一种调控CD276基因表达的方法

一种调控cd276基因表达的方法
技术领域
1.本技术涉及一种调控cd276基因表达的方法，属于生物技术领域。


背景技术：

2.癌症是恶性肿瘤的统称，其特点为不正常细胞失控分裂、无限增殖、侵入并破坏周围正常组织。癌症是全球第二大死因，每年导致约1千万人死亡，全球大约六分之一的死亡由癌症造成。目前，化疗仍是癌症治疗主要手段，但远未达到理想的效果。近年来，随着靶向治疗或精准治疗被证实能够极大改善癌症患者的治疗效果，靶向治疗或精准治疗日益成为抗肿瘤治疗领域的热点。然而，靶向治疗或精准治疗的发展依然受到多方面条件的限制，很大程度上归结于没有找到合适的靶点，以及缺乏准确地对各类病人进行分型的方法。
3.在癌症的免疫治疗方法中，采用检查点的抑制剂治疗是目前最常用的免疫治疗方案。b7-h3(cd276)是b7和cd28家族重要的免疫检查点成员,在多种恶性肿瘤中均有表达，并且与恶性肿瘤的生长、转移、复发、预后不良等因素密切相关，因此，亟需筛选出一种特异性针对cd276的调控物质，并厘清其中的调控机制，从而开发新的药物靶点，以达到有效抑制细胞增殖、侵袭和转移的效果，同时能依据该调控物质或调控机制筛选出对靶向cd276的药物或治疗敏感的病人，以便进行精准治疗。


技术实现要素：

4.鉴于上述技术问题，本技术一种调控cd276基因表达的方法。
5.发明人首次发现fkhd家族蛋白与cd276之间存在紧密的关联性。fkhd家族蛋白能特异性地调控cd276的表达，而该调控的靶点序列为cd276基因增强子中的fkhd基序。本技术将通过具体的fkhd家族蛋白foxa1在某细胞(前列腺癌细胞)中的实验来示例性阐述本技术的核心技术思想。
6.第一方面，本技术提供了一种调控细胞中cd276基因表达的方法，包括改变fkhd家族蛋白在所述细胞中的表达量或活性的步骤；或者包括在所述细胞中，干预fkhd家族蛋白与cd276基因的增强子相结合的步骤；或者包括在所述细胞中，编辑cd276基因的增强子中的fkhd基序的步骤。
7.所属领域技术人员知道，蛋白功能的发挥通常与蛋白的表达量和活性有关，因此，fkhd家族蛋白特异性地调控cd276的表达时，改变fkhd家族蛋白的表达量或活性都能影响其对cd276的调控作用。
8.在一些实施方式中，“调控”为抑制或增强。
9.在一些实施方式中，“改变”为增加或减少；其可以通过本领域的常规技术手段来实现，包括但不限于加入能增加fkhd家族蛋白表达量或活性的促进剂或激动剂，或者加入能减少fkhd家族蛋白表达量或活性的抑制剂或阻遏剂，或者编辑fkhd家族蛋白的核酸序列，或者使fkhd家族蛋白在细胞中重组表达等；这些物质例如ezh2或其抑制剂gsk126、epz-6438、bet或其抑制剂jq1、lsd1或其抑制剂gsk2879552。
10.在一些实施方式中，“干预”为促进或阻碍；其可以通过本领域的常规技术手段来实现，包括但不限于加入fkhd家族蛋白的竞争性配体，从而阻碍fkhd家族蛋白与cd276基因的增强子结合；或者编辑cd276基因的增强子序列，以促进或阻碍fkhd家族蛋白与cd276基因的增强子结合等。
11.在一些实施方式中，“编辑”为突变、修饰或敲除；其可以通过本领域的常规技术手段来实现，包括但不限于点突变、移码突变、重排、甲基化修饰、化学修饰、基因打靶、基因编辑、基因沉默(例如采用sirna、shrna质粒和shrna慢病毒颗粒)等。
12.在一些实施方式中，fkhd基序的序列如seq id no.1或seq id no.2所示，或者cd276基因的增强子的序列如seq id no.3所示。
13.第二方面，本技术提供了一种检测、监测或评估待测样本中cd276表达量的方法，包括测定待测样本中fkhd家族蛋白的表达量，通过与对照样本中fkhd家族蛋白的表达量进行比较，根据fkhd家族蛋白与cd276表达的负相关的关系，推断待测样本中cd276的表达量相对于对照样本中的是升高还是降低。
14.第三方面，本技术提供了fkhd家族蛋白在制备降低细胞中cd276表达量的药物、化合物、组合物或制剂中的用途，或fkhd家族蛋白在制备同时降低细胞中cd276和tgfβ的表达量的药物、化合物、组合物或制剂中的用途。
15.第四方面，本技术提供了一种抑制细胞增殖、侵袭或迁移的方法，包括抑制cd276的表达，和/或提高fkhd家族蛋白的表达量或活性。
16.在一些实施方式中，上述细胞或其对应的个体经历过放疗。
17.本技术提供了一种治疗癌症的方法，包括抑制cd276的表达，和/或提高fkhd家族蛋白的表达量或活性；优选的，患癌症的个体经历过放疗。
18.第五方面，本技术提供了一种筛选对药物或治疗敏感的个体的方法，或一种评估个体对药物或治疗敏感程度的方法，或一种评估个体治疗预后的方法；包括测定个体的fkhd家族蛋白的表达量或活性的步骤，所述药物或治疗以cd276为靶点。
19.本技术提供了一种评估疾病进展的方法，包括测定个体的fkhd家族蛋白的表达量或活性的步骤。
20.在一些实施方式中，fkhd家族蛋白为foxa1、foxa1的片段、foxa1的变体和/或foxa1的衍生物。
21.在一些实施方式中，foxa1、foxa1的片段、foxa1的变体和/或foxa1的衍生物均含有与fkhd基序结合的序列。
22.第六方面，本技术提供了一种核酸，其序列如seq id no.1、seq id no.2或seq id no.3所示。
23.第七方面，本技术提供了上述核酸或其配体在抑制cd276基因表达中的应用，其中，上述核酸作为靶标被结合或被编辑。
24.本技术具有以下超过现有技术的优点：
25.1)首次证明fkhd家族蛋白对cd276基因的表达有调节作用。
26.2)首次证明fkhd家族蛋白能够与cd276基因的增强子特异性结合，从而抑制cd276基因的转录。
27.3)首次证明增强子的fkhd基序的序列可以作为药物或治疗的靶点来调节cd276表
达。
28.4)首次证明fkhd家族蛋白的表达量可以作为未来筛选对cd276调控敏感的病人的依据。
附图说明
29.通过阅读对下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本技术的限制。
30.图1显示的是构建的foxa1敲低细胞系。
31.图2显示的是foxa1表达量的降低会升高cd276的表达量。
32.图3显示的是foxa1与cd276基因增强子特异性结合的核酸序列被成功敲除。
33.图4显示的是foxa1与cd276基因增强子特异性结合从而抑制cd276基因的表达。
34.图5显示的是敲除foxa1能引起细胞侵袭增强。
35.图6显示的是敲低cd276能特异性抑制细胞侵袭。
36.图7显示的是foxa1蛋白表达量随着辐照强度的增强而降低。
37.图8显示的是cd276的蛋白表达随着辐照强度的增强而升高。
38.图9显示的是放疗和cd276敲低联合治疗对细胞增殖的抑制作用。
39.图10显示的是人前列腺癌细胞系中foxa1蛋白的表达差异。
40.图11显示的是pc-3细胞中cd276的敲除效率。
41.图12显示的是敲除cd276能抑制pc-3细胞增殖。
42.图13显示的是敲除cd276能抑制pc-3细胞侵袭。
43.图14显示的是敲除cd276能抑制pc-3细胞迁移。
具体实施方式
44.以下实施例仅用于更加清楚地说明本技术的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本技术的保护范围。
45.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本技术；本技术的说明书和权利要求书及上述附图说明中的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。
46.在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本技术的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
47.在本技术实施例的描述中，术语“和/或”仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
48.如说明书和随附的权利要求书中所使用，除非上下文中明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指称。
49.如本文所使用，“cd276”，又叫做b7-h3，是一个具有534个氨基酸的i型跨膜糖蛋白，隶属于b7-cd28家族的免疫检查点分子。在正常情况下cd276的蛋白表达量被严密调控并维持在一个较低的水平，但是在多种肿瘤中cd276过表达，例如在前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌等癌症中，cd276的高表达与癌症的发展呈正相关，与病人生存期呈负相关。
50.如本文所使用，“fkhd(forkhead)家族蛋白”也被成为叉头盒蛋白或fox(forkhead box)蛋白，是一类在其dna结合区具有翼状螺旋结构的转录因子。由于与该dna结合区结合的氨基酸残基比较保守，因此，研究人员推测这种结合模式可能在fkhd家族蛋白中普遍存在。
51.如本文所用，术语“fkhd基序(fkhd motif)”是本领域的常规术语，指与fkhd家族蛋白结合的目标基因增强子区域的核酸序列。
52.如本文所使用，“foxa1(forkhead box a1)”，又称hnf-3α，是叉头基因家族转录因子的一种。foxa1蛋白通过直接结合在fkhd基序上调控目标基因的转录。
53.本技术也同样适用于foxa1的片段、foxa1的变体和/或foxa1的衍生物。
54.如本文所使用，“片段”是指包含于蛋白中的一段多肽。
55.如本文所使用，“变体”是指与原蛋白序列有50％-60％以上同源性、61％-70％以上同源性、或71％-80％以上同源性、或81％-90％以上同源性、或91％-99％以上、或100％同源性的氨基酸序列。
56.如本文所使用，“衍生物”是指在原蛋白质过一系列反应化合而成的新物质，其具有与原蛋白质相似的性质或功能。
57.在一些实施方式中，foxa1的片段、foxa1的变体和/或foxa1的衍生物包含与cd276增强子中fkhd基序结合的全部氨基酸；或具有与cd276增强子中fkhd基序结合的功能。
58.如本文所使用，“转化生长因子-β(transforming growth factor-β,tgf-β)”属于一组新近发现的调节细胞生长和分化的tgf-β超家族。
59.在医学背景下，“检测”或“测定”是通过测量一个或多个因素来鉴定一种或多种健康情况(包括疾病和/或损伤)以确定疾病性质和/或原因的行为或过程。
60.如本文所用，术语“治疗”指减少或减轻疾病发作和/或症状的进展、严重程度和/或持续时间。
61.如本文所用，“监测”涉及跟踪那些已经被诊断的疾病、病症、并发症或风险，例如分析疾病的进展、或分析特定治疗对疾病或病症的进展的影响。
62.如本文所用，“评估”指在疾病的症状或标志物变得明显、或已经显著改变之前，对疾病的病症或并发症进行预判。
63.在医学上，“预后”是指根据经验预测的疾病发展情况。
64.如本文所使用，“细胞增殖”是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础，异常的细胞增殖可能导致肿瘤的产生。
65.如本文所使用，“侵袭”指恶性肿瘤从原发瘤或继发瘤向邻近的宿主组织侵犯或占领。
66.如本文所使用，“迁移”指肿瘤细胞由其原发部位侵入淋巴管、血管或体腔部位，肿瘤细胞被血流、淋巴流带到另一部位或器官继续生长，形成与原发瘤同样类型的肿瘤。
67.如本文所用，术语“配体”是指能选择性地与目标物结合，其包括但不限于蛋白、核
酸适配体(aptamer)、肽适配体、肽体(peptibody)、拟似物(mimetic)、噬菌体、抑制剂、化合物、抗体等。
68.术语“特异识别”或“选择性结合”或“特异性结合”指当该结合配体存在于含有其他分子或生物体的混合物中时，所述目标物也优先结合或识别所述结合配体。该结合可经由共价或非共价相互作用或两者的组合来介导。
69.本技术的方法可以是体外方法，也可以是体内方法；可以是诊断方法或治疗方法，也可以是非诊断方法或非治疗方法，本领域技术人员能够根据实际情况选用。
70.如本文所用，“细胞”为动物细胞或人体细胞，可为分离的细胞、体外细胞或体内细胞；可选地为肿瘤细胞(癌细胞)或转移型癌细胞，例如，乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞等。
71.在一些实施例中，细胞为去势抵抗性前列腺癌(metastatic castration resistant prostate cancer,mcrpc)细胞。
72.在一些实施例中，细胞为foxa1低表达的前述各种癌细胞。
73.如本文所用，“患者”或“个体”或“受试者”指人或动物。
74.在一些实施方式中，个体患有癌症，例如乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等。
75.如本文所用，“靶点”或“靶标”指药物在体内的作用结合位点，或治疗方法针对的位点。
76.如本文所用，术语“对照群体”或“对照样本”可以是阴性对照群体或阳性对照群体。在一些实施方案中，对照群体是患有与受检个体相同疾病的个体的群体。在一些实施方案中，对照群体是患有与受检个体相同疾病并且对该疾病不出现危象反应和/或威胁生命反应的个体的群体。在一些实施方案中，对照群体是正常个体的群体。在一些实施方案中，对照群体是这样的个体群体，其中对照群体的大部分成员并不患有与受检个体相同的疾病。在一些实施方案中，上述人群是无偏人群。
77.如本文所使用，“待测样本”是指从受试者获得的流体、组织、分泌物或排泄物的样品，包括但不限于血液，血清，血浆，唾液，痰液，尿，胃液，消化液，泪液，汗液，粪便，精液，阴道液，间质液，源自肿瘤组织的流体，眼内液，粘液，耳垢，油，腺体分泌物，脊髓液，皮肤，来自颅骨内的脑脊液，来自鼻拭子、咽喉拭子、口拭子(例如，颊拭子)、阴道拭子或鼻咽洗液的组织、流体或物质，活检流体或材料，胎液，羊水，脐带血，淋巴液，腔液，脓液，从受试者获得的微生物群，胎粪，乳汁或者其他分泌物或排泄物的样品。
78.本技术首次揭示了fkhd家族蛋白与cd276的关联，以及fkhd家族蛋白调控cd276的机制，为相关疾病的治疗提供了重要的研究思路和干预靶标。仅仅为了示例性地阐述本发明的核心思想，以下采用一种具体的fkhd家族蛋白——foxa1、在一种具体的细胞(前列腺癌细胞)进行实验。
79.实施例1敲低载体plko.1-puro-foxa1的构建
80.shrna引物设计：获得shfoxa1序列，并设计shrna限制性内酶切位点接头与载体限制性内切酶位点(age1及ecor.1)相匹配，引物序列详见表1，委托华大基因公司合成。
81.表1 shfoxa1引物
[0082][0083]
shfoxa1引物退火：将引物12000rpm离心10min后，加入无菌水稀释至100um，并按下表2配制退火体系，100℃水浴15min后，在水浴中自然冷却。
[0084]
表2引物退火体系
[0085]
退火体系50ul正向引物1ul反向引物1ul10xneb buffer45ulddh2o43ul
[0086]
载体质粒plko.1-puro双酶切：酶切体系的反应管进行封口膜封口、混匀及离心等操作，并在37℃的条件下，至少酶切2小时，随后将体系进行1％琼脂糖凝胶电泳(电压设置为120v，电泳时间设置为30分钟)后，回收质粒plko.1-puro酶切片段产物，反应体系如下表3。
[0087]
表3 plko.1-puro双酶切反应体系
[0088]
酶切体系50ulplko.1-puro3ulecor i-hf1ulage i-hf1ul10x quickcut buffer5ulddh2o40ul
[0089]
载体质粒plko.1-puro与shfoxa1引物退火产物的连接：对下述连接体系的反应管进行封口膜封口、混匀及离心等操作。反应条件为4℃过夜，连接体系如下表4。
[0090]
表4 t4连接酶连接体系
[0091]
连接体系10ulplko.1-puro酶切质粒2ult4连接酶2ult4连接酶buffer1ulshfoxa1退火产物5ul
[0092]
转化与鉴定：
[0093]
①
上述连接产物可直接用于转化过程，于冰上操作。首先取连接产物5ul，加入到50μl感受态细胞(dh-5α)中，用移液器吹打均匀(注意感受态细胞较脆弱，勿用力吹打)，于冰上静置30分钟。
[0094]
②
将上述产物置于提前预热的42℃金属浴中，经45秒热激后，放置冰上2分钟。
[0095]
③
加入提前预热的1ml无抗性lb液体培养基，将其水平放置，于37℃摇床上恢复培养1～2小时。
[0096]
④
取150～200μl均匀涂在含有氨苄抗性板上，37℃培养箱培养16～18小时。
[0097]
⑤
随机选取5个长势饱满的单菌落接种于3～5ml lb培养基中(氨苄霉素浓度为100μg/ml)，在恒温摇床中过夜培养(200rpm、37℃)，随机挑选3～5个克隆菌液送往生工生物公司进行测序验证。
[0098]
实施例2 foxa1敲低慢病毒的包装
[0099]
选取生长状态良好的hek-293t细胞，每孔以1～2
×
106个的密度均匀接种于六孔板中，转染前一天铺板，细胞长至80～90％汇合度时即可用于转染。
[0100]
转染：将病毒骨架质粒以及辅助质粒按照plko.1-puro-shfoxa1:pspax2:pmd2.g＝4:3:1的比例混合用以制备脂质体复合物，其中lipofectamine 3000的作用是增强转染效率，转染体系如下表5、表6。
[0101]
表5.溶液配制体系
[0102]
组分(a管)体积opti-mem无血清培养基500ullipofectamine 3000转染试剂40ul
[0103]
表6.溶液配制体系
[0104]
组分(b管)体积plko.1-puro-shfoxa1500ulopti-mem无血清培养基40ul
[0105]
制备脂质体-dna复合物：将上述a、b两管内容物混合均匀，室温孵育15～20分钟。
[0106]
加入复合物前，舍弃旧培养基，每孔再加入9ml新鲜无双抗但加有10％胎牛血清的dmem培养基，小心地沿着孔板壁加入上述培养基(hek-293t细胞贴壁能力弱，因此要小心加入培养基以免破坏细胞)，再向每孔加入1ml的步骤(3)中的混合物，轻轻晃动培养皿，使其分布均匀。
[0107]
将293t细胞放回细胞培养箱(37℃、5％co2)继续孵育6～8小时后，小心抽弃培养基，替换成10ml提前预热的完全无双抗但加有10％fbs的dmem培养基，注意旧的培养基用84消毒液处理消毒后再处置。
[0108]
将培养皿放在培养箱(37℃、5％co2)中继续孵育48小时。
[0109]
转染约48小时后，用注射器从每孔中收集10ml的培养细胞的上清液，为了除去慢病毒上清液中残留的细胞碎片，使用孔径为0.45μm大小的过滤器过滤上清液即为shfoxa1敲低慢病毒。
[0110]
实施例3敲低foxa1稳定细胞系的构建
[0111]
宿主细胞铺板：感染前一天晚上将处于对数生长期的宿主细胞lncap以2～3
×
105细胞/孔接种于含有2ml培养基的6孔培养板中，将其放回细胞培养箱(37℃、5％co2)过夜孵育，感染时使细胞密度达到30～40％汇合度(注意细胞接种不宜过多)。
[0112]
孔板离心感染：将上述2ml制备好的病毒上清液转移至相应的孔中，同时加入2μg/ml的polybrene(polybrene的作用是增强病毒的感染效率)。用封口膜将孔板四周封闭以防细胞污染，室温下离心6孔培养板(2000rpm、升降速参数设置为3、离心20分钟)，离心结束后
将培养板上的封口膜撕去，在培养箱中(37℃、5％co2)继续孵育。
[0113]
敲低细胞系筛选：培养2天后将原先的培养基替换为含嘌呤的培养基加压筛选培养(见图1)。
[0114]
实施例4荧光定量pcr对foxa1敲低细胞系的验证
[0115]
目的基因序列及引物设计：通过qrt-pcr的方法检测lncap细胞foxa1及cd276的表达情况，根据设计目的基因foxa1、cd276与内参基因gapdh引物，引物合成见表7，引物委托华大基因公司合成。
[0116]
表7荧光定量pcr引物
[0117]
引物名称引物序列(5’～3’)foxa1-fgaagatggaagggcatgaaa(seq id no.6)foxa1-rcgctcgtagtcatggtgttc(seq id no.7)cd276-fagctgtgaggaggagaatgc(seq id no.8)cd276-rtgctgtcagagtgtttcagagg(seq id no.9)gapdh-ftgcaccaccaactgcttagc(seq id no.10)gapdh-rggcatggactgtggtcatgag(seq id no.11)
[0118]
细胞总rna提取：根据实验需要提前准备如下实验材料及器材：rna提取试剂盒，氯仿、无水乙醇、离心机、涡旋仪、pcr仪、移液器及带滤芯的枪头。收集处于对数生长期的肿瘤细胞，提取细胞的总rna。其基本操作步骤如下：
[0119]
①
弃去旧的培养基，用pbs清洗一至两遍，加入1ml rna裂解液(按照细胞数量加入裂解液，该试剂盒要求是10cm2的贴壁细胞加入1ml的裂解液)，吹打均匀至细胞完全裂解，将上述裂解液加入2ml无核酸酶的离心管中。
[0120]
②
每1ml裂解样品中加入0.2ml的氯仿，涡旋震荡15～30秒，置于冰上孵育10～15分钟。
[0121]
③
在12000g、4℃持续离心15分钟，随后尽可能的抽出上层水相，并将其转移至无核酸酶的离心管中，并加入与水相等体积的无水乙醇，剧烈涡旋震荡20秒。
[0122]
④
将hibind rna收集管安装在2ml离心管上，并将上述混合物转移至hibind rna收集管内，离心(10000g、25℃、1分钟)，弃去离心管内的液体。
[0123]
⑤
加入500μl rna wash buffer i进行洗涤，离心(10000g、25℃、1分钟)，弃去液体。再加入500μl rna wash buffer i洗涤1次，再次离心(10000g、25℃、1分钟)，弃去液体。
[0124]
⑥
加入500μl rna wash buffer ii洗涤2次，13000g空离2分钟。
[0125]
⑦
将hibind rna收集管安装在新的离心管上，加入50μl提前70℃预热的depc水，静置5分钟后再进行离心(13000g、25℃、1分钟)，收集离心管内的rna即可。
[0126]
第一链cdna的合成(反转录)：
[0127]
①
向提前灭菌的pcr管中加入表8中的反应物质。
[0128]
表8溶液配制体系
[0129]
组分体积总rna(0.1ng～5μg)3uloligo(dt)18(0.1μg/μl)1uldepc水up to 12ul
[0130]
②
离心并混匀上述模板及引物，在pcr仪中65℃孵育10分钟，再置于冰上孵育；
[0131]
③
将
②
中所述反应物置于冰上，根据以下顺序加入反应物至上述pcr管内(此时总体积为20μl)，将体系(见表9)轻轻混匀，瞬时离心。
[0132]
表9溶液配制体系
[0133]
组分体积5
×
reaction buffer4ulribolock rna酶抑制剂1ul10mm dntp mix2ulreveraid m-mulv逆转录酶1ul
[0134]
④
接着按照如下程序进行反转录：42℃孵育60分钟，70℃孵育5分钟。
[0135]
⑤
使用nanodrop对cdna进行浓度测定，并调整浓度为800～1000ng/μl，-20℃或者-80℃保存备用。
[0136]
荧光定量pcr：
[0137]
①
本实验中选取gapdh作为相对定量的内参基因，反应体系为12ul，其应体系如表10：
[0138]
表10荧光定量pcr反应体系
[0139]
组分体积2
×
light cycler 480 sybr greeni master6ulforward primer0.5ulreverse primer0.5ulcdna5ul
[0140]
②
反应液的配置需在冰上进行，在管内充分混匀，盖上封板膜，瞬时离心。设置荧光定量pcr反应程序，并将反应混合物放置到荧光定量pcr仪中。反应条件如表11：
[0141]
表11荧光定量pcr反应程序
[0142][0143]
结果发现，foxa1敲低细胞系lncap细胞中foxa1显著降低，且foxa1表达量的降低的同时cd276的表达量会升高(见图2)。
[0144]
实施例5靶向cd276增强子的敲除载体plenticrisprv2-sgrna1 2(cd276 enhancer-targeting)的构建
[0145]
获取foxa1与cd276增强子的结合序列(如seq id no.3所示)，其中，fkhd基序的序列如seq id no.1或seq id no.2所示。
[0146]
sgrna1 2(cd276 enhancer-targeting)引物设计：获得sgrna1 2(cd276 enhancer-targeting)，设计限制性内酶切位点接头与载体限制性内切酶位点(bsmbi)相匹
配，引物序列详见表12，委托华大基因公司合成。
[0147]
表12 sgrna1 2引物
[0148][0149]
sgrna1 2(cd276 enhancer-targeting)引物退火：将引物12000rpm离心10min后，加入无菌水稀释至100um，并按下表13配制退火体系，100℃水浴15min后，在水浴中自然冷却。
[0150]
表13引物退火体系
[0151]
退火体系50ul正向引物1ul反向引物1ul10xneb buffer45ulddh2o43ul
[0152]
载体质粒plenticrisprv2单酶切：酶切体系的反应管进行封口膜封口、混匀及离心等操作，并在37℃的条件下，至少酶切2小时，随后将体系进行1％琼脂糖凝胶电泳(电压设置为120v，电泳时间设置为30分钟)后，回收质粒plenticrisprv2酶切片段产物，反应体系如下表14。
[0153]
表14 plko.1-puro双酶切反应体系
[0154][0155][0156]
载体质粒plenticrisprv2与sgrna1 2(cd276 enhancer-targeting)引物退火产物的连接：对下述连接体系的反应管进行封口膜封口、混匀及离心等操作。反应条件为4℃过夜，连接体系如下表15。
[0157]
表15 t4连接酶连接体系
[0158]
连接体系10ul
plenticrisprv2质粒单酶切产物2ult4连接酶2ult4连接酶buffer1ulsgrna1 2(cd276enhancer-targeting)引物退火产物5ul
[0159]
转化与鉴定：
[0160]
①
上述连接产物可直接用于转化过程，于冰上操作。首先取连接产物5ul，加入到50μl感受态细胞(dh-5α)中，用移液器吹打均匀(注意感受态细胞较脆弱，勿用力吹打)，于冰上静置30分钟；
[0161]
②
将上述产物置于提前预热的42℃金属浴中，经45秒热激后，放置冰上2分钟；
[0162]
③
加入提前预热的1ml无抗性lb液体培养基，将其水平放置，于37℃摇床上恢复培养1～2小时；
[0163]
④
取150～200μl均匀涂在含有氨苄抗性板上，37℃培养箱培养16～18小时；
[0164]
⑤
随机选取5个长势饱满的单菌落接种于3～5ml lb培养基中(氨苄霉素浓度为100μg/ml)，在恒温摇床中过夜培养(200rpm、37℃)，随机挑选3～5个克隆菌液送往生工生物公司进行测序验证。
[0165]
实施例6靶向cd276增强子的敲除慢病毒的包装
[0166]
选取生长状态良好的hek-293t细胞，每孔以1～2
×
106个的密度均匀接种于六孔板中，转染前一天铺板，细胞长至80～90％汇合度时即可用于转染。
[0167]
转染：将病毒骨架质粒以及辅助质粒按照plenticrisprv2-sgrna1 2(cd276 enhancer-targeting):pspax2:pmd2.g＝4:3:1的比例混合用以制备脂质体复合物，其中lipofectamine 3000的作用是增强转染效率，转染体系如下表16、表17。
[0168]
表16.溶液配制体系
[0169]
组分(a管)体积opti-mem无血清培养基500ullipofectamine 3000转染试剂40ul
[0170]
表17.溶液配制体系
[0171][0172]
制备脂质体-dna复合物:将上述a、b两管内容物混合均匀，室温孵育15～20分钟。
[0173]
加入复合物前，舍弃旧培养基，每孔再加入9ml新鲜无双抗但加有10％胎牛血清的dmem培养基，小心地沿着孔板壁加入上述培养基(hek-293t细胞贴壁能力弱，因此要小心加入培养基以免破坏细胞)，再向每孔加入1ml的步骤(3)中的混合物，轻轻晃动培养皿，使其分布均匀。
[0174]
将293t细胞放回细胞培养箱(37℃、5％co2)继续孵育6～8小时后，小心抽弃培养基，替换成10ml提前预热的完全无双抗但加有10％fbs的dmem培养基，注意旧的培养基用84消毒液处理消毒后再处置。
[0175]
将培养皿放在培养箱(37℃、5％co2)中继续孵育48小时。
[0176]
转染约48小时后，用注射器从每孔中收集10ml的培养细胞的上清液，为了除去慢病毒上清液中残留的细胞碎片，使用孔径为0.45μm大小的过滤器过，滤上清液即为cd276 enhancer-targeting敲除慢病毒。
[0177]
实施例7构建靶向敲除foxa1与cd276增强子结合位点的稳定细胞系
[0178]
宿主细胞铺板：感染前一天晚上将处于对数生长期的宿主细胞lncap以2～3
×
105细胞/孔接种于含有2ml培养基的6孔培养板中，将其放回细胞培养箱(37℃、5％co2)过夜孵育，感染时使细胞密度达到30～40％汇合度(注意细胞接种不宜过多)。
[0179]
孔板离心感染：将上述2ml制备好的病毒上清液转移至相应的孔中，同时加入2μg/ml的polybrene(polybrene的作用是增强病毒的感染效率)。用封口膜将孔板四周封闭以防细胞污染，室温下离心6孔培养板(2000rpm、升降速参数设置为3、离心20分钟)，离心结束后将培养板上的封口膜撕去，在培养箱中(37℃、5％co2)继续孵育。
[0180]
敲除细胞系筛选：培养2天后将原先的培养基替换为含嘌呤的培养基加压筛选培养。
[0181]
实施例8 pcr及测序验证靶向敲除foxa1与cd276增强子结合位点的稳定细胞系
[0182]
靶向敲除foxa1与cd276增强子结合位点的稳定lncap细胞系的基因组dna(gdna)提取：根据实验需要提前准备如下实验材料及器材：基因组dna提取试剂盒(takara)、离心机、涡旋仪、pcr仪、移液器及带滤芯的枪头。收集处于对数生长期的肿瘤细胞，提取细胞的gdna。其基本操作步骤如下：
[0183]
①
收集细胞用200μl pbs溶液悬浮细胞。
[0184]
②
加入180μl buffer gb、20μl的proteinase k和10μl的rnase a(10mg/ml)混匀，于56℃水浴温浴10分钟。
[0185]
③
向裂解液中加入200μl 100％乙醇，混匀将溶液移至spin column中，12,000rpm离心2分钟，弃滤液。
[0186]
④
加入500μl的buffer wa 12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
[0187]
⑤
加入700μl的buffer wb 12,000rpm离心1分钟，弃滤液，共洗2遍，空离12,000r离心2分钟。
[0188]
⑥
加入50-200μl灭菌水洗脱，获得gdna。
[0189]
验证引物设计：根据cd276增强子序列在sgrna1 2(cd276enhancer-targeting)两端设计验证引物，引物合成见表18，引物委托华大基因公司合成。
[0190]
表18 pcr引物
[0191][0192]
gdna目的片段的扩增及电泳：以靶向敲除foxa1与cd276增强子结合位点的稳定lncap细胞系的gdna为模板扩增基因组相应位置序列，pcr产物通过pcr扩增产物的片段长
度初步验证lncap细胞基因组中foxa1与cd276增强子结合位点的敲除情况。
[0193]
将上一步扩增的片段委托生工生物进行测序，进一步验证lncap细胞基因组中foxa1与cd276增强子结合位点的敲除情况。
[0194]
结果显示，采用crispr-cas9基因编辑技术结合二代测序技术证实lncap细胞系中转录因子foxa1与cd276基因增强子特异性结合的核酸序列被成功敲除(见图3)。
[0195]
实施例9靶向敲除foxa1与cd276增强子结合位点的稳定细胞系再次敲低foxa1验证其对cd276的调控
[0196]
宿主细胞铺板：感染前一天晚上将处于对数生长期的宿主细胞lncap ctr grnas及lncap sgrna1 2以2～3
×
105细胞/孔接种于含有2ml培养基的6孔培养板中，将其放回细胞培养箱(37℃、5％co2)过夜孵育，感染时使细胞密度达到30～40％汇合度(注意细胞接种不宜过多)。
[0197]
孔板离心感染：将2ml制备好的shctrl/shfoxa1病毒上清液转移至相应的孔中，同时加入2μg/ml的polybrene(polybrene的作用是增强病毒的感染效率)。用封口膜将孔板四周封闭以防细胞污染，室温下离心6孔培养板(2000rpm、升降速参数设置为3、离心20分钟)，离心结束后将培养板上的封口膜撕去，在培养箱中(37℃、5％co2)继续孵育。
[0198]
敲除细胞系筛选：培养2天后将原先的培养基替换为含嘌呤的培养基加压筛选培养。
[0199]
实施例10 pcr及荧光定量pcr对靶向敲除foxa1与cd276增强子结合位点的稳定细胞系中foxa1对cd276调控的验证
[0200]
pcr验证敲除cd276及敲低foxa1的各组细胞的gdna目的片段：按上述基因组提取方法提取敲除cd276及敲低foxa1的各组细胞的gdna，并以其为模板扩增基因组相应位置序列，pcr产物通过pcr扩增产物的片段长度初步验证lncap细胞基因组中foxa1与cd276增强子结合位点的敲除情况。
[0201]
荧光定量pcr对敲除cd276增强子及敲低foxa1的各组细胞系中foxa1对cd276调控的验证：按上述rna提取及反转录方法提取细胞总rna并反转录。按表7中引物及上述荧光定量pcr体系及程序检测敲除cd276及敲低foxa1的各组细胞系中foxa1对cd276调控。
[0202]
采用实时荧光定量聚合酶链反应证实前列腺癌细胞在敲除转录因子foxa1与cd276基因增强子特异性结合的核酸序列之后，foxa1敲低不再引起cd276基因表达变化，证实在前列腺癌细胞中foxa1与cd276基因增强子特异性结合从而抑制cd276基因的表达(图4)。
[0203]
实施例11 transwell侵袭实验验证foxa1低表达前列腺癌细胞系对cd276敲低敏感
[0204]
消化生长状态良好的lncap为单细胞悬液，离心后用无1％血清rpmi-1640培养基重悬，调整细胞密度为3.3
×
105个细胞/ml，在加有matrigel基质胶的transwell上室中加入100μl含有3.3
×
104个细胞的悬液，下室加入650μl含40％fbs的rpmi-1640完全培养基；放在37℃、5％co2培养箱中继续培养48小时,染色计数。
[0205]
结果表明，在前列腺癌细胞中敲除foxa1引起细胞侵袭增强(见图5)，敲低cd276特异性抑制细胞侵袭(见图6)。
[0206]
实施例12放疗和cd276敲低联合治疗对细胞增殖的抑制作用
[0207]
实验发现，小鼠前列腺癌细胞myc-cap放射辐照后，western blot检测foxa1蛋白表达量随着辐照强度的增强呈现梯度降低，流式细胞术检测cd276的蛋白表达呈现梯度升高(见图7-8)。
[0208]
用mtt法检测放疗和cd276敲低联合治疗对前列腺癌细胞生长的影响：
[0209]
myc-cap细胞铺板至六孔板，每孔1x105。待细胞贴壁后分别感染plko/shmcd276-1病毒，感染15h后换液，36h后将细胞转移至含有puro的筛选培养基中筛选72h。随后将细胞铺板至三个六孔板中，每板myc-cap plko/shmcd276-1各三孔。待细胞贴壁后取一个六孔板辐照10gy,辐照48h后收取细胞，每孔500cells铺板至96孔板中，共4板。待细胞贴壁后加入mtt,并于加入mtt 4h后吸弃培养基并加入150ul dmso，避光震荡96孔板10min。使mtt完全溶解，随后用酶标仪检测490nm处的吸光值，此后每24h加入mtt进行检测，连续三天。结果显示，放疗的基础上敲除cd276对细胞增殖的抑制作用更明显(见图9)。
[0210]
在pc-3细胞中研究敲除cd276，对细胞增殖、侵袭和迁移的影响：
[0211]
用geo分析人前列腺癌细胞系中foxa1蛋白的表达差异，发现mcrpc细胞系的pc-3细胞中foxa1表达量较低(见图10)。
[0212]
用qpcr检测pc-3细胞发现，其中的cd276被高效率敲除(见图11)。
[0213]
结果表明，敲除cd276后，能够抑制pc-3细胞增殖(见图12)、抑制pc-3细胞侵袭(见图13)和抑制pc-3细胞迁移(见图14)。
[0214]
以上对本技术具体实施方式的描述详细地公开了本技术的技术细节，并举例说明了本技术的技术思路，旨在满足专利法的授权规定，但不应反而被认为是对本技术保护范围的限制。该领域的科研人员可以根据本技术，结合彼时的知识与技术作出各种改变或变形，只要未脱离本技术的核心思路与精神，均应属于本技术所附的权利要求的保护范围。