一种可降解免疫磁珠及其制备方法

1.本发明涉及纳米磁性材料领域和生物学领域，具体涉及一种可降解免疫磁珠及其制备方法。


背景技术：

2.胰岛移植是指分离和纯化供体胰腺中的胰岛细胞团，通常经门静脉将其输注移植至糖尿病患者的肝脏中，该手术方法作为1型糖尿病的根治手段之一，近年来也取得了许多进展。目前，胰岛移植领域主要存在以下问题和困惑：(1)供体短缺，移植所需胰岛数量多(》11000ieq/kg体重)；(2)移植物在宿主体内难以长期存活，患者不易获得长期胰岛素脱离状态；(3)免疫抑制存在的若干问题等。目前常规的临床胰岛细胞团分离过程耗时长，约需5-8个小时，同时需4-5人操作，胰岛分离的结果常受到患者住院时间长短、器官获取方法、保存时间和保存条件等因素的影响，常导致外分泌组织与胰岛组织之间的密度差很小，很难用密度梯度的方法实现胰岛和外分泌腺组织的分离。
3.免疫磁珠(imm，immunomagnetic microspheres)一般是指均匀、球形、具有超顺磁性及保护壳的微粒。免疫磁珠细胞分离的基本原理是：磁珠既能结合活性蛋白质(抗体)，又能被磁铁所吸引，经过一定处理后，可将特异性单克隆抗体结合在磁珠上，使之成为抗体的载体。磁珠上抗体与特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物。把这种复合物放入磁场中，复合物就会因磁力作用而发生力学移动，使复合物与其他物质分离，达到分离特异性成分的目的。在各种制备微球的方法中，20世纪90年代初由t.nakashima，m.shimizu等提出的膜乳化法，无疑是被公认的最好的方法。膜乳化过程基本原理是：多孔膜的两侧分别是分散相和连续相，以一定的压力将分散相通过多孔膜压入到连续相中形成液滴，液滴在多孔膜上成长至一定尺寸后脱离，如果多孔膜的孔间距过小，则会发生液滴之间的合并现象。
4.海藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，海藻酸钠具有明显的ph敏感性。海藻酸钠可以在极其温和的条件下快速形成凝胶，当有ca
2
、ba
2
等阳离子存在时，g单元上的na

与二价阳离子发生离子交换反应，g单元堆积形成交联网络结构，从而形成水凝胶。海藻酸钠形成凝胶的条件温和，这可以避免敏感性药物、蛋白质、细胞和酶等活性物质的失活。
5.hpi抗体是由世界顶级实验材料供应商novus biologicals inc和thermofisher开发的鼠抗人胰岛细胞膜蛋白特异性单克隆抗体，可分为hpi1、hpi2、hpi3、hpi4，可与人胰岛细胞团表面膜蛋白特异性结合，与外分泌或者导管细胞几乎不结合。
6.因此，完善人胰岛分离提取的方法极其重要，因此，发明人发明了一种可降解免疫磁珠及其制备方法。


技术实现要素：

7.基于以上问题，本发明提供了一种可降解免疫磁珠及其制备方法，本发明制备的
免疫磁珠毒性小，磁响应好，表面生物相容性好，可有效实现人胰岛分离，大大缩短了人胰岛分离的时间。
8.为解决以上技术问题，本发明提供了一种可降解免疫磁珠的制备方法，包括如下步骤：
9.s1：制备可降解磁珠微球原料
10.取0.05-0.5g海藻酸钠，加蒸馏水至10ml，在室温和磁力搅拌下溶解0.5-1h，得0.5-5％海藻酸钠溶液；取5-10ml上述配制的海藻酸钠溶液，向其中加入2-50μl浓度为50mg/ml且粒径为100-500nm的磁珠，上下振荡，使磁珠与海藻酸钠混合均匀，作为水相；另外，取液体石蜡100-1000ml，加至烧杯中，再向烧杯中加入0.5-5ml司盘80，混合均匀，作为油相；随后将水相和油相混合，用玻棒搅拌均匀，油相简单分散水相，即得可降解磁珠微球原料；
11.s2：采用快速膜乳化技术和步骤s1中制备的可降解磁珠微球原料制备获得海藻酸盐磁珠微球；
12.s3：海藻酸盐磁珠微球与抗体的偶联
13.取步骤s2制备的海藻酸盐磁珠微球置于试管中，用0.01mol/lpbs洗涤3次，最后定容到1-5ml，加入1-20mg edc和5-30mg suflo-nhs，混匀后室温反应5-30min，然后加入2-20mg 6-氨基己酸，室温旋转搅拌12-28h后，用0.01mol/l pbs洗涤3遍；取上述已连接好6-氨基己酸“手臂”分子的磁性微球于实验管中，用上述0.01mol/lpbs定容至1-10ml，加入1-20mg edc和5-30mg suflo-nhs，混匀后室温反应10-20min，然后加入200-800μg鼠抗人胰岛细胞膜蛋白单克隆抗体hpi-2，混匀后室温旋转搅拌1-4h，加入0.05-0.5mol/l甘氨酸溶液，甘氨酸溶液中含0.2％人血清白蛋白或0.2％小牛血清白蛋白，封闭10-20h，用0.01mol/l pbs洗涤3遍，加入hanks液4℃保存，即得。
14.进一步的，步骤s2用于固化的溶液为浓度为0.2-10％的cacl2溶液和浓度为0.2-10％的bacl2溶液中的任意一种或是两种。
15.进一步的，步骤s1中的海藻酸钠溶液的浓度为2％，2％海藻酸钠溶液的取用量为10ml，加入的磁珠的粒径为300nm、体积为10μl，取用的液体石蜡的体积为140ml，司盘80的加入体积为3.5ml；步骤s3中海藻酸盐磁珠微球的取用量为2mg，定容体积为2ml，随后加入的edc和suflo-nhs的质量分别为10mg和15mg，随后室温下反应时间为15min，加入6-氨基己酸的体积为10mg，之后0.01mol/l pbs定容体积为2ml，随后加入的edc和suflo-nhs的质量分别为10mg和15mg，甘氨酸溶液的加入浓度为0.2mol/l。
16.为解决以上技术问题，本发明还提供了可降解免疫磁珠。
17.为解决以上技术问题，本发明还提供了可降解免疫磁珠在分离人胰岛细胞团的产品中的应用。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明制备的免疫磁珠包被有胰岛细胞膜特异性抗体，可特异性靶向到人胰腺中的胰岛，并在胰腺消化过程中与胰岛结合，并在外加磁场作用下，实现胰岛细胞团与外分泌组织分离，可大大缩短胰岛分离的时间，提升胰岛细胞团分离的效率，提高胰岛细胞团的活性和功能，有利于减少移植所需的胰岛量，提高移植效果，间接降低胰岛移植手术的成本；本发明制备的免疫磁珠毒性小、磁响应好、表面生物相容性好，且在溶液ph较高的情况下能降解。
附图说明
19.图1为本发明的实施例2的可降解微球粒子径分布图；
20.图2为本发明的实施例2的可降解微球冻干后在冷场发射扫描电镜下的粒子形态图。
具体实施方式
21.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
22.实施例1：
23.本实施例提供一种可降解免疫磁珠的制备方法，包括如下步骤：
24.s1：制备可降解磁珠微球原料
25.取0.05-0.5g海藻酸钠，加蒸馏水至10ml，在室温和磁力搅拌下溶解0.5-1h，得0.5-5％海藻酸钠溶液；取5-10ml上述配制的海藻酸钠溶液，向其中加入2-50μl浓度为50mg/ml且粒径为100-500nm的磁珠，上下振荡，使磁珠与海藻酸钠混合均匀，作为水相；另外，取液体石蜡100-1000ml，加至烧杯中，再向烧杯中加入0.5-5ml司盘80，混合均匀，作为油相；随后将水相和油相混合，用玻棒搅拌均匀，油相简单分散水相，即得可降解磁珠微球原料；
26.s2：采用快速膜乳化技术和步骤s1中制备的可降解磁珠微球原料制备获得海藻酸盐磁珠微球，本实施例采用的快速膜乳化技术所使用的膜乳化器的厂家为中科森辉微球技术(苏州)有限公司，膜乳化器的型号为fm0210-500m，具体过程如下：打开开阀用供气，调节减压阀到0.2-1.6mpa；打开乳化用供气，调节减压阀到0-3.0mpa；将干燥的膜管放置于乳剂的外相溶液中超声20-60min，将膜管中的气泡用外相溶液填充；在润湿状态下将膜管装到膜乳化器上；开启膜乳化器电源，点击触摸屏，按一般膜乳化法微球生产工艺进行磁珠微球的生产；
27.固化：在膜乳化后得到的磁珠微球溶液中缓慢加入浓度为0.2-10％的cacl2溶液和浓度为0.2-10％的bacl2溶液中的任意一种或是两种的混合液，同时快速搅拌微球溶液，使其固化5-50min；
28.分离和洗涤：含磁珠的微球可采用超强磁铁进行磁分离，除去上清液石蜡，加入异丙醇洗涤磁珠两次，每次用超强磁铁进行分离，再用0.2-10％cacl2溶液和0.2-10％的bacl2溶液中的任意一种或是两种的混合液，保存海藻酸盐磁珠微球产品，或者放于蒸馏水中冻干后保存；采用激光粒度分析仪分析所得磁珠微球的粒径大小及分布，一般粒径为0.5-50.0μm并且粒径分布范围尽量小为最佳；冻干后的微球可进行冷场发射扫描电镜检查微球粒子表面圆整情况；
29.s3：海藻酸盐磁珠微球与抗体的偶联
30.取步骤s2制备的海藻酸盐磁珠微球置于试管中，用0.01mol/lpbs洗涤3次，最后定容到1-5ml，加入1-20mg水溶性碳二亚胺(edc)和5-30mg n-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(suflo-nhs)，混匀后室温反应5-30min，然后加入2-20mg6-氨基己酸，室温旋转搅拌12-28h后，用0.01mol/lpbs洗涤3遍；取上述已连接好6-氨基己酸“手臂”分子的磁性微球于实验管
中，用上述0.01mol/lpbs定容至1-10ml，加入1-20mg edc和5-30mg suflo-nhs，混匀后室温反应10-20min，然后加入200-800μg鼠抗人胰岛细胞膜蛋白单克隆抗体hpi-2，混匀后室温旋转搅拌1-4h，加入0.05-0.5mol/l甘氨酸溶液，甘氨酸溶液中含0.2％人血清白蛋白或0.2％小牛血清白蛋白，封闭10-20h，用0.01mol/lpbs洗涤3遍，加入hanks液4℃保存，即得。
31.本实施例制备的可降解免疫磁珠可应用于分离人胰岛细胞团的产品中。
32.实施例2：
33.本实施例的可降解免疫磁珠微球的配方如下：
[0034][0035]
本实施例的制备方法如下：
[0036]
s1：称取海藻酸钠0.2g，加蒸馏水至10ml，在室温和磁力搅拌下溶解0.5-1h，溶解均匀，得2％海藻酸钠溶液；取10ml 2％海藻酸钠溶液，加入10μl浓度为50mg/ml粒径300nm的磁珠，上下振荡，使磁珠与海藻酸钠混合均匀，作为水相(內相)；另外，取液体石蜡140ml，加至烧杯中，加入3.5ml司盘80，混合均匀，作为油相(外相)；将水相加至油相中或者将油相加至水相中，用玻棒搅拌均匀，油相简单分散水相，即得可降解磁珠微球原料；
[0037]
s2：采用快速膜乳化技术和步骤s1中制备的可降解磁珠微球原料制备获得直径为1μm左右的海藻酸盐磁珠微球，本实施例采用的快速膜乳化技术所使用的膜乳化器的厂家为中科森辉微球技术(苏州)有限公司，膜乳化器的型号为fm0210-500m，具体过程如下：打开开阀用供气，调节减压阀至0.4-0.6mpa；打开乳化用供气，调节减压阀到0-2.0mpa；将干燥的膜管放置于乳剂的外相溶液中，超声30min以上，将膜管中的气泡用外相溶液填充；在润湿状态下将膜管装到膜乳化器上；开启膜乳化器电源，点击触摸屏，工艺操作
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确定
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进至膜乳化器菜单；点击进气阀开，确认乳化用供气阀的进气压力(一般进气压力0.54mpa左右)
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开排气阀
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开进料阀
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将海藻酸钠油水混合物搅拌混合后进料
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关排气阀
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关进料阀
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开进气阀
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开乳化阀，每个阀门开之后稍过几秒，让气体充分进出交换，完成一次微球制备，关进气阀
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关乳化阀；一般微球生产需重复上述e工艺进行3-5轮的进料和出料，如果5轮进样结果还不理想，可能要调整油水相的比例配方，再进行试验；微球制备结束后，关进气阀
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关乳化阀
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开排气阀
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关排气阀；关机：退出界面，关闭后面的电源，结束本次微球制备操作。
[0038]
固化：在膜乳化后得到的磁珠微球溶液中缓慢加入浓度为2％的cacl2溶液，同时快速搅拌微球溶液，使其充分固化(》10min)；
[0039]
分离和洗涤：含磁珠的微球可采用超强磁铁进行磁分离，除去上清液体石蜡，加入异丙醇洗涤磁珠两次，每次用超强磁铁进行分离，再用2％cacl2溶液保存海藻酸钙磁珠微球产品；或者放于蒸馏水中冻干后保存；采用激光粒度分析仪分析所得磁珠微球的粒径大小及分布，一般粒径0.5-100.0μm，并且粒径分布范围尽量小为最佳，见附图1；冻干后进行冷场发射扫描电镜检查微球粒子表面圆整情况，结果见附图2；
[0040]
s3：海藻酸盐磁珠微球与抗体的偶联
[0041]
取2mg步骤s2中制备的可降解海藻酸钙磁性微球于试管中，用0.01mol/l pbs洗涤3次，最后定容到2ml，加入10mg edc和15mg suflo-nhs，混匀后室温反应15min，然后加入10mg 6-氨基己酸，室温旋转搅拌18h后，用上述0.01mol/lpbs洗涤3遍；取上述已连接好6-氨基己酸“手臂”分子的磁性微球于实验管中，用上述0.01mol/lpbs定容至2ml，加入10mg edc和15mg suflo-nhs，混匀后室温反应15min，然后加入400μg鼠抗人胰岛细胞膜蛋白单克隆抗体hpi-2，混匀后室温旋转搅拌2h，加入0.2mol/l的甘氨酸溶液(含0.2％人血清白蛋白或0.2％小牛血清白蛋白)封闭12h，用上述0.01mol/lpbs洗涤3遍，加入改良型hanks液4℃保存，即得。
[0042]
本实施例采用胰岛细胞免疫磁珠专用的分离设备(专利申请号：201910125465.2)进行免疫磁珠人胰岛细胞分离的应用，将含磁珠人胰岛用ph7.4的0.01mol/lpbs溶液洗涤2遍，溶解磁珠，得到不含免疫磁珠的人胰岛细胞团。
[0043]
利用本实施例制备的免疫磁珠进行人胰岛细胞团分离时，平均所需胰岛分离的时间(从器官修剪到胰岛培养)约为3.5h，较常规ricordi半自动人胰岛分离方法(平均约为6.2h)所需时间大大缩短，大部分胰岛的纯度可达85％以上，较ricordi半自动人胰岛分离方法(纯度为30％-100％)有了很大的提高；平均胰岛活性达89.32％，与常规ricordi半自动人胰岛分离方法获得的胰岛活性无差别；胰岛获得量平均为8214ieq/g消化的胰腺组织，较ricordi半自动人胰岛分离方法(平均为6135ieq/g消化的胰腺组织)有大幅度提高。
[0044]
本实施例制备的可降解免疫磁珠可应用于分离人胰岛细胞团的产品中。
[0045]
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。