乙酸铅染毒对TK6细胞DNA双链断裂损伤及修复的试验方法

乙酸铅染毒对tk6细胞dna双链断裂损伤及修复的试验方法
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种乙酸铅染毒对tk6细胞dna双链断裂损伤及修复的试验方法。


背景技术：

2.目前，铅属高毒物品，是最常见的环境污染物和职业病危害因素，铅进入人体内会对全身多个系统产生毒性作用。国际癌症研究机构将铅的无机化合物划为“对人类很可能是致癌物”(2a类)，将铅划为“对人类可能是致癌物”(2b类)。近年来，铅及其化合物对细胞的遗传损伤广受关注，但铅诱导dna损伤的修复机制还不明确，而修复机制的阐明对于其危害，包括致癌、致畸和致突变危害的预防和控制至关重要。
3.人淋巴母细胞(tk6细胞)具有良好的分化能力、稳定的基因组和p53的正常表达，广泛应用于人类遗传毒性的体外研究。
4.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术没有有关乙酸铅诱导dna双链断裂蛋白标志物γ-h2ax表达及修复蛋白表达的报道。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种乙酸铅染毒对tk6细胞dna双链断裂损伤及修复的试验方法。
6.本发明是这样实现的，一种乙酸铅染毒对tk6细胞dna双链断裂损伤及修复的试验方法，所述乙酸铅染毒对tk6细胞dna双链断裂损伤及修复的试验方法为120μmol/l。
7.本发明的另一目的在于提供一种确定所述乙酸铅染毒对tk6细胞dna双链断裂损伤及修复的试验方法的乙酸铅染毒对tk6细胞dna双链断裂损伤及修复的试验方法，所述乙酸铅染毒对tk6细胞dna双链断裂损伤及修复的试验方法包括：
8.利用乙酸铅染毒tk6细胞，构建铅诱导tk6细胞遗传损伤模型，利用免疫荧光试验、western-blot检测乙酸铅染毒后γ-h2ax蛋白焦点形成，确定诱导tk6细胞dna双链断裂蛋白标志物γ-h2ax表达的乙酸铅最低浓度。
9.进一步，所述乙酸铅染毒对tk6细胞dna双链断裂损伤及修复的试验方法包括以下步骤：
10.步骤一，获取tk6细胞，并将获取tk6细胞接种于6孔板中，同时利用不同浓度的乙酸铅对tk6细胞染毒24小时，冰上孵育10min，收集细胞进行检测；
11.步骤二，利用免疫荧光技术确定乙酸铅诱导tk6细胞dna双链断裂的状态；并利用western blot方法检测γ-h2ax蛋白表达的浓度效应关系；
12.步骤三，基于确定的乙酸铅诱导tk6细胞dna双链断裂的状态以及γ-h2ax蛋白表达的浓度效应关系确定乙酸铅染毒对tk6细胞dna双链断裂损伤及修复的试验方法。
13.进一步，所述利用不同浓度的乙酸铅对tk6细胞染毒24小时包括：
14.分别利用120μmol/l、240μmol/l以及480μmol/l的乙酸铅对tk6细胞染毒24小时。
15.进一步，所述利用免疫荧光技术确定乙酸铅诱导tk6细胞dna双链断裂的状态包括：
16.首先，将免疫荧光固定液固定好的细胞置于小离心管中，经离心和pbs溶液清洗，滴加0.1％tritonx-100与细胞混匀室温孵育，清除0.1％tritonx-100；
17.其次，加山羊血清与细胞混匀室温孵育，滴加一抗混匀4℃过夜孵育，滴加稀释后的荧光二抗，与细胞混匀，室温孵育60min；
18.然后，清除二抗，将玻片浸泡在pbs中1次5min；将稀释后的dapi加入细胞5min复染核；清除dapi，将离心后的细胞加入200μl胎牛血清；
19.最后，将细胞吹打均匀涂在干净的载玻片上，滴加抗荧光淬灭剂封片，-20℃稍冷10min固定细胞；于荧光显微镜下放大400倍观察染色效果。
20.进一步，所述荧光二抗的稀释比例为1:200；所述dapi的稀释比例为1:1000；
21.进一步，所述利用western blot方法检测γ-h2ax蛋白表达的浓度效应关系包括：
22.抽提样本蛋白质，酶标仪检测蛋白质的浓度；依次进行sds-page、转印至pvdf膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗、ecl底物发光、图像保存、用凝胶图象处理系统分析目标条带的光密度值。
23.进一步，所述乙酸铅染毒对tk6细胞dna双链断裂损伤及修复的试验方法还包括：
24.基于建立的铅诱导tk6细胞遗传损伤模型，应用免疫荧光试验、流式细胞术检测乙酸铅染毒后细胞周期变化、细胞凋亡、rad51蛋白、brca1蛋白、53bp1蛋白的表达水平，确定乙酸铅染毒诱导tk6细胞dna损伤修复。
25.进一步，所述应用免疫荧光试验、流式细胞术检测乙酸铅染毒后细胞周期变化、细胞凋亡、rad51蛋白、brca1蛋白、53bp1蛋白的表达水平包括：
26.(1)将预热的终浓度为10μm的edu染色液，加至各组细胞中，在37℃、5％co2细胞培养箱中培养2h；弃培养基，加入4％多聚甲醛室温下固定15min，用含3％bsa的pbs洗涤细胞2次；去除洗涤液，加入0.1ml 0.5％triton x-100到每个孔中室温孵育20min；洗涤后加入click-it反应液室温孵育30min；洗涤后加入按1:2000稀释的hoechst33342染色液进行染色；荧光倒置显微镜拍照，同一视野下，分别用绿光和蓝光两种激发光激发细胞荧光；
27.(2)将各组细胞收集至离心管内，310g离心5min后收集细胞；pbs洗涤细胞，加入预冷70％乙醇4℃固定过夜；每管细胞样品中加入100μl rnase a，37℃水浴30min；每管加入500μl的propidium iodide染色液，4℃避光孵育30min；进行流式检测分析；
28.(3)将各组细胞收集至离心管内，310g离心5min后收集细胞；小心吸除上清，用pbs洗涤细胞2次，并进行细胞计数，收集105个细胞，加入500μl的binding buffer重悬细胞；加入5μl的annexinv-fitc混匀后，加入10μl的propidium iodide，混匀；室温避光孵育15min；进行流式检测。
29.结合上述的技术方案和解决的技术问题，从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
30.第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
31.本发明使用western blot和免疫荧光两种方法检测不同浓度乙酸铅染毒后tk6细
胞γ-h2ax焦点形成情况，明确了随着铅染毒浓度增高，铅诱导tk6细胞γ-h2ax的表达升高，呈现出明显的剂量依赖效应，证实乙酸铅染毒可导致tk6细胞的遗传损伤。
32.本发明采用edu法检测细胞增殖、采用pi染色检测细胞周期、采用annexin v-fitc/pi双染色法检测细胞凋亡变化。证实随着乙酸铅染毒浓度增高，乙酸铅诱导tk6细胞增殖、阻滞细胞周期和促进细胞凋亡。
33.本发明提取细胞核蛋白，采用western blot检测了hr修复通路关键蛋白rad51、brca1和nhej修复通路53bp1的表达变化。证实乙酸铅染毒诱导tk6细胞的hr修复通路和激活nhej修复通路，修复过程倾向nhej修复。
34.第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
35.本发明明确乙酸铅诱导tk6细胞dna双链断裂后，存在hr修复通路诱导和nhej修复通路异常活化，修复过程有nhej的倾向性，造成错误修复效率的提高，引起遗传损伤效应。
36.本发明能够应用于预防dna损伤和促进dna修复中。
37.第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
38.本发明的技术方案阐述了铅致细胞dna双链断裂损伤修复机制，乙酸铅染毒诱导tk6细胞dna双链断裂后，存在同源重组(hr)修复通路诱导和非同源末端连接(nhej)修复通路异常活化，修复过程有nhej的倾向性，造成错误修复效率的提高，从而引起遗传损伤效应。为深入了解铅的遗传毒性和致癌作用机制提供科学依据。
39.毒物遗传毒性危害不仅涉及接触者本身的健康，而且涉及到下一代子女的健康问题，有关工业(环境)化学物遗传毒性的影响问题一直以来为国内外科学家高度重视。重金属铅的一般毒性如神经毒性、血液毒性、肾毒性、免疫毒性等的研究较为深入，但对其遗传毒性及其分子机制的研究有限且结果存在分歧。铅诱导细胞dna双链断裂损伤的修复机制目前还不明确，探究dna损伤修复机制对于维持细胞基因稳定性和揭示疾病的进展具有重要意义，rad51和brca1是调控同源重组修复dna双链断裂的核心蛋白，53bp1是调控nhej修复通路重要蛋白，本发明通过研究rad51、brca1和53bp1在铅致tk6细胞dna双链断裂损伤中的应答功能及分子机制，对金属毒物铅遗传毒性的研究在理论上有所突破，而且对于深入了解铅的遗传毒性机制、预防和减少铅的致癌、致畸和致突变危害具有重要意义。
附图说明
40.图1是本发明实施例提供的乙酸铅染毒对tk6细胞dna双链断裂损伤及修复的试验方法流程图；
41.图2是本发明实施例提供的免疫荧光染色检测tk6细胞γ-h2ax焦点形成示意图；
42.图3是本发明实施例提供的western blot检测tk6细胞γ-h2ax蛋白表达示意图；
43.图4是本发明实施例提供的edu法检测tk6细胞的典型荧光图；
44.图5是本发明实施例提供的pi染色及流式细胞仪检测tk6细胞的周期变化示意图；
45.图6是本发明实施例提供的annexin v-fitc/pi双染细胞及流式细胞分析技术检测tk6细胞的凋亡示意图；
46.图7是本发明实施例提供的western blot检测tk6细胞rad51、brca1、53bp1蛋白表达示意图。
具体实施方式
47.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
48.一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
49.本发明实施例提供的乙酸铅染毒对tk6细胞dna双链断裂损伤及修复的试验方法包括：
50.利用乙酸铅染毒浓度tk6细胞，构建铅诱导tk6细胞遗传损伤模型，利用免疫荧光试验、western-blot检测乙酸铅染毒后γ-h2ax蛋白焦点形成，确定诱导tk6细胞dna双链断裂蛋白标志物γ-h2ax表达的乙酸铅最低浓度。
51.如图1所示，本发明实施例提供的乙酸铅染毒对tk6细胞dna双链断裂损伤及修复的试验方法包括以下步骤：
52.s101，获取tk6细胞，并将获取tk6细胞接种于6孔板中，同时利用不同浓度的乙酸铅对tk6细胞染毒24小时，冰上孵育10min，收集细胞进行检测；
53.s102，利用免疫荧光技术确定乙酸铅诱导tk6细胞dna双链断裂的状态；并利用western blot方法检测γ-h2ax蛋白表达的浓度效应关系；
54.s103，基于确定的乙酸铅诱导tk6细胞dna双链断裂的状态以及γ-h2ax蛋白表达的浓度效应关系确定乙酸铅染毒对tk6细胞dna双链断裂损伤及修复的试验方法。
55.本发明实施例提供的利用不同浓度的乙酸铅对tk6细胞染毒24小时包括：
56.分别利用120μmol/l、240μmol/l以及480μmol/l的乙酸铅对tk6细胞染毒24小时。
57.本发明实施例提供的利用免疫荧光技术确定乙酸铅诱导tk6细胞dna双链断裂的状态包括：
58.首先，将免疫荧光固定液固定好的细胞置于小离心管中，经离心和pbs溶液清洗，滴加0.1％tritonx-100与细胞混匀室温孵育，清除0.1％tritonx-100；
59.其次，加山羊血清与细胞混匀室温孵育，滴加一抗混匀4℃过夜孵育，滴加稀释后的荧光二抗，与细胞混匀，室温孵育60min；
60.然后，清除二抗，将玻片浸泡在pbs中1次5min；将稀释后的dapi加入细胞5min复染核；清除dapi，将离心后的细胞加入200μl胎牛血清；
61.最后，将细胞吹打均匀涂在干净的载玻片上，滴加抗荧光淬灭剂封片，-20℃稍冷10min固定细胞；于荧光显微镜下放大400倍观察染色效果。
62.本发明实施例提供的荧光二抗的稀释比例为1:200；所述dapi的稀释比例为1:1000；
63.本发明实施例提供的利用western blot方法检测γ-h2ax蛋白表达的浓度效应关系包括：
64.抽提样本蛋白质，酶标仪检测蛋白质的浓度；依次进行sds-page、转印至pvdf膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗、ecl底物发光、图像保存、用凝胶图象处理系统分析目标条带的光密度值。
65.本发明实施例提供的乙酸铅染毒对tk6细胞dna双链断裂损伤及修复的试验方法
还包括：
66.基于建立的铅诱导tk6细胞遗传损伤模型，应用免疫荧光试验、流式细胞术检测乙酸铅染毒后细胞周期变化、细胞凋亡、rad51蛋白、brca1蛋白、53bp1蛋白的表达水平，确定乙酸铅染毒诱导tk6细胞dna损伤修复。
67.本发明实施例提供的应用免疫荧光试验、流式细胞术检测乙酸铅染毒后细胞周期变化、细胞凋亡、rad51蛋白、brca1蛋白、53bp1蛋白的表达水平包括：
68.(1)将预热的终浓度为10μm的edu染色液，加至各组细胞中，在37℃、5％co2细胞培养箱中培养2h；弃培养基，加入4％多聚甲醛室温下固定15min，用含3％bsa的pbs洗涤细胞2次；去除洗涤液，加入0.1ml 0.5％triton x-100到每个孔中室温孵育20min；洗涤后加入click-it反应液室温孵育30min；洗涤后加入按1:2000稀释的hoechst33342染色液进行染色；荧光倒置显微镜拍照，同一视野下，分别用绿光和蓝光两种激发光激发细胞荧光；
69.(2)将各组细胞收集至离心管内，310g离心5min后收集细胞；pbs洗涤细胞，加入预冷70％乙醇4℃固定过夜；每管细胞样品中加入100μl rnase a，37℃水浴30min；每管加入500μl的propidium iodide染色液，4℃避光孵育30min；进行流式检测分析；
70.(3)将各组细胞收集至离心管内，310g离心5min后收集细胞；小心吸除上清，用pbs洗涤细胞2次，并进行细胞计数，收集105个细胞，加入500μl的binding buffer重悬细胞；加入5μl的annexinv-fitc混匀后，加入10μl的propidium iodide，混匀；室温避光孵育15min；进行流式检测。
71.二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用的应用实施例。
72.人淋巴母细胞(tk6细胞)具有良好的分化能力、稳定的基因组和p53的正常表达，广泛应用于人类遗传毒性的体外研究，其实验结果可以较好代表人体细胞对毒物的毒性反应。
73.铅中毒是最常见的职业危害之一，我国铅和精炼铅产量居世界第三位，铅的冶炼、熔化、加工、铸造等企业众多从业人员数量庞大，由于部分企业生产工艺落后防护设施缺乏，我国接铅工人屡屡发生铅中毒危害事件。目前，我国对职业接触铅作业人员的职业健康检查项目是以《职业健康监护技术规范》(gbz188)为依据，该《规范》没有列出关于遗传物质损伤的检查项目，在实际工作中无法发现铅对遗传物质的损伤。
74.应用本发明实施例方法，可以对铅作业工人外周血淋巴细胞开展dna双链断裂蛋白标志物γ-h2ax表达及修复蛋白表达，及时发现铅对作业工人的遗传损伤情况。
75.三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
76.1材料和方法
77.1.1实验试剂和仪器
78.乙酸铅粉剂(美国sigma公司)、rpmi 1640培养基(美国gibco公司)、马血清(美国gibco公司)、edu成像检测试剂盒(中国凯基生物)、γ-h2ax(英国abcam公司)、dapi(中国阿拉丁)、细胞凋亡检测试剂盒(中国万类生物公司)、细胞周期检测试剂盒(中国万类生物公司)、rad51抗体(中国万类生物公司)、brca1抗体(中国万类生物公司)、53bp1抗体(中国
abclonal公司)、全蛋白提取试剂盒(中国万类生物公司)、内参抗体β-actin(中国万类生物公司)；hf-90型co2培养箱(上海力申公司)、ix53倒置相差显微镜(日本olympus公司)、dycz-24dn双垂直蛋白电泳仪(北京六一公司)、nano 2000紫外分光光度计(美国thermo公司)、wd-9413b型凝胶成像系统(北京六一公司)、elx-800酶标仪(美国biotek公司)、novocyte流式细胞仪(美国acea公司)。
79.1.2细胞培养
80.tk6细胞由福建省疾病预防控制中心郑奎成教授提供。按乙酸铅染毒浓度将实验分组为0μmol/l(阴性对照组)、120μmol/l(低剂量组)、240μmol/l(中剂量组)、480μmol/l(高剂量组)，tk6细胞接种于6孔板中，乙酸铅避光染毒24h，另设阳性对照组：加入100μm h2o2，冰上孵育10min，染毒结束后收集细胞进行检测。
81.1.3γ-h2ax表达
82.将免疫荧光固定液固定好的细胞置于小离心管中，经离心和pbs溶液清洗，滴加0.1％tritonx-100与细胞混匀室温孵育，清除0.1％tritonx-100，加山羊血清与细胞混匀室温孵育，滴加一抗混匀4℃过夜孵育，滴加荧光二抗，稀释比例为1:200(以下操作注意避光)，与细胞混匀，室温孵育60min。清除二抗，将玻片浸泡在pbs中1次5min。加dapi，1:1000稀释加入细胞5min复染核。清除dapi，将离心后的细胞加入200μl胎牛血清，将细胞吹打均匀涂在干净的载玻片上，滴加抗荧光淬灭剂封片，-20℃稍冷10min固定细胞。于荧光显微镜下放大400倍观察染色效果。
83.1.4细胞增殖
84.将预热的终浓度为10μm的edu染色液，加至各组细胞中，在37℃、5％co2细胞培养箱中培养2h。弃培养基，加入4％多聚甲醛室温下固定15min，用含3％bsa的pbs洗涤细胞2次。去除洗涤液，加入0.1ml 0.5％triton x-100到每个孔中室温孵育20min。洗涤后加入click-it反应液室温孵育30min。洗涤后加入hoechst33342染色液(1:2000稀释)染色。荧光倒置显微镜拍照，同一视野下，分别用绿光和蓝光两种激发光激发细胞荧光。
85.1.5细胞周期
86.将各组细胞收集至离心管内，310g离心5min后收集细胞。pbs洗涤细胞，加入预冷70％乙醇4℃固定过夜。每管细胞样品中加入100μl rnase a，37℃水浴30min。每管加入500μl的propidium iodide染色液，4℃避光孵育30min。随即进行流式检测分析。
87.1.6细胞凋亡
88.将各组细胞收集至离心管内，310g离心5min后收集细胞。小心吸除上清，用pbs洗涤细胞2次，并进行细胞计数，收集105个细胞，加入500μl的binding buffer重悬细胞；加入5μl的annexinv-fitc混匀后，加入10μl的propidium iodide，混匀。室温避光孵育15min。随即进行流式检测。
89.1.7westernblot检测
90.抽提样本蛋白质，酶标仪检测蛋白质的浓度。依次进行sds-page、转印至pvdf膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗、ecl底物发光、图像保存、用凝胶图象处理系统(gel-pro-analyzer软件)分析目标条带的光密度值。
91.1.8统计学方法
92.采用spss19.0软件进行统计分析，连续性数据的描述采用均数
±
标准差(x
±
s)表
示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用dunnett-t法进行分析。检验水准α＝0.05。
93.2结果
94.2.1乙酸铅对tk6细胞dna双链断裂蛋白γ-h2ax表达的影响
95.免疫荧光技术观察乙酸铅诱导tk6细胞dna双链断裂的情况，在图2，阳性对照组显著诱导γ-h2ax焦点形成，红色荧光非常明显，而阴性对照组未见明显的红色荧光，表明该方法可行。与对照组比较，随乙酸铅处理浓度的升高，γ-h2ax的红色荧光明显增多，细胞γ-h2ax阳性率显著升高，差异均具有统计学意义(f＝138.34，p＜0.01)。(见图2、表1)。
96.western blot方法检测γ-h2ax蛋白表达的浓度效应关系，结果显示，随乙酸铅处理浓度的升高，γ-h2ax蛋白表达也升高，差异均具有统计学意义(f＝289.89，p＜0.01)。(见图3、表1)。
97.2.2乙酸铅对人淋巴母细胞增殖的影响
98.不同浓度乙酸铅(0、120、240、480μm)处理tk6细胞24h后，采用edu法标记新合成的dna，荧光显微镜下检测细胞增殖。含有新合成dna的细胞被hoechest和edu双染成绿色，其余细胞被hoechest染成蓝色。结果显示，随着乙酸铅浓度的增加，tk6细胞增殖率呈显著降低，差异具有统计学意义(f＝43.04，p＜0.01)。(见图4、表1)。
99.2.3乙酸铅对人淋巴母细胞周期分布的影响
100.采用pi染色及流式细胞仪分析细胞周期变化。不同浓度乙酸铅(0、120、240、480μm)处理tk6细胞24h后，各个周期的细胞比例发生显著变化。图5和表1结果显示，与对照组相比，g1期的细胞比例随着乙酸铅浓度的增加出现升高趋势(f＝4.19，p＜0.05)，s期的细胞比例随着乙酸铅浓度的增加出现降低趋势(f＝81.94，p＜0.01)，g2期的细胞比例无明显变化(f＝1.73，p＞0.05)。
101.2.4乙酸铅对人淋巴母细胞凋亡的影响
102.为进一步分析乙酸铅诱导tk6细胞发生周期阻滞后，继而是否发生细胞凋亡，本发明采用了annexin v-fitc/pi双染细胞及流式细胞分析技术，检测不同浓度乙酸铅(0、120、240、480μm)处理tk6细胞24h后的细胞凋亡发生情况。结果显示，随着乙酸铅浓度的增加，细胞凋亡率呈升高趋势，差异具有统计学意义(f＝77.44，p＜0.01)。(见图6、表1)。
103.表1tk6细胞γ-h2ax阳性率、γ-h2ax蛋白、细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的变化(n＝3)
[0104][0105]
[注]与乙酸铅浓度为0μmol/l组比较，ap＜0.01，bp＜0.05
[0106]
2.5乙酸铅对dna双链断裂损伤修复蛋白rad51、brca1、53bp1表达的影响
[0107]
图7和表2结果显示，乙酸铅染毒tk6细胞24h后，随着乙酸铅剂量的增加，与对照组比较，hr修复通路蛋白rad51的表达出现先升高后降低，总体维持在一个高表达的水平，差异有统计学意义(f＝263.16，p＜0.01)，hr修复通路蛋白brca1的表达出现了显著降低，差异有统计学意义(f＝69.76，p＜0.01)，nhej修复通路蛋白53bp1的表达出现显著升高，差异有统计学意义(f＝86.17，p＜0.01)。
[0108]
表2 tk6细胞rad51、brca1、53bp1的表达变化(n＝3)
[0109][0110]
[注]与乙酸铅浓度为0μmol/l组比较，ap＜0.01，bp＜0.05
[0111]
3结果
[0112]
γ-h2ax蛋白是反映dna双链断裂损伤的标志物。本发明使用western blot和免疫
荧光两种方法检测不同浓度乙酸铅染毒后tk6细胞γ-h2ax焦点形成情况，发现随着铅染毒浓度增高，铅诱导tk6细胞γ-h2ax的表达升高，呈现出明显的剂量依赖效应，证实乙酸铅染毒可导致tk6细胞的遗传损伤。细胞发生遗传损伤后，细胞为保护其正常的生理功能和稳定的遗传性状会启动dna损伤反应，即细胞应对dna损伤压力所产生的反应，如发生细胞周期阻滞、dna修复或细胞凋亡等。本发明的实验结果显示，乙酸铅诱导tk6细胞周期阻滞，随着乙酸铅染毒浓度增高，乙酸铅诱导tk6细胞由g1期向s期和g2的进展，促进细胞分裂停滞在g1期，随着乙酸铅染毒浓度增高，乙酸铅诱导tk6细胞增殖能力，降低细胞dna新合成率，细胞凋亡明显上升。
[0113]
当dna受到损伤时，细胞会启动多种复杂而精细的的信号通路来进行修复。真核细胞dna双链断裂主要通过同源重组(hr)和非同源末端连接(nhej)两种方式进行修复，相关通路的蛋白被招募到损伤位点发挥不同的修复功能。本发明提取细胞核蛋白，采用western blot检测了hr修复通路关键蛋白rad51、brca1和nhej修复通路53bp1的表达变化。本发明的研究结果显示，乙酸铅处理24h后，tk6细胞的rad51表达随着乙酸铅浓度的增加呈先升高后降低，而brca1的表达呈显著降低，提示低浓度铅染毒能够快速诱导tk6细胞rad51蛋白高表达以对抗细胞遗传损伤，低浓度铅染毒即可诱导brca1的表达，随着铅染毒浓度的升高，rad51蛋白表达受诱导，brca1蛋白表达进一步受诱导，表明tk6细胞遗传损伤和hr修复通路的保护逐渐失衡，细胞遗传损害进一步加重。乙酸铅处理24h后，随着乙酸铅剂量的增加，tk6细胞nhej修复通路的关键蛋白53bp1的表达出现显著升高，提示乙酸铅可能导致tk6细胞nhej修复通路的激活，促进tk6细胞的nhej修复效率。hr修复主要发生在细胞周期的s期或g2期，nhej修复可以发生在整个细胞周期内。本发明显示随着乙酸铅染毒浓度增高，tk6细胞周期阻滞，细胞分裂停滞在g1期，提示dna双链断裂损伤的修复主要是nhej修复。hr修复是以未受损姐妹染色单体或同源染色体为模板，对损伤的dna分子进行准确修复，nhej修复是真核细胞在不依赖同源性dna的情况下，将两个染色体的dna断裂末端直接相互连接的修复，是一种快速高效和易错的修复机制。hr修复和nhej修复共同维持基因组的完整性，但也存在着竞争诱导，hr通路的诱导和/或nhej通路的激活将使dna双链断裂倾向于易错修复途径，导致细胞遗传损伤。
[0114]
综上所述，本发明发现乙酸铅诱导tk6细胞dna双链断裂后，可能存在hr修复通路诱导和nhej修复通路异常活化，修复过程有nhej的倾向性，造成错误修复效率的提高，从而引起遗传损伤效应。
[0115]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。