5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体的制备方法与流程

1.本发明涉及一种5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体的制备方法。更具体地，涉及一种在浓缩结晶过程中不使用有机溶剂而获得5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体的方法。


背景技术：

2.通常已知的5＇-鸟苷酸二钠晶体形式为无定形、板状四水合物、柱状七水合物。以无定形为例，由于固液分离、搬运、贮存存在困难，因此工业上使用的形式主要是七水合物。
3.工业上获得所述晶体的方法是使用属于醇类反溶剂的甲醇、乙醇等亲水性有机溶剂。
4.如上所述，在使用有机溶剂的结晶法中，使用的亲水性有机溶剂会包括在晶体内部并在干燥产品后残留，从而引起用户的不安。另外，在回收用于工艺的亲水性有机溶剂的过程中，需要得到高纯度的有机溶剂，因此会产生蒸馏塔投资成本及其相关的效用成本，以及为工人提供安全的防爆费用等。
5.因此，本发明人为了解决上述的缺点而多次进行改进实验，结果发现不使用有机溶剂也可以获得5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体，因此完成了本发明。


技术实现要素：

6.技术问题
7.一方面提供一种5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体的制备方法，其包括：混合盐水溶液和5＇-鸟苷酸水溶液，从而在混合溶液中形成非晶态固体；以及将晶种添加至所述混合溶液中，从而形成5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体，其中，所述添加晶种的步骤在将温度维持在25至45℃下进行。
8.技术方案
9.一方面提供一种5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体的制备方法，其包括：混合盐水溶液和5＇-鸟苷酸水溶液，从而在混合溶液中形成非晶态固体；以及将晶种添加至所述混合溶液中，从而形成5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体，其中，所述添加晶种的步骤在将温度维持在25至45℃下进行。
10.在所述方法中，所述盐水溶液的ph可以是7至10。所述添加可以是在将所述混合溶液的温度维持在25至45℃下进行。
11.所述盐水溶液中的盐浓度包括任意的，只要其与5＇-鸟苷酸水溶液混合后形成具有160至360g/l的盐浓度的混合溶液即可。例如，所述盐水溶液可以是200至400g/l的盐水溶液。
12.所述5＇-鸟苷酸水溶液可以是通过将5＇-鸟苷酸添加至水中来制备。所述5＇-鸟苷酸水溶液可以是50至400g/l的5＇-鸟苷酸水溶液。所述5＇-鸟苷酸水溶液可以是包括盐的水溶液，例如，可以是5＇-鸟苷酸二钠水溶液。所述5＇-鸟苷酸水溶液可以包括通过培养微生物来获得的一种。所述通过培养微生物来获得的一种可以是通过在含有5＇-鸟苷酸的培养液
中去除细胞来得到的上清液。所述通过培养微生物来获得的一种可以通过使用离子交换层析或活性炭，从所述上清液中纯化来得到。使用活性炭的纯化可以是混合活性炭和培养液以使杂质结合于活性炭，然后从反应物去除该杂质结合的活性炭。
13.在所述方法中，混合5＇-鸟苷酸水溶液可以进行至所述混合溶液中的盐浓度达到160至360g/l。混合5＇-鸟苷酸水溶液可以进行至所述混合溶液中的nacl浓度达到160至360g/l。
14.在所述方法中，形成所述非晶态固体的步骤可以包括干燥所述混合溶液以使所述盐浓度达到160至360g/l。混合5＇-鸟苷酸水溶液可以是分开所述水溶液而部分添加。所述添加可以是滴落。所述添加可以在1至1000分钟内进行。混合5＇-鸟苷酸水溶液可以是搅拌的同时进行。
15.本说明书中的术语“非晶态固体”，不似晶体那样定形且以无序沉淀的白色固体漂浮在溶液中，并且通过显微镜观察时，其因无定形而不透明且具有不规律、不透明的形态。干燥该非晶态固体并分析水合物后证实其为无水物。
16.在所述方法中，添加晶种可以是在将所述混合溶液的温度维持在25至45℃下进行。所述晶种可以包括5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体。添加晶种可以是搅拌反应器的同时进行。添加晶种可以是分开晶体而部分添加。所述添加可以是滴落。所述添加可以在1至1000分钟内进行。所述添加的晶种的量可以在算出5＇-鸟苷酸水溶液和盐水溶液的混合溶液中的5＇-鸟苷酸盐的重量后，将此当作晶种添加重量的标准。所述添加的晶种的量可以是基于所述5＇-鸟苷酸盐100重量份的0.1至5.5重量份，或0.1至5.0重量份。所述5＇-鸟苷酸盐可以是例如5＇-鸟苷酸二钠。
17.所述方法在形成5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体之后进一步包括，冷却含有形成的晶体的溶液。所述冷却可以是在小于或等于25℃，例如，4至25℃、4至20℃、4至15℃、4至10℃、10至25℃、15至25℃、或10至20℃下进行。
18.所述方法在形成5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体之后进一步包括，从含有形成的晶体的溶液中分离所述晶体。所述分离可以是离心或过滤。所述分离可以是在100至1000xg下进行。所述分离可以在1至30分钟内进行。所述过滤可以使用0.22至200μm的过滤器。
19.在所述方法中，所述盐水溶液可以是金属盐的水溶液。即，所述盐水溶液的盐可以是金属盐。所述金属盐可以包括碱金属盐。所述碱金属盐可以是含有钠的盐。所述碱金属盐可以是nacl、kcl、na2co3、nahco3，或na2co3。
20.一具体实施方式可以是5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体的制备方法，其包括：在盐水溶液中混合5＇-鸟苷酸水溶液，以使混合溶液中的盐浓度达到160至360g/l，从而在混合溶液中形成非晶态固体；以及将晶种添加至所述混合溶液中，从而形成5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体，其中，所述混合溶液的温度为25至45℃。所述盐水溶液可以是200至400g/l的盐水溶液。所述5＇-鸟苷酸水溶液可以是50至400g/l的5＇-鸟苷酸水溶液。所述盐水溶液的ph可以是7至10。所述晶种可以是5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体。所述5＇-鸟苷酸水溶液包括通过培养微生物来获得的一种。所述5＇-鸟苷酸水溶液可以包括通过培养微生物来获得的培养物或在其去除细胞的培养上清液，或者从其纯化的5＇-鸟苷酸。所述微生物可以具有5＇-鸟苷酸生产能力。所述添加的晶种的量可以是基于所述混合溶液中形成的5＇-鸟苷酸100重量份的0.1至5.5重量份。所述盐可以是nacl。所述5＇-鸟苷酸盐可以是例如5＇-鸟苷酸二钠。
21.一具体实施方式可以是5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体的制备方法，其包括：混合nacl水溶液和5＇-鸟苷酸水溶液以使混合溶液中的盐浓度达到160至360g/l，从而在混合溶液中形成非晶态固体；以及基于所述混合溶液中形成的5＇-鸟苷酸盐100重量份，向所述混合溶液中添加0.1至5.5重量份的作为晶种的5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体，从而形成5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体，其中，所述混合溶液的温度为25至45℃。所述盐水溶液可以是200至400g/l的盐水溶液。所述5＇-鸟苷酸水溶液可以是50至400g/l的5＇-鸟苷酸水溶液。所述盐水溶液的ph可以是7至10。所述5＇-鸟苷酸水溶液包括通过培养微生物来获得的一种。所述5＇-鸟苷酸水溶液可以包括通过培养微生物来获得的培养物或在其去除细胞的培养上清液，或者从其纯化的5＇-鸟苷酸。所述微生物可以具有5＇-鸟苷酸生产能力。所述添加的晶种的量可以是基于所述5＇-鸟苷酸盐100重量份的0.1至5.5重量份。
22.有益效果
23.根据一方面的通过5＇-鸟苷酸水溶液来制备5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体的方法，可以通过5＇-鸟苷酸水溶液有效地制备5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体。
24.具体地，根据本发明的5＇-鸟苷酸二钠七水合物的制备方法，可以在不添加有机溶剂的情况下获得5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体。根据本发明的制备方法，在由有机溶剂导致的安全性方面更有助于操作者，并且由于不会在最终产品内残留有机溶剂，因此可以防止最终用户产生对有机溶剂有害性的不安另外，由于降低防爆设备投资和设备维护费用，或者降低以高纯度回收使用的有机溶剂时所需的蒸馏塔投资和设备成本以及用于工序操作的效益成本，因此更具有经济性。
附图说明
25.图1是用显微镜拍摄根据实施例1获得的5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体的图。
26.图2是用显微镜拍摄根据比较例2获得的板状5＇-鸟苷酸二钠四水合物晶体的图。
27.图3是用显微镜拍摄根据比较例3使用亲水性有机溶剂甲醇来获得的5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体的图。
具体实施方式
28.下面，通过本发明的实施例进行详细描述。但是，以下实施例仅用于示例性描述，本发明的范围并不限于此。
29.实施例1
30.在本实施例中，在不使用有机溶剂的情况下，自5＇-鸟苷酸二钠水溶液形成5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体并进行分离。
31.在3l烧瓶中，用30分钟将380g/l的5＇-鸟苷酸二钠水溶液0.875l缓慢添加至ph9、温度40℃、300g/l的氯化钠水溶液1l中。结果，混合溶液中形成非晶态固体。另外，所述5＇-鸟苷酸二钠通过自身的微生物发酵来得到含有5＇-鸟苷酸的发酵产物并经纯化来获得。所述300g/l的氯化钠水溶液的ph通过使用2ml的浓度为50(w/w)％的naoh来调节。在所述混合溶液中的氯化钠浓度为160g/l时，所述非晶态固体转化为5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体。
32.将氯化钠水溶液和5＇-鸟苷酸二钠水溶液的混合溶液温度维持在42℃，并基于所述混合溶液中形成的5＇-鸟苷酸二钠重量，将作为晶种的5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体以1
重量％添加至溶液中，且在相同条件下温育。温育后，非晶态固体在一小时内转化为柱状5＇-鸟苷酸二钠七水合物。结果，所述混合溶液呈包括晶体的浆液形式。术语“浆液”是指固状的晶体和液体混合的粘性悬浮液。下面，将包括晶体的所述混合溶液也称作晶体浆液。
33.这表明，在5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶种存在的情况下，可以通过温育氯化钠水溶液和5＇-鸟苷酸水溶液的混合溶液来形成柱状5＇-鸟苷酸二钠七水合物。这表明，在不使用有机溶剂的情况下，可以通过温育混合溶液来形成柱状5＇-鸟苷酸二钠七水合物。这是所属领域技术人员没有预测到的显著效果。
34.然后，温育一小时后两小时内将晶体浆液的温度逐渐自然冷却至25℃或更低。
35.将所述晶体浆液放入篮式离心机h-110f(kokusan co.ltd.，日本)中，并在340xg的转鼓(bowl)g-力下离心二十分钟。离心后去除上清液取晶体浆液。从得到的晶体浆液中得到285g的5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体。
36.所述h-110f离心机内部安装有穿孔篮(perforated basket)，该穿孔篮与外部旋转电源相(external rotation supply)连接。穿孔篮由聚酰胺复丝纤维滤布(polyamide multifilament fiber filter fabric)制成，过滤器的透气性在2mbar为250l/m2/s。在室温下，将过滤的晶体干燥24小时。
37.使用hplc分析了所述分离的5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体的纯度与浓度。具体地，将1.0g干燥的所述5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体和5＇-鸟苷酸二钠七水合物标准晶体(sigma，≥99.0(w/w)％(hplc))溶于1l的三蒸水中，从而分别制备1.0g/l的实施例和标准品溶液。标准品溶液中的5＇-鸟苷酸二钠七水合物通过标准试剂生产厂家的证书来确定标准品的纯度。然后，将标准品内的5＇-鸟苷酸二钠的浓度计算为1.0000g/l
×
[标准产品的纯度]。
[0038]
将5ul的实施例和标准品溶液加载到agilent 1260infinity quaternary lc(agilent technology inc.)系统中的柱上。所述柱为shiseido capcell pak c18 acr(150mm
×
4.6mm，3um)。然后，将乙腈2％(v/v)/磷酸盐缓冲液(ph 2.4)98％(v/v)以1ml/min的流速流入所述柱中，并检测了流出的洗脱液在254nm的吸光度。所述磷酸盐缓冲液包括2g/l磷酸铵、0.2g/l四丁基磷酸铵以及0.82g/l磷酸。此时，温度为35℃。在检测过滤液中的5＇-gmp浓度时也使用了该hplc条件。结果，以下式计算了纯度。
[0039]
纯度＝5＇-gmp含量/所有固体成分的重量x100
[0040]
另外，将5ul的所述实施例和标准品溶液放入cary 100uv-vis(agilent technology inc.)仪器的矩形池中后，检测了在420nm的透视率。
[0041]
结果，在25℃下自然干燥得到的晶体浆液十二小时，从而得到了5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体。所述干燥的晶体的残留水分含量为23.6(w/v)％。所述得到的干燥的5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体重量为261g、收率为78.0％、纯度为95.0％。在上述晶体5(w/v)％水溶液的特定情况下，透射率(t)％为95.0％，ph为7.0至8.5。
[0042]
图1是用显微镜拍摄根据实施例1获得的5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体的图。在图1中，5＇-鸟苷酸二钠的晶体为柱状，证实根据实施例1获得的晶体为5＇-鸟苷酸二钠七水合物。
[0043]
比较例1
[0044]
除添加380g/l的5＇-鸟苷酸二钠1.3l来替代0.875l，以使所述混合溶液中的氯化
钠浓度达到130.4g/l之外，按照与所述实施例相同的过程进行了实验。结果，添加所述晶种后观察了六小时，但为没有观察到所述非晶态固体转化为5＇-鸟苷酸二钠七水合物。在两小时内将混合溶液的温度逐渐冷却至25℃或更低后，所述非晶态固体以原样存在，因而无法通过篮式分离器的离心来进行分离。
[0045]
比较例2
[0046]
利用0.3g的5％naoh，将380g/l的5＇-鸟苷酸二钠水溶液0.875l缓慢添加至ph调节为9、温度40℃、300g/l的氯化钠水溶液1l中后，在氯化钠浓度达到160g/l时，非晶态即无定形晶体转化为板状四水晶体。将盐水溶液和5＇-鸟苷酸二钠水溶液的混合溶液内部温度维持在约52℃，并向混合溶液中添加基于5＇-鸟苷酸二钠重量的1重量％的晶种后，虽然转化在一小时以内结束，但转化的结晶为板状四水晶体而非柱状七水晶体。
[0047]
图2是用显微镜拍摄根据比较例2获得的板状5＇-鸟苷酸二钠四水合物晶体的图。
[0048]
比较例3：使用有机溶剂的晶体
[0049]
将4.4g的na2po4放入200g/l的5＇-鸟苷酸二钠溶液1.5l中完全溶解后，在38℃温度下以120rpm搅拌10至20分钟。将0.2l的甲醇以每分钟3.4ml添加至其中，然后基于溶液内5＇-鸟苷酸二钠的重量，添加1％作为晶种的5＇-鸟苷酸二钠七水合物，待体系完全平行后，重复使用1l的甲醇以每分钟3.4ml并以相同的速度结晶共五小时，然后脱水获得295g的柱状晶体。
[0050]
结果，在25℃下自然干燥得到的晶体十二小时，从而得到5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体。所述干燥的晶体的残留水分含量为23.6(w/v)％。
[0051]
表1示出用于实施例1和比较例3所示方法的甲醇的量以及由此产生的5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体的纯度和其中残留的甲醇含量。在表1中，甲醇的使用量以获得100g的5＇-鸟苷酸二钠七水合物为准。另外，根据实施例1所示的方法检测了5＇-鸟苷酸二钠七水合物的纯度(％)。残留的甲醇含量是指残留在所述晶体5(w/v)％水溶液中的甲醇。
[0052]
【表1】
[0053][0054]
如表1所示，实施例1的晶体可以维持大于或等于95％的纯度，与比较例3相似。
[0055]
另外，比较例3为了获得100g的5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体需要使用270g的有机溶剂甲醇，但实施例1无需使用有机溶剂。
[0056]
图3是用显微镜拍摄根据比较例3使用亲水性有机溶剂甲醇来获得的5＇-鸟苷酸二钠七水合物晶体的图。
[0057]
评价例1.混合溶液中的盐浓度对晶体形成带来的影响
[0058]
在本部分中，除使用400g/l的氯化钠水溶液以替代300g/l的氯化钠水溶液，并添加不同量的5＇-鸟苷酸二钠水溶液，以使混合溶液中的nacl浓度达到120至380g/l之外，按照与所述实施例1相同的过程进行了实验。
[0059]
结果，通过显微镜观察了所述混合溶液中形成的非晶态固体或晶体。其结果示于表2。
[0060]
【表2】
[0061][0062]
如表2所示，当混合溶液中的氯化钠浓度大于或等于160g/l时，非晶态固体形式的5＇-鸟苷酸二钠转化为七水合物。另一方面，当混合溶液中的氯化钠浓度大于360g/l时，获得了尺寸小且与氯化钠混合的晶体，因此难以从晶体浆液中分离出5＇-鸟苷酸二钠。晶体越大越容易从晶体浆液中分离5＇-鸟苷酸二钠晶体。结果，同时考虑到以下的第二部分，证实当混合溶液中的盐浓度为160至360g/l时，5＇-鸟苷酸二钠形成七水合物。
[0063]
评价例2.混合溶液内5＇-鸟苷酸的溶解度
[0064]
确认了在温度40℃和25℃下，将5＇-鸟苷酸水溶液添加至氯化钠浓度不同的氯化钠水溶液时的5＇-鸟苷酸的溶解度。
[0065]
具体地，通过分别在40℃和25℃下，将5＇-鸟苷酸水溶液充分溶解于每种氯化钠水溶液中来制备饱和溶液。结果，制备了以160至360g/l的浓度包括氯化钠的饱和溶液。如表3和表4所示，在混合溶液内包括大于或等于400g/l氯化钠的溶液中沉淀出盐晶体。然后，检测了离心饱和溶液后得到的上清液，即，混合溶液中的5＇-鸟苷酸的浓度(g/l)。
[0066]
表3和表4示出分别在40℃和25℃下的5＇-鸟苷酸二钠七水合物的氯化钠浓度。
[0067]
【表3】
[0068][0069]
【表4】
[0070][0071]
如表3和表4所示，证实5＇-鸟苷酸二钠七水合物在160g/l至360g/l，例如，在160g/l至360g/l的每个氯化钠水溶液中具有低溶解度。另一方面，5＇-鸟苷酸二钠七水合物在小于160g/l的每个氯化钠水溶液中，未能维持柱状而溶解。
[0072]
评价例3.混合溶液的温度对晶体形成带来的影响
[0073]
利用0.3g的5％naoh，将380g/l的5＇-鸟苷酸二钠水溶液0.875l缓慢添加至ph调节为9、浓度为300g/l的氯化钠水溶液1l中。混合溶液中的氯化钠浓度为160g/l、5＇-鸟苷酸二钠的浓度为200g/l，在将混合溶液内部温度调节为下表5所示的温度后，添加基于5＇-鸟苷酸二钠重量的1重量％的晶种，通过显微镜观察了5＇-鸟苷酸钠的非晶态固体是否转化为七水合物晶体。表5示出根据混合溶液温度的晶体。
[0074]
【表5】
[0075]
温度(℃)晶体形式转化时间(分钟)20柱状七水晶体18025柱状七水晶体8030柱状七水晶体6035柱状七水晶体4240柱状七水晶体3045柱状七水晶体2550板状四方晶体30
[0076]
如表5所示，已证实在20℃转化为柱状七水晶体，但转化花费了一定的时间，而当温度大于或等于25℃时，非晶态固体快速转化为七水合物。另一方面，当温度大于45℃时，非晶态固体转化为四水合物。
[0077]
评价例4.添加的晶种的量对晶体形成带来的影响
[0078]
利用0.3g的5％naoh，将浓度为380g/l的5＇-鸟苷酸水溶液0.875l缓慢添加至ph调节为9、浓度为300g/l的氯化钠水溶液1l中。得到的混合溶液中的氯化钠浓度为160g/l，5＇-鸟苷酸的浓度为200g/l，混合溶液的温度为40℃。
[0079]
非晶态固体形成后，添加下表6所示的晶种，并通过显微镜观察了晶体转化速度。表6示出根据添加至混合溶液内晶种量的晶体。
[0080]
【表6】
[0081][0082]
如下表6所示，证实随着添加的晶种的重量增加，5＇-鸟苷酸二钠从非晶态固体转化为柱状七水合物的时间显示出减少的趋势，但在以大于5.0重量份包括时，转化时间不再减少。