香味或风味组合物的优化的制作方法

1.本技术涉及用于识别能够将被至少两个年龄组差异地感知的气味剂组合物结合的嗅觉感受器的方法。所识别的嗅觉感受器可用于产生与年龄相关的气味或风味特征，该气味或风味特征确定用于刺激感受器的气味剂组合物的有效浓度范围。反过来，气味或风味特征可用于优化风味和气味以对某些年龄组产生吸引力，或打消某些年龄组使用的念头。在一些情况下，可以筛选气味剂组合物以确定它们是否被年龄组差异地感知。


背景技术：

2.气味分子属于多种化学类别，包括例如醇、醛、酮和羧酸、含硫化合物和精油。气味剂组合物通常包括结合一或多种与特定感知的气味或味道相关联的相应嗅觉感受器的气味分子。一些科学研究表明，某些嗅觉感知会随着人类年龄的增长而减弱，使得可能需要更高浓度的气味分子，以便使成人感知到与儿童或青少年所感知到的相同的气味分子的强度水平。这种嗅觉能力下降可能类似于成人随着他们年龄的增长而对某些听觉频率失去敏感性的现象。感知的差异可能是由于嗅觉感受器与年龄相关的下调，或者是由于沿着感知神经通路的其他干扰。感受器的下调也可能随着诸如帕金森病和阿尔茨海默病等神经系统疾病或其他生理状态出现。
3.为了避免传统的端部点燃型香烟对健康造成的影响，烟草行业在新的电子烟释放物(电子香烟)产品的研发方面经历了增长。然而，这些新产品遭到了批评者的强烈反对，他们声称这些新产品被设计成吸引儿童和青少年。到目前为止，这是一个需要证明或反驳的复杂断言，因为对味觉和嗅觉感知的年龄相关成分以及这些现象背后的科学知之甚少。大多数研究都聚焦在消费者调查或焦点群组上，这些是不可靠的，因为它们是基于主观解释。
4.因此，设计和优化风味和气味以吸引某些年龄组，或相反地，以产生无吸引力的并且阻止某些年龄组的使用的风味和气味将是有用的。这些设计的风味和气味可以被包括在各种消费品中，例如，有年龄限制的产品，如酒精或烟草。设计的气味也可用于某些环境中，以吸引某些年龄组或增加它们对某些年龄组的吸引力。


技术实现要素：

5.本文描述了用于识别能够将被至少两个年龄组差异地感知的气味剂组合物结合的嗅觉感受器的方法。所识别的嗅觉感受器可用于产生与年龄相关的气味或风味特征，该气味或风味特征确定用于刺激感受器的气味剂组合物的有效浓度范围。反过来，气味或风味特征可用于优化风味和气味以对某些年龄组产生吸引力，或打消某些年龄组使用的念头。在一些情况下，可以筛选气味剂组合物以确定它们是否被年龄组差异地感知。
6.可以将气味剂组合物以在某些年龄组中引起期望反应的浓度添加到消费品或各种环境中。例如，在某些浓度下，气味剂组合物可能起到阻止儿童和青少年使用有年龄限制的产品的作用。包括高浓度薄荷醇的气味剂组合物对该年龄组可能是有用的威慑。
7.一般而言，本文所述的方法可以包括以下步骤中的一或多个：用气味剂组合物分
析嗅觉感受器以确定用于刺激感受器的有效浓度范围，识别导致一个年龄组相对于另一个年龄组的被差异地感知的气味剂组合物和/或相应的嗅觉感受器，将气味剂组合物以适当的浓度添加到消费品中，使其在一个年龄组中引起比另一个年龄组优先的反应，针对在最终消费品的背景下的目标反应重新测量对已识别感受器的刺激以确认期望的活性水平，并基于与消费品混合物的干扰或协同作用来调整气味剂组合物的浓度。
8.一种用于确定与产品一起使用的气味剂组合物的浓度的方法可以包括：1)识别与气味剂组合物结合的一或多种嗅觉感受器，其中气味剂组合物被至少两个年龄组差异地感知，并且其中识别通过以下方式进行：a)将所述一或多种嗅觉感受器暴露于多种气味剂浓度的气味剂组合物中，所述一或多种嗅觉感受器与报告子偶联，所述报告子在气味剂组合物结合到所述一或多种嗅觉感受器时产生信号；以及b)通过测量所产生的信号来检测所述一或多种嗅觉感受器在每种气味浓度下与气味剂组合物的结合；2)通过确定气味剂组合物的引起对所述一或多种气味感受器的约10％至约90％的最大结合反应的浓度(约ec
10
至约ec
90
浓度)来形成与年龄相关的气味或风味特征；和3)以在所述至少两个年龄组中的一个年龄组中产生期望效果的浓度将气味剂组合物包括在产品中。
9.可以将气味剂组合物以在某个年龄组中产生期望效果的浓度包括在产品或环境中。例如，为成人设计的气味剂组合物可以以ec
10
至大于ec
90
的浓度包括在产品中，以产生阻止该产品在儿童和青少年中使用的负面效果。通常被年龄组差异地感知的示例性气味剂组合物包括薄荷醇、薄荷、香蕉、洋葱和玫瑰。
10.所述一或多种嗅觉感受器可以是使用酵母或哺乳动物细胞的活细胞测定的一部分。可替代地，嗅觉感受器可以在使用宿主细胞的膜级分的测定中提供。在一些情况下，所述一或多种嗅觉感受器可以在脂质体中提供。
11.本文还描述了用于阻止儿童或青少年使用有年龄限制的产品的方法。这些方法通常包括检测在多种浓度下的气味剂组合物与如上所述的一或多种嗅觉感受器的结合，以及具体地针对其(一或多种)目标嗅觉感受器在浓度范围为ec
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至大于ec
90
浓度的气味剂组合物中使用薄荷醇。示例性的有年龄限制的产品包括酒精、尼古丁和烟草。
具体实施方式
12.本文描述了用于识别能够将被至少两个年龄组差异地感知的气味剂组合物结合的嗅觉感受器的方法。所识别的嗅觉感受器可用于确定用于刺激感受器的气味剂组合物的有效浓度范围，其中感受器刺激产生特定的与年龄相关的气味或风味特征。反过来，气味或风味特征可用于优化风味和气味以对某些年龄组产生吸引力，或打消某些年龄组使用的念头。在一些情况下，可以筛选气味剂组合物以确定它们是否被年龄组差异地感知。
13.关于年龄组，感知方面的差异通常被理解为存在于两个不同年龄组的人之间，例如在年长者和年轻者之间。年长者可以是大约30岁，而年轻者可以是大约10岁。在一些情况下，年长者可以是大约40岁，而年轻者可以是大约20岁。在另一些情况下，年长者可以是大约50岁，而年轻者可以是大约30岁。年龄组也可以指成人和儿童。成人通常是超过可以消费有年龄限制的产品(包括酒精、烟草和电子香烟)的法定年龄的人。在美国，这通常包括对于使用烟草和电子香烟为18岁及以上。在世界其他地区，消费有年龄限制的产品的法定年龄可以介于15至25岁及以上。成人年龄组的一个子集是高龄组，其包括大约65岁及以上的人。
儿童通常可能是低于消费有年龄限制的产品的最低年龄(在美国为18岁)的人。儿童年龄组的一个子集是青少年年龄组，其通常包括年龄在大约10至17岁之间的人。
14.被差异地感知的气味剂组合物可以以优化期望反应的浓度被包括在有年龄限制的产品中，如上所述。这可能有助于酒精、烟草和电子香烟行业更好地针对成年消费者，并允许在不直接对儿童进行测试的情况下评估年龄有差别的风味特征。有年龄限制的产品通常是法律上限制某些年龄组使用的产品。
15.在一些变型中，被差异地感知的气味剂组合物可以用在某些环境中以吸引或增加它们对某些年龄组的吸引力。例如，这些组合物可用于家中以为家中成人或儿童提供期望的反应。
16.本文所述的气味剂组合物可以是包括一或多种气味分子的组合物，所述气味分子可被至少一种嗅觉感受器检测到，并且它们与感知到的气味或风味相关联。如本文所用，术语“气味分子”和“气味剂”可互换使用。
17.本文所述的嗅觉感受器(or)可以是人类嗅觉感受器、在非人类动物中发现的嗅觉感受器、微量胺相关感受器、犁鼻骨感受器、甲酰肽感受器、膜鸟苷酸环化酶、亚型gc-d感受器和g蛋白偶联味觉感受器。嗅觉感受器也可以是由嗅觉感受器、微量胺相关感受器、犁鼻骨感受器、甲酰肽感受器、膜鸟苷酸环化酶、亚型gc-d感受器和g蛋白偶联味觉感受器构成的杂合感受器。另外，嗅觉感受器可以是由嗅觉感受器和原产于酵母或哺乳动物细胞类型的信号感受器蛋白质构成的杂合或嵌合感受器，或密码子优化的嗅觉感受器或通过定向进化改造的那些感受器。此外，嗅觉感受器可以指异位嗅觉感受器和位于鼻腔中的嗅觉感受器。
18.在一些变型中，本文所述的方法包括以下各项中的一或多步：用气味剂组合物测定嗅觉感受器以确定用于刺激感受器的有效浓度范围，识别相对于另一个年龄组被一个年龄组差异性地感知的气味剂组合物和/或相应嗅觉感受器，将所述气味剂组合物以适当的浓度添加到消费品中，从而其在一个年龄组中引起比另一个年龄组优先的反应，针对在最终消费品的背景下的目标反应重新测量对已识别感受器的刺激以确认所需活性水平，并基于与消费品混合物的干扰或协同作用来调整气味剂组合物的浓度。
19.在另一些变型中，本文所述的方法用于为气味剂组合物形成与年龄相关的气味或风味特征。气味剂组合物可以以不同浓度与消费品(例如，有年龄限制的产品)一起使用。在此，所述方法通常包括：1)识别与气味剂组合物结合的一或多种嗅觉感受器，其中气味剂组合物被至少两个年龄组差异性地感知，并且其中通过以下方式进行识别：a)将所述一或多种嗅觉感受器暴露于多种气味剂浓度的气味剂组合物中，所述一或多种嗅觉感受器与报告子偶联，所述报告子在气味剂组合物结合到所述一或多种嗅觉感受器时产生信号；以及b)通过测量所产生的信号来检测所述一或多种嗅觉感受器在每一气味浓度下与气味剂组合物的结合；2)通过确定气味剂组合物的引起对所述一或多种气味感受器的约10％至约90％的最大结合反应的浓度(约ec
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至约ec
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浓度)来形成与年龄相关的气味或风味特征；和3)以在所述至少两个年龄组中的一个年龄组中产生所需效果的浓度将气味剂组合物包括在产品中。
20.可以将气味剂组合物以在某个年龄组中产生所需效果的浓度包括在产品中。气味剂组合物可以以约ec
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至约ec
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的浓度、约ec
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至约ec
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的浓度、约ec
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至约ec
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的浓度、约
ec
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至约ec
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的浓度、约ec
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至约ec
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的浓度、约ec
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至约ec
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的浓度、约ec
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至约ec
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的浓度、约ec
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至约ec
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的浓度或大于ec
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的浓度包括在产品中(取决于应用和感受器-气味剂反应水平等因素)以在不同年龄的人(例如，年长者和年轻者)之间产生差异效果。例如，产品中所包括的气味剂组合物的浓度可能会产生阻止该产品在儿童和青少年中使用但不阻止其在成人中使用的负面效果。可以包括在产品中以在一个年龄组而不是另一个年龄组中以产生差异效果(例如，负面效果)的气味剂组合物的浓度可以是ec
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、ec
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、ec
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、ec
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、ec
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、ec
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、ec
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、ec
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或ec
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浓度。在一些应用中采用大于ec
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的浓度可能是有用的。
21.气味剂组合物
22.本文所述的气味剂组合物包括一或多种气味剂。气味剂组合物可以具有任何合适的形式，例如，组合物可以是液体、固体、半固体或气体形式。在一些变型中，已知气味剂组合物被至少两个年龄组差异地感知，但需要识别他们相应的嗅觉感受器。例如，通常已知包含薄荷醇的组合物被儿童和成人差异地感知，但需要识别他们相应的嗅觉感受器以便确定用于不同感受器激活的有效浓度。已知被某些年龄组差异地感知的其他示例性气味剂可以包括但不限于薄荷、香蕉、洋葱和玫瑰。
23.在筛选气味剂组合物以确定它们是否被至少两个年龄组差异地感知的变型中，被差异地感知的气味剂可以包括但不限于以下的全部或(一或多种)成分：焦糖、蜂蜜、奶油糖果、黄油、酱油、巧克力、糖蜜、二氧化硫、乙醇、醋酸、乙酸乙酯、烧过的火柴、卷心菜、臭鼬、大蒜、硫醇、硫化氢、柴油、煤油、塑料、焦油、霉菌、软木塞、蘑菇、灰尘、花卉物质(例如，天竺葵、紫罗兰、橙花和薰衣草)、水果物质(例如，葡萄柚、柠檬、黑莓、覆盆子、草莓、黑醋栗、樱桃、杏、桃、苹果、菠萝、甜瓜、香蕉、草莓酱、葡萄干、西梅、无花果、邻氨基苯甲酸甲酯)、草本植物或蔬菜(割下来的青草、甜椒、桉树、青豆、芦笋、绿橄榄、黑橄榄、朝鲜蓟)、干草、稻草、茶、烟草、核桃、榛子、杏仁、雪利酒、甘草、茴香、黑胡椒、丁香、咖啡、培根、橡木、雪松和香草。
24.筛选以确定气味剂组合物激活(结合)嗅觉感受器的能力可以包括产生测试气味剂组合物的系列稀释液，针对一或多种感受器测试每种稀释液，并确定ec
50
浓度。根据该信息，气味剂组合物可被设计成使得未稀释混合物的感受器信号传导对于激活感受器中的至少一种处于ec
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至大于ec
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的浓度。
25.嗅觉感受器
26.任何合适的嗅觉感受器均可用于本文所述的方法中。大多数嗅觉感受器是g蛋白偶联感受器，它们在感受器被气味剂激活后与g蛋白相关联以进行信号转导。嗅觉感受器的辨别力如此强大，使得它们一共可以以数百万种组合结合数以千计的挥发性化学物质，每一种挥发性化学物质都有可能不同的感知。众所周知，嗅觉系统使用组合感受器编码方案来破译气味分子。一种嗅觉感受器可以分辨出多种气味剂，并且一种气味剂可以被多种嗅觉感受器分辨出。气味剂的轻微结构变化或气味剂在环境中浓度的变化也可能导致一个年龄组对气味剂的感知方式发生变化。
27.在一些变型中，嗅觉感受器是哺乳动物嗅觉感受器，例如人类嗅觉感受器。在另一些变型中，嗅觉感受器来自其他哺乳动物，例如小鼠、大鼠、猫、狗、牛、马、山羊、猪和熊。在更多变型中，嗅觉感受器是杂合嗅觉感受器。
28.可用于本文公开的方法中的示例性人类嗅觉感受器(包括单核苷酸多态性(snp)
变型)包括来自以下18个分类的人类家族的那些嗅觉感受器，如下进一步描述：or1、or2、or3、or4、or5、or6、or7、or8、or9、or10、or11、or12、or13、or14、or51、or52、or55和or56。
29.人类家族or1有21个成员：or1a、or1b、or1c、or1d、or1e、or1f、or1g、or1h、or1i、or1j、or1k、or1l、or1m、or1n、or1p、or1q、or1r、or1s、or1x、or1aa和or1ab。家族or2有41个成员：or2a、or2b、or2c、or2d、or2e、or2f、or2g、or2h、or2i、or2j、or2k、or2l、or2m、or2n、or2q、or2r、or2s、or2t、or2u、or2v、or2w、or2x、or2y、or2z、or2ad、or2ae、or2af、or2ag、or2ah、or2ai、or2aj、or2ak、or2al、or2am、or2ao、or2ap、or2as和or2at。
30.人类家族or3有3个成员：or3a、or3b和or3d。
31.人类家族or4有21个成员：or4a、or4b、or4c、or4d、or4e、or4f、or4g、or4h、or4k、or4l、or4m、or4n、or4p、or4q、or4r、or4s、or4t、or4u、or4v、or4w和or4x。
32.人类家族or5有49个成员：or5a、or5b、or5c、or5d、or5e、or5f、or5g、or5h、or5i、or5j、or5k、or5l、or5m、or5p、or5r、or5s、or5t、or5v、or5w、or5ac、or5ah、or5ak、or5al、or5am、or5an、or5ao、or5ap、or5aq、or5ar、or5as、or5au、or5w、or5x、or5y、or5z、or5ba、or5bb、or5bc、or5bd、or5be、or5bh、or5bj、or5bk、or5bl、or5bm、or5bn、or5bp、or5bq、or5br、or5bs和or5bt。
33.人类家族or6有21个成员：or6a、or6b、or6c、or6d、or6e、or6f、or6j、or6k、or6l、or6m、or6n、or6p、or6q、or6r、or6s、or6t、or6u、or6v、or6w、or6x和orgy。
34.人类家族or7有9个成员：or7a、or7c、or7d、or7e、or7g、or7h、or7k、or7l和or7m。
35.人类家族or8有18个成员：or8a、or8b、or8c、or8d、or8f、or8g、or8h、or8i、or8j、or8k、or8l、or8q、or8r、or8s、or8t、or8u、or8v和or8x。
36.人类家族or9有12个成员：or9a、or9g、or9h、or9j、or9k、or9l、or9m、or9n、or9p、or9q、or9r和or9s。
37.人类家族or10有29个成员：or10a、or10b、or10c、or10d、or10g、or10h、or10j、or10k、or10n、or10p、or10q、or10r、or10s、or10t、or10u、or10v、or10w、or10x、or10y、or10z、or10aa、or10ab、or10ac、or10ad、or10ae、or10af、or10ag、or10ah和or10ak。
38.人类家族or11有11个成员：or11a、or11g、or11h、or11i、or11j、or11k、or11l、or11m、or11n、or11p、or11q。
39.人类家族or12有1个成员：or12d。
40.人类家族or13有11个成员：or13a、or13c、or13d、or13e、or13f、or13g、or13h、or13i、or13j、or13k和or13z。
41.人类家族or14有6个成员：or14a、or14c、or14i、or14j、or14k和or14l。
42.人类家族or51有21个成员：or51a、or51b、or51c、or51d、or51e、or51f、or51g、or51h、or51i、or51j、or51k、or51l、or51m、or51n、or51p、or51q、or51r、or51s、or51t、or51v和or51ab。
43.人类家族or52有22个成员：or52a、or52b、or52d、or52e、or52h、or52i、or52j、or52k、or52l、or52m、or52n、or52p、or52q、or52r、or52s、or52t、or52u、or52v、or52w、or52x、or52y和or52z。
44.人类家族or55有1个成员：or55b。
45.人类家族or56有2个成员：or56a和or56b。
46.异位嗅觉感受器也可用于本文所述的方法中。这些感受器的基因序列通常与鼻子中的嗅觉感受器相同，但在嗅觉方面不起作用的器官、组织或细胞中表达。例如，在许多非嗅觉组织和细胞中发现了异位嗅觉感受器，这些非嗅觉组织和细胞包括皮肤、大脑、乳房、结肠、红细胞、眼睛、心脏、肾脏、肝脏、肺、卵巢、前列腺、脾脏、睾丸、白细胞、淋巴结、肾上腺组织、脂肪组织和神经组织。异位嗅觉感受器也可以是来自另一种哺乳动物的嗅觉感受器。
47.在脂肪中发现的示例性异位嗅觉感受器包括例如or51e2、or2w3、or51e1、or2a1/42、or2a4/7、or52n4、or13a1、047d2、or10j1、or1l8、or2b6、or4d6、tas1r3、tas2r10、tas2r13、tas2r14、tas2r19、tas2r20、tas2r31、tas2r40、tas2r42、tas2r5、vn1r1和vn1r2。
48.在肾上腺组织中发现的异位嗅觉感受器包括例如or51e2、orw3、or51e1、or2a1/42、or2a4/7、or52n4、or13a1、or5k2、or3a2、or2h2、or7c1、or2l13、or1l8、or2t8、or10ad1、or52b6、or1e1、or13j1、or2c1、or52d1、or10a2、or2b6、or8g5、or1f12、or4d6、tas1r1、tas1r3、tas2r10、tas2r13、tas2r14、tas2r19、tas2r20、tas2r3、tas2r30、tas2r31、tas2r4、tas2r42、tas2r5、tas2r50、tas2r9和vn1r1。
49.在中枢神经系统器官和组织中发现的异位嗅觉感受器包括例如or51e2、or2w3、or4n4、or51e1、or52n4、or13a1、or5k2、or7d2、or3a2、or2v1、or2h2、or7c1、or2l13、or1l8、or2t8、or10ad1、or3a3、or2k2、or13j1、or2c1、or7a5、or10a2、or1f12、taar3、taar5、taar6。tas1r1、tas1r3、tas2r1、tas2r10、tas2r13、tas2r14、tas2r19、tas2r20、tas2r3、tas2r30、tas2r31、tas2r39、tas2r4、tas2r40、tas2r42、tas2r46、tas2r5、tas2r50、tas2r7、tas2r8、tas2r9、vn1r1、vn1r2和vn1r5。
50.在多巴胺能神经元中发现的异位嗅觉感受器包括例如or51e1、or51e2和or2j3。在乳房中发现的异位嗅觉感受器包括例如or51e2、or51e1、or2a1/42、or2a4/7、or52n4、or5k2、or3a2、or2t8、or10ad1、or3a3、or2k2、or1e1、or2c1、or2c3、or8d1、or7a5、or10a2、tas1r1、tas1r3、tas2r10、tas2r13、tas2r14、tas2r19、tas2r20、tas2r31、tas2r4、tas2r5和vn1r1。
51.在结肠中发现的异位嗅觉感受器包括例如or51e2、or2w3、or51e1、or2a1/42、or2a4/7、or5k2、or7d2、or7c1、or2l13、or7a5、or51b5、tas1r1、tas1r3、tas2r14、tas2r20、tas2r4、tas2r43、tas2r5和vn1r1。
52.在心脏组织中发现的异位嗅觉感受器包括例如or51e2、or51e1、or52n4、or13a1、or2h2、or10ad1、or3a3、or52b6、or2k2、or8g5、or4d6、tas1r1、tas1r3、tas2r10、tas2r13、tas2r14、tas2r19、tas2r20、tas2r3、tas2r30、tas2r31、tas2r4、tas2r43、tas2r46、tas2r5、tas2r50、tas2r7和vn1r1。
53.在肾脏中发现的异位嗅觉感受器包括例如or51e2、or51e1、or2a1/42、or2a4/7、or5k2、or1l8、or10a2、or1f12、tas1r1、tas1r3、tas2r1、tas2r10、tas2r14、tas2r19、tas2r20、tas2r3、tas2r30、tas2r31、tas2r4、tas2r42、tas2r43、tas2r5、tas2r50和vn1r1。
54.在肝脏中发现的异位嗅觉感受器包括例如or2w3、or51e1、or2a1/42、or2a4/7、or7d2、or1l8、or2t8、tas1r3、tas2r14、tas2r20、tas2r30、tas2r40、tas2r5、vn1r1和vn1r2。
55.在淋巴结组织中发现的异位嗅觉感受器包括例如or51e2、or51e1、or2a1/42、or52n4、or13a1、or5k2、or3a2、or2h2、or3a3、or2b6、tas1r3、tas2r14、tas2r19、tas2r20、tas2r31、tas2r4、tas2r40、tas2r43、tas2r5和vn1r1。
56.在卵巢组织中发现的异位嗅觉感受器包括例如or51e2、or2w3、or4n4、or51e1、or2a1/42、or2a4/7、or52n4、or5k2、or3a2、or2v1、or2h2、or2l13、or1l8、or10ad1、or3a3、or52b6、or13j1、or2c1、or52d1、or51b5、or1f12、tas1r1、tas1r3、tas2r1、tas2r10、tas2r13、tas2r14、tas2r19、tas2r20、tas2r3、tas2r31、tas2r4、tas2r42、tas2r43、tas2r5、tas2r50、tas2r60、tas2r7、vn1r1和vn1r2。
57.在前列腺中发现的异位嗅觉感受器包括例如or51e2、or2w3、or51e1、or2a1/42、or2a4/7、or52n4、or13a1、or5k2、or2h2、or7c1、or1e1、or13j1、or51b5、tas1r3、tas2r14、tas2r19、tas2r20、tas2r43、tas2r46、tas2r5和vn1r1。
58.在皮肤中发现的异位嗅觉感受器包括例如or2at4和or51e2。
59.在睾丸中发现的异位嗅觉感受器包括例如or4n4、or6f1、or2h1、or51e2、or2w3、or4n4、or51e1、or2a1/42、or2a4/7、or52n4、or7d2、or3a2、or2v1、or2h2、or7c1、or10j1、or1l8、or1c1、or2h1、or10ad1、or3a3、or13c3、or2k2、or1e1、or2c1、or2k2、or1e1、or2c1、or2c3、or8d1、or52d1、or7a5、or10a2、or2b6、or7e24、or6f1、or8g5、or51b5、or1f12、tas1r1、tas1r3、tas2r1、tas2r14、tas2r19、tas2r20、tas2r3、tas2r31、tas2r4、tas2r43、tas2r5、tas2r50、tas2r60、vn1r1、vn1r2、vn1r3和vn1r4。
60.在白细胞中发现的异位嗅觉感受器包括例如or2w3、or2a4/7、or52n4、or7d2、or2l13、or3a3、or2c1、or2c3、or2b6、tas1r3、tas2r14、tas2r20、tas2r40和tas2r60。
61.在又一些变型中，嗅觉感受器是经过改造的感受器。例如，可以将来自一种嗅觉感受器的n末端区域的氨基酸融合到第二种不同的嗅觉感受器的n末端区域。在一些变型中，n末端氨基酸来自供体嗅觉感受器的氨基酸位置1-61。在另一些变型中，n末端氨基酸来自供体嗅觉感受器的氨基酸位置1-55。在一种变型中，n末端氨基酸是从氨基酸位置1-20或所述氨基酸直至第一跨膜结构域，或者氨基酸位置1-40(其包括第一跨膜结构域的共有序列)。在另一种变型中，n末端氨基酸在其氨基酸位置1-61的n末端区域被融合到受体嗅觉感受器。将来自供体多肽的c末端的氨基酸融合到受体嗅觉感受器的c末端。在一些变型中，来自受体嗅觉感受器的c末端的1-50个氨基酸被来自供体多肽的氨基酸取代。在另一些变型中，来自受体嗅觉感受器的c末端的1-55个氨基酸被来自供体多肽的氨基酸取代。供体多肽可以是另一种嗅觉感受器。各种标签也可以包括在经过改造的嗅觉感受器中。例如，嗅觉感受器可以在其n末端或c末端与flag、his、rho或lucy标签融合，以协助某些纯化步骤和生化表征过程。
62.在一些变型中，所述一或多种嗅觉感受器是or51e1、or8k3、or2w1、or2j2、or11h7p、or5p3或or1g1。这些感受器可用于结合或识别包括薄荷醇或薄荷的气味剂组合物。嗅觉感受器or52d1和or1g1可用于结合或识别包括乙酸异戊酯或香蕉的组合物。
63.与年龄相关的气味或风味特征
64.上文所提到的气味剂组合物和嗅觉感受器可用于为气味剂组合物产生与年龄相关的气味或风味特征。然后所述特征可以帮助确定包括在消费品中的气味剂组合物的有效浓度范围以在某些年龄组中获得所需效果。浓度可以经选择以产生积极效果，其中气味剂通常被认为对一个年龄组产生吸引力，或者经选择以产生负面效果，其中气味剂通常被认为对一个年龄组没有吸引力。在一种变型中，基于浓度差异，气味剂组合物被至少两个年龄组差异性地感知。
65.用于确定与产品一起使用的气味剂组合物的浓度的方法可以包括：1)识别与气味剂组合物结合的一或多种嗅觉感受器，其中气味剂组合物被至少两个年龄组差异性地感知，并且其中通过以下方式进行识别：a)将所述一或多种嗅觉感受器暴露于多种气味剂浓度的气味剂组合物中，所述一或多种嗅觉感受器与报告子偶联，所述报告子在气味剂组合物结合到所述一或多种嗅觉感受器时产生信号；以及b)通过测量所产生的信号来检测所述一或多种嗅觉感受器在每一气味浓度下与气味剂组合物的结合；2)通过确定气味剂组合物的引起对所述一或多种气味感受器的约10％至约90％的最大结合反应的浓度(约ec
10
至约ec
90
浓度)来形成与年龄相关的气味或风味特征；和3)以在所述至少两个年龄组中的一个年龄组中产生所需效果的浓度将气味剂组合物包括在产品中。
66.如前所述，可以将气味剂组合物以在某个年龄组中产生所需效果的浓度包括在产品中。基于所用浓度，至少两个年龄组的效果可能不同。例如，可以将气味剂组合物以低浓度(例如，ec
10
浓度)或高浓度(例如，ec
90
浓度)包括在产品中以产生阻止该产品在儿童和青少年中使用但不阻止其在成人中使用的负面效果。有年龄限制的产品可以包括酒精、尼古丁或烟草。例如，含有尼古丁的有年龄限制的产品包括但不限于电子香烟和其他电子烟设备以及端部点燃型香烟。
67.在一种变型中，气味剂组合物包括浓度为ec
80
至大于ec
90
的薄荷醇，以阻止儿童和青少年使用有年龄限制的产品。薄荷醇是一种气味剂，其通常被认为在至少两个年龄组(成人和儿童)之间被差异地感知。成人需要大约两倍的薄荷醇浓度才能感知到与儿童相同的强度水平。这种效果可能是由于感受器的下调或由于沿着感知神经通路的其他干扰。这种嗅觉能力下降的观察结果类似于成人随着他们年龄的增长而对某些听觉频率失去敏感性的现象。包括薄荷醇的气味剂组合物的年龄相关气味或风味特征的产生在实例1中进一步详述。
68.还可以针对薄荷醇敏感感受器(例如，or51e1)筛选气味剂组合物以确定它们是否可以被某些年龄组差异地感知。例如，可以针对or51e1和其他与薄荷醇相关的or筛选一系列气味剂，以识别在某个浓度范围内更具体地针对这些感受器的气味剂。然后将识别出的最佳气味剂以多种浓度添加到目标消费品中，并且比较有和没有消费品的气味剂浓度与感受器刺激的激活曲线，以评估消费品的其他成分对感受器对气味剂的敏感度的影响。然后可以选出气味剂的最佳浓度，其提供对(一或多种)薄荷醇感受器的高刺激，所述高刺激足以被年轻消费者强烈地(即，负面地)感知，但通过目标感受器的感官知觉减弱的成人将不太强烈地感知。
69.在一些变型中，被差异地感知的气味剂组合物可用于某些环境中以吸引或增加它们对某些年龄组的吸引力。例如，这些组合物可用于家中以为家中成人或儿童提供期望的反应(例如，放松)。
70.当在家庭环境中使用时，可以通过将被差异地感知的气味剂组合物置于产品的材料(例如塑料、皮革、布料、木头或蜡部分等)中来递送该组合物，随着时间的推移气味从材料中慢慢释放。在一些变型中，当材料经受一组不同的条件时，气味从材料中释放出来。例如，气味可以置于这样的材料中：在加热该材料时气味会释放出来(例如，类似于glad插件)。除了温度之外，其他条件的变化也可用于释放气味，这些条件包括例如溶剂或ph、气流或光的变化。
71.当产生与年龄相关的气味或风味特征时，将所述一或多种嗅觉感受器暴露于多种气味剂浓度的气味剂组合物中，并基于测量由与所述一或多种感受器偶联的报告子产生的信号来检测所述一或多种嗅觉感受器的结合。报告子或报道分子可以是能够间接或直接被检测的部分。报告子包括但不限于发色团、荧光团、荧光蛋白、发光蛋白、感受器、半抗原、酶和放射性同位素。可以使用各种技术(例如，通过标准读板机、二元比色表征等)来检测或测量由报告子所产生的信号。
72.在一些变型中，一或多种报告子是荧光报告子、生物发光报告子、酶和离子通道中的一或多种。荧光报告子的示例包括但不限于：来自维多利亚多管发光水母(aequorea victoria)或海洋腔肠(renilla reniformis)的绿色荧光蛋白及其活性变体(例如，蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白等)；来自水螅类水母、桡足动物、栉水母、珊瑚虫和奶嘴海葵的荧光蛋白及其活性变体；和藻胆蛋白及其活性变体。其他荧光报告子包括例如小分子，如cpsd(二钠3-(4-甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环[3.3.1.1
3,7
]癸烷}-4-基)苯基磷酸酯，赛默飞世尔(thermofisher)目录#t2141)。生物发光报告子包括例如水母发光蛋白(和其他ca
2
调节的光蛋白)、基于荧光素底物的荧光素酶、基于腔肠素底物的荧光素酶(例如，海肾属(renilla)、高斯椰属(gaussia)和metridina)和来自海萤(cypridina)的荧光素酶及其活性变体。在一些变型中，生物发光报告子可以是北美萤火虫荧光素酶、日本萤火虫荧光素酶、意大利萤火虫荧光素酶、东欧萤火虫荧光素酶、宾夕法尼亚萤火虫荧光素酶、叩头虫荧光素酶、苹绕实蝇荧光素酶、海肾属荧光素酶、高斯椰属荧光素酶、海萤属荧光素酶、metridina荧光素酶或oluc和红萤火虫荧光素酶，所有这些都可从赛默飞世尔科技公司和/或普洛麦格公司(promega)商购获得。
[0073]
可以使用的示例性酶报告子包括β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶和过氧化氢酶。可以采用的离子通道报告子包括例如camp激活的阳离子通道。一或多种报告子还可包括正电子发射断层扫描(pet)报告子、单光子发射计算机断层扫描(spect)报告子、光声报告子、x射线报告子或超声报告子。
[0074]
年龄相关的气味或风味特征可以使用测定产生，在所述测定中，一或多种嗅觉感受器是使用酵母或哺乳动物细胞的活细胞测定的一部分。可替代地，嗅觉感受器可以在使用宿主细胞膜级分的测定中提供。用于制备酵母膜级分的示例性方法在实例2中描述。在一些情况下，一或多种嗅觉感受器可以在脂质体(蛋白脂质体)中提供，其可以如实例3中所述制备。
[0075]
宿主细胞可以是原核或真核细胞，其中可以引入、表达和/或繁殖本发明的载体。微生物宿主细胞是原核或真核微生物的细胞，所述原核或真核微生物包括细菌、酵母、微观真菌以及真菌和粘液菌的生命周期中的微观阶段。典型的原核宿主细胞包括大肠杆菌(e.coli.)的各种菌株。典型的真核宿主细胞是酵母或丝状真菌，或者是哺乳动物细胞，如中国仓鼠细胞、鼠类nih 3t3成纤维细胞、人类肾细胞或啮齿动物骨髓瘤或杂交瘤细胞。
[0076]
可用作宿主细胞的示例性真核细胞包括但不限于真菌细胞、动物细胞、植物细胞和藻类细胞。在一些变型中，真核细胞是真菌细胞，包括但不限于曲霉属(aspergillus)、木霉属(trichoderma)、酵母菌属(saccharomyces)、金孢子菌属(chrysosporium)、克鲁维酵母属(klyuveromyces)、念珠菌属(candida)、毕赤酵母属(pichia)、脱杆菌属(debaromyces)、汉逊酵母属(hansenula)、耶氏酵母属(yarrowia)、接合酵母属
(zygosaccharomyces)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)、青霉菌属(penicillium)或根霉属(rhizopus)的真菌。在另一些变型中，真菌细胞来自酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(pichia pastoris)、黑曲霉(aspergillus niger)、米曲霉(aspergillus oryzae)、卢克诺文思金孢子菌(chrysosporium lucknowense)或里氏木霉(trichoderma reesei)。
[0077]
在更多变型中，宿主细胞是动物细胞。动物细胞可以是哺乳动物细胞，例如牛、犬、猫、仓鼠、小鼠、猪、兔、大鼠或绵羊来源的细胞。在一些变型中，哺乳动物细胞是灵长类动物的细胞，灵长类动物包括但不限于猴子、黑猩猩、大猩猩和人类。更具体地，动物细胞可以包括成纤维细胞、上皮细胞(例如，肾、乳腺、前列腺、肺)、角质细胞、肝细胞、脂肪细胞、内皮细胞、造血细胞。在一些变型中，动物细胞是成体细胞(例如，终末分化的、分裂的或非分裂的)或干细胞。在另一些变型中，哺乳动物细胞系用作宿主细胞。细胞系可以源自中国仓鼠细胞、人肾细胞、猴肾细胞、人宫颈癌细胞或小鼠骨髓瘤细胞。
[0078]
真核细胞也可以是植物细胞。在一些变型中，植物细胞是单子叶或双子叶植物的细胞，单子叶或双子叶植物包括但不限于苜蓿、杏仁、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆、黑莓、芸苔、西兰花、卷心菜、油菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、樱桃、菊苣、柑橘、咖啡、棉花、黄瓜、桉树、麻类植物、生菜、扁豆、玉米、芒果、甜瓜、燕麦、木瓜、豌豆、花生、菠萝、李子、马铃薯(包括红薯)、南瓜、萝卜、油菜籽、覆盆子、大米、黑麦、高粱、大豆、菠菜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、烟草、番茄、芜菁、小麦、西葫芦和其他果蔬(例如西红柿、胡椒、辣椒、茄子、黄瓜、南瓜等)、其他球茎类蔬菜(例如大蒜、洋葱、韭菜等)、其他梨果(例如苹果、梨等)、其他核果(例如桃、油桃、杏、梨、李子等)、拟南芥、诸如针叶树和落叶树等木本植物、观赏植物、多年生草、饲料作物、花卉、其他蔬菜、其他水果、其他农作物、草本植物、草或多年生植物部分(例如球茎；块茎；根；冠；茎；匍匐茎；分蘖；芽；插条，包括无根插条、有根插条和愈伤组织插条或愈伤组织产生的小苗；顶端分生组织等)。
[0079]
在一些实施例中，真核细胞是藻类，包括但不限于小球藻属(chlorella)、衣藻属(chlamydomonas)、栅藻属(scenedesmus)、等鞭金藻属(isochrysis)、杜氏藻属(dunaliella)、四棱藻属(tetraselmis)、微绿藻属(nannochloropsis)或原藻属(prototheca)的藻类。
[0080]
实例
[0081]
以下实例仅用于说明目的，并且不应以任何方式被解释为限制。
[0082]
实例1：薄荷醇的年龄相关风味特征的产生
[0083]
薄荷醇在文献中已被充分证实，随着年龄的增长，人们对薄荷醇的风味和气味的感知越来越不强烈。由于薄荷醇的气味和风味感知是通过化合物与人类嗅觉感受器子集的结合来控制的(在其他气味剂存在或不存在的情况下)，一或多种薄荷醇敏感的嗅觉感受器可能会相对于年轻者降低它们向年长者的大脑发出的信号传导。目前对这种感知的降低知之甚少，并且这种感知的降低可能是由于多种因素造成的。例如，它可以反映感受器基因表达的下调、表达感受器的特定神经元的毒性或坏死，或嗅球信号处理的变化导致感受器向大脑的信号传导的降低。
[0084]
当产生薄荷醇的年龄相关风味特征时，可以通过在共表达气味剂感受器表达的辅助因子的hek293t中转染人类嗅觉感受器cdna序列来完成对薄荷醇做出反应的嗅觉感受器
的识别(参见，例如，萨伊托(saito,h.)等人，细胞(cell)，119:679-691(2004))。然后可以将转染的细胞暴露于在生长培养基中的1nm至1mm的薄荷醇的系列稀释液，并且可以使用商业测定通过细胞中的camp产生来测量感受器信号传导。
[0085]
接下来，与未转染的对照细胞相比，当暴露于至少一种薄荷醇浓度时，可以通过增加信号传导来识别阳性嗅觉感受器。在每种情况下，都定义了感受器与薄荷醇的ec
50
。嗅觉感受器or1g1、8k3、2w1、2j2、11h7p和51e1已通过这种方法被识别为薄荷醇敏感的嗅觉感受器。
[0086]
当研发年龄差别的气味(风味)组合物时，可以针对它们激活薄荷醇敏感感受器(例如，or1g1、8k3、2w1、2j2、11h7p和51e1)的能力来筛选气味剂组合物。在每种情况下，可以针对每种薄荷醇敏感感受器及确定的ec
50
对测试气味剂组合物的系列稀释液进行测试。根据该信息，气味剂混合物可以设计成使得未稀释混合物的感受器信号传导对于至少一种薄荷醇敏感感受器处于ec
80
和ec
90
之间。这些混合物还可以包含更令人愉悦的其他气味剂，代表最终产品的期望的风味感知。
[0087]
然后可以通过针对代表不同年龄组的人类感官小组测试设计的气味剂组合物来评估设计的成功。对于年龄差别的感受器(例如薄荷醇感受器)的ec
80
至ec
90
浓度的气味剂组合物，年轻者对检测的敏感性最高，并且会通过目标感受器感知强信号，这可能导致对在其他情况下令人愉快的气味剂的负面反应。随着年长者的敏感性降低，感受器的ec
50
转移到更高的浓度，并且来自设计的混合物的表观信号对年长的个体来说可能不那么强烈并因此不会被感知为是令人不快的。
[0088]
实例2：由酵母细胞制备膜级分
[0089]
来自酵母细胞的膜级分可以通过在搅拌器中用玻璃珠裂解来制备，如下所述。
[0090]
1.从在半乳糖中诱导表达嗅觉感受器的酵母细胞开始。
[0091]
a)记录od
660
和原始培养物体积。
[0092]
2.在50ml离心管中离心沉淀并弃去上清液，直到所有相同类型的细胞都在该管中。
[0093]
3.通过以3000rpm(1250rcf)离心4分钟来在pbs中(1l ddh2o中的pbs盐)洗涤细胞3次，并弃去上清液。
[0094]
4.在10ml细胞裂解缓冲液(8.5ml pbs、250μl蛋白酶抑制剂混合物iv、500μl pmsf)中重新悬浮细胞沉淀。
[0095]
5.用玻璃珠裂解细胞。
[0096]
a)将细胞裂解缓冲液中的细胞加入搅拌器储液槽中。
[0097]
b)用玻璃珠装满储液槽的一半。用裂解缓冲液装满到金属螺母的顶部。
[0098]
c)将储液槽盖上盖子并放入四周加冰的金属内腔中。
[0099]
d)将储液槽和内腔旋入塑料外腔中并装满冰块。
[0100]
e)放在搅拌机上并在低速30秒和关闭3分钟之间交替运行7次。
[0101]
6.将裂解液从储液槽中转移到15ml离心管中，用1ml细胞裂解缓冲液冲洗珠子并将其添加到裂解液中。
[0102]
7.将玻璃珠洗到锥形烧瓶中。
[0103]
8.在4℃下以4830rpm(3000rcf)离心裂解物10分钟并收集上清液。
[0104]
9.将上清液分装到超速离心机的上空的3ml管子中并称重。
[0105]
10.在4℃下在超速离心机上以43,000rpm旋转管子1小时以获得带有膜级分的沉淀。
[0106]
当膜级分待被用于进一步实验时，用990μl水重新悬浮沉淀。
[0107]
实例3：蛋白脂质体的制备
[0108]
可以形成包括嗅觉感受器的脂质体，如下所述。
[0109]
1.首先将酵母脂质(例如来自的总酵母提取物)在试管中重新悬浮在酵母裂解缓冲液中。然后将装有脂质溶液的试管放入装45ml水的50ml离心管中，用超声波仪搅拌。随着脂质体的形成，溶液变得更清澈。
[0110]
2.然后将如实例2中所述制备的酵母膜级分加入脂质体中。
[0111]
3.向酵母脂质中加入约25％至约90％的带有嗅觉感受器的酵母膜以形成悬浮液。
[0112]
4.使用5000nm然后1000nm孔径挤出机挤出脂质悬浮液。挤出机应保持在55℃至60℃之间。重复挤压脂质悬浮液至少四次。
[0113]
5.将脂质悬浮液放入干净的小瓶中，并在4℃下储存直至用于进一步实验。
[0114]
尽管为了清楚和理解的目的，已经通过说明和示例的方式对上述发明进行了一些详细的描述，但显而易见的是，某些改变和修改可以实施并且旨在落入随附权利要求的范围内。