一种枯草芽孢杆菌及应用其产纳米硒的方法

1.本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌及应用其产纳米硒的方法。


背景技术：

2.硒是一种动物必需的微量元素，参与机体多种代谢途径，对健康至关重要。研究表明，硒具有抗癌抗氧化、提高免疫力、调节新陈代谢等功能。
3.近年来，纳米硒作为一种新型硒产品引起了广泛关注，其粒径在1~100nm之间，从而使其具有高生物学活性。但是，纳米硒的工业合成往往通过化学法，即向硒酸盐或亚硒酸盐溶液中加入维生素c等还原剂，在额外添加牛血清白蛋白等稳定剂的条件下制备得到。该过程不仅耗费资源，且产物中易掺有化学品残留，造成潜在毒性。
4.以细菌进行纳米硒制备，不受季节环境等因素的制约，同时不需要额外添加还原剂或稳定剂，能有效改善化学法的不足。如zl201710517574.x公开了制备富生物纳米单质硒的方法及应用。
5.但由于细菌产纳米硒的过程首先是在胞内将硒酸盐或亚硒酸盐还原成纳米硒，进一步分泌多糖、蛋白等物质将纳米硒包被并释放至胞外，释放的纳米硒往往黏附在细菌表面，难以单独分离提取。因此，如何提取细菌所产的纳米硒，是目前纳米硒制备过程中的难点。
6.研究表明，纳米硒的生物学活性与其粒径大小密切相关，纳米硒粒径越小则其比表面积越大且生物学活性越强。现有的纳米硒提取技术包括低速离心法、正己烷萃取并离心法等，但均存在一定的局限性。例如低速离心法旨在通过离心去除菌体从而保留上清中的纳米硒，但该方法不能将蛋白、有机硒或多糖完全沉淀，因此上清产物粒径较大，往往达到几百甚至上千纳米；正己烷萃取并离心法旨在通过正己烷萃取将产物中溶于有机相的物质与水相分离，并进一步收集水相并通过离心去除菌体，但同样与低速离心法类似，水相上清产物粒径仍有几百纳米。


技术实现要素：

7.为了解决现有技术的问题，本发明提供一种枯草芽孢杆菌产纳米硒的制备方法及其应用。
8.一种枯草芽孢杆菌，命名为bacillus subtilis sr41，于2021年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101），保藏编号：cgmcc no.23536，富硒发酵后可制备枯草芽孢杆菌及纳米硒复合物，通过超声破碎后可得到枯草芽孢杆菌产纳米硒。
9.一种采用所述的枯草芽孢杆菌产纳米硒的制备方法，包括以下步骤：1）活化的菌接种于含亚硒酸钠的发酵培养基中；2）振荡培养；
3）收集发酵液并超声破碎；4）测定纳米粒径。
10.步骤1）所述的发酵培养基：蔗糖 30g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母提取物15g/l，磷酸二氢钾1g/l，氯化钠5g/l，无水硫酸镁1.5g/l；初始ph=7.0。
11.步骤1）所述的培养基中亚硒酸钠终浓度为2mm。
12.步骤2）中培养温度为37℃，转速为200rpm，培养时间为24小时。
13.步骤3）所述发酵液为枯草芽孢杆菌及纳米硒复合物，可进一步通过超声破碎提取枯草芽孢杆菌产纳米硒，包括以下步骤：将发酵液置于超声破碎仪，100w，60hz，5s on/5s off，冰上破碎20分钟。
14.步骤4）所述的纳米粒径测定方法，是利用malvern zetasizer nano zs90纳米粒度仪及其应用程序进行测定，结果表明枯草芽孢杆菌产纳米硒平均粒径为65.07
±
2.39nm。
15.所述的枯草芽孢杆菌产纳米硒具有抗氧化活性，可缓解过氧化氢诱导的细胞氧化损伤。
16.本发明的有益效果是：所述的枯草芽孢杆菌bacillus subtilis sr41，具有高效还原亚硒酸钠并生成纳米硒的能力。本发明首次公开了仅需超声破碎即可提取枯草芽孢杆菌产纳米硒的制备方法，所提取的纳米硒平均粒径为65.07
±
2.39nm。同时，所述的枯草芽孢杆菌产纳米硒具有缓解细胞氧化应激的功能，提示其具有较好的抗氧化能力。
附图说明
17.图1是枯草芽孢杆菌b. subtilis sr41富硒发酵照片。
18.图2是枯草芽孢杆菌b. subtilis sr41及纳米硒复合物的场扫描电镜图片。
19.图3是不同方式提取枯草芽孢杆菌b. subtilis sr41产纳米硒的粒径对比分析图。
20.图4是枯草芽孢杆菌b. subtilis sr41产纳米硒的透射电镜图片。
21.图5是枯草芽孢杆菌b. subtilis sr41产纳米硒对氧化损伤细胞存活率的影响结果图；其中*p＜0.05代表与空白对照组显著，# p＜0.05代表与过氧化氢组显著。
具体实施方式
22.实施例1枯草芽孢杆菌b. subtilis sr41富硒发酵1. 培养基配制lb平板培养基：nacl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂25g，去离子水1l，121℃高温高压灭菌21min。
23.种子培养基：葡萄糖 10g，胰蛋白胨5g，酵母提取物5g，nacl 5g，去离子水1l，115℃高温高压灭菌30min。
24.发酵培养基：蔗糖 30g，胰蛋白胨10g，酵母提取物15g，k2hpo
4 1g，nacl 5g，mgso
4 1.5g，去离子水1l，ph为7.0，115℃高温高压灭菌30min。
25.2. 菌种活化
将冻存于-80℃的枯草芽孢杆菌b. subtilis sr41菌种常温解冻，取一环在lb平板培养基划线，于37℃培养12h。从平板培养基挑取单菌落接种于种子培养基中，于37℃，200rpm培养12h，即为b. subtilis sr41种子液。
26.3. 发酵与产物收集将b. subtilis sr41种子液以3%接种量接种至含2mm亚硒酸钠的发酵培养基中，于37℃，200 rpm培养24h，结果如图1所示，所得发酵液呈深红色，即为枯草芽孢杆菌及纳米硒复合物。
27.4. 产物硒含量检测参照国标gb 1903.9-2015对发酵液中亚硒酸钠残留量进行检测，结果表明：亚硒酸钠未检出，即b. subtilis sr41已将2mm亚硒酸钠完全还原。
28.参照国标gb/t 13883-2008对枯草芽孢杆菌及纳米硒复合物的总硒含量进行测定，结果表明：总硒含量为4400-5000mg/kg。
29.实施例2枯草芽孢杆菌及纳米硒复合物性状表征取实施例1中的枯草芽孢杆菌及纳米硒复合物，以2.5%戊二醛固定12小时。依次通过pbs清洗，1%锇酸固定，酒精梯度脱水，乙酸异戊酯处理，临界点干燥并镀膜后，在场发射扫描电镜下观察。
30.结果如图2所示，枯草芽孢杆菌b. subtilis sr41将亚硒酸钠还原生成纳米硒，并将其释放至胞外，形成枯草芽孢杆菌及纳米硒复合物，其中纳米硒呈球状，即为图中箭头所指示。
31.实施例3 复合物中纳米硒提取方式及粒径对比取实施例1中的枯草芽孢杆菌及纳米硒复合物，分别采用超声破碎、低速离心、正己烷萃取并离心等方式，旨在将枯草芽孢杆菌与纳米硒分离从而提取纳米硒，并进行粒径检测。
32.超声破碎法：取发酵液于离心管，置于超声破碎仪，超声5s on/5s off，60hz，功率100w，冰浴超声20min，并用于粒径检测；低速离心法：取发酵液于离心管，置于离心机，3000
×
g，离心5min，弃上清，沉淀经pbs重悬，并用于粒径检测；正己烷萃取并离心法：取发酵液于离心管，加入1/2体积正己烷，充分震荡混匀，取下层水相，置于离心机，3000
×
g，离心5min，弃上清，沉淀经pbs重悬，并用于粒径检测。
33.粒径检测方法为，分别取三种方法提取得到的产物各1 ml，置于malvern zetasizer nano zs90纳米粒度仪，并利用对应软件程序进行测定，可得产物粒径分布范围及平均粒径。
34.结果如图3所示，枯草芽孢杆菌及纳米硒复合物，即原液粒径范围较大，主要在800-1100nm之间，平均粒径为535.1
±
13.3nm；采用正己烷萃取并离心法后产物粒径范围在100-600nm之间，平均粒径为256.7
±
4.9nm；采用低速离心法后产物粒径范围在200-600nm之间，平均粒径为405.5
±
6.1nm；采用超声破碎法获得产物的粒度主要分布于30-200nm之间，平均粒径为65.07
±
2.39nm。因此，确定采用超声破碎法可将枯草芽孢杆菌菌体破碎并分离得到纳米硒，远低于低速离心法和正己烷萃取并离心法所得产物的粒径。经涂板计数，确定超声破碎法搜所得产物不含枯草芽孢杆菌，即为枯草芽孢杆菌产纳米硒。
35.实施例4 枯草芽孢杆菌产纳米硒性状表征取实施例3中的枯草芽孢杆菌产纳米硒，以2.5%戊二醛固定12小时后。依次通过pbs清洗，预包埋处理，1%锇酸固定，酒精梯度脱水，包埋剂处理，70℃加热，切片染色后，在透射电镜下观察。
36.结果如图4所示，纳米硒呈单分散均匀球状，粒径分别在30-200nm，与粒径检测结果相一致。且产物中仅含纳米硒，不含有枯草芽孢杆菌，证明本发明公开的方法可将纳米硒与枯草芽孢杆菌分离。
37.本发明通过纳米粒径分析、场扫描电镜及透射电镜观察，确定了枯草芽孢杆菌b. subtilis sr41将亚硒酸钠还原为纳米硒，并分泌至胞外。并首次发现可通过超声破碎法有效裂解菌体，从而提取纳米硒，平均粒径为65.07
±
2.39nm。
38.实施例5枯草芽孢杆菌产纳米硒对氧化损伤细胞存活率的影响取实施例3中的枯草芽孢杆菌产纳米硒，紫外照射灭菌，测定硒含量。并用 dmem/f12 培养基稀释至梯度浓度（10、20、40μm），分别预孵育ipec-j2细胞4小时，另外设置空白对照组，即加入等体积dmem/f12 培养基，不含纳米硒。随后分别加入用dmem/f12 培养基配置的过氧化氢（浓度为300μm）或dmem/f12 培养基，孵育12小时后加入cck8试剂，再孵育2小时后于od450测定吸光度。
39.分组及结果如图5所示，300μm过氧化氢显著降低了ipec-j2细胞存活率，提示氧化损伤模型建立成功；三种浓度的纳米硒预孵育可显著缓解过氧化氢诱导的细胞存活率下降，其中20μm纳米硒缓解效果最佳，提示其具有较好的抗氧化功能；此外，三种浓度的纳米硒预孵育均不影响细胞正常存活。
40.上述描述中的实施方案可以进一步组合或者替换，且实施方案仅仅是对本发明的优选实施例进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变化和改进，均属于本发明的保护范围。本发明的保护范围由所附权利要求及其任何等同物给出。