一种用于器官移植前后多重病毒快速筛查和定量检测的引物、探针和试剂盒的制作方法

1.本发明属于体外核酸检测领域，本发明提供了一种用于器官移植前后多重病毒快速筛查和定量检测的实时荧光定量real time-pcr(rt-pcr或qpcr)引物、探针和试剂盒及检测方法，可用于降低器官移植后潜伏病毒内源性感染的风险。


背景技术：

2.器官移植正在成为很多疾病的治疗方法。由于免疫抑制剂的使用，感染问题已经是决定手术成败和移植后存活的关键原因。
3.任何潜伏性病毒感染的再激活(复制)风险都与移植后免疫抑制使用的性质和强度相关。因此移植前对供者器官和受体状况携带的潜伏性评估筛查，和及时用药治疗，对于降低移植后内源性病毒感染的风险十分重要。常见的潜伏病毒感染如人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，hcmv)，属疱疹病毒β科，在人群中血清抗体阳性率超过90％，在免疫正常的人群中cmv呈潜伏感染无症状，但在免疫抑制的人群中会被激活而引起各种疾病如肺炎，肝炎等全身性疾病。hcmv 感染细胞主要为t细胞和多型核细胞，因此病毒还可以随着移植器官而传给受者进而引起疾病。ebv(epstein-barr virus，人疱疹病毒)是一种线性双链dna 病毒，属疱疹病毒γ科。人群中90％以上感染过ebv，多为隐性感染，移植后患者免疫功能缺陷，ebv再激活或发生ebv相关的淋巴增殖性疾病(ebv-ptld)的致死率高达84.6％。人类单纯疱疹病毒(human herpes virus)6(hhv6)和人类单纯疱疹病毒8(hhv8)和其他疱疹病毒一样可以引起发热等症状，原发感染后潜伏在淋巴细胞；通常hhv6和其他病毒感染同时出现，因此推断hhv6可能是促进其他病毒的感染。hhv8是疱疹病毒γ科，与卡波西肉瘤发生密切相关。人多瘤病毒bk，jc病毒(bk or jc virus，)为dna双链病毒，属多瘤病毒，二者 70％以上序列同源。60-80％的成人呈bk或jc病毒血清为阳性反应。bk，jc病毒可以大量存在于肾小管及尿路上皮细胞中，肾脏移植后bk病毒激活引起相关肾病，而jc病毒激活后主要引起进行性多灶性白质脑病。因此，器官移植前后多重潜伏病毒病原体的及时检测、早期诊断对提高患者生存率至关重要。
4.实时荧光定量qpcr技术，通过设置特异性探针和荧光信号的动态监测,可以在单管内封闭完成pcr产物的扩增及分析的全过程，还可以对多个pcr扩增产物同时进行实时定量动态监测及自动分析结果，具有实时准确、快速简便、高通量和高灵敏度等特点，是一种先进的分子检测技术，克服了传统聚合酶链式反应 (pcr)检出效率低和不能定量等缺点。


技术实现要素：

5.本发明用roche magnapure核酸提取试剂，或者其他公司生产(如qiagen 核酸提取试剂)或个人常用的核酸提取纯化试剂盒提取多种不同样品(外周血浆，全血，尿液或者脑脊液，呼吸道咽拭子，肺泡灌洗液及新鲜组织)中的总核酸，使用实时荧光聚合酶链反应(real time rt-pcr)同时定性、定量和高通量检测样本中hcmv、ebv、hhv6、hhv8、bkv和jcv
等多重潜伏病毒病原体。
6.本发明提供一种用于器官移植前后多重病毒快速筛查和定量检测的引物、探针。所述引物、探针包括六对，即通过对hcmv、ebv、hhv6、hhv8、bkv、jcv的核酸序列进行比对分析，根据引物探针设计的基本原则，分别选择无二级结构且高度保守的区段，利用引物分析软件和人工设计，并经多次实验优化后确定适合实时荧光定量qpcr的多对引物和探针。
7.在本发明的一种实施方式中，本发明所述hcmv正向、反向引物和荧光探针序列分别是：
8.正向引物5'-gctttacggtgttgtgtc-3'
9.反向引物5'-tgcataaagagcttgcc-3'
10.寡核苷酸探针：5'-fam-atgaagggttgcgg-mgb nfq-3'
11.所述ebv正向、反向引物和荧光探针序列分别是：
12.正向引物：5'-aatcttcttcatagcctgagacg-3'
13.反向引物：5'-aactacccgcaatgaaatggaa-3'
14.寡核苷酸探针：5'-fam-aaggttcggaaatctgt-bhq-3'
15.所述hhv6正向、反向引物和荧光探针序列分别是：
16.正向引物：5'-tcgatcatcctcaacctagc-3'
17.反向引物：5'-cgctcctggataatttggctttg-3'
18.寡核苷酸探针：5'-fam-attccttcgggtgtgacgtctggtg-bhq-3'
19.所述hhv8正向、反向引物和荧光探针序列分别是：
20.正向引物：5'-tggggcacgctattctg-3'
21.反向引物：5'-gaacacgatgtcaaatccgttg-3'
22.寡核苷酸探针：5'-fam-ggcacgaccatgg-mgb nfq-3'
23.所述bkv正向、反向引物和荧光探针序列分别是：
24.正向引物：5'-tgttgagtgttgagaatctgctgtt-3'
25.反向引物：5'-tgatctacaccagtttcttagtcaagct-3'
26.寡核苷酸探针：bk/jc probe
27.所述jcv正向、反向引物和荧光探针序列分别是：
28.正向引物：5'-agagtgttgggatcctgtgttttc-3'
29.反向引物：5'-gcattcctcagtcaagctgtgt-3'
30.寡核苷酸探针：bk/jc probe
31.上述六对荧光探针3'端标记有荧光淬灭基团，5'端分别标记有荧光报告基团。
32.在本发明的一种实施方式中，所述bk/jc probe为：
33.5'-fam-aaaggtagaagaccctaaag-mgb nfq-3'。
34.在本发明的一种实施方式中，所述荧光报告基团为fam；所述荧光淬灭基团为bhq。
35.本发明第二目的提供一种用于器官移植前后多重病毒快速筛查和定量检测的试剂盒，其特征在于，试剂盒包括括hcmv、ebv、hhv6、hhv8、bkv、jcv反应混合液、dna人工内标(bioline bio-35029)、阳性质控品、阴性质控品；其中所述rt-pcr反应液含有内标探针和上述的荧光rt-pcr引物和荧光探针。
36.在本发明的一种实施方式中，hcmv反应混合液由与hcmv靶多核苷酸的结合的正向
引物，反向引物，和能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光报告基团(fam)和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针组成，另外还有实时定量pcr反应需要的pcr混合液及人工内标扩增反应(特异探针报告基团为cy5)混合液； ebv、hhv6、hhv8、bkv、jcv反应混合液分别由与ebv、hhv6和hhv8、bkv、jcv 靶多核苷酸的结合的正向引物，反向引物，和能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光报告基团(均为fam)和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针组成，另外还有pcr反应需要的混合液。
37.在本发明的一种实施方式中，其中阴性质控品为去离子水，阳性质控品为含有病毒特异序列的合成dna或各病毒株的dna提取物。
38.本发明还提供一种用于器官移植前后多重病毒快速筛查和定量检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
39.1)dna提取：使用magna pure lc和罗氏magna核酸提取纯化试剂盒(rochecat n)，05323738001)，或者其他公司生产(如qiagen核酸提取试剂)或个人常用的核酸提取纯化试剂盒，在推荐的操作程序下，可提取高纯度的全核酸。dna 内部提取参照(iec：bioline bio-35029)提取前加入标本中作为质量监控。
40.2)实时定量-pcr反应：
41.按表1配方配置反应混合液：
42.表1.反应混合液配方
[0043][0044]
按表2以下方式安排96孔扩增板：
[0045]
表2. 96孔扩增板
[0046][0047][0048]
配制含有内标探针和权利要求1至4任一所述的荧光rt-pcr引物和荧光探针的反应体系，对rna模板进行扩增，反应条件：94℃ 10min,1个循环；然后94℃ 15s,55℃ 45s,45个循环；
[0049]
(3)结果分析
[0050]
反应结束后保存检测数据文件。根据pcr扩增结果所得到的曲线，分析实验结果。有效结果判断如下：
[0051]
a.无模板质控没有靶基因和内标扩增信号
[0052]
b.阴性质控没有靶基因扩增信号。
[0053]
c.阳性质控有靶基因扩增信号(465-510nm)。
[0054]
d.所有标本都有与阴性质控不超过2个ct(cycle of threshold)值的人工内标扩增信号(618-660nm)。超过2个ct,提示标本可能有在提取或者扩增环节有抑制因素影响，需要对原标本重复试验。
[0055]
本发明有益效果如下：
[0056]
1.本发明提供实时荧光pcr检测试剂盒，可以同时定性定量检测器官移植前后血浆，全血，尿液，脑脊液，呼吸道样本、组织等各种样品中的hcmv,ebv,hhv6, hhv8,bkv,jcv等多种病毒潜伏病毒感染。
[0057]
2.选择各病毒的无二级结构且高度保守的区段设计引物，扩增目标区域不产生干扰，避免pcr扩增过程中的非特异性扩增；选用独特探针序列，在提高扩增效率的同时，保证对各种潜伏病毒的有效检出；具有病毒检测范围广、检测效率高、灵敏度高以及准确度高等优势。
[0058]
3.为器官移植供体潜伏病毒感染快速筛查提供高灵敏、高通量、实时可靠、准确定量的早期诊断证据，有效减少漏检、假阴性或假阳性结果，改善因潜伏潜伏病原体激活后感染导致的器官功能丧失，提高患者的生存质量和术后生存率。
[0059]
4.适合各种厂家生产或个人常用的核酸提取纯化试剂盒提取高纯度的全核酸；可根据众多厂家多通道荧光pcr仪器的不同需求选择特殊的荧光报告基团和与之相对应的荧光淬灭基团进行不同方式的多种组合；可以选用其他常用或个人不同喜好的内参照，如rnasn p、gapdh、b2m、18srna、、tbp、β-actin、hprt 等。
[0060]
5.克服现有器官移植病原体感染检测技术如用影像学、血清学、免疫学和免疫组织化学、病毒分离培养以及传统pcr法等的检测范围受限、准确率低和检出效率低的缺陷。
附图说明
[0061]
为了更清楚地说明本技术实施例的技术方案，下面将对本技术实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定。
[0062]
图1为本技术实施例提供的显示灵敏度的检测结果的示意图；
[0063]
图2为本技术实施例提供的人工内标扩增曲线的示意图。
具体实施方式
[0064]
实施例1敏感性：
[0065]
病毒检测试剂盒灵敏度实验
[0066]
分别检测各种病毒的浓度为25000copies/ul、2500copies/ul、250 copies/ul、25copies,2.5copies/ul的5份阳性质控，检测结果表明，本试剂盒可以检测出病毒的最低浓度的灵敏度为25copies。
[0067]
实施例2特异性
[0068]
本发明针对设计特异性引物和探针，可分别检测出hcmv，ebv，hhv6，hhv8，及bkv和jcv，没有交叉反应，说明本试剂盒具有很好的特异性。
[0069][0070]
实施例3反应体系的建立与优化
[0071]
引物探针浓度的优化：经多次重复试验发现引物和探针浓度在15-45pmol和 5pmol反应最佳。
[0072]
反应温度的优化：根据酶的活性和靶多核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为：94 ℃ 10min,1个循环；最后94℃ 15s,55℃ 45s,45个循环。
[0073]
实施例4检测方法步骤
[0074]
标本:根据国内外相关文献报道表明可检测的标本包括：血浆(hcmv，bkv,ebv)，外周全血(ebv，hhv6，hhv8)，尿液(hcmv，bkv)，脑脊液(ebv,jcv), 呼吸道拭子样本(hcmv,)，新鲜组织样品(hcmv,ebv,hhv6,hhv8,bkv,jcv)等。标本可立即用于测试，也可以保存于-70℃待测，保存期为6个月。
[0075]
(l)dna提取：使用magna pure lc和罗氏magna核酸提取纯化试剂盒(rochecat no 05323738001)，或各种厂家生产或个人常用的核酸提取纯化试剂盒，在推荐的操作程序下，可提取高纯度的全核酸。dna内部提取参照(iec：biolinebio-35029)，或选用其他常用或个人不同喜好的内参照，如rnasn p、gapdh、b2m、 18srna、、tbp、β-actin、hprt等，提取前加入标本中作为质量监控。
[0076]
(2)实时定量-pcr反应：
[0077]
反应混合物组分：
[0078]
反应组成最终浓度数量2 x quanta反应混合物1x12.5ul正向引物15-45pmol0.5ul反向引物15-45pmol0.5ul探针5pmol0.5ul水 1ul提取总核酸 10ul总和 25ul
[0079]
(3)结果分析
[0080]
反应结束后保存检测数据文件。根据pcr扩增结果所得到的曲线，分析实验结果。
[0081]
有效结果判断：
[0082]
1无模板质控没有靶基因和内标扩增信号
[0083]
2阴性质控没有靶基因扩增信号。
[0084]
3阳性质控有靶基因扩增信号(465-510nm)。
[0085]
4所有标本都有与阴性质控不超过2个ct(cycle of threshold)值的人工内标扩增信号(618-660nm)。超过2个ct,提示标本可能有在提取或者扩增环节有抑制因素影响，需要对原标本重复试验。
[0086]
实施例5
[0087]
人工内标没有抑制的曲线。
[0088]
e1-5为标本人工内标扩增曲线，相差小于2个ct值。没有模板的对照(ntc) 没有人工内标扩增曲线同理适用于其他rnasn p、gapdh、b2m、18srna、、tbp、β-actin、hprt等管家基因的内参照。
[0089]
实施例6多重实时定量pcr(不同引物对和荧光基团/淬灭剂标记探针的多重组合)。
[0090]
多重反应的三个优点：更高的通量(每块反应板可分析更多样本)、更低的样本用量和试剂用量——取决于实验中的靶点数。例如，如果定量实验中只包括一个靶点分析，在同一反应中加入标准品分析，如内参，进行双重反应靶点分析将提高2倍的通量，同时每个样本减少一半的样本用量和试剂用量。但如果定量实验包括两个靶点分析，可将两个靶点反应与一个标准品反应组合成三重反应。在这种情况下，样本用量和试剂用量将进一步降低。
[0091]
反应混合液1：含有hcmv(fam荧光标记探针)，bk-jc(vic荧光标记探针) 和提取内标(cy5荧光标记探针)。
[0092]
hcmv寡核苷酸探针：5'-fam-atgaagggttgcgg-mgb nfq-3'
[0093]
bkv-jcv寡核苷酸探针5'-vic-aaaggtagaagaccctaaag-mgbnfq-3'
[0094]
反应组成最终浓度数量2 x quanta反应混合物1x12.5ul正向引物(hcmv，bkv，jcv)15-45pmol0.5ul反向引物(hcmv，bkv，jcv)15-45pmol0.5ul探针(hcmv，bkv，jcv)5pmol0.5ul内部质控混合液 1ul提取总核酸 10ul总和 25ul
[0095]
反应混合液2：含有hhv6(fam标记探针，hhv8(vic荧光标记探针)，ebv (tet荧光标记探针)
[0096]
hhv6寡核苷酸探针：5'-fam-attccttcgggtgtgacgtctggtg-bhq-3'
[0097]
hhv8寡核苷酸探针：5'-vic-ggcacgaccatgg-mgb nfq-3'
[0098]
ebv寡核苷酸探针：5'-tet-aaggttcggaaatctgt-bhq-3'
[0099]
反应组成最终浓度数量
2 x quanta反应混合物1x12.5ul正向引物(hhv6，hhv8，ebv)15-45pmol0.5ul反向引物(hhv6，hhv8，ebv)15-45pmol0.5ul探针(hhv6，hhv8，ebv)5pmol0.5ul水 1ul提取总核酸 10ul总和 25ul