肿瘤特异性启动子及其应用

1.本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体涉及肿瘤特异性启动子及其应用。


背景技术：

2.手术治疗、放射治疗和化学治疗等是目前治疗肿瘤的常规手段。近年来,肿瘤免疫治疗发展迅速，已成为肿瘤临床治疗研究的热点。溶瘤腺病毒是重组的复制型腺病毒，通过插入肿瘤特异性启动子或缺失病毒在正常细胞中增殖所需相关基因，仅在肿瘤细胞中增殖的病毒，能够特异性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无杀伤活性。溶瘤腺病毒是具备易于生产、高效临床安全等优良特性。近年来,溶瘤腺病毒因其创新性和疗效成为肿瘤治疗领域的热点。
3.尽管溶瘤腺病毒在肿瘤治疗中取得了一定进展，但在大部分临床实验中未能展现完全的抗肿瘤作用，其主要面临几个方面的挑战，包括溶瘤腺病毒肿瘤特异性增殖能力有限，在瘤内感染传播受限，单一治疗无法应对肿瘤复杂性，肿瘤抑制微环境抑制溶瘤腺病毒作用等。针对溶瘤腺病毒应用的挑战，主要解决措施有优化肿瘤特异性启动子增强瘤内增殖能力、表达促凋亡蛋白使肿瘤细胞敏感化、优化运输方式及介导免疫调节等。
4.肿瘤特异性高效增殖能力是溶瘤腺病毒的源头创新环节，也是临床应用最大挑战之一。为保证溶瘤腺病毒在正常细胞中的安全性，确保其仅在肿瘤细胞中增殖，主要通过两种方式进行：一是利用肿瘤特异性启动子控制病毒增殖所必需的基因，从而控制病毒的增殖；二是将病毒增殖在正常细胞中所必需而在肿瘤细胞中不需要的基因进行缺失，使病毒只能在肿瘤细胞中增殖，前者的应用已成为靶向基因病毒治疗中的一个重要策略。
5.人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,htert)被证实与正常组织相比，在多种恶性肿瘤组织中高表达，如肺癌、食管癌、乳腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、宫颈癌、直肠癌、肾癌及白血病细胞等多种恶性肿瘤。因而端粒酶的启动子可被作为肿瘤特异性启动子用于溶瘤腺病毒治疗，现有研究表明htert启动子作为肿瘤特异性启动子活性相当有限，实际应用中难以取得好的效果。
6.本领域目前急需对肿瘤特异性启动子进行优化改构，提高溶瘤腺病毒的肿瘤特异性高效增殖能力，进而实现溶瘤腺病毒的高效特异性杀伤能力，为本领域肿瘤免疫治疗的研发提供新的有效选择。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题是溶瘤腺病毒肿瘤特异性增殖能力有限。本发明解决上述问题的技术方案是提供了一种核心启动元件。该核心启动元件既有独立的启动基因表达的功能，可单独作为启动子使用，也可作为元件构建启动子。
8.该核心启动元件：
9.1)、核苷酸序列如seq id no.1所示；
10.或者：
11.2)、在序列seq id no.1所示的核苷酸序列中有1个或几个发生碱基插入、缺失和/或替换突变，且仍然具有启动子功能的核酸分子。
12.优选的，上述的1个或几个碱基插入、缺失和/或替换突变为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基发生插入、缺失和/或替换突变。
13.进一步的，上述的核心启动元件的核苷酸序列如seq id no.3、seq id no.4或seq id no.5中的任一项所示。
14.本发明还同时提供了含有上述的核心启动元件的启动子。
15.进一步的，上述的启动子的核苷酸序列如seq id no.6、seq id no.7或seq id no.8所示。
16.其中，上述的启动子还插入了至少一个e2f结合位点。
17.其中，上述的e2f结合位点的核苷酸序列如seq id no.15所示。或者是在序列seq id no.15所示的核苷酸序列中有1个或几个碱基插入、缺失和/或替换突变，且仍然具有e2f结合位点功能的核酸分子。
18.优选的，上述的1个或几个碱基插入、缺失和/或替换突变为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基发生插入、缺失和/或替换突变。
19.进一步的，上述的启动子中的e2f结合位点插入在上述核心启动元件的5’端和/或3’端。
20.进一步的，上述的启动子的核苷酸序列如seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11、seq id no.12、seq id no.13或seq id no.14所示。
21.本发明也提供了上述的核心启动元件或者上述启动子在制备病毒或质粒中的应用。进一步的，所述的病毒为腺病毒。更进一步的，所述的腺病毒为溶瘤腺病毒。
22.本发明也提供了含有上述核心启动元件或者上述启动子的重组载体。
23.其中，上述的重组载体是质粒载体或病毒载体。
24.其中，上述的的病毒载体是腺病毒载体、腺病毒相关病毒或逆转录病毒载体。
25.其中，上述的病毒载体是溶瘤病毒。
26.进一步的，上述溶瘤病毒是溶瘤腺病毒、溶瘤细小病毒、溶瘤疱疹病毒、溶瘤痘病毒、溶瘤水泡性口炎病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤粘液瘤病毒、溶瘤逆转录病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤痘苗病毒中的至少一种。
27.其中，上述的质粒载体为pdc316、pdc311、pdc312、pdc315、pdc511、pdc512、pdc515、pdc516、pshuttle、pshuttle-cmv、pctap-shuttle系列质粒、pntap-shuttle系列质粒、padtrack、padtrack-cmv、pacad5系列质粒、phbad系列质粒或者pxc1质粒中的至少一种。
28.其中，上述重组载体中所述的溶瘤腺病毒是血清型属于a亚属、b亚属、c亚属、d亚属、e亚属、f亚属或、g亚属的腺病毒。
29.其中，上述重组载体中所述的溶瘤腺病毒可选自血清型中分属a亚属的12、18、31和61型，分属b亚属的3、7、11、14、16、21、34、35、55、66、68、76～79型，分属c亚属的1、2、5、6、57和89型；分属d亚属的8、9、13、15、17、19、20、22～30、32、33、36～39、46、48、49、53、54、56、58～60、62～65、67、69～75、80～88、90～103型；分属e亚属的4型，分属f亚属的40和41型；分属g亚属52型等腺病毒。
30.其中，上述的重组载体中所述的溶瘤腺病毒中是由上述的核心启动元件或者上述启动子驱动e1a和/或e1b-19k基因的表达。
31.其中，上述重组溶瘤腺病毒中所述的e1a为缺失了中间的24bp的e1a(delta24)，核苷酸序列为seq id no.16所示。其中，所述的e1b 19k的核苷酸序列为seq id no.17所示。
32.本发明同时也提供了含有上述重组载体的宿主细胞。进一步的，上述的宿主细胞为真核细胞。
33.在此基础上本发明提供了一种抗肿瘤药物。该抗肿瘤药物是由上述的重组载体添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。
34.同时，本发明也提供了制备上述重组载体的方法。该方法包括以下步骤：
35.a)、将上述的核心启动元件或者上述启动子可操作地连接腺病毒增殖所须的基因，构建入穿梭质粒中；
36.b)、将步骤a)构建得到的穿梭质粒和腺病毒骨架质粒转入包装细胞，包装得到溶瘤腺病毒。
37.其中，上述方法中所述的腺病毒增殖所须的基因为e1a和/或e1b-19k基因。
38.其中，上述方法中所述的穿梭质粒为pdc316。
39.其中，上述方法中所述的腺病毒骨架质粒pbhgloxdele13cre、pbhgfrtdele13flp、padeasy-1、padeasy-2、pbhge3i或pbhge10i中的至少一种；
40.其中，上述方法中所述的包装细胞为hek293细胞。
41.其中，上述的穿梭载体与腺病毒骨架质粒利用lipofectamine 3000转入hek293细胞，进行溶瘤腺病毒包装。
42.本发明的有益效果为：本发明创造性地得到了修饰的肿瘤特异性核心启动元件和肿瘤特异性启动子，具有更好的肿瘤特异性启动子功能。并以此启动子构建了溶瘤腺病毒，其具有能够在肿瘤细胞中特异增殖，而不在正常细胞中增殖的特异靶向性优点，是一种优秀的针对多种肿瘤的免疫治疗药物。经实验证明，本发明的肿瘤特异性核心启动元件和肿瘤特异性启动子仅在肿瘤细胞中有活性，在正常细胞中无活性，具有安全性和特异性。本发明溶瘤腺病毒在体外能够更有效杀伤多种肿瘤细胞，而对正常细胞无杀伤。更为重要的是，在体内实验中，本发明溶瘤腺病毒能够有效抑制肿瘤生长，为本领域免疫治疗药物的开发和应用提供了新的选择。
附图说明
43.图1 rt-pcr检测不同人源细胞中人端粒酶逆转录酶的mrna表达。
44.图2不同人源肿瘤细胞htert启动子突变检测。
45.图3 htert wt启动子示意图。
46.图4双荧光素法检测htert点突变启动子活性。*为p《0.05；**为p《0.01。
47.图5双荧光素法检测htert点突变核心启动元件活性。*为p《0.05；**为p《0.01；***为p《0.001。
48.图6双荧光素法检测e2f结合位点修饰后的htert点突变启动子活性。*为p《0.05；**为p《0.01；***为p《0.001。
49.图7 rt-pcr检测溶瘤腺病毒oad-null感染细胞后的e1a mrna表达。
50.图8 western blot检测溶瘤腺病毒oad-null感染细胞后的e1a蛋白表达。
51.图9 cck8法检测溶瘤腺病毒oad-null的体外杀伤肿瘤细胞活性。*为p《0.05；**为p《0.01；***为p《0.001。
52.图10不同肿瘤模型中oad-null溶瘤腺病毒的肿瘤杀伤活性。a.oad-null溶瘤腺病毒治疗a375肿瘤后的肿瘤体积和肿瘤大小，符号
×
表示肿瘤消退；b.oad-null溶瘤腺病毒治疗u87mg肿瘤后的肿瘤体积和肿瘤大小；c.oad-null溶瘤腺病毒治疗skov3肿瘤后的肿瘤体积和肿瘤大小。*为p《0.05；**为p《0.05。
具体实施方式
53.溶瘤病毒尤其是溶瘤腺病毒的肿瘤治疗目前还面临一些挑战，其中之一就是溶瘤腺病毒肿瘤特异性增殖能力有限。
54.本发明为增强溶瘤病毒的瘤内增殖能力，特别是肿瘤特异性增殖能力，进行了大量的创造性工作。本发明惊喜的发现，对htert启动子进行特定的改造，可以得到高效率的肿瘤特异性启动子。当然，此启动子也可以应用于除制备溶瘤腺病毒之外的其他领域，比如用于制备顺转表达质粒，用于制备其他溶瘤病毒，如溶瘤细小病毒、溶瘤疱疹病毒、溶瘤痘病毒、溶瘤水泡性口炎病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤粘液瘤病毒、溶瘤逆转录病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤痘苗病毒等。
55.有前期的工作对多种肿瘤细胞的htert启动子区域进行测序，发现了启动子两处突变，c突变为t，导致htert基因高表达。我们预计这两处突变可能会与htert启动子的特异性启动能力强弱有关，有可能可以用于溶瘤腺病毒的启动子上提高其治疗效果。将野生型htert启动子(htert wt，seq id no.2)、c69t突变启动子(seq id no.6)、c47t突变启动子(seq id no.7)和dt双突变启动子(seq id no.8)片段连接于质粒中，转染多种细胞。实验结果表明，在正常细胞中上述启动子控制的报告基因基本不表达，而在多种肿瘤细胞中有强表达，且突变的启动子表达能力强于野生型，dt双突变启动子的肿瘤特异性表达能力最强。
56.进一步的，本发明使用了截短的181bp核心启动子区段(seq id no.1)，对其进行了对应于野生型的c69t突变和/或c47t突变。首先，发现该区段具有启动子功能，能启动荧光素酶在多种肿瘤细胞中表达。而c69t突变(seq id no.3)、c47t突变(seq id no.4)以及dt双突变(seq id no.5)的181bp核心启动子区段，其启动子活性有显著的提高，尤其是dt双突变的181bp核心启动子区段，启动子活性最强。即截短的181bp核心启动子区段为一核心启动元件。该核心启动元件既有独立的启动基因表达的功能，作为启动子使用；也可以作为元件构建其他的启动子。
57.随后，为了更进一步的提高上述的启动子的肿瘤特异性表达能力，我们使用了在上述的启动子上插入e2f-1启动子上的e2f结合位点的方式进行进一步的改造。结果表明，插入e2f-1启动子上的e2f结合位点能有效增强上述启动子的肿瘤特异性表达能力。本领域技术人员可以插入一个或者多个(所述多个可以为2、3、4、5、6个或更多)，并且选择合适的插入位点。在本发明的一个实例中，是在启动子的htert 181bp核心片段的上游和/或下游插入e2f结合位点的。构建了在启动子-181bp和-182bp之间插入一个e2f结合位点，在启动子 4bp和 5bp之间插入一个e2f结合位点，以及同时在上述两个位置各插入一个e2f结合位
点的改造后的启动子，均能提升其肿瘤特异性表达能力。
58.可见，上述的核心启动元件和启动子特别适用于制备需要在肿瘤细胞中实现特异性表达的重组载体。比如质粒载体或病毒载体。
59.在此基础上，本发明还提供了一种有上述的核心启动元件和启动子参与的溶瘤病毒制备及肿瘤治疗方案。可以将上述的启动子用于构建各种溶瘤病毒，在这些溶瘤病毒中启动主要用于复制或增殖的基因的表达，从而可以制备新的溶瘤病毒。比如溶瘤腺病毒、溶瘤细小病毒、溶瘤疱疹病毒、溶瘤痘病毒、溶瘤水泡性口炎病毒、溶瘤麻疹病毒、溶瘤粘液瘤病毒、溶瘤逆转录病毒、溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤痘苗病毒等。
60.当然，本发明提供的启动子适合参与新的溶瘤腺病毒的构建。如不同血清型的腺病毒中，替换原有的内源性启动子，启动e1等增殖必需基因的表达，进而控制腺病毒在肿瘤细胞中的复制增殖，得到肿瘤特异性增殖能力提高的溶瘤型腺病毒。可以用于各种血清型的溶瘤腺病毒的制备，如血清型中分属a亚属的12、18、31和61型，分属b亚属的3、7、11、14、16、21、34、35、55、66、68、76～79型，分属c亚属的1、2、5、6、57和89型；分属d亚属的8、9、13、15、17、19、20、22～30、32、33、36～39、46、48、49、53、54、56、58～60、62～65、67、69～75、80～88、90～103型；分属e亚属的4型，分属f亚属的40和41型；分属g亚属52型。
61.本领域技术人员知晓，溶瘤病毒尤其是溶瘤腺病毒的制备需要用到一些常用的载体。一般是使用穿梭载体和骨架载体。穿梭载体可选自pdc316、pdc311，pdc312，pdc315，pdc511，pdc512，pdc515，pdc516，pshuttle，pshuttle-cmv，pctap-shuttle系列载体，pntap-shuttle系列载体，padtrack，padtrack-cmv，pacad5系列载体，phbad系列载体，pxc1等。骨架载体可选自pbhgloxdele13cre，pbhgfrtdele13flp，padeasy-1，padeasy-2，pbhge3i，pbhge10i等。将构建好的穿梭载体和骨架载体共同转染入细胞中，即可实现病毒的包装和进一步的增殖。
62.在本发明的一个实例中，使用了质粒pdc316作为穿梭质粒，将改造后的htert启动子与腺病毒增殖所必需的e1a/e1b-19k片段连入该质粒。还使用了pbhglox(delta)e1,3cre作为骨架质粒。将构建好的穿梭载体和骨架载体共同转染入hek293细胞中，包装得到溶瘤腺病毒。得到的溶瘤腺病毒的特异性地高效表达e1a基因，同时在体外、体内的抗肿瘤试验中表现出更好的抗肿瘤效果。
63.本发明启动子，具有肿瘤特异性，能用于构建溶瘤腺病毒、肿瘤靶向质粒等各种以肿瘤为目标的药物。构建得到的溶瘤腺病毒具有能够在肿瘤细胞中特异增殖，而不在正常细胞中增殖，能有效杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤增长，具有有效性、安全性和特异性。
[0064]“基因”或“编码序列”是指“编码”特定蛋白质的dna或rna的核苷酸序列或区域。当置于合适的调控区域如启动子的控制下时，编码dna序列被转录为rna并被翻译成多肽。基因也可以包含几个可操作地连接的片段，例如启动子、5
′
前导序列、内含子、编码序列和3
′
非翻译序列，也可包含聚腺苷酸化位点或信号序列。嵌合或重组基因是通常在自然界中找不到的基因，例如这样的基因，该基因中如启动子在自然界中与所转录的dna区域的部分或全部是不相关的。“基因的表达”是指将基因转录成rna和/或翻译成活性蛋白的过程。
[0065]
以下结合实施例对本发明方法进行进一步说明。
[0066]
实施例中使用的主要试剂为：
[0067]
anti-e1a抗体购自santa cruz biotechnology公司。
[0068]
balb/c nude小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
[0069]
rt-pcr所用逆转录试剂盒和sybr染料检测试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
[0070]
cck8检测试剂购自mce公司。
[0071]
双荧光素酶检测试剂盒购自promega corporation公司。
[0072]
其他试剂均为进口或国产分析纯产品。
[0073]
实施例一不同人源细胞中人端粒酶逆转录酶的mrna表达检测
[0074]
本实施例所用细胞为人源正常细胞人胚肺成纤维细胞mrc-5(atcc：ccl-171)和人原代皮肤成纤维细胞pcs-201-010(atcc：pcs-201-010
tm
)，人源肿瘤细胞：恶性胶质母细胞瘤细胞u87mg(atcc：htb-14)、恶性黑色素瘤a375(atcc：crl-1619)、肺癌细胞a549(atcc：crm-ccl-185)、乳腺癌细胞mcf-7(atcc：htb-22)、宫颈癌细胞hela(atcc：crm-ccl-2)和卵巢癌细胞skov3(atcc：htb-77)。收取细胞，提取细胞总rna并逆转录为cdna，通过rt-pcr检测人端粒酶逆转录酶的表达，gapdh作为内参。
[0075]
结果所示(图1)，在正常细胞mrc-5和pcs-201-010中，人端粒酶逆转录酶几乎不表达，而在6种不同肿瘤来源的肿瘤细胞中，人端粒酶逆转录酶都高表达。
[0076]
实施例二不同人源肿瘤细胞htert启动子突变检测
[0077]
收集肿瘤细胞u87mg、a375、a549、mcf-7、hela和skov3，提取细胞基因组，对htert启动子核酸序列进行测序。
[0078]
实验结果显示(图2)：在u87mg细胞中，htert启动子存在部分c69t和c47t双突变；在a375细胞中，存在c69t突变；而其他细胞中，htert启动子无突变。因而考虑是否可将这些突变应用到溶瘤腺病毒的启动子优化和溶瘤效果的改进上。
[0079]
实施例三htert启动子初步优化
[0080]
一、htert启动子点突变构建
[0081]
本实施例采用htert启动子的-378～ 77区域序列(来自人5号染色体tert 5'调节区域，序列id:ng_055467.1)，共455bp，标记为htert wt(图3中标为l-wt)序列(seq id no.2)(参见图3)。通过研究其序列，选取了其中的-181～ 77的含181bp区段为其有强启动子活性的核心区域，标记为181-wt序列(seq id no.1)(见图3)。图3中 1表示mrna序列第1个核苷酸，-1表示第1个到转录起始位点的5’核苷酸。c69t(-69位核苷酸c)和c47t(-47位核苷酸c)均表示htert启动子序列具有单一胞嘧啶c突变为胸腺嘧啶t。dt表明序列具有上述-47和-69位c
→
t的双突变。各相关核酸序列见表1：
[0082]
表1.各种htert启动子核酸序列
[0083]
[0084][0085]
[0086]
pgl3-basic质粒(此质粒购自microbix biosystems inc)可用于启动子活性检测，即多克隆位点区位于萤火虫荧光素酶基因上游。将pgl3-basic质粒用限制性内切酶xhoi和hindiii酶切后，再将上述的htert wt、181-wt、181-c69t、181-c47t、181-dt、l-c69t、l-c47t和l-dt片段分别与酶切后的pgl3-basic连接，构建为pgl3-l-wt、pgl3-181-wt、pgl3-181-c69t、pgl3-181-c47t、pgl3-181-dt、pgl3-l-c69t、pgl3-l-c47t和pgl3-l-dt，测序正确。
[0087]
二、htert点突变启动子活性检测
[0088]
pgl3-basic质粒携带萤火虫荧光素酶基因，可用于检测启动子活性强弱。96孔板分别铺入u87mg每孔1.5
×
104个细胞，a375每孔1.5
×
104个细胞，mrc-5、pcs-201-010、a549、mcf-7、hela和skov3每孔各1
×
104个细胞，37℃过夜培养。
[0089]
分组：(1)control
[0090]
(2)pgl3-basic(100ng) prl-tk(内参质粒10ng)
[0091]
(3)pgl3-l-wt(100ng) prl-tk(内参质粒10ng)
[0092]
(4)pgl3-l-c69t(100ng) prl-tk(内参质粒10ng)
[0093]
(5)pgl3-l-c47t(100ng) prl-tk(内参质粒10ng)
[0094]
(6)pgl3-l-dt(100ng) prl-tk(内参质粒10ng)
[0095]
将上述分组中质粒利用lipofectamine 3000转染各细胞24h后检测双荧光。注：prl-tk为hsv tk启动子启动海肾萤光素酶的表达，pcmv-tk为cmv启动子启动海肾萤光素酶的表达。mrc-5和pcs-201-010所用内参质粒为pcmv-tk。
[0096]
结果显示(如图4)，在正常细胞mrc-5和pcs-201-010细胞中，几乎未检测到萤火虫荧光素酶。而在肿瘤细胞中，与l-wt序列相比，l-dt双突变的启动子活性显著增高，表明htert wt启动子(-378～ 77)双突变后活性明显增强。
[0097]
三、htert点突变核心启动元件启动子活性检测
[0098]
进一步的检测截断的181bp核心启动元件核心区域的启动子活性，96孔板分别铺入u87mg每孔1.5
×
104个细胞，a375每孔1.5
×
104个细胞，mrc-5、pcs-201-010、a549、mcf-7、hela和skov3每孔各1
×
104个细胞，37℃过夜培养。
[0099]
分组：(1)control
[0100]
(2)pgl3-basic(100ng) prl-cmv(内参质粒5ng)
[0101]
(3)pgl3-l-wt(100ng) prl-cmv(内参质粒5ng)
[0102]
(4)pgl3-181-wt(100ng) prl-cmv(内参质粒5ng)
[0103]
(5)pgl3-181-c69t(100ng) prl-cmv(内参质粒5ng)
[0104]
(6)pgl3-181-c47t(100ng) prl-cmv(内参质粒5ng)
[0105]
(7)pgl3-181-dt(100ng) prl-cmv(内参质粒5ng)
[0106]
将上述分组中质粒利用lipofectamine 3000转染各细胞24h后检测双荧光。注：pcmv-tk为cmv启动子启动海肾萤光素酶的表达。
[0107]
结果显示(如图5)，在正常细胞mrc-5和pcs-201-010细胞中，几乎未检测到萤火虫荧光素酶。而在肿瘤细胞中，与181-wt序列相比，181-dt双突变的启动子活性显著增高，表明181bp核心启动元件双突变后启动子活性明显增强。
[0108]
四、htert双突变启动子进一步优化
[0109]
e2f-1启动子在本领域也被报道过用于溶瘤腺病毒治疗，在rb缺陷细胞中能够选择性增殖。e2f-1启动子上的e2f结合位点是参与e2f-rb复合物结合的关键位点，e2f结合位点的核酸序列为tcggcggctcgtggctctttcgcggcaaaaaggatttggcgcg taaaagtgg(seq id no.15)。本发明考虑将其与htert启动子配合可能进一步增强其活性，本发明在l-wt和l-dt基础上将e2f结合位点插入-181bp至-182bp之间形成e2f up，插入 4bp至 5bp之间形成e2f down，两个位点间均插入形成e2f up down(参见表1和图3)。将pgl3-basic质粒用限制性内切酶xhoi和hindiii酶切后，再将图3所示l-wt-e2f up、l-wt-e2f down、l-wt-e2f up down、l-dt-e2f up、l-dt-e2f down和l-dt-e2f up down片段与酶切后的pgl3-basic连接，构建为pgl3-l-wt-e2f up、pgl3-l-wt-e2f down、pgl3-l-wt-e2f up down、pgl3-l-dt-e2f up、pgl3-l-dt-e2f down和pgl3-l-dt-e2f up down，测序正确。
[0110]
96孔板分别铺入u87mg每孔1.5
×
104个细胞，a375每孔1.5
×
104个细胞，mrc-5、pcs-201-010、a549、mcf-7、hela和skov3每孔各1
×
104个细胞，37℃过夜培养。
[0111]
分组：
[0112]
(1)control
[0113]
(2)pgl3-basic(100ng) prl-tk(内参质粒10ng)
[0114]
(3)pgl3-l-wt(100ng) prl-tk(内参质粒10ng)
[0115]
(4)pgl3-l-wt-e2f down(100ng) prl-tk(内参质粒10ng)
[0116]
(5)pgl3-l-wt-e2f up(100ng) prl-tk(内参质粒10ng)
[0117]
(6)pgl3-l-wt-e2f up down(100ng) prl-tk(内参质粒10ng)
[0118]
(7)pgl3-l-dt(100ng) prl-tk(内参质粒10ng)
[0119]
(8)pgl3-l-dt-e2f down(100ng) prl-tk(内参质粒10ng)
[0120]
(9)pgl3-l-dt-e2f up(100ng) prl-tk(内参质粒10ng)
[0121]
(10)pgl3-l-dt-e2f up down(100ng) prl-tk(内参质粒10ng)
[0122]
将上述分组中质粒利用lipofectamine 3000转染各细胞24h后检测双荧光。mrc-5和pcs-201-010所用内参质粒为pcmv-tk 50ng，其余肿瘤细胞所用内参质粒为prl-tk 10ng。
[0123]
结果显示(如图6)，在正常细胞mrc-5和pcs-201-010细胞中，几乎未检测到萤火虫荧光素酶，但能够检测到海肾萤光素酶。而在肿瘤细胞中，与pgl3-l-dt序列相比，pgl3-l-dt e2f down的启动子活性显著增高，pgl3-l-dt-e2f down和pgl3-l-dt-e2f up down无显著性差别，因而后续实验中选用l-dt-e2f down序列作为最优启动子序列，标记为mhtret，共504bp(seq id no.12)。
[0124]
实施例四溶瘤腺病毒oad-htert(htert做启动子)和oad-null(mhtert做启动子)的包装和功能验证
[0125]
将pdc316质粒用限制性内切酶xbai和hindiii酶切后，再将htert wt和mhtert(实施例三中最优启动子l-dt-e2f down(seq id no.12))，分别与腺病毒增殖所必需的e1a/e1b-19k(核苷酸序列为seq id no.18所示)连入酶切后的pdc316质粒，构建为pdc316-htert和pdc316-mhtert，htert与e1a之间加入一个ecori酶切位点以方便验证。
[0126]
利用将lipofectamine 3000将pdc316-htert与腺病毒骨架质粒pbhglox(delta)e1,3cre转入hek293细胞，进行溶瘤腺病毒包装，标记为溶瘤腺病毒oad-htert；同样利用将
lipofectamine 3000将pdc316-mhtert与腺病毒骨架质粒pbhglox(delta)e1,3cre转入hek293细胞，进行溶瘤腺病毒包装，标记为溶瘤腺病毒oad-null。
[0127]
将6孔板分别铺入mrc-5、pcs-201-010、u87mg、a375、a549和skov3每孔各3
×
105个细胞，37℃过夜培养。次日，a549细胞按照moi(pfu)＝64，其余细胞按照moi(pfu)＝32，分别感染ad-gfp(表达gfp蛋白的腺病毒)、h101、oad-htert和oad-null。感染24h后，收集细胞沉淀，分别用rt-pcr和western blot方法检测e1a的mrna表达水平和蛋白表达水平。h101为阳性对照溶瘤腺病毒(购自上海三维生物技术有限公司)。
[0128]
结果所示(图7rt-pcr检测和图8western blot检测)，在正常细胞mrc-5和pcs-201-010细胞中，几乎检测不到e1a的mrna和蛋白表达。而在肿瘤细胞中，能够检测到e1a的mrna和蛋白表达，并且与h101和oad-htert相比，oad-null感染后e1a显著上调，表明oad-null在肿瘤细胞中高效增殖，且并不影响正常细胞。
[0129]
实施例五溶瘤腺病毒oav-htert和oad-null的肿瘤体外杀伤活性检测
[0130]
将96孔板分别铺入mrc-5、pcs-201-010、u87mg、a375、a549和skov3每孔各3
×
103个细胞，37℃过夜培养。次日，mrc-5、pcs-201-010、u87mg、a375和a549按照moi(pfu)＝128、256、512、1024，skov3细胞按照moi(pfu)＝31.25、62.5、250、1000，分别感染oad-gfp(htert wt启动子后为gfp蛋白)、h101、实施例四制备的oad-htert和oad-null。感染3-6天后，cck8法检测细胞的存活情况。
[0131]
结果显示(图9)，在正常细胞mrc-5和pcs-201-010细胞中，细胞存活较好，并且各组之间生存率无统计学差异。而在肿瘤细胞中，与oad-gfp相比，h101和oad-htert能够有效杀伤肿瘤细胞，而oad-null杀伤肿瘤细胞活性最强，具有统计学差异。
[0132]
实施例六溶瘤腺病毒oad-null的体内肿瘤杀伤活性检测
[0133]
(1)a375肿瘤模型：4周大小的balb/c nude小鼠皮下接种1
×
107个a375细胞，待肿瘤体积长至约50-100mm3时，给药，分组如下：
[0134]
①
vehicle:50μl无菌pbs；
[0135]
②
h101：每只1
×
107pfu，体积50μl；
[0136]
③
oad-null:每只1
×
107pfu，体积50μl；
[0137]
给药方式：隔天给药一次，共5次，瘤内给药。定期量取小鼠肿瘤大小。
[0138]
(2)u87mg肿瘤模型：4周大小的balb/c nude小鼠皮下接种2
×
106个u87mg细胞，待肿瘤体积长至约50-100mm3时，给药，分组如下：
[0139]
①
vehicle:50μl无菌pbs；
[0140]
②
oad-null:每只1
×
107pfu，体积50μl；
[0141]
给药方式：每周一次，共2次，瘤内给药。定期量取小鼠肿瘤大小。
[0142]
(3)skov3肿瘤模型：4周大小的balb/c nude小鼠皮下接种5
×
106个skov3细胞，待肿瘤体积长至约50-100mm3时，给药，分组如下：
[0143]
①
vehicle:50μl无菌pbs；
[0144]
②
oad-null:每只1
×
107pfu，体积50μl；
[0145]
给药方式：每周一次，共2次，瘤内给药。定期量取小鼠肿瘤大小。
[0146]
从结果看(图10a)，在a375肿瘤模型中，vehicle组肿瘤生长较快，与vehicle相比，h101在一定程度上抑制肿瘤生长，抑瘤率为33％。而oad-null溶瘤腺病毒能够有效抑制肿
瘤生长，肿瘤抑制率达到77％，并且有2只小鼠出现肿瘤消退(符号x表示肿瘤消退)。在u87mg模型中(图10b)，vehicle组肿瘤生长也相对较快，与vehicle相比，oad-null溶瘤腺病毒能够有效抑制肿瘤生长，肿瘤抑制率达到79％。在skov3模型中(图10c)，vehicle组肿瘤生长也相对较快，与vehicle相比，oad-null溶瘤腺病毒能够有效抑制肿瘤生长，肿瘤抑制率达到75％。
[0147]
本发明使用到的其他核苷酸序列：
[0148]
seq id no.16(e1a(delta24)的核苷酸序列)：
[0149]
atgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgatcgatccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccccgggcacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtaagtgaaaattatgggcagtgggtgatagagtggtgggtttggtgtggtaattttttttttaatttttacagttttgtggtttaaagaattttgtattgtgatttttttaaaaggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagagaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataaggtgtaaacctgtgattgcgtgtgtggttaacgcctttgtttgctgaatgagttgatgtaagtttaataaagggtgagataatgttt
[0150]
seq id no.17(e1b 19k的核苷酸序列)
[0151]
tatataatgcgccgtgggctaatcttggttacatctgacctcatggaggcttgggagtgtttggaagatttttctgctgtgcgtaacttgctggaacagagctctaacagtacctcttggttttggaggtttctgtggggctcatcccaggcaaagttagtctgcagaattaaggaggattacaagtgggaatttgaagagcttttgaaatcctgtggtgagctgtttgattctttgaatctgggtcaccaggcgcttttccaagagaaggtcatcaagactttggatttttccacaccggggcgcgctgcggctgctgttgcttttttgagttttataaaggataaatggagtgaagaaacccatctgagcggggggtacctgctggattttctggccatgcatctgtggagagcggttgtgagacacaagaatcgcctgctactgttgtcttccgtccgcccggcgataataccgacggaggagcagcagcagcagcaggaggaagccaggcggcggcggcaggagcagagcccatggaacccgagagccggcctggaccctcgggaatga
[0152]
seq id no.18(e1adelta24-e1b 19k的核苷酸序列)：
[0153]
atgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctgataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgaggaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttctccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggaggtgatcgatccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtggagcaccccgggcacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatgaggacctgtggcatgtttgtctacagtaagtgaaaattatgggcagtgggtgatagagtggtgggtttggtgtggtaattttttttttaatttttacagttttg
tggtttaaagaattttgtattgtgatttttttaaaaggtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgccgtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagagaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccggtccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccaggctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataaggtgtaaacctgtgattgcgtgtgtggttaacgcctttgtttgctgaatgagttgatgtaagtttaataaagggtgagataatgtttaacttgcatggcgtgttaaatggggcggggcttaaagggtatataatgcgccgtgggctaatcttggttacatctgacctcatggaggcttgggagtgtttggaagatttttctgctgtgcgtaacttgctggaacagagctctaacagtacctcttggttttggaggtttctgtggggctcatcccaggcaaagttagtctgcagaattaaggaggattacaagtgggaatttgaagagcttttgaaatcctgtggtgagctgtttgattctttgaatctgggtcaccaggcgcttttccaagagaaggtcatcaagactttggatttttccacaccggggcgcgctgcggctgctgttgcttttttgagttttataaaggataaatggagtgaagaaacccatctgagcggggggtacctgctggattttctggccatgcatctgtggagagcggttgtgagacacaagaatcgcctgctactgttgtcttccgtccgcccggcgataataccgacggaggagcagcagcagcagcaggaggaagccaggcggcggcggcaggagcagagcccatggaacccgagagccggcctggaccctcgggaatga