蛋白酶)，其经由孔进入细胞以诱导细胞凋亡(细胞死亡)。这些分子从ctl的释放可用作疫苗接种后成功诱导细胞介导的免疫应答的量度。这可以通过酶联免疫吸附测定(elisa)或酶联免疫斑点测定(elispot)来完成，其中可以定量地测量ctl。由于ctl还能够产生重要的细胞因子，例如ifn-γ，因此可以通过elispot和流式细胞仪测量这些细胞中的细胞内ifn-γ，来实现产生ifn-γ的cd8细胞的定量测量。
[0327]
cd4 “辅助”t细胞：cd4 淋巴细胞或辅助t细胞是免疫应答介质，在建立和最大化适应性免疫应答能力方面发挥重要作用。这些细胞没有细胞毒性或吞噬活性；并且不能杀死受感染的细胞或清除病原体，但本质上是通过指导其他细胞执行这些任务来“管理”免疫应答。专业apc可以诱导两种类型的效应cd4 t辅助细胞应答，称为th1和th2，每一种都旨在消除不同类型的病原体。
[0328]
辅助t细胞表达识别与ii类mhc分子结合的抗原的t细胞受体(tcr)。原始辅助t细胞的活化导致其释放细胞因子，这会影响许多细胞类型的活性，包括活化它的apc。辅助t细胞需要比细胞毒性t细胞更温和的活化刺激。辅助t细胞可以提供“帮助”活化细胞毒性细胞的额外信号。专业apc可以诱导两种类型的效应cd4 t辅助细胞应答，称为th1和th2，每一种都旨在消除不同类型的病原体。两种th细胞群在产生的效应蛋白(细胞因子)的模式上有所不同。一般来说，th1细胞通过活化巨噬细胞和细胞毒性t细胞来辅助细胞介导的免疫应答；而th2细胞通过刺激b细胞转化为浆细胞和通过形成抗体来促进体液免疫应答。例如，受th1细胞调节的应答可能会在小鼠中诱导igg2a和igg2b(人中的igg1和igg3)，并有利于细胞介导的对抗原的免疫应答。如果对抗原的igg应答受th2型细胞的调节，则它可能主要增强小鼠中igg1(人中的igg2)的产生。与th1或th2应答相关的细胞因子的量度将给出成功疫苗接种的量度。这可以通过针对th1细胞因子(例如ifn-γ、il-2、il-12、tnf-α等)或th2细胞因子(例如il-4、il-5、il-10等)设计的特异性elisa来实现。
[0329]
iii)细胞因子的测量：从区域淋巴结释放的细胞因子的测量给出成功免疫的良好指示。由于抗原呈递以及apc和免疫效应细胞(如cd4和cd8 t细胞)的成熟，淋巴结细胞释放了几种细胞因子。通过在抗原存在的情况下体外培养这些lnc，可以通过测量某些重要细胞因子如ifn-γ、il-2、il-12、tnf-α和gm-csf的释放来检测抗原特异性免疫应答。这可以通过elisa使用培养上清液和重组细胞因子作为标准来完成。
[0330]
可以以普通技术人员已知的多种方式确定成功的免疫，包括但不限于血凝抑制
(haij)和血清中和抑制测定以检测功能性抗体；挑战研究，其中疫苗接种的受试者受到相关病原体的挑战，以确定疫苗接种的功效；以及使用荧光活化细胞分选(facs)来确定表达特异性细胞表面标记的细胞群，例如用于鉴别活化的或记忆淋巴细胞。普通技术人员还可使用其他已知方法确定用本文公开的组合物免疫是否引发抗体和/或细胞介导的免疫应答。
[0331]
在一个实施方式中，本文公开的组合物可用于诱导针对组合物中提供的抗原(例如肽抗原)的抗体免疫应答的方法。在一些实施方式中，组合物进一步包含增强对抗原的免疫应答的试剂(例如抗-ctla-4抗体)。
[0332]
与细胞介导的免疫相反，“抗体免疫应答”或“体液免疫应答”(在本文中可互换使用)由在b淋巴细胞谱系(b细胞)的细胞中产生的分泌抗体介导。此类分泌的抗体与抗原结合，例如外来物质、病原体(例如病毒、细菌等)和/或癌细胞表面上的那些抗原，并标记它们以进行破坏。
[0333]
如本文所用，“体液免疫应答”是指抗体产生，并且除此之外或可选地，还可以包括伴随它的附属过程，例如t辅助2(th2)或t辅助17(th17)细胞的产生和/或活化、细胞因子产生、同种型转换、亲和力成熟和记忆细胞活化。“体液免疫应答”还可以包括抗体的效应器功能，例如毒素中和、经典补体活化、以及促进吞噬作用和病原体消除。体液免疫应答通常由cd4 th2细胞辅助，因此这种细胞类型的活化或产生也可能表明体液免疫应答。
[0334]“抗体”是包含基本上或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的一种或多种多肽的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ的恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，它们依次分别限定了免疫球蛋白类别igg、igm、iga、igd和ige。典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含含有四个多肽的蛋白质。每个抗体结构单元由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链和一条“重”链。每条链的n末端限定了主要负责抗原识别的可变区。抗体结构单元(例如iga和igm类别的)也可以彼此组装成寡聚形式和另外的多肽链，例如与j链多肽缔合的igm五聚体。
[0335]
抗体是称为b淋巴细胞(b细胞)的白细胞子集的抗原特异性糖蛋白产物。抗原与b细胞表面上表达的抗体接合可诱导抗体应答，其包括刺激b细胞活化、进行有丝分裂并最终分化为浆细胞，该浆细胞专门用于合成和分泌抗原特异性抗体。
[0336]
b细胞是免疫应答期间唯一的抗体生产者，并因此是有效体液免疫的关键因素。除了产生大量抗体之外，b细胞还作为抗原呈递细胞，并可以将抗原肽呈递给t细胞，例如t辅助cd4或细胞毒性cd8 t细胞，从而传播免疫应答。b细胞以及t细胞是适应性免疫应答的一部分。在例如通过疫苗接种或自然感染诱导的主动免疫应答期间，抗原特异性b细胞被活化并克隆扩增。在扩增过程中，b细胞进化为对表位具有更高的亲和力。b细胞的增殖可以由活化的t辅助细胞间接诱导，也可以通过刺激受体，例如tlr来直接诱导。
[0337]
抗原呈递细胞，例如树突细胞和b细胞，被吸引到疫苗接种部位，并可以与疫苗组合物中所含的抗原和佐剂相互作用。通常，佐剂刺激细胞活化，而抗原为靶标提供蓝图。不同类型的佐剂可以为细胞提供不同的刺激信号。例如，聚肌胞(tlr3激动剂)可以活化树突细胞，但不能活化b细胞。例如pam3cys、pam2cys和fsl-1的佐剂尤其擅长活化和启动b细胞的增殖，这有望促进抗体应答的产生(moyle 2008；so 2012)。
[0338]
体液免疫应答是用于有效感染病疫苗的常见机制之一(例如，防止病毒或细菌入
侵者)。然而，体液免疫应答也可用于对抗癌症。虽然癌症疫苗通常被设计为产生可以识别和破坏癌细胞的细胞介导的免疫应答，但b细胞介导的应答可以通过其他机制靶向癌细胞，这些机制在一些情况下可能与细胞毒性t细胞合作以获得最大利益。b细胞介导的(例如体液免疫应答介导的)抗肿瘤应答的实例包括但不限于：1)由b细胞产生的与在肿瘤细胞或影响肿瘤发生的其他细胞上发现的表面抗原(例如新抗原)结合的抗体。例如，此类抗体可以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)或补体固定诱导靶细胞的杀伤，这可能导致免疫系统可识别的另外的抗原的释放；2)与肿瘤细胞上的受体结合以阻断其刺激并有效中和其作用的抗体；3)与由肿瘤或肿瘤相关细胞释放或相关的因子结合以调节支持癌症的信号传导或细胞途径的抗体；和4)通过目前未知的机制与细胞内靶标结合并介导抗肿瘤活性的抗体。
[0339]
评价抗体应答的一种方法是测量与具体抗原反应的抗体的滴度。这可以使用本领域已知的多种方法来进行，例如从动物获得的含有抗体的物质的酶联免疫吸附测定(elisa)。例如，可以在暴露于抗原之前和之后的受试者中确定与具体抗原结合的血清抗体的滴定。暴露于抗原后抗原特异性抗体滴度的统计学上显著的增加表明受试者已对抗原产生抗体应答。
[0340]
非限制性地，可用于检测抗原特异性抗体存在的其他测定包括免疫测定(例如放射免疫测定(ria))、免疫沉淀测定和蛋白质印迹(例如wester印迹)测定；和中和测定(例如，在体外或体内测定中中和病毒感染性)。
[0341]
本文公开的组合物可用于治疗或防止由细胞介导的免疫应答或体液免疫应答改善的疾病和/或紊乱的方法。本文公开的组合物和方法可用于期望向受试者施用试剂(例如肽抗原)以诱导细胞介导的免疫应答或体液免疫应答的任何情况。在一个实施方式中，组合物可用于递送个性化疫苗，例如包括新抗原。
[0342]
在一个实施方式中，本公开内容涉及包括将本文所述的组合物施用于有需要的受试者的方法。在一个实施方式中，方法用于治疗和/或防止受试者中的疾病、紊乱或病症。在一个实施方式中，方法用于治疗和/或防止感染病或癌症。
[0343]
在一个实施方式中，该方法用于在所述受试者中诱导针对治疗剂(例如肽抗原)的抗体免疫应答和/或细胞介导的免疫应答。在一个实施方式中，这种方法用于治疗和/或防止感染病或癌症。
[0344]
如本文所用，“治疗”或
“……
的治疗”或“防止”或
“……
的防止”是指用于获得有益或期望结果的方法。有益或期望的结果可以包括但不限于减轻或改善一种或多种症状或病症、缩减疾病程度、稳定疾病状态、防止疾病发展、防止疾病传播、延迟或减缓疾病进展(例如压制)、延迟或减缓疾病发作、赋予针对致病因子的保护性免疫以及改善或缓和疾病状态。“治疗”或“防止”还可以意指将患者的生存期延长至超过不存在治疗时预期的生存期，并且还可以意指暂时抑制疾病的进展或防止疾病的发生，例如通过防止受试者中的感染。“治疗”或“防止”还可以指降低肿瘤块的大小、降低肿瘤侵袭性等。
[0345]“治疗”与“防止”的区别在于“治疗”通常发生在已经患有疾病或紊乱或已知已经暴露于感染原的受试者中，而“防止”通常发生在没有患有疾病或紊乱或不知道已经暴露于感染原的受试者中。如将理解的，治疗和防止可能存在重叠。例如，可以“治疗”受试者中的疾病，同时“防止”疾病的症状或进展。此外，至少在疫苗接种的背景下，“治疗”和“防止”可
能重叠，因为对受试者的治疗是诱导免疫应答，该免疫应答可能具有防止由病原体感染或防止由病原体感染引起的潜在疾病或症状的后续效果。通过例如“治疗感染病”或“治疗癌症”的表达，这些防止方面包括在本文中。
[0346]
在一个实施方式中，本文公开的组合物可用于治疗和/或防止有需要的受试者中的例如由病毒感染引起的感染病。受试者可能感染了病毒或可能处于发展病毒感染的风险中。可以通过使用或施用如本文公开的组合物来治疗和/或防止的病毒感染，不限于牛痘病毒、痘苗病毒(vaccinia virus)、假牛痘病毒、人疱疹病毒1、人疱疹病毒2、巨细胞病毒、人腺病毒a-f、多瘤病毒、人乳头瘤病毒(hpv)、细小病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、正呼肠孤病毒、轮状病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、肺炎病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、狂犬病病毒、加利福尼亚脑炎病毒、日本脑炎病毒、汉坦病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、冠状病毒、肠道病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、诺如病毒、黄病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、水痘、严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)和中东呼吸系统综合征相关冠状病毒(mers-cov)。
[0347]
在一个实施方式中，本文公开的组合物可用于治疗和/或防止有需要的受试者中的例如由非病毒病原体(例如细菌或原生动物)引起的感染病。受试者可能被病原体感染或可能处于发展病原体感染的风险中。示例性细菌病原体可以包括但不限于炭疽(炭疽杆菌)、布鲁氏菌、百日咳博德特氏菌、念珠菌、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、霍乱、肉毒杆菌、球孢子菌(coccidioides immitis)、隐球菌、白喉、大肠杆菌o157:h7、肠出血性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、军团杆菌、钩端螺旋体、李斯特菌、脑膜炎球菌、肺炎支原体、分枝杆菌、百日咳、肺炎、沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、肺炎链球菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌。在具体实施方式中，细菌感染是炭疽。非限制性地，示例性原生动物病原体可包括引起疟疾的疟原虫属(恶性疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫或诺氏疟原虫)的那些。
[0348]
在一个实施方式中，本文公开的组合物可用于治疗和/或防止有需要的受试者中的癌症。受试者可能患有癌症或可能有发展癌症的风险。
[0349]
如本文所用，术语“癌症”、“癌症细胞”、“肿瘤”和“肿瘤细胞”(可互换使用)是指表现出异常生长的细胞，其特征在于对细胞增殖或永生化的细胞的控制的显著丧失。术语“癌症”或“肿瘤”包括转移性和非转移性癌症或肿瘤。可以使用本领域普遍接受的标准来诊断癌症，包括恶性肿瘤的存在。
[0350]
非限制性地，可以通过使用或施用如本文公开的组合物来治疗和/或防止的癌症包括癌、腺癌、淋巴瘤、白血病、肉瘤、胚细胞瘤、骨髓瘤和生殖细胞肿瘤。非限制性地，具体合适的实施方式可包括成胶质细胞瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、乳腺癌、输卵管癌、前列腺癌或腹膜癌。在一个实施方式中，癌症可以由例如病毒的病原体引起。与癌症发展相关的病毒是普通技术人员已知的并且包括但不限于人乳头瘤病毒(hpv)、约翰坎宁安病毒(john cunningham virus)(jcv)、人疱疹病毒8、爱泼斯坦巴尔病毒(ebv)、默克尔细胞多瘤病毒、丙型肝炎病毒和人类t细胞白血病病毒-1。在一个实施方式中，癌症是表达一种或多种肿瘤特异性新抗原的癌症。
[0351]
在一个具体实施方式中，癌症是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、输卵管癌、腹膜癌、成
胶质细胞瘤或弥漫性大b细胞淋巴瘤。
[0352]
本文公开的方法和组合物可用于治疗或预防癌症；例如，降低癌症的严重程度(例如肿瘤的大小、侵略性和/或侵袭性、恶性等)或防止癌症复发。
[0353]
在一个实施方式中，用于治疗和/或防止癌症的方法首先包括鉴别患者肿瘤细胞中的一种或多种新抗原或新表位。普通技术人员将理解本领域已知的可用于鉴别一种或多种新抗原的方法(参见，例如，srivastava 2015)。作为示例性实施方式，全基因组/外显子组测序可用于鉴别在个体患者的肿瘤中独特存在的突变新抗原。可以分析已鉴别的新抗原的集合以选择(例如基于算法)具体的、优化的新抗原和/或新表位子集，以用作个性化癌症疫苗。
[0354]
已经鉴别和选择了一种或多种新抗原后，本领域技术人员将理解存在多种其中在体外或体内产生此类新抗原的方式。可以通过本领域已知的任何方法产生新抗原肽，然后可以将其配制成如本文所述的组合物或试剂盒并施用于受试者。
[0355]
在一个实施方式中，在向受试者施用后，组合物在癌症治疗中诱导肿瘤特异性免疫应答。这意味着免疫应答特异性靶向肿瘤细胞，而对不表达新抗原的身体正常细胞没有显著影响。此外，在一个实施方式中，组合物可以包含至少一种患者特异性新表位，使得肿瘤特异性免疫应答对于受试者或受试者子集是患者特异性的，即个体化免疫疗法。
[0356]
在一个实施方式中，本文公开的组合物可用于通过提供中和抗体或通过诱导产生中和抗体的体液免疫应答来中和毒素、中和病毒、中和细菌或中和过敏原。
[0357]
使用如本文所公开的方法，如本文所公开的组合物可以通过允许至少一种疏水相试剂靶向淋巴组织中的免疫细胞、淋巴结或淋巴样细胞的任何合适途径施用。在一个实施方式中，施用途径是皮下注射。在一个实施方式中，施用途径是肌肉内注射。
[0358]
实施方式
[0359]
本公开内容的具体实施方式包括但不限于以下内容：
[0360]
1.一种用于将至少两种试剂递送至受试者的组合物，其包括：
[0361]
i)疏水相；和
[0362]
ii)水相；
[0363]
其中所述组合物是所述疏水相在所述水相中的乳剂，其中所述疏水相包括至少一种疏水相试剂，并且其中所述水相包括至少一种水相试剂。
[0364]
2.根据实施方式1所述的组合物，其中所述疏水相与所述水相的比率为70：30v/v至50：50v/v。
[0365]
3.根据实施方式1或2所述的组合物，其中所述疏水相包括一种或多种疏水物质，所述疏水物质选自植物油、坚果油、矿物油中的二缩甘露醇油酸酯和矿物油中的脱水山梨醇单油酸酯。
[0366]
4.根据实施方式3所述的组合物，其中所述疏水物质包括矿物油、矿物油中的二缩甘露醇油酸酯或矿物油中的脱水山梨醇单油酸酯。
[0367]
5.根据实施方式4所述的组合物，其中所述疏水物质包括矿物油中的二缩甘露醇油酸酯。
[0368]
6.根据实施方式4所述的组合物，其中所述疏水物质包括在矿物油中的脱水山梨醇单油酸酯。
[0369]
7.根据实施方式3至6中任一项所述的组合物，其中所述疏水相包括在所述疏水物质中重构的所述至少一种疏水相试剂的干燥的制品。
[0370]
8.根据实施方式1或2所述的组合物，其中所述疏水相包括矿物油中的脂质和胆固醇。
[0371]
9.根据实施方式8所述的组合物，其中所述脂质是磷脂。
[0372]
10.根据实施方式9所述的组合物，其中所述磷脂是dopc。
[0373]
11.根据实施方式8-10中任一项所述的组合物，其中所述疏水相包括在矿物油中重构的所述脂质、胆固醇和所述至少一种疏水相试剂的干燥组合物。
[0374]
12.根据实施方式8至11中任一项所述的组合物，其中所述脂质和胆固醇在所述疏水相中形成脂质囊泡颗粒。
[0375]
13.根据实施方式12所述的组合物，其中所述至少一种疏水相试剂中的一种或多种被包封在所述脂质囊泡颗粒中。
[0376]
14.根据实施方式1或2所述的组合物，其中所述疏水相包括疏水物质中的磷脂和胆固醇，所述疏水物质选自植物油、坚果油、矿物油、矿物油中的二缩甘露醇油酸酯和矿物油中的脱水山梨醇单油酸酯。
[0377]
15.根据实施方式14所述的组合物，其中所述磷脂是dopc。
[0378]
16.根据实施方式14或15所述的组合物，其中所述疏水相包括在矿物油中的二缩甘露醇油酸酯或矿物油中的脱水山梨醇单油酸酯中重构的dopc、胆固醇和所述至少一种疏水相试剂的干燥的组合物。
[0379]
17.根据实施方式1或2所述的组合物，其中所述疏水相包括矿物油中的二缩甘露醇油酸酯中的dopc和胆固醇。
[0380]
18.根据实施方式17所述的组合物，其中所述疏水相包括在矿物油中的二缩甘露醇油酸酯中重构的dopc、胆固醇和所述至少一种疏水相试剂的干燥的组合物。
[0381]
19.根据实施方式1或2所述的组合物，其中所述疏水相包括矿物油中的脱水山梨醇单油酸酯中的dopc和胆固醇。
[0382]
20.根据实施方式19所述的组合物，其中所述疏水相包括在矿物油中的脱水山梨醇单油酸酯中重构的dopc、胆固醇和所述至少一种疏水相试剂的干燥的组合物。
[0383]
21.根据实施方式15至20中任一项所述的组合物，其中所述dopc和胆固醇在所述疏水相中形成脂质囊泡颗粒。
[0384]
22.根据实施方式21所述的组合物，其中所述至少一种疏水相试剂中的一种或多种被包封在所述脂质囊泡颗粒中。
[0385]
23.根据实施方式1至22中任一项所述的组合物，其中所述至少一种疏水相试剂是小分子药物、抗体、抗体的功能性片段、抗体的功能性等同物、抗体模拟物、免疫调节剂、抗原、t辅助表位、佐剂、过敏原、dna多核苷酸或rna多核苷酸。
[0386]
24.根据实施方式23所述的组合物，其中所述至少一种疏水相试剂是抗原和佐剂。
[0387]
25.根据实施方式23所述的组合物，其中所述至少一种疏水相试剂是抗原、t辅助表位和佐剂。
[0388]
26.根据实施方式23所述的组合物，其中所述至少一种疏水相试剂是seq id no:1的肽抗原、seq id no:30的t辅助表位和基于dna的聚肌胞。
[0389]
27.根据实施方式23所述的组合物，其中所述至少一种疏水相试剂是seq id no:18的肽抗原、seq id no:20的肽抗原、seq id no:22的肽抗原、seq id no:23的肽抗原、seq id no:24的肽抗原、seq id no:28的t辅助表位和基于dna的聚肌胞。
[0390]
28.根据实施方式23所述的组合物，其中所述至少一种疏水相试剂是seq id no:34的融合肽和基于dna的聚肌胞。
[0391]
29.根据实施方式23所述的组合物，其中所述至少一种疏水相试剂是seq id no:35的肽抗原、seq id no:36的肽抗原、seq id no:37的肽抗原、seq id no:38的肽抗原、seq id no:20的肽抗原、seq id no:23的肽抗原、seq id no:28的t辅助表位和基于dna的聚肌胞。
[0392]
30.根据实施方式1至29中任一项所述的组合物，其中所述水相包括水、水溶液或其组合。
[0393]
31.根据实施方式30所述的组合物，其中所述水相进一步包括乳化剂。
[0394]
32.根据实施方式31所述的组合物，其中所述乳化剂是聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱水山梨醇单月桂酸酯或脱水山梨醇单油酸酯。
[0395]
33.根据实施方式30至32中任一项所述的组合物，其中所述水相包括在水、水溶液或其组合中重构的所述至少一种水相试剂的干燥的制品。
[0396]
34.根据实施方式30至33中任一项所述的组合物，其中所述水相进一步包括脂质。
[0397]
35.根据实施方式34所述的组合物，其中所述脂质是磷脂。
[0398]
36.根据实施方式35所述的组合物，其中所述水相包括在水、水溶液或其组合中重构的所述脂质和所述至少一种水相试剂的干燥的制品。
[0399]
37.根据实施方式1至36中任一项所述的组合物，其中所述至少一种水相试剂是小分子药物、抗体、抗体的功能性片段、抗体的功能性等同物、抗体模拟物、免疫调节剂、抗原、t辅助表位、佐剂、过敏原、dna多核苷酸或rna多核苷酸。
[0400]
38.根据实施方式37所述的组合物，其中所述至少一种水相试剂是抗体、抗体的功能性等同物、抗体的功能性片段或抗体模拟物。
[0401]
39.根据实施方式38所述的组合物，其中所述至少一种水相试剂是结合ctla-4的抗体、抗体的功能性等同物、抗体的功能性片段或抗体模拟物。
[0402]
40.根据实施方式39所述的组合物，其中所述至少一种水相试剂是结合ctla-4的抗体。
[0403]
41.一种用于向受试者递送至少两种试剂的组合物，其包括：
[0404]
i)疏水相，其包括矿物油中的二缩甘露醇油酸酯、dopc、胆固醇、seq id no:1的肽抗原、seq id no:30的t辅助表位和基于dna的聚肌胞；和
[0405]
ii)包括水和/或水溶液、聚山梨醇酯20和结合ctla-4的抗体的水相；
[0406]
其中所述组合物是所述疏水相在所述水相中的乳剂。
[0407]
42.一种用于向受试者递送至少两种试剂的组合物，其包括：
[0408]
i)疏水相，其包括矿物油中的二缩甘露醇油酸酯、dopc、胆固醇、seq id no:18的肽抗原、seq id no:20的肽抗原、seq id no:22的肽抗原、seq id no:23的肽抗原、seq id no:24的肽抗原、seq id no:28的t辅助表位和基于dna的聚肌胞；和
[0409]
ii)包括水和/或水溶液、聚山梨醇酯20和结合ctla-4的抗体的水相；
[0410]
其中所述组合物是所述疏水相在所述水相中的乳剂。
[0411]
43.一种用于将至少两种试剂递送至受试者的组合物，其包括：
[0412]
i)疏水相，其包括矿物油中的二缩甘露醇油酸酯、dopc、胆固醇、seq id no:34的融合肽和基于dna的聚肌胞；和
[0413]
ii)包括水和/或水溶液、聚山梨醇酯20和结合ctla-4的抗体的水相；
[0414]
其中所述组合物是所述疏水相在所述水相中的乳剂。
[0415]
44.一种用于将至少两种试剂递送至受试者的组合物，其包括：
[0416]
i)疏水相，其包括矿物油中的二缩甘露醇油酸酯、dopc、胆固醇、seq id no:35的肽抗原、seq id no:36的肽抗原、seq id no:37的肽抗原、seq id no:38的肽抗原、seq id no:20的肽抗原、seq id no:23的肽抗原、seq id no:28的t辅助表位和基于dna的聚肌胞；和
[0417]
ii)包括水和/或水溶液、聚山梨醇酯20和结合ctla-4的抗体的水相；
[0418]
其中所述组合物是所述疏水相在所述水相中的乳剂。
[0419]
45.根据实施方式41至44中任一项所述的组合物，其中所述dopc和胆固醇在所述疏水相中形成脂质囊泡颗粒。
[0420]
46.根据实施方式45所述的组合物，其中所述至少一种疏水相试剂中的一种或多种被包封在所述脂质囊泡颗粒中。
[0421]
47.根据实施方式1至46中任一项所述的组合物，其中所述乳剂稳定至少1小时。
[0422]
48.根据实施方式47所述的组合物，其中所述乳剂稳定至少4小时。
[0423]
49.根据实施方式1至48中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于通过注射施用至受试者。
[0424]
50.根据实施方式49所述的组合物，其中所述注射是皮下或肌肉内的。
[0425]
51.一种制备用于将至少两种试剂递送至受试者的组合物的方法，所述方法包括：
[0426]
i)提供包括至少一种疏水相试剂的疏水相；
[0427]
ii)提供包括至少一种水相试剂的水相；
[0428]
iii)将所述疏水相和所述水相混合以产生所述疏水相在所述水相中的乳剂。
[0429]
52.根据实施方式51所述的方法，其中所述疏水相与所述水相的比率为70：30v/v至50：50v/v。
[0430]
53.根据实施方式51或52所述的方法，其中所述疏水相包括选自植物油、坚果油、矿物油、矿物油中的二缩甘露醇油酸酯和矿物油中的脱水山梨醇单油酸酯的一种或多种疏水物质。
[0431]
54.根据实施方式53所述的方法，其中所述疏水物质包括矿物油、矿物油中的二缩甘露醇油酸酯或矿物油中的脱水山梨醇单油酸酯。
[0432]
55.根据实施方式54所述的方法，其中所述疏水物质包括矿物油中的二缩甘露醇油酸酯。
[0433]
56.根据实施方式54所述的方法，其中所述疏水物质包括矿物油中的脱水山梨醇单油酸酯。
[0434]
57.根据实施方式55或56所述的方法，其中所述疏水相通过在所述疏水物质中重构所述至少一种疏水相试剂的干燥的制品来产生。
id no:24的肽抗原、seq id no:28的t辅助表位和基于dna的聚肌胞。
[0455]
78.根据实施方式73所述的方法，其中所述至少一种疏水相试剂是seq id no:34的融合肽和基于dna的聚肌胞。
[0456]
79.根据实施方式73所述的方法，其中所述至少一种疏水相试剂是seq id no:35的肽抗原、seq id no:36的肽抗原、seq id no:37的肽抗原、seq id no:38的肽抗原、seq id no:20的肽抗原、seq id no:23的肽抗原、seq id no:28的t辅助表位和基于dna的聚肌胞。
[0457]
80.根据实施方式51至79中任一项所述的方法，其中所述水相包括水、水溶液或其组合。
[0458]
81.根据实施方式80所述的方法，其中所述水相进一步包括乳化剂。
[0459]
82.根据实施方式81所述的方法，其中所述乳化剂是聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱水山梨醇单月桂酸酯或脱水山梨醇单油酸酯。
[0460]
83.根据实施方式80至82中任一项所述的方法，其中所述水相通过在水、水溶液或其组合中重构所述至少一种水相试剂的干燥的制品来产生。
[0461]
84.根据实施方式80至82中任一项所述的方法，其中所述水相进一步包括脂质。
[0462]
85.根据实施方式84所述的方法，其中所述脂质是磷脂。
[0463]
86.根据实施方式84或85所述的方法，其中所述水相通过在水、水溶液或其组合中重构所述脂质和所述至少一种水相试剂的干燥的组合物来产生。
[0464]
87.根据实施方式51至86中任一项所述的方法，其中所述至少一种水相试剂是小分子药物、抗体、抗体的功能性片段、抗体的功能性等同物、抗体模拟物、免疫调节剂、抗原、t辅助表位、佐剂、过敏原、dna多核苷酸或rna多核苷酸。
[0465]
88.根据实施方式87所述的方法，其中所述至少一种水相试剂是抗体、抗体的功能性等同物、抗体的功能性片段或抗体模拟物。
[0466]
89.根据实施方式88所述的方法，其中所述至少一种水相试剂是结合ctla-4的抗体、抗体的功能性等同物、抗体的功能性片段或抗体模拟物。
[0467]
90.根据实施方式89所述的方法，其中所述至少一种水相试剂是结合ctla-4的抗体。
[0468]
91.根据实施方式51或52所述的方法，其中：
[0469]
i)所述疏水相包括矿物油中的二缩甘露醇油酸酯、dopc、胆固醇、seq id no:1的肽抗原、seq id no:30的t辅助表位和基于dna的聚肌胞；和
[0470]
ii)所述水相包括水和/或水溶液、聚山梨醇酯20和结合ctla-4的抗体。
[0471]
92.根据实施方式91所述的方法，其中所述疏水相通过在矿物油中的二缩甘露醇油酸酯中重构dopc、胆固醇、seq id no:1的肽抗原、seq id no:30的t辅助表位和基于dna的聚肌胞的干燥的组合物来产生。
[0472]
93.根据实施方式51或52所述的方法，其中：
[0473]
i)所述疏水相包括矿物油中的二缩甘露醇油酸酯、dopc、胆固醇、seq id no:18的肽抗原、seq id no:20的肽抗原、seq id no:22的肽抗原、seq id no:23的肽抗原、seq id no:24的肽抗原、seq id no:28的t辅助表位和基于dna的聚肌胞；和
[0474]
ii)所述水相包括水和/或水溶液、聚山梨醇酯20和结合ctla-4的抗体。
[0475]
94.根据实施方式93所述的方法，其中所述疏水相通过在矿物油中的二缩甘露醇油酸酯中重构dopc、胆固醇、seq id no:18的肽抗原、seq id no:20的肽抗原、seq id no:22的肽抗原、seq id no:23的肽抗原、seq id no:24的肽抗原、seq id no:28的t辅助表位和基于dna的聚肌胞的干燥的组合物来产生。
[0476]
95.根据实施方式51或52所述的方法，其中：
[0477]
i)所述疏水相包括矿物油中的二缩甘露醇油酸酯、dopc、胆固醇、seq id no:34的融合肽和基于dna的聚肌胞；和
[0478]
ii)所述水相包括水和/或水溶液、聚山梨醇酯20和结合ctla-4的抗体。
[0479]
96.根据实施方式95所述的方法，其中所述疏水相通过在矿物油中的二缩甘露醇油酸酯中重构dopc、胆固醇、seq id no:34的融合肽和基于dna的聚肌胞的干燥的组合物来产生。
[0480]
97.根据实施方式51或52所述的方法，其中：
[0481]
i)所述疏水相包括矿物油中的二缩甘露醇油酸酯、dopc、胆固醇、seq id no:35的肽抗原、seq id no:36的肽抗原、seq id no:37的肽抗原、seq id no:38的肽抗原、seq id no:20的肽抗原、seq id no:23的肽抗原、seq id no:28的t辅助表位和基于dna的聚肌胞；和
[0482]
ii)水相包括水和/或水溶液、聚山梨醇酯20和结合ctla-4的抗体。
[0483]
98.根据实施方式97所述的方法，其中所述疏水相通过在矿物油中的二缩甘露醇油酸酯中重构dopc、胆固醇、seq id no:35的肽抗原、seq id no:36的肽抗原、seq id no:37的肽抗原、seq id no:38的肽抗原、seq id no:20的肽抗原、seq id no:23的肽抗原、seq id no:28的t辅助表位以及基于dna的聚肌胞的干燥的组合物来产生。
[0484]
99.根据实施方式93至98中任一项所述的方法，其中所述dopc和胆固醇在所述疏水相中形成脂质囊泡颗粒。
[0485]
100.根据实施方式99所述的方法，其中所述至少一种疏水相试剂中的一种或多种被包封在所述脂质囊泡颗粒中。
[0486]
101.根据实施方式91至100中任一项所述的方法，其中所述水相通过在水和/或水溶液中重构与ctla-4结合的所述抗体的干燥的制品来产生。
[0487]
102.根据实施方式51至101中任一项所述的方法，其中所述乳剂稳定至少1小时。
[0488]
103.根据实施方式102所述的方法，其中所述乳剂稳定至少4小时。
[0489]
104.根据实施方式51至103中任一项所述的方法，其中通过将所述疏水相和所述水相置于器皿中并用涡流混合器搅拌所述器皿来混合所述疏水相和所述水相。
[0490]
105.根据实施方式51至103中任一项所述的方法，其中通过将所述疏水相抽吸到第一注射器中、将所述水相抽吸到第二注射器中、将所述第一注射器和所述第二注射器连接到连接器，并向所述第一和第二注射器施加交替压力以使相重复地通过连接器来混合所述疏水相和所述水相。
[0491]
106.通过实施方式51至105中任一项所述的方法产生的组合物。
[0492]
107.一种用于将至少两种试剂递送至受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用实施方式1至50中任一项所述的组合物。
[0493]
108.一种用于在受试者中诱导免疫应答的方法，包括向所述受试者施用实施方式
1至50中任一项所述的组合物。
[0494]
109.根据实施方式108所述的方法，其中所述免疫应答是抗体应答和/或细胞介导的应答。
[0495]
110.一种用于治疗、防止或诊断受试者中的疾病、紊乱或病症的方法，包括向所述受试者施用实施方式1至50中任一项所述的组合物。
[0496]
111.一种用于调节受试者中的免疫应答的方法，包括向受试者施用实施方式1至50中任一项的组合物。
[0497]
112.一种治疗或防止受试者中由细胞介导的免疫应答或体液免疫应答改善的疾病和/或紊乱的方法，包括向所述受试者施用实施方式1至50中任一项所述的组合物。
[0498]
113.一种用于治疗和/或防止受试者中由病毒、细菌或原生动物引起的感染病的方法，包括向所述受试者施用实施方式1至50中任一项所述的组合物。
[0499]
114.一种治疗和/或防止受试者中癌症的方法，包括向所述受试者施用实施方式1至50中任一项所述的组合物。
[0500]
115.根据实施方式114所述的方法，其中所述癌症是癌、腺癌、淋巴瘤、白血病、肉瘤、胚细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、乳腺癌、输卵管癌、前列腺癌或腹膜癌。
[0501]
116.一种在受试者中用抗体中和毒素、病毒、细菌或过敏原的方法，所述方法包括向所述受试者施用实施方式1至50中任一项的组合物。
[0502]
117.根据实施方式107至116中任一项所述的方法，其中所述组合物通过注射施用至所述受试者。
[0503]
118.根据实施方式117所述的方法，其中所述注射是皮下的或肌肉内的。
[0504]
119.一种试剂盒，其包括：
[0505]
a)包括至少一种疏水相试剂的干燥的制品的第一容器；
[0506]
b)包括一种或多种疏水物质的第二容器；和
[0507]
c)包括水溶液的第三容器，所述水溶液包括至少一种水相试剂。
[0508]
120.一种试剂盒，其包括：
[0509]
a)包括至少一种疏水相试剂的干燥的制品的第一容器；
[0510]
b)包括一种或多种疏水物质的第二容器；
[0511]
c)包括至少一种水相试剂的干燥的制品的第三容器；和
[0512]
d)包括水、水溶液或其组合的第四容器。
[0513]
121.根据实施方式119或120所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括至少两个注射器。
[0514]
122.根据实施方式119至121中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括用于连接所述至少两个注射器的连接器。
[0515]
123.根据实施方式119至122中任一项所述的试剂盒，其中至少一种疏水相试剂的干燥的制品进一步包括dopc和胆固醇。
[0516]
124.根据实施方式119至123中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种疏水物质包括植物油、坚果油或矿物油。
[0517]
125.根据实施方式124所述的试剂盒，其中所述疏水物质包括矿物油中的二缩甘露醇油酸酯。
[0518]
126.根据实施方式124所述的试剂盒，其中所述疏水物质包括矿物油中的脱水山梨醇单油酸酯。
[0519]
127.根据实施方式119至126中任一项所述的试剂盒，其中所述水溶液包括磷酸盐缓冲盐水。
[0520]
128.实施方式1至50中任一项所述的组合物用于将至少两种试剂递送至受试者中的用途。
[0521]
129.实施方式1至50中任一项所述的组合物用于在受试者中诱导免疫应答的用途。
[0522]
130.根据实施方式129所述的用途，其中所述免疫应答是抗体应答和/或细胞介导的应答。
[0523]
131.实施方式1至50中任一项所述的组合物用于治疗、防止或诊断受试者中的疾病、紊乱或症状的用途。
[0524]
132.实施方式1至50中任一项所述的组合物用于调节受试者中的免疫应答的用途。
[0525]
133.实施方式1至50中任一项所述的组合物用于治疗或防止受试者中由细胞介导的免疫应答或体液免疫应答改善的疾病和/或紊乱的用途。
[0526]
134.实施方式1至50中任一项所述的组合物用于治疗和/或防止受试者中由病毒、细菌或原生动物引起的感染病的用途。
[0527]
135.实施方式1至50中任一项所述的组合物用于治疗和/或防止受试者中癌症的用途。
[0528]
136.根据实施方式135所述的用途，其中所述癌症是癌、腺癌、淋巴瘤、白血病、肉瘤、胚细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、乳腺癌、输卵管癌、前列腺癌或腹膜癌。
[0529]
137.实施方式1至50中任一项所述的组合物用于使用抗体中和受试者中的毒素、病毒、细菌或过敏原的用途。
[0530]
138.根据实施方式128至137中任一项所述的用途，其中所述组合物用于通过注射施用至所述受试者。
[0531]
139.根据实施方式138所述的用途，其中所述注射是皮下的或肌肉内的。
[0532]
实施例
[0533]
现在将通过参考附图的非限制性实施例来描述本发明。
[0534]
实施例1
[0535]
使用矿物油和水与表面活性剂制备o/w乳剂。
[0536]
将0.7ml矿物油(疏水相)吸入注射器中，同时将0.3ml含表面活性剂的水(水相)吸入另一个注射器中。使用vygon
tm
连接器三通旋塞连接两个注射器，在注射器之间传递通过旋塞120次来使相混合，以使用70：30的疏水：水比率形成乳剂，首先使疏水相进入水相。使用含有按重量计0.5％tween
tm 20、0.25％tween
tm 80、0.5％tween
tm 80或0.5％peg 400的水作为水相制备四种乳剂。
[0537]
为了评价乳剂稳定性，观察乳剂的相分离或破裂4小时。还对乳剂进行滴落测试和氯化钴纸测试，以鉴别混合物形成水包油(o/w)还是油包水(w/o)乳剂。水滴测试由下述组成：在250ml烧杯中加入约200ml蒸馏水，然后在不搅拌的情况下将一滴(约3mg)制备好的乳
剂滴在水上。液滴分散到水中表明乳剂是o/w。如果液滴漂浮在水面上，并且在轻轻手工搅拌后水仍然澄清，则乳剂为w/o。油滴测试由下述组成：在5ml玻璃小瓶中装入约4ml矿物油，然后在不搅拌的情况下将一滴(约3mg)制备好的乳剂滴在油上。如果液滴不分散在油中，则乳剂为o/w。液滴分散到油中表明乳剂是w/o。氯化钴纸测试：在氯化钴滤纸条上放置一滴乳剂，纸条由蓝色变为粉红色，这说明形成的乳剂为o/w。
[0538]
结果如下表1所示。使用0.5％tween
tm 20、0.25％tween
tm 80或0.5％tween
tm 80形成的乳剂稳定超过4小时，而使用peg 400形成的乳剂在30分钟内分离。水滴测试表明，所有乳剂均为o/w乳剂。
[0539]
表1
[0540][0541]
这些结果表明，使用矿物油和含有表面活性剂的水相可以形成稳定的o/w乳剂。
[0542]
实施例2
[0543]
使用在ms80油中重构并与含表面活性剂的水混合的dpx来制备o/w乳剂。
[0544]
通过在ms80油中重构冷冻干燥的组合物(dpx)制备疏水相。dpx是包含两亲性脂质(dopc)、胆固醇、肽和佐剂的组合物。dpx-r9f(0.1mg/ml hpv16e7
49-57
肽抗原[r9f；seq id no:1]、0.1mg/ml源自破伤风毒素
947-967
[f21e；seq id no:30]的通用t辅助表位、0.4mg/ml聚didc多核苷酸)在0.7ml ms80油中重构以形成疏水相。然后将疏水相与含有按重量计0.5％tween
tm 20、0.25％tween
tm 80、0.5％tween
tm 80或0.5％peg 400的水相以按体积计90：10、80：20和70：30的疏水：水比率混合，并涡流混合2分钟以形成乳剂。为了评价乳剂稳定性，观察乳剂的相分离或破裂4小时。还对乳剂进行滴落测试，以鉴别混合物形成o/w还是w/o乳剂。
[0545]
结果如下表2所示。使用dpx-r9f/ms80油作为疏水相，只有70：30疏水：水比率产生稳定的乳剂，其他比率立即或在30分钟内分离。然而，水滴测试表明乳剂是w/o。不受理论束缚，由于span
tm 80的低hlb值，ms80油中存在span
tm 80表面活性剂可能会逆转或抑制o/w乳剂的形成。
[0546]
表2
[0547][0548]
使用50：50疏水：水比率制备混合物。dpx-survivac冷冻干燥的组合物(1mg/ml 5种生存素肽抗原[seq id no:18、20、22、23和24]、0.5mg/ml a16l破伤风毒素辅助肽[seq id no:28]、0.4mg/ml聚didc多核苷酸)在ms80油中重构以形成疏水相，并通过重复穿过vygon
tm
连接器以50：50疏水：水的比率与含有按重量计0.5％tween
tm 20或0.5％tween
tm
80的水相混合。结果显示在下表3中。混合物形成稳定超过4小时的乳剂。水滴测试表明，乳剂为在水中迅速分散的o/w。
[0549]
表3
[0550][0551]
这些结果表明可以使用含表面活性剂的油中的含两亲性脂质的dpx组合物和含表面活性剂的水相形成稳定的o/w乳剂。
[0552]
实施例3
[0553]
使用在矿物油中重构并与含有表面活性剂的水混合的dpx来制备o/w乳剂。
[0554]
通过用0.7ml矿物油重构dpx-r9f冻干组合物来制备疏水相。然后将疏水相与0.3ml的含有按重量计0.5％tween
tm 20、0.25％tween
tm 80、0.5％tween
tm 80或0.5％peg 400的水相混合，并通过涡流混合2分钟以形成具有70：30疏水：水的比率的乳剂。
[0555]
结果如下表4所示。水滴测试表明乳剂为o/w。含有tween
tm 20或tween
tm 80的乳剂稳定超过4小时，而含有peg 400的乳剂在1小时内分离。
[0556]
表4
[0557][0558]
这些结果表明，使用油中的含两亲性脂质的dpx组合物和含有表面活性剂的水相可以形成稳定的o/w乳剂。
[0559]
实施例4
[0560]
使用不同的混合方法，使用与含有表面活性剂的水混合的矿物油中重构的dpx制备o/w乳剂。
[0561]
通过用0.7ml矿物油重构dpx-survivac冷冻干燥的组合物制备疏水相，并与0.3ml含有按重量计0.5％tween
tm 20、0.25％tween
tm 80、0.5％tween
tm 80或0.5％peg 400的水相混合。通过涡流混合2分钟或通过使相在注射器之间重复穿过vygon
tm
连接器来混合相。
[0562]
使用通过涡流混合的乳化的结果如下表5所示。含有tween
tm 20或tween
tm 80的乳剂稳定超过4小时，而含有peg 400的乳剂在1小时内分离。水滴测试表明所有乳剂都是o/w。使用通过穿过连接器进行乳化的结果如下表6所示。与涡流混合方法一样，所有的乳剂都是o/w并且所有乳剂都稳定超过4小时，除了含有peg 400的乳剂在1小时内分离。通过穿过连接器形成的o/w乳剂比通过涡流混合形成的乳剂在水中分散更快。
[0563]
表5
[0564][0565][0566]
表6
[0567][0568]
实施例5
[0569]
使用不同的表面活性剂、混合方法和比率，使用与含有表面活性剂的水混合的montanide
tm isa51 vg油中重构的dpx制备o/w乳剂。
[0570]
通过用montanide
tm isa51 vg油重构dpx-survivac冷冻干燥的组合物制备疏水相，并与含有按重量计0.5％tween
tm 20或0.5％tween
tm 80的水相混合。将这些相以70：30或50：50疏水：水的比率混合，并通过涡流混合或通过在注射器之间重复穿过vygon
tm
连接器进行混合以形成乳剂。
[0571]
结果示于下表7(通过穿过混合)和表8(通过涡流混合)中。使用任一混合方法，70：30的疏水：水的比率的乳剂比50：50比率的乳剂更粘。所有乳剂均稳定超过4小时，并且如水滴测试、滴油测试和钴纸测试所示为o/w。使用tween
tm 20涡流混合形成的乳剂在油滴测试期间沉入油中，表明它们的密度高于通过穿过连接器形成的乳剂。与使用tween 20
tm
的类似乳剂相比，通过利用tween 80
tm
使用70：30的比率穿过混合形成的乳剂在水中分散得更缓慢。
[0572]
表7
[0573][0574][0575]
表8
[0576][0577]
这些结果表明，在montanide
tm isa51油中使用含有两亲性脂质的dpx组合物和含有表面活性剂的水相可以形成稳定的o/w乳剂。
[0578]
实施例6
[0579]
使用在矿物油或ms80油中重构的dpx与含有抗ctla-4抗体或白蛋白的水制备o/w乳剂。
[0580]
通过使用0.7ml矿物油或ms80油重构dpx-fp(0.2mg/ml fp抗原[seq id no:34]、0.4mg/ml聚didc多核苷酸)制备疏水相。将疏水相与0.3ml含有0.5％tween
tm 20和6.7mg/ml抗ctla-4抗体的水相混合，并通过涡流混合2分钟混合以形成70：30的疏水：水比率的乳剂。乳剂中抗ctla-4抗体的最终浓度为2.0mg/ml。结果如下表9所示。ms80油乳剂为w/o，并在小于1小时内分离。这与实施例2的结果一致，表明需要较低的疏水：水的比率(例如50：50)以在疏水相中用ms80油形成o/w乳剂。矿物油乳剂为o/w并保持稳定超过4小时。
[0581]
表9
[0582][0583]
通过在montanide
tm isa51 vg油中制备dpx-fp的疏水相来生产不同的o/w乳剂。通过将在pbs中的8.47mg/ml白蛋白的溶液与在无菌水中的tween
tm 20混合来制备水相，以获得按重量计0.5％tween
tm 20和6.7mg/ml白蛋白的水相。然后通过在注射器之间重复穿过vygon
tm
连接器或通过涡流混合来混合这些相以形成乳剂。结果如下表10所示。两种乳剂均为o/w。通过穿过连接器形成的乳剂稳定超过4小时，而涡流混合形成的乳剂稳定2小时。
[0584]
表10
[0585][0586]
这些结果表明，在montanide
tm isa51油中使用含有两亲性脂质的dpx组合物和含有表面活性剂和水溶性分子的水相可以形成稳定的o/w乳剂。
[0587]
实施例7
[0588]
用o/w乳剂同时递送dpx-fp和抗ctla-4抗体治疗受肿瘤攻击的小鼠。
[0589]
评估了o/w乳剂同时递送dpx-fp和抗ctla-4抗体在控制肿瘤生长方面的功效，并与对照治疗进行了比较。评价了在具有dpx-fp的o/w乳剂中递送的抗ctla-4抗体是否可以以与经由腹膜内(i.p.)注射全身性递送抗ctla-4或通过在疏水运载体中递送抗ctla-4相同的方式控制肿瘤生长。该研究在c3荷瘤小鼠中进行，并且包括与节拍环磷酰胺(mcpa)的联合治疗。
[0590]
使用dpx-fp冷冻干燥组合物制备根据本发明的o/w乳剂。通过将fp(neomps；seq id no:34)和基于dna的聚肌胞多核苷酸佐剂储备液(biospring)添加到脂质混合物溶液中，充分混合并冷冻干燥来制备dpx-fp。通过在室温下以300rpm充分摇动1小时或直到溶解，将含有以10:1比率(w：w)的dopc和胆固醇的脂质混合物(132mgml)(lipoid gmbh,germany)溶解在40％的叔丁醇中。接下来，在dmso中制备fp储备液(10mg/ml)，在无菌水中制备基于dna的聚肌胞多核苷酸佐剂储备液(10mg/ml)。向0.8ml等分的脂质混合物溶液中加入16μl fp储备液，以300rpm充分摇动5分钟，以获得0.1mg/ml的最终填充浓度。向形成的fp-脂质混合物溶液中加入32μl基于dna的聚肌胞多核苷酸佐剂储备液，以300rpm充分摇动5分钟以获得0.2mg/ml的最终填充浓度。用40％叔丁醇定量至1.6ml并冷冻干燥。
[0591]
使用70：30的疏水:水的比率制备根据本发明的o/w乳剂。通过向每个小瓶中加入1.0ml isa 51油(seppic)来重构三个小瓶dpx-fp(imv,dpx20-181109-1)来制备疏水相。将冷冻干燥的dpx-fp在油中浸泡5分钟并充分涡流2分钟以形成澄清溶液。通过首先将409.23mg tween
tm 20(sigma aldrich,slbz5913)添加到15-ml falcon管中，然后向管中添加9.815g无菌水(baxter,w7f0520)并通过涡流混合以形成4％tween
tm 20储备溶液，来制备水相。然后，将0.265ml抗ctla-4(biocell,702418a2b,pbs中7.54mg/ml,ph 7.0)与35μl的4％tween
tm 20储备液(imv,02jan2019bm-1)一起加入到1.5ml微量离心管(eppendorf tube)并通过涡流混合以形成含有按重量计0.5％tween
tm 20和6.7mg/ml抗ctla-4的水相。通过用0.7ml疏水相填充normject注射器(henke sass wolf,18d30c8)，用0.3ml制备的水
相填充另一个normject注射器，使用vyclic适配器(vygon
tm
，210317fc)连接每个注射器，然后将相来回穿过连接器120次(首先将疏水相传递到水相中)来形成o/w乳剂。乳剂中抗ctla-4抗体的最终浓度为2.0mg/ml。如下表11所示，通过水滴测试、油滴测试和钴条测试(cobalt strip test)确认乳剂为o/w。最终的o/w乳剂制剂含有2mg/ml抗ctla-4、66mg/ml dopc/胆固醇、0.1mg/ml fp和0.2mg/ml didc。
[0592]
表11
[0593][0594]
制备制剂用于处理对照组。对照组1、2、3和5中的小鼠用isa51油中的dpx-fp(即仅疏水相)处理。对照组6中的小鼠用isa51油中的dpx-fp连同isa51油中的dpx-抗ctla-4处理(在疏水相中含有抗ctla-4抗体，而不是肽和佐剂)。组7中的小鼠除dpx-fp的肽和佐剂外还用包含抗ctla-4抗体的dpx-fp/抗ctla-4处理。对照组3、4和5中的小鼠经由i.p.注射接受抗ctla-4。对照组9的小鼠在肿瘤植入后未接受任何处理。用根据本发明的o/w乳剂的皮下(s.c.)注射处理组8中的小鼠，具有疏水相中的dpx-fp和水相中的抗ctla-4抗体。所有dpx处理均通过s.c.注射进行。处理的制剂示于表12中：
[0595]
表12：处理
[0596][0597]
第2、5、6、7和8组也用mcpa处理，如表13中所述：
[0598]
表13：节拍环磷酰胺
[0599] 组2、5、6、7、8试剂cpa(sigma)制品0.133mg/ml*剂量20mg/kg/天剂量体积～3ml路径饮用水(po)
循环数2每个循环处理数每天7
×
24小时(节拍)处理位置口服研究所需的总数20等分试样
[0600]
使用表14中列出的原材料制备冷冻干燥的dpx-fp：
[0601]
表14：dpx原材料
[0602][0603]
研究时间线如图1所示。小鼠(每组n＝8)在研究第0天(sd0)植入c3-10细胞，并在其饮用水中以20mg/kg/天的剂量用mcpa在sd7和sd21开始处理7天。小鼠要么不施用，要么在sd14和sd28通过i.p.注射或通过s.c.注射dpx以dpx-fp和/或抗ctla-4(0.1mg)的组合施用。高达sd72(图2a)的结果表明，与单独使用dpx-fp处理(第1组；p＝0.0195)相比，dpx-fp mcpa(第2组)处理的小鼠具有显著的生存率优势，并且在根据本发明的o/w乳剂中递送的抗ctla-4(第8组)与第2组相比显著提高了存活率(p＝0.0011)。与单独dpx-fp mcpa(第2组)相比，通过i.p.注射(第5组)或通过s.c.注射dpx(第6、7组)递送的抗ctla-4的存活率有增加的趋势。重要的是，用本发明的o/w乳剂制剂处理的小鼠(第8组)在sd48-sd60之间具有比对照组5、6和7中的小鼠更高的总体存活率(图2b)。类似地，与对照组5、6和7中的小鼠相比，用本发明的o/w乳剂制剂处理的小鼠(第8组)具有减缓的肿瘤生长(图3a和b)。使用mantel-cox和gehan-breslow-wilcoxon检验进行生存率统计分析，***p《0.001，*p《0.05。通过线性回归比较进行肿瘤体积统计分析，***p《0.0001。
[0604]
这些结果表明，与接受疏水性dpx中的抗ctla-4或通过单独的i.p.注射的对照小鼠相比，在根据本发明的o/w乳剂制剂中递送的dpx-fp与抗ctla-4的组合改善了治疗小鼠的存活率和肿瘤控制。
[0605]
实施例8
[0606]
进一步测试来自实施例7的小鼠针对抗ctla4抗体的抗药物抗体(ada)的形成。收集血清用于评估sd42(第2组，n＝2，第5组，n＝2，第6组，n＝0，第7组，n＝3，第8组，n＝4)和sd55/56(第2组，n＝1，第5组，n＝2，第6组，n＝2，第7组，n＝3，第8组，n＝6)上的ada形成，以及在研究结束时(eos)在最初的肿瘤攻击中幸存下来，并再次攻击并且不进一步处理的小鼠(第2组，n＝0，第5组，n＝2，第6组，n＝1，第7组，n＝2，第8组，n＝2)。通过桥接elisa与抗ctla-4包被和检测抗体(图5a)、igg2b同种型对照包被抗体和抗cla-4检测抗体(图5b)以及igg1同种型对照包被抗体和抗ctla检测抗体(图5c)，检测ada形成。来自第6、7和8组的小鼠通过sd55/56发展了ada，其然后下降(第7和8组)或保持恒定(第6组)至eos。使用tukey的多重比较检验通过单向anova评估统计显著性，*p《0.05。
[0607]
图5中所示的结果表明，与对照组合物(第6组和第7组)相比，施用本发明组合物的
小鼠(第8组)生成了较低滴度的针对抗ctla4抗体的不需要的ada。实际上，当将抗ctla4抗体作为在本发明的组合物中的水相试剂提供时(第8组)，与不包含o/w乳剂的和在其中抗ctla4抗体在疏水运载体中提供的对照组合物(第7组)相比，产生了显著更低滴度的ada。
[0608]
实施例9
[0609]
评价在o/w乳剂水相中水相试剂的稳定性。
[0610]
通过将疏水相(在montanide
tm isa 51油中dpx-空)和水相(含有水相试剂)以通过vygon
tm
连接器120次来制备o/w乳剂。如表15所示制备三种示例性o/w乳剂：
[0611]
表15：制剂制备
[0612][0613][0614]
作为水相试剂，制剂1包含寡核苷酸，制剂2包含环磷酰胺，制剂3包含抗ctla4抗体。montanide
tm isa 51油形成制剂的疏水相。为确认制剂为o/w乳剂，如实施例1所述，对制剂进行水滴测试、油滴测试和钴纸测试。滴落测试和钴条测试二者均用于寡核苷酸、环磷酰胺和抗ctla4制剂的乳剂鉴别。所有测试都证实了制剂形成了o/w乳剂。
[0615]
为了通过高效液相色谱(hplc)进行分析，将o/w乳剂制剂以15,000rpm离心30分钟以分离油层(顶部)和水层(底部)，并分析来自这两层的样品。使用正丁醇萃取法(用于油相)和总溶解法(用于水相)制备样品。正丁醇萃取法(用于油相)：向100μl顶层油样品中加入300μl的0.1m nahco3和400μl的水饱和1-丁醇。将样品涡流混合并以5000rpm离心2分钟。取底层进行分析。总溶解法(用于水相)：向75μl底层水样品中加入最多5ml流动相a。用于环磷酰胺、寡核苷酸和抗ctla4分析的流动相如下：环磷酰胺：流动相a：水中30％乙腈；流动相b：甲醇。寡核苷酸：流动相a：tris、乙腈、水的混合物；流动相b：tris、nacl、乙腈、水的混合物。抗ctla4：流动相a：0.1％tfa/水；流动相b：0.1％tfa/乙腈；流动相c：甲醇。对于含有环磷酰胺水相试剂的制剂，只测试水相，因为没有建立hplc方法来测试油相中的环磷酰胺。
[0616]
制剂1(寡核苷酸水相试剂)的疏水(油)相和水性(水)相的hplc分析在表16中显示：
[0617]
表16：寡核苷酸hplc分析
[0618][0619][0620]
如表16中所见，寡核苷酸水相试剂保留在水相(底层-水)中，其中在o/w乳剂形成后立即(t＝0)和乳化后2小时(t＝2h)发现0％在疏水相(顶层-油)中。每个样品制品都进行了两次测试。制剂1的hplc色谱图见图6。
[0621]
制剂2(环磷酰胺水相试剂)的水性(水)相的hplc分析在表17中显示：
[0622]
表17：环磷酰胺hplc分析
[0623][0624]
如表17所见，环磷酰胺保留在样品的水相(底层-水)中。制剂2的hplc色谱图如图7所示。
[0625]
制剂3(抗ctla4抗体水相试剂)的疏水(油)相和水性(水)相的hplc分析在表18中显示：
[0626]
表18：抗ctla4 hplc分析
[0627][0628]
如表18中所见，抗ctla-4保留在样品的水相(底层-水)中。制剂3的hplc色谱图如图8所示。
[0629]
这些结果表明根据本发明的o/w制剂形成乳剂，其中水相试剂稳定地保持在乳剂的水相中。
[0630]
本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指示通过引用并入一样。对任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内容，不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于此类出版物。
[0631]
尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和实例的方式对前述发明进行了一些详细的描述，但是根据本发明的教导，对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下可以对其进行某些改变和修改。
[0632]
必须注意，如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数参考，除非上下文另有明确规定。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0633]
如本文在说明书和权利要求中使用的短语“和/或”应理解为表示如此结合的元件中的“之一或两者”，即，在一些情况下结合存在而在其他情况下分离存在的元件。用“和/或”列出的多个元件应以相同的方式解释，即“一个或多个”这样结合的元件。除了由“和/或”子句具体标识的元件之外，可以任选地存在其他元件，无论是否与那些具体标识的元件相关或不相关。因此，作为非限制性实例，当与例如“包括”的开放式语言结合使用时，对“a和/或b”的引用在一个实施方式中可以仅指a(任选地包括除b之外的元件)；在另一个实施方式中，仅指b(任选地包括除a之外的元件)；在仍另一个实施方式中，指a和b两者(任选地包括其他元件)；等等。
[0634]
如本文在说明书和权利要求书中所用的，“或”应理解为包含与如上定义的“和/或”相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或者“和/或”应被解释为包含性的，即包括至少一个，但也包括多个元件或元件列表中的多于一个，以及任选的额外未列出的项目。
[0635]
如本文通篇所用，术语“约”表示合理地接近。例如，“约”可以表示如本领域普通技术人员所确定的具体值的可接受的标准偏差和/或可接受的误差范围内，这将取决于如何测量具体值。此外，当表示整数时，约可以指该整数任一侧的十进制值。当在范围的上下文中使用时，术语“约”涵盖在范围一端的一个具体值与在范围另一端的另一个具体值之间的所有示例性值，以及超出每一端的合理接近的值。
[0636]
如本文所用，无论是在说明书还是所附权利要求中，过渡性术语“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”等都应理解为包括性的或开放式(即，意味着包括但不限于)，并且它们不排除未列举的元件、材料或方法步骤。只有过渡性短语“由
……
组成”和“基
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