功能性肺血管床的再生的制作方法

功能性肺血管床的再生
1.本技术是中国专利申请201680066181.5的分案申请，原申请201680066181.5的申请日为2016年09月09日，其名称为“功能性肺血管床的再生”。
技术领域
2.本披露涉及功能性肺血管床的再生。


背景技术：

3.对于患有末期肺病的患者，肺移植是一种有效的治疗选择。然而，供体数量并不能满足日益增长的需求，而慢性免疫抑制和排斥反应的影响限制了长期结果。肺移植的典型等待时间可以为两年或更长时间，导致等待名单上的人的死亡率为30％。


技术实现要素：

4.本披露至少部分是基于以下设备(例如，生物反应器)和方法的开发，这些设备和方法能够通过递送细胞并用内皮和血管周细胞重新填充无细胞肺支架的血管隔室来再生功能性肺血管床并使用多阶段培养程序使该肺血管床成熟。实现方式可以包括以下特征中的一个或多个。
5.在第一方面，本文提供了用于血管再生的方法，这些方法包括将内皮细胞递送至肺支架；将血管周细胞递送至该肺支架；并且向该支架提供多阶段培养程序，该多阶段培养程序包括：第一阶段，该第一阶段包括递送具有40-100ng/ml促血管生成因子的血管生成培养基；以及第二阶段，该第二阶段包括递送具有0.5％-2％血清和1ng/ml-20ng/ml血管生成因子的稳定化培养基。
6.在一些实施例中，这些促血管生成因子包括重组人vegf、bfgf、ang1、egf和pdgf中的至少一种或多种，例如，两种、三种、四种或全部五种。
7.在一些实施例中，该稳定化培养基包括毛喉素和/或氢化可的松中的至少一种。
8.在一些实施例中，这些方法包括将该肺支架维持在围绕该肺支架的生物反应器中，该生物反应器包括气管管线、动脉管线和静脉管线。在一些实施例中，该肺支架包括气道和脉管系统，并且该方法包括将该气道连接至该气管管线；将该肺支架连接至该动脉管线和该静脉管线；并且经该动脉管线和该静脉管线对该肺支架接种细胞。
9.本文还提供了用于血管再生的方法，这些方法可以包括将huvec和血管周支持性hmsc递送至肺支架；在第一阶段期间将血管生成培养基递送至该肺支架；并在第二阶段期间将稳定化培养基递送至该肺支架。
10.在一些实施例中，这些方法包括将该肺支架维持在围绕该肺支架的生物反应器中，该生物反应器包括气管管线、动脉管线和静脉管线，其中通过该动脉管线和该静脉管线递送这些huvec和这些血管周支持性hmsc。
11.此外，本文提供了用于从人类诱导多能干细胞(hipsc)中分化内皮细胞和血管周细胞的方法。这些方法包括在至少一种gsk3抑制剂的存在下培养这些hipsc；在完全分化培
养基的存在下培养这些hipsc；用补充有tgf-β1抑制剂的该分化培养基培养这些hipsc；并分离hipsc衍生的血管周祖细胞(hipsc-ppc)和hipsc衍生的内皮细胞(hipsc-ec)。
12.在一些实施例中，该至少一种gsk3抑制剂是chir99021。在一些实施例中，该至少一种tgf-β1抑制剂是sb431542。
13.在一些实施例中，这些方法包括维持4％或更少o2的低氧培养条件。
14.在一些实施例中，这些方法包括包括测量由cd31和ve-钙粘蛋白表达定义的内皮覆盖度的增加平台期，以指示足够的血管和第一阶段培养的结束。
15.各个实施例提供了用于实现本文描述的方法的装置和系统。在一些实现方式中，这些装置和/或系统可以包括控制系统，该控制系统包括用于实现所描述的方法的计算机控制。该控制系统可以包括联接至一个或多个处理器并具有存储在其上的指令的非瞬态计算机可读存储介质，这些指令在由该一个或多个处理器执行时使得该一个或多个处理器执行用于根据本文描述的前述实现方式或实施例中的任一项进行血管再生的操作。
16.如本文所使用的，“功能性”肺组织执行正常健康肺的大部分或全部功能，其包括允许将氧从空气运送到血流中，将二氧化碳从血流释放到空气中，将吸入的空气加湿，产生表面活性剂以降低肺泡中的表面张力，并且产生并运送粘液以从远端至近端气道去除吸入的微粒物质。在一些实施例中，“功能性”肺组织将至少允许将氧从空气运送到血流中并将二氧化碳从血流释放到空气中。
17.如本文所使用的，术语“去细胞化”和“无细胞”用作或定义为使用标准组织学染色过程，在组织切片中完全或几乎完全不存在可检测的细胞内物质、内皮细胞、上皮细胞和细胞核。优选但不是必需地，残留的细胞碎片也已从去细胞化的器官或组织中去除。
18.在一些实施方式中，本文所述的组合物、设备和方法可以具有改善天然细胞外基质支架的血管再生的特别优势。例如，某些实施方式可以提供通过肺动脉和肺静脉递送细胞(如内皮细胞或祖细胞)的方法，其可以得到从常规动脉内皮递送方法获得的内皮覆盖度的两倍，同时还提供整个肺内均匀的内皮覆盖。在其他实例中，某些实施方式可以提供两阶段器官培养程序，其可以包括血管生成培养基，随后是稳定化培养基。这种多阶段组合可有助于首先促进有效的内皮重塑，并且然后促进血管稳定和屏障功能功能性。该两阶段培养程序可以与患者衍生的细胞来源组合，以使用临床相关的细胞来源产生功能性肺脉管系统。
19.除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然类似或等同于在此所述的那些的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但以下描述了适合的方法和材料。在此提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用以其全文结合在此。在发生冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。此外，这些材料、方法、以及实例仅是说明性的，并且不旨在进行限制。
20.本发明的其他特征以及优点通过以下详细描述以及以下权利要求将会变得清楚。
附图说明
21.图1是示例性肺生物反应器的示意图，该示例性肺生物反应器包括具有灌注系统和如图3所示的气动压力控制模块的负压湿式通气系统。
22.图2a和2b是图1中呈现的示例性正压歧管的示意图。
23.图3是连接到器官培养室的气动压力控制模块的示意图。
24.图4是显示在通过肺动脉(pa)的无细胞大鼠肺的微球体灌注期间从肺静脉(pv)、气管(tr)和肺外周(peri)收集的流体体积的图表(归一化为从三个隔室收集的总体积)。
25.图5a是显示直接插管的肺动脉(pa)和气管(tr)、通过左心耳(laa)插管的pv和结扎的主动脉(ao)的图像。此插管策略允许通过pa和pv二者进行灌注以及从气管(tr)和pv收集流体。
26.图5b是显示通过pa灌注了绿色荧光微球体(0.2μm)的无细胞大鼠肺的代表性整装图像的图像。
27.图5c是显示在通过肺动脉(pa)灌注期间从pv、气管(tr)和肺外周(peri)收集的流体中的0.2-μm和0.02-μm微球体的浓度的图表，归一化为输入的微球体浓度。
28.图5d是显示通过无细胞肺的pa和pv的微球体灌注的图，突出显示沿着血管轨迹的流体泄漏和在灌注期间静水压力的逐渐减小。
29.图5e是通过pa灌注了绿色荧光微球体(0.2μm)且通过pv灌注了红色荧光微球体(0.2μm)的无细胞大鼠肺的代表性整装图像。
30.图5f是通过pa(i，ii，iii)或通过pa&pv(vi，v，vi)递送人脐静脉内皮细胞(huvec)后1天再生肺的内皮覆盖的代表性图像。上图显示cd31(红色，内皮细胞)和层粘连蛋白(绿色，肺基质)的荧光图像(i，vi)。中图显示层粘连蛋白(来自上图)的针对其覆盖度定量的处理图像(ii，v)。下图显示cd31(来自上图)的针对其覆盖度定量的处理图像(iii，vi)。
31.图5g是显示在细胞递送后1天归一化为层粘连蛋白(基质)覆盖度的cd31(内皮)覆盖度的定量的图表。
32.图5h是显示在通过pa&pv(cd31，红色；层粘连蛋白，绿色)递送huvec后1天，无细胞大鼠肺叶的内皮覆盖的代表性拼接图像。
33.图6是接种了荧光标记的huvec的无细胞大鼠肺的整装图像。
34.图7a是显示两阶段培养策略的图。
35.图7b是显示当在血管生成或稳定化培养基中培养2天时huvec跨孔(transwell)渗透性测定中500-kda葡聚糖的相对泄漏的图表。泄漏值被归一化为没有huvec的跨孔(
‘
无细胞’对照)的那些。
36.图7c是显示与细胞递送后1天时huvec再生肺的覆盖度相比，在两阶段培养(8天)后在egm-2和huvec-hmsc再生肺中14天培养后huvec再生肺的内皮覆盖度的定量的图表。通过将cd31的覆盖度归一化为层粘连蛋白的覆盖度来定量覆盖度。
37.图7d是显示在两阶段培养(cd31，红色；层粘连蛋白，绿色；dapi，蓝色)后huvec-hmsc再生肺叶的内皮覆盖的代表性拼接图像。
38.图7e是表征两阶段培养结束时huvec-hmsc再生肺的图像。(i)由内皮细胞(cd31，红色)形成的相互连接的血管网络结构，单独的hmsc(sm22α，绿色)粘附于该网络上。(ii)由在管腔表面上的podxl(绿色)和基底表面上的coliv(红色)的定位显示的顶端-基底极性的建立。(iii)由细胞边界相关联的zo-1(红色)的富集显示的内皮细胞之间的紧密连接的建立。
39.图7f是显示ivp-bal测定的过程的图。
40.图7g是显示在对新鲜分离的尸体肺(尸体)、6小时冷局部缺血后的肺(6小时冷局
部缺血)和无细胞肺(去细胞)进行体外灌注和bal测定之后，血管内(pv流体)和血管外(来自肺外周和气管(包括bal)的流体)隔室中葡聚糖量的定量的图表。
41.图7h是显示在培养的第3、6和8天在huvec-hmsc再生肺上进行体外灌注和bal测定之后血管内和血管外隔室中葡聚糖量的定量的图表。
42.图7i是显示huvec-hmsc再生肺每日pa压力测量的图表(归一化为第1天的压力值)。
43.图7j是显示来自新鲜分离的尸体肺(尸体)、6小时冷局部缺血后的肺(6小时冷局部缺血)、无细胞肺(去细胞)和两阶段培养结束时huvec-hmsc再生肺(再生)的副肺叶的湿/干比的图表。
44.图7k是显示huvec-hmsc再生肺的原位移植的图像。代表性图片显示再灌注之前(左图)和之后(右图)pa和pv吻合后的再生左侧移植物。
45.图7l是显示移植后3天再生左肺移植物的荧光微血管造影术(fma)的图像，显示通过再生血管网络(cd31，紫色)灌注的0.2-μm微球体(fma，绿色)。
46.图8是显示内皮细胞的血管隔室特异性递送的图像。在通过pa&pv(cd31，棕色)递送huvec后1天无细胞大鼠肺的cd31免疫组织化学染色的代表性图像，证明了动脉(a)和静脉(v)的良好再内皮化以及支气管(b)中内皮细胞的不存在。ai，肺泡；ad，肺泡管。
47.图9a是显示来自hipsc的内皮和血管周细胞分化的图表。(a)显示来自hipsc的内皮和血管周细胞分化的一般过程的图。
48.图9b是显示分化结束时cd31和cd140b表达的代表性流式细胞术分析的图表。可观察到两个主要细胞群：cd31

cd140b-内皮细胞(hipsc-ec，蓝色)和cd31-cd140b

血管周祖细胞(hipsc-ppc，绿色)。
49.图9c是显示来自整个分化的cd31

cd140b-hipsc-ec和cd31-cd140b

hipsc-ppc的定量的图表。误差条表示实验值的标准偏差。
50.图9d是表征hipsc-ec的一系列图像，其显示内皮标记物cd31(i，红色)和ve-钙粘蛋白(ii，红色)的均匀表达，以及不存在血管周标记物cd140b(iii，红色)和平滑肌标记物α-sma(iv，红色)表达。
51.图9e是显示使用egm-fbs-sb培养基在体外扩增期间hipsc-ec的生长曲线的图表。
52.图9f是表征hipsc-ppc的图表和图像系列，其显示超过一半的细胞表达周细胞标记物ng2(i)，cd140b(ii，红色)的均匀表达以及不存在内皮标记物cd31(iii，红色)表达。
53.图9g是显示hipsc-ppc的平滑肌分化的一系列图像。当在egm-fbs-sb培养基中培养时，hipsc-ppc表达低水平的平滑肌标记物α-sma(i，绿色)和钙调理蛋白(ii，绿色)。在smgm-2中分化6天后，α-sma(iii，绿色)和钙调理蛋白(iv，绿色)表达大大升高。
54.图9h是概述从hipsc的hipsc-ec和hipsc-ppc分化以及hipsc-ppc向着平滑肌样细胞的进一步分化的图。
55.图10a-c是显示纯化的hipsc-ec中ve-钙粘蛋白(a)、kdr(b)和cd45(c)的流式细胞术分析的图表，证明内皮标记物(ve-钙粘蛋白和kdr)的均匀表达以及不存在造血标记物cd45表达。
56.图11a是两阶段培养后hipsc再生肺叶的代表性拼接图像(cd31，紫色；mcherry，黄色；dapi，蓝色)。
57.图11b是显示粘附于由hipsc-ec(cd31，紫色)形成的内皮网络的单独hipsc-ppc(cd140b，绿色)的存在的图像。
58.图11c是显示由在管腔表面上的podxl(绿色)和基底表面上的coliv(红色)的定位显示的顶端-基底极性的建立的图像。
59.图11d是显示在培养的第2、4和6天在hipsc再生肺上进行体外灌注和bal测定之后，血管和非血管隔室中葡聚糖量的定量的图表。
60.图11e是显示hipsc再生肺的每日pa压力测量的图表(归一化为第1天的压力值)。
61.图11f是显示来自两阶段培养结束时hipsc再生肺(ipsc-再生)的副肺叶的湿/干比的图表。
62.图11g是显示移植后3天hipsc再生左肺移植物的荧光微血管造影术(fma)的图像，显示通过再生血管网络(cd31，紫色)灌注的0.2-μm微球体(fma，绿色)。
63.图12a是用于无细胞人肺叶中的血管再生的生物反应器设置的图像，其允许通过pa和pv二者的内皮递送和灌注。
64.图12b是培养(i)期间、紧随(ii)之后、(iii)期间和(iv)刃天青灌注结束时再生人肺叶的一系列代表性图像。虚线指示由刃天青代谢突出显示的再细胞化区域(iv)。
65.图12c是两阶段培养(cd31，紫色；基质自体荧光，绿色；dapi，蓝色)后hipsc再生人肺叶的代表性拼接图像。
66.图12d是显示粘附于由hipsc-ec(cd31，紫色)形成的内皮网络的单独hipsc-ppc(mcherry，黄色，左图；cd140b，绿色，右图)的存在的图像。
67.图12e是显示hipsc再生人肺叶的荧光微血管造影术(fma)的图像，显示通过再生血管网络(cd31，紫色)灌注的0.2-μm微球体(fma，绿色)。
具体实施方式
68.本文件涉及再生肺血管床所涉及的方法和材料。本文描述了以下设备(例如，生物反应器)和方法的开发，这些设备和方法能够通过递送细胞并用内皮和血管周细胞重新填充无细胞肺支架的血管隔室来再生功能性肺血管床并使用多阶段培养程序使该肺血管床成熟。
69.根据本文提供的方法可以生成或再生生物人工肺组织(例如，整个器官或其部分)的肺血管床。在一些实施例中，这些方法包括将本文提供的生物人工肺组织移植给对其有需要的受试者(例如，人类患者)。在一些实施例中，将生物人工肺组织移植至患病部位或损伤组织。例如，可以将生物人工肺组织移植到受试者的胸腔中以代替(或结合)无功能或功能不良的肺；用于进行肺移植的方法在本领域中是已知的，参见例如boasquevisque等人,surgical techniques:lung transplant and lung volume reduction[外科技术：肺移植和肺减容术],proceedings of the american thoracic society[美国胸科协会学报]6:66-78(2009)；camargo等人,surgical maneuvers for the management of bronchial complications in lung transplantation[肺移植中支气管并发症管理的外科操纵],eur j cardiothorac surg[欧洲心胸外科杂志]2008；34:1206-1209(2008)；yoshida等人,“surgical technique of experimental lung transplantation in rabbits[兔实验肺移植外科技术],”ann thorac cardiovasc surg.[胸外科和心血管外科年鉴]11(1):7-11
(2005)；venuta等人,evolving techniques and perspectives in lung transplantation[不断发展的肺移植技术和观点],transplantation proceedings[移植进展]37(6):2682-2683(2005)；yang和conte,transplantation proceedings[移植进展]32(7):1521-1522(2000)；gaissert和patterson,surgical techniques of single and bilateral lung transplantation in the transplantation and replacement of thoracic organs[胸腔器官移植和置换中的单肺和双肺移植外科技术],第二版.springer netherlands[荷兰施普林格](1996)。
[0070]
这些方法可以包括在用以部分或完全移除受试者的肺的外科手术过程中和/或在肺切除期间移植本文提供的生物人工肺或其部分。这些方法还可以包括从活体供体或尸体收获肺或其部分，并在本文所述的生物反应器中保存或再生该肺。在一些情况下，本文提供的方法可用于替代或补充肺组织和在受试者(例如，人或动物受试者)中的功能。
[0071]
去细胞化组织/器官基质
[0072]
存在多种用于制备去细胞化肺组织基质的方法和材料。可以使用任何适当的材料来制备这种基质。在某些实施例中，组织基质可以是从去细胞化肺组织开发的无细胞组织支架。例如，可以通过合适的方法将组织如人肺(例如一个或一对人肺或其部分，例如人、猪、牛、灵长类动物或绵羊尸体肺或其部分)去细胞化以从该组织中去除天然细胞，同时维持该组织或组织部分的形态完整性和脉管系统并保存细胞外基质(ecm)蛋白质。描述了用于使哺乳动物肺组织去细胞化的方法，例如o'neill jd等人,decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering[人和猪肺组织的去细胞化以用于肺组织工程].ann thorac surg.[胸外科年鉴]2013年9月；96(3):1046-55；nichols je等人,production and assessment of decellularized pig and human lung scaffolds[去细胞化猪和人肺支架的生产和评估],tissue eng part a.[组织工程a部分]2013年9月；19(17-18):2045-62；gilpin se等人,perfusion decellularization of human and porcine lungs:bringing the matrix to clinical scale[人和猪肺的灌注去细胞化：使该基质成为临床规模].journal of heart and lung transplantation[心脏和肺移植杂志].in press[出版中]；song jj等人,bioartificial lung engineering[生物人工肺工程].am j transplant.[美国移植杂志]2012年2月；12(2):283-8；guyette,j.p.等人perfusion decellularization of whole organs[整个器官的灌注去细胞化].nat protoc[自然方案]9,1451-1468(2014)以及ott hc等人,regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung[生物人工肺的再生和原位移植].nat med.[自然医学]2010年8月；16(8):927-33。示例性的去细胞化方法可以包括使组织(例如，肺组织)经历反复的冻融循环，例如使用液氮。在其他情况下，可以使组织经受阴离子或离子细胞破裂介质，如十二烷基硫酸钠(sds)、聚乙二醇(peg)或tritonx。也可用核酸酶溶液(例如核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶)处理组织，并在无菌磷酸盐缓冲盐水中伴随轻轻搅拌进行洗涤。示例性方法在本领域中是已知的，例如o'neill jd等人,decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering[人和猪肺组织的去细胞化以用于肺组织工程].ann thorac surg.[胸外科年鉴]2013年9月；96(3):1046-55。在一些情况下，可以通过使用本领域已知的方法和材料冲洗该器官或组织的脉管、导管和/或腔来执行去细胞化。例如，如描述于maghsoudlou p等
人,preservation of micro-architecture and angiogenic potential in a pulmonary acellular matrix obtained using intermittent intra-tracheal flow of detergent enzymatic treatment[使用洗涤剂酶处理的间歇性气管内流获得的肺无细胞基质中的微构造和血管生成潜力的保存].biomaterials.[生物材料]2013年9月；34(28):6638-48。在冲洗步骤之后，可通过管线用如上所述的细胞破裂介质如在去离子水中的1％sds来灌注该器官或组织。灌注穿过组织可以是顺行或逆行的，并且可以交替方向性以改进灌注效率。根据器官或组织的大小和重量以及一种或多种特定的阴离子或离子洗涤剂和细胞破裂介质中一种或多种阴离子或离子洗涤剂的浓度，通常用细胞破裂介质以从约2至约12小时/10克组织来灌注组织。包括洗涤，器官可以每10克组织灌注持续长达约12至约72小时。一般将灌注调整为包括流速和压力的生理条件，例如5-100mmhg之间的压力和0.1-10倍于源生物或个体的生理心输出量的流速。
[0073]
在另一个示例性方法中，去细胞化方法包括将洗涤剂，例如，(1)0.1％sds，(2)2％脱氧胆酸钠(sdc)，或(3)8mmol/升(3)3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐(chaps)(ph12)洗涤剂，以30cm h2o的恒定压力灌注通过肺动脉。所有3种洗涤剂的方案包括：
[0074]
1.用磷酸盐缓冲盐水(pbs)进行10分钟初始顺行洗涤，
[0075]
2.洗涤剂灌注持续使得不透明的半透明基质可视化(指示去细胞化)所需的时间加上另外20％的所述初始时间(例如，70分钟 14分钟)，
[0076]
3. 15分钟去离子h2o洗涤，以及
[0077]
4.另外172小时pbs洗涤(添加抗生素和抗真菌剂)。
[0078]
这种去细胞化方法例如可以包括在去离子h2o之后另外的1％triton-x洗涤。sdc方案可包括sdc之前0.1％triton-x灌注和sdc之后1mol/升nacl洗涤。
[0079]
类似地，猪和人肺去细胞化方法可以包括以恒定的压力通过肺动脉来灌注洗涤剂或其他去细胞化剂，随后用h2o、1％triton-x溶液和pbs顺序洗涤。与大鼠肺类似，在视觉检查和不透明的半透明基质出现后，可以认为去细胞化完成。起始器官的变异性主要是由于收获期间预冲洗的广泛性，并且任何产生的凝块都可能贡献于灌注所需的长度。通常，去细胞化灌注的时间可以变化，例如从4至7天。
[0080]
去细胞化组织可以基本上由组织的全部或大部分区域的细胞外基质(ecm)组分(包括血管树的ecm组分)(例如，至少：按重量计85％纯、90％纯、92％纯、95％纯、96％纯、97％纯、98％纯和99％纯)组成。ecm组分可以包括以下项中的任一项或全部或者以下项的任何组合：纤连蛋白、原纤维蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白家族成员(例如，胶原蛋白i、iii和iv)、糖胺聚糖、基质(ground substance)、网状纤维和血小板反应蛋白(thrombospondin)，其可以保持组织化为定义的结构，如基膜。在某些实施例中，去细胞化肺组织基质保留完整的去细胞化脉管系统。保存基本上完整的去细胞化脉管系统使移植后组织基质能够与受试者的血管系统连接。另外，去细胞化组织基质可以用例如照射(例如，uv、γ)进一步处理以减少或消除留在去细胞化组织基质上或去细胞化组织基质中的任何类型的微生物的存在。
[0081]
使用物理、化学和酶学手段获得去细胞化组织基质的方法是本领域已知的，参见例如liao等人,biomaterials[生物材料]29(8):1065-74(2008)；gilbert等人,
biomaterials[生物材料]27(9):3675-83(2006)；teebken等人,eur.j.vasc.endovasc.surg.[欧洲血管和血管内外科杂志]19:381-86(2000)。还参见美国专利公开号2009/0142836、2005/0256588、2007/0244568、和2003/0087428。
[0082]
气道器官生物反应器装置
[0083]
本文所述的生物人工肺组织(例如，整个器官或其部分)可以使用生物反应器产生，该生物反应器被配置为提供有益于肺组织生长、保存、修复、修饰或其组合的真实环境。示例性的气道器官生物反应器呈现于图1-图3中。在整个说明书中，肺将作为器官或气道器官的实例提供。其他实例可以包括肺的部分，其包括分层脉管系统结构，例如肺叶或肺段。呈现于图1-图3中的示例性生物反应器能够支持来自活体供体或尸体的收获的肺。本文描述的任何生物反应器可以被配置为允许以仰卧位培养肺。
[0084]
参考图1，生物反应器100的部件包括肺室101、孵育器室102、培养基储器103、动脉灌注泵104、引流泵105、动脉压力传感器106、室压力传感器107、气管压力传感器108、静脉压力传感器109、动脉管线110、静脉管线111、气管管线112、无菌过滤器113、氧合器114、控制模块115、静脉阀116、过滤器封堵器117、平衡管线118、气动压力控制(ppc)模块300和正压歧管(ppm)200。
[0085]
在肺室101内，将细胞基质用细胞和培养基顺行灌注，以允许接种细胞使其在肺基质中生长。灌注通过到肺动脉的动脉管线110发生，并通过到肺静脉的静脉管线111发生。此配置允许细胞和培养基从动脉和静脉两侧到达毛细血管床，并允许培养基扩散通过无细胞基底膜并通过气管或跨过胸膜离开基质。
[0086]
细胞和/或培养基通过动脉管线110和静脉管线111流动通过肺脉管系统。为了再循环，培养基通过氧合器114。氧合的培养基流动通过动脉灌注泵104。此泵由控制模块115控制，该控制模块分别基于来自动脉压力传感器106和静脉压力传感器109的压力读数来控制速度。基于细胞的大小和数量可以修饰动脉和静脉灌注压力，以优化细胞递送。控制模块115还能够记录数据(例如，来自动脉压力传感器106和静脉压力传感器109的电阻读数)。培养基完成电路，返回到动脉管线110。在初始顺行接种期间，在到达毛细血管床之前或在到达毛细血管床时，培养基扩散通过肺基质。为了引导培养基通过支架，正压歧管200可以修饰肺内压力。在一些情况下，可以使用逆行接种。
[0087]
在肺去细胞化后，基质足以承受生理条件(例如，由肺基质的再内皮化导致的血管阻力增加)，并且生物反应器100切换至顺行灌注。脉管系统阻力由动脉压力传感器106随时间测量。随着血管系统被填充，跨过血管膜的扩散降低，导致由动脉传感器106测量的压力增加(即，血管阻力增加)。在一些实例中，通过生物反应器100灌注颗粒(例如微球体)并监测它们的进展以确定跨过血管膜的扩散速率。
[0088]
生物反应器100组合了流量灌注系统和负压通气。将肺基质放置于肺室101中。流动灌注系统使用连接到肺的肺动脉的动脉管线110。培养基从培养基储器103中被抽吸并通过氧合器114。氧合器114将空气与孵育器室102周围的环境进行交换。在通过氧合器114之后，动脉压力传感器106记录动脉压力并将这个数据传输到控制模块115。然后动脉压力读数调节将培养基从储器泵送到肺动脉的滚轮泵。然后，培养基通过出口管线从肺室101循环出来，并且使用引流泵105将培养基泵送到培养基储器103中。引流泵105是双向的并且可以用于在培养基储器103与肺室101之间循环培养基。这种再循环也有助于维持肺室101中的
正确ph。控制模块115基于由室压力传感器107记录的压力读数来控制引流泵105，例如速度和/或方向。当肺室101中的室压力波动时，液体流入和流出气管管线112。因为静脉管线111对培养基储器103是开放的，所以静脉压力与室压力平衡，因此防止了会导致流体从动脉流入组织的跨肺压力梯度。通过监测室压力并相应地泵送，可以维持肺室101中的培养基水平。
[0089]
如图1所示，生物反应器100还包括气管压力传感器108和静脉压力传感器109。气管压力传感器108测量气道(例如，气管)内的压力。
[0090]
生物反应器100还可以使用静脉压力传感器109而有源地监测静脉管线111与培养基储器103之间的培养基交换速率。在加载到系统中之后，在静脉阀116关闭时，静脉由储器的液位控制；或者如果静脉阀116处于打开位置，由可以附接至该静脉阀的阻力阀控制。例如，静脉阀116通常处于打开位置。低压读数(例如，《-5mmhg)可以触发静脉阀116关闭(例如，自动或由操作员进行)，从而提供更多的静脉背压以防止毛细血管后血管坍塌。如果压力读数高(例如》20mmhg)，则静脉阀116可以打开以减少静脉后负荷并使向间质空间和气道中的流体转移最小化。
[0091]
仍参考图1，通过无菌过滤器113使培养基室103中的压力与周围环境(例如，孵育器室102)平衡。这种交换还允许在孵育器室102与培养基储器103之间交换气体(例如二氧化碳)，这有助于维持系统中培养基的适当ph值。可以相对于肺室101的高度来调整培养基储器103的高度。这导致了湿呼吸正压并且影响关于肺的气管气道压力。例如，培养基储器103被设定为在浸没于培养基中的肺上方4cm处。这导致了气道正压。
[0092]
通常，由本文所述的任何传感器记录的压力在生理范围内(取决于所培养的器官)。例如，动脉范围可以是10-35mmhg的均值，肺室101可以在-40至40mmhg的均值之间。
[0093]
肺室101与培养基储器103之间的压力平衡管线118和无菌过滤器113上的过滤器封堵器117均衡肺室101与培养基储器103之间的压力。这确保了在呼吸周期的所有阶段期间跨两个室的相等压力。此修饰可适用于本文讨论的所有生物反应器(小动物和大型动物/人均适用)，并可用于正压和负压通气模式以及湿和干通气模式。引入此压力平衡管线118使得能够建立双向跨肺梯度。换言之，肺可以通过ppm 200从内部压缩(从而建立气道正压)，并且通过ppc模块300从外部压缩(从而建立室正压)。
[0094]
这种双向跨肺梯度的目的是防止在长期分离的肺培养物上形成间质性水肿，并通过将间质流体推入脉管系统来治疗已经形成的水肿(例如，在先前受损的肺中)，从而改进肺功能(例如，顺应性、扩散性、重量和尺寸)。如果静脉压力可以相对于室压力进行调整，则可以实现此梯度。通过调节培养基储器103的高度，并且从而调节静脉插管中水柱的高度并将肺静脉引流回到培养基室103，可以将静脉压力保持在高于或低于室压的恒定水平。本质上，两个室之间的平衡允许在负压通气期间恒定的肺静脉引流。相比之下，如果不维持平衡并且pv保持恒定，则肺室101中的负压将导致静脉流中的静脉引流减少或逆转(例如，部分或完全)，而肺室101中的正压会使肺静脉坍塌，导致流出阻塞。
[0095]
正压歧管200连接到气管管线112，以使得生物反应器100能够产生负压通气并且在整个吸气和呼气过程中产生和维持气道正压(通过气管管线112)。生物反应器100进一步被配置为适于大的基质尺寸(例如，成人的肺和人类儿童的肺)并且由于添加平衡管线118和过滤器封堵器117而适于长期培养。
[0096]
参考图2a，正压歧管200包括气管管线部分304(例如，图1中所示的气管管线112的部分)、压力储器302、压力释放阀301、压缩机303(例如，加压气体源)、可充气的呼吸袋306和歧管压力传感器308。气管管线304连接到肺的气道(未示出)。压缩机303向压力储器302提供正压，并且压力储器302中的压力水平可以通过压力释放阀301进行修饰(例如，可以降低压力)。在某些实施例中，正压歧管200是计算机化的系统，其响应于气道中吸气和呼气相关的压力变化(例如，如由气管压力传感器108或歧管压力传感器308所记录的)而有源地调节压力储器302中的压力。可充气呼吸袋306附接到压力储器302以容纳在吸气和呼气期间突然的体积变化，同时保持室、气管和肺中的压力恒定。可充气呼吸袋306的体积可以根据正在培养的肺的尺寸而变化。例如，可充气呼吸袋306的体积可以在250cc与4000cc之间、至少250cc、小于4000cc、在300cc与3500cc之间、在400cc与3000cc之间、在500cc与2500cc之间、在600cc与2000cc之间、在700cc与1500cc之间以及在800cc与1000cc之间。可充气呼吸袋306的材料可以是任何柔性的、不透气的和可灭菌的材料(例如，胶乳或橡胶)。歧管压力传感器308协助监测呼气末压力并使得能够进行通气管线中的流量计算。
[0097]
参考图2b，正压歧管200还可以包括吸气阀322、和呼气阀324以及呼气压力释放阀326。气管管线304连接到肺的气道(未示出)。如参考图3a所述，压缩机303向压力储器302提供正压，并且压力储器302中的压力水平可以通过压力释放阀324进行修饰(例如，可以降低压力)。气管管线304还连接到吸气阀322和呼气阀324。吸气阀322和呼气阀324是单向阀，其允许流体(例如空气)沿一个方向流动并且防止回流。在呼气阶段期间，空气从气管管线304流动通过呼气阀324和呼气压力阀326到达排气管线(未示出)。归因于吸气阀322，排出的流体不会进入压力储器301。在吸气阶段期间，空气从压力储器流动通过吸气阀322经由气管管线304到达肺的气道。呼气压力释放阀324确保呼气管线在吸入阶段期间保持正压，从而防止空气在吸入阶段期间流动通过呼气管线。
[0098]
参考图3，气动压力控制模块300包括入口压力阀703、入口压力储器705、入口压缩机701、入口管线707、出口压力阀704、出口压力储器706、出口压缩机702、出口管线708和ppc控制器709。入口管线707和出口管线708连接到肺室101，该肺室包括室压力传感器710。入口压缩机701和出口压缩机702将入口压力储器705和出口压力储器706用气体(例如，空气)填充。入口压力阀703和出口压力阀704(例如，电磁阀)以及入口压缩机701和出口压缩机702由ppc控制器709控制。在吸气阶段期间，出口阀704打开并在肺室101中产生负压。一旦室压力传感器710记录目标负压(例如-20cmh2o)，则出口阀704关闭。在吸气和呼气期间，室压力范围可以是从-50到 100cmh2o。一旦肺顺应性接近正常肺，则室压力更接近地模拟胸膜内压力的生理范围(例如，-10至 25cmh2o)。在适当的平台期之后，呼气阶段开始，其中入口压力阀703打开并允许在肺室101内部产生正压。一旦室压力传感器710记录目标正压(例如25cmh2o)，则入口阀703关闭。入口压力储器705和出口压力储器706被适当地确定尺寸以使得能够快速调节肺室101中的压力。入口压力储器705和出口压力储器706防止和/或减少由入口压缩机701或出口压缩机702产生的振动伪像。在一些实施例中，压力平衡的斜率可通过放置在入口管线707和/或出口管线708中的附加阻力阀(未示出)进行调节。通气可以是压力控制的(pc)或体积控制的(vc)。
[0099]
其他示例性生物反应器和方法描述于例如15年3月13日提交并且标题为lung bioreactor[肺生物反应器]的pct/us 2015/020605和2012年2月24日提交并且标题为
bioartificial lung[生物人工肺]的美国专利号9,005,885中，特此将这些文件的内容各自通过引用以其全文并入。
[0100]
细胞接种
[0101]
在本文所述的一些方法中，将肺组织基质(例如去细胞化肺组织基质或人工肺基质)用细胞(例如分化细胞或再生细胞)接种。
[0102]
可以使用任何适当的再生细胞类型(如初试或未分化的细胞类型)来接种肺组织基质。这些细胞可以在包括但不限于干细胞阶段(例如，诱导后)、祖细胞阶段、成血管细胞阶段或分化阶段(例如，cd 31 、vwf 、cd140b )的多个阶段进行接种。如本文所使用的，再生细胞可以包括但不限于祖细胞、前体细胞和“成体”衍生的干细胞(包括脐带细胞(例如，人脐静脉内皮细胞)、胎盘衍生的细胞和胎儿干细胞)。再生细胞也可以包括分化或定向细胞类型。适用于本文提供的方法和材料的干细胞可以包括人类诱导多能干细胞(ipsc)和衍生物(例如，未分化的、分化的内胚层，前内胚层(anteriolized endoderm)，ttf-1阳性肺祖细胞，内皮祖细胞，和中胚层祖细胞，血管周细胞，肌肉祖细胞)、人间充质干细胞、人脐静脉内皮细胞、多潜能成体祖细胞(mapc)、ips衍生的间充质细胞或胚胎干细胞。在一些情况下，也可以使用衍生自其他组织的再生细胞。例如，可使用衍生自皮肤、骨骼、肌肉、骨髓、滑膜、胎盘或脂肪组织的再生细胞来开发接种了干细胞的组织基质。
[0103]
在一些情况下，本文提供的肺组织基质可以可替代地或进一步接种分化的细胞类型如(优选人)上皮细胞和内皮细胞。例如，肺基质可通过脉管系统(例如，通过动脉管线110、静脉管线111或动脉管线110和静脉管线111二者)接种内皮细胞，并通过气道(例如，通过气管管线112)接种上皮细胞。肺基质还可以接种一个或多个细胞类型(例如，以下中的一个或多个类型：上皮细胞和间充质细胞、成体外周血衍生的内皮细胞、脐带血衍生的内皮细胞、ips衍生的上皮细胞和内皮细胞、祖细胞阶段细胞(例如平滑肌)、成体肺衍生的细胞混合物(例如大鼠、人)、可商购的小气道上皮细胞或肺泡上皮细胞、胚胎干(es)细胞衍生的上皮细胞、和/或人脐静脉内皮细胞(huvec))。
[0104]
通过肺动脉和肺静脉二者将血管相关细胞和/或培养基递送至无细胞肺支架中有助于改进细胞分布和分布。例如，在肺室101内，将细胞基质用细胞和培养基顺行灌注，以允许接种细胞使其在肺基质上生长。灌注通过到肺动脉的动脉管线110发生，并通过到肺静脉的静脉管线111发生。此配置允许细胞和培养基从动脉和静脉两侧到达毛细血管床，并允许培养基扩散通过无细胞基底膜并通过气管或跨过胸膜离开基质。
[0105]
在一些情况下，如本文提供的去细胞化或人工肺组织基质可通过灌注接种来接种上述细胞类型和细胞密度。例如，可以使用流体灌注系统通过保存在组织基质中的血管系统(例如，通过动脉管线110)在肺室101内接种去细胞化肺组织基质。在一些情况下，可以在适当的条件下使用自动化流体灌注系统。这种灌注接种方法可以改进接种效率并且在整个组合物中提供更均匀的细胞分布。可以使用定量生化和图像分析技术来评估在静态或灌注接种方法后接种的细胞的分布。细胞可通过动脉和静脉管线(内皮细胞)或通过气道(气管)管线(上皮细胞)引入基质。组织基质可以在体外以任何适当的细胞密度接种至少一个细胞类型。用于接种基质的细胞密度可以为至少1x103个细胞/克基质。可使用的细胞密度范围可以在约1x105至约1x10
10
个细胞/克基质之间(例如，至少100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000、1,000,000,000、或10,000,000,000个细胞/克基质)。
[0106]
在一些情况下，如本文提供的去细胞化或人工肺组织基质可通过灌注接种来接种上述细胞类型和细胞密度。例如，可以使用流体灌注系统通过保存在组织基质中的血管系统(例如，通过动脉管线110)来接种去细胞化肺组织基质。在一些情况下，可以在适当的条件下使用自动化流体灌注系统。这种灌注接种方法可以改进接种效率并且在整个组合物中提供更均匀的细胞分布。可以使用定量生化和图像分析技术来评估在静态或灌注接种方法后接种的细胞的分布。
[0107]
在一些情况下，可以用一种或多种生长因子浸渍组织基质以刺激接种的再生细胞的分化。例如，组织基质可以用适合于本文提供的方法和材料的生长因子浸渍，例如血管内皮生长因子(vegf)、tgf-β生长因子、骨形态发生蛋白(例如，bmp-1、bmp-4)、血小板衍生的生长因子(pdgf)、碱性成纤维细胞生长因子(b-fgf)(例如，fgf-10)、胰岛素样生长因子(igf)、表皮生长因子(egf)或生长分化因子5(gdf-5)。参见例如desai和cardoso,respire.res.[呼吸研究]3:2(2002)。可以封装这些生长因子来控制时间释放(temporal release)。支架的不同部位可以用不同的生长因子进行增强，以增加对生长因子刺激的空间控制。
[0108]
接种的组织基质可以在接种后孵育一段时间(例如，从数小时至约14天或更长)以改进细胞在组织基质中的固定和渗透。可以在如下条件下维持接种的组织基质：其中至少一些再生细胞可以在无细胞组织基质之内和之上繁殖和/或分化。这样的条件可以包括但不限于适当的温度(35-38摄氏度)和/或压力(例如，大气压)、电活动和/或机械活动(例如，通过正压或负压通气，呼气末正压为1-20cmh2o，气道压力均值为5-50cmh2o，并且峰值吸气压力为5-65cmh2o)、适当量的流体(例如o2(1％-100％fio2)和/或co2(0-10％fico2))、适当量的湿度(10％-100％)以及无菌或接近无菌的条件。这样的条件还可以包括湿式通气、湿到干通气和干式通气。在一些情况下，可以将营养补充剂(例如营养素和/或碳源如葡萄糖)、外源激素或生长因子添加到接种的组织基质中。可以进行组织学和细胞染色以测定接种细胞的繁殖。可以执行任何适当的方法来测定接种细胞的分化。通常，将在例如如本文所述的气道器官生物反应器装置中进行本文所述的方法。
[0109]
因此，本文描述的方法可以用于产生肺，其可以作为体外设备或可移植肺组织移植物向患者提供气体交换。如本文所述，可移植组织将优选保持可连接至患者血管系统的足够完整的脉管系统。
[0110]
本文描述的生物人工肺组织可以与包装材料组合以生成制品或试剂盒。存在用于生产制品的部件和方法。除了生物人工组织之外，制品或试剂盒还可以包括例如一种或多种抗粘合剂、无菌水、药物载体、缓冲剂和/或用于促进功能性肺组织在体外和/或移植后的发育的其他试剂。另外，在这样的制品中可以包括描述可以如何使用其中所含组合物的印刷说明书。制品或试剂盒中的部件可以包装在多个合适的容器中。
[0111]
使用多阶段培养程序进行的血管成熟
[0112]
为了促进分离器官培养中的血管成熟，可以使用两阶段培养程序来基于无细胞肺支架再生整个肺脉管系统或脉管系统部分。例如，与血管周支持细胞组合，将再生细胞从高血管生成状态转变为低血管生成状态的两阶段培养程序可以帮助促进再生肺中的血管成熟过程，其类似典型血管发育的体内腔形成。
[0113]
可使用灌注接种(例如，如别处所述从pa和pv二者)将细胞(例如，huvecs、hmsc、
hipsc-ec和/或hipsc-ppc)接种到无细胞肺支架上。任选地，静态培养可以遵循灌注接种以允许细胞初始附着到血管基底膜。通过pa用培养基进行灌注可能会持续到培养结束。
[0114]
在第一阶段期间，将如别处所述的血管生成培养基递送至经接种的肺支架。在第二阶段期间，将经接种的肺支架在如别处所述的稳定化培养基中培养。在一些实例中，第一阶段比第二阶段更长。例如，第一阶段可以是6天，而第二阶段仅2天。通过cd31和ve-钙粘蛋白表达定义的达到平台期的内皮覆盖度增加将指示已经实现了足够的血管重塑，这是第一阶段培养的主要目标。
[0115]
可使用该两阶段培养程序来重演天然脉管系统单元的组织，该天然脉管系统单元具有形成互连网络的内皮细胞和单独粘附在血管网络周围的血管周细胞。这允许将内皮细胞(作为单细胞悬浮液)递送至无细胞血管床中，并且然后这些内皮细胞经历附着和重塑。这导致内皮覆盖度的增加以及能够围绕并承受灌注流体流动的连续和极化血管腔的形成。在再生肺中体外血管成熟过程中的这些形态学变化类似于体内血管发育过程中的腔形成过程。
[0116]
细胞接种—衍生临床相关内皮细胞和血管周细胞
[0117]
在本文所述的一些方法中，将肺组织基质(例如去细胞化肺组织基质或人工肺基质)用细胞(例如分化细胞或再生细胞)接种。有效的向无细胞肺支架的内皮递送和分离的器官培养条件可有助于有效的血管成熟。
[0118]
使用患者衍生的细胞进行器官再生容易转化到临床应用，因为hipsc为从单细胞来源重建器官提供了产生所有必需细胞类型的潜力。例如，hipsc衍生的血管细胞类型可用于再生肺脉管系统。hipsc衍生的血管细胞类型经历高效内皮分化，伴随产生周细胞以构成总分化细胞的很大部分(例如，总分化细胞的至少50％、60％、70％、80％、90％)。
[0119]
从人胚胎干细胞和ipsc的血管细胞分化可以使用三维胚状体和二维细胞培养二者。例如，可以将hipsc接种到二维表面(例如，6孔板或在胶原中经包被的6孔板)上。当接种时，可以将细胞用抑制剂(例如，gsk-3抑制剂如chir99021、氯化锂(licl)、purvalanol a、奥罗莫星、阿斯特保罗酮、肯帕素酮、苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮(tdzd-8)、2-硫代(3-碘代苄基)-5-(1-吡啶基)-[1,3,4]-噁二唑(gsk3抑制剂ii)、2,4-二苄基-5-氧代噻二唑烷-3-硫酮(otdzt)、(2'z,3'e)-6-溴靛玉红-3'-肟(bio)、α4二溴苯乙酮(即τ蛋白激酶i(tpk i)抑制剂)、2-氯-1-(4,5-二溴-噻吩-2-基)-乙酮、n-(4-甲氧基苄基)-n'-(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)脲(ar-a014418)、靛玉红-5-磺酰胺；靛玉红-5-磺酸(2-羟乙基)-酰胺靛玉红-3'-单肟；5-碘-靛玉红-3'-单肟；5-氟靛玉红；5,5'-二溴靛玉红；5-硝基靛玉红；5-氯靛玉红；5-甲基靛玉红、5溴靛玉红、4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮(tdzd-8)、2-硫代(3-碘苄基)-5-(1-吡啶基)-[1,3,4]-噁二唑(gsk3抑制剂ii)、2,4-二苄基-5-氧代噻二唑烷-3-硫酮(otdzt)、(2'z,3'e)-6-溴靛玉红-3'-肟(bio)、α4二溴苯乙酮(即τ蛋白激酶i(tpk i)抑制剂)、2-氯-1-(4,5-二溴-噻吩-2-基)-乙酮、(vi)n-(4-甲氧基苄基)-n'-(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)脲(ar-a014418)、h-keappappqspp-nh2(l803)和myr-n-gkeappappqspp-nh2(l803-mts))进行处理；在一些实施例中，gsk3-β抑制剂是chir99021(例如，以5-20um使用，例如10-15um，例如约12μm，斯泰姆特公司(stemgent))并且可以使用培养基(例如mtesrtm))(例如，持续1至24小时)。在多于90％的细胞中表达brachyury基因(中胚层祖细胞标记物)指示此阶段完成。
[0120]
为了分化细胞，将细胞置于完全分化培养基(例如，imdm(吉博科公司(gibco)))中。分化培养基还可以包括补充血清或血清替代品，化合物，氨基酸，培养基补充物和/或蛋白质(例如，bit 9500(干细胞技术公司(stemcell technologies))，单硫代甘油(450mm，西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich))，mem非必需氨基酸(吉博科公司))，1％glutamax，1％p/s，重组人bmp4(派普泰克公司(peprotech))、vegf(派普泰克公司)和bfgf(派普泰克公司))。
[0121]
然后，可以将hipsc衍生的内皮细胞(hipsc-ec)和/或hipsc衍生的血管周祖细胞(hipsc-ppc)扩增到足以用于人尺寸肺工程的规模，而不丧失它们的内皮特性或增殖潜力。例如，分化的细胞可以解离为单细胞(例如，通过使用酶促细胞解离试剂，如胰蛋白酶或tryple(吉博科公司))，用一种或多种抗体或同种型对照(例如，抗人cd31-bv605、cd140b 和cd140b-pe抗体(bd生物科学公司(bd biosciences))进行染色，并且进行分离(例如，使用facsariaii(bd生物科学公司)，通过荧光活化细胞分选(facs))。
[0122]
分离后，hipsc-和hipsc-ppc可以在胶原蛋白i(bd生物科学公司)包被的烧瓶中培养，例如使用egm-fbs-sb培养基，它为egm-2，不含氢化可的松，补充有以下项中的一个或多个：20％限定fbs(海克隆公司(hyclone))、1％pen/strep、和tgfβ受体i(alk5)抑制剂，该抑制剂例如是sb431542、sb525334、sd-208、ew-7197、sb505124或galunisertib(ly2157299)；在一些实施例中，该抑制剂是sb431542(例如，在5-20μm，例如8-15μm，例如10μm)。
[0123]
为了向着平滑肌细胞样表型分化，将hipsc-ppc在平滑肌生长培养基-2(smgm2，龙沙公司(lonza))中培养，直到在多于90％的细胞中α-sma和钙调理蛋白上调(例如，持续6天)。
[0124]
血管功能的体外和体内表征
[0125]
可以进行任何一种或多种适当的方法来测定移植前或移植后的肺功能。例如，可以执行方法来评估组织愈合，来评估功能性，并且来评估细胞内生长。在一些情况下，可以收集组织部分并用固定剂如例如中性缓冲福尔马林处理。可以将这样的组织部分进行脱水，石蜡包埋，并用超薄切片机切片以用于组织学分析。切片可以用苏木精和伊红(h&e)染色，并且然后安装在载玻片上以用于形态学和细胞性的显微镜评价。例如，可以进行组织学和细胞染色以检测接种细胞的繁殖。测定可以包括对移植的组织基质或成像技术(例如，计算机断层摄影(ct)、超声或磁共振成像(例如，对比增强mri))的功能评价。测定可进一步包括休息和生理应激下的功能测试(例如，身体体积描记法、肺功能测试)。接种了细胞的基质的功能性可以使用各种方法进行测定，例如组织学、电子显微镜和机械测试(例如，体积和顺应性的)。气体交换可以作为另一种功能性测定来测量。为了测定细胞增殖，可以通过例如检测胸苷掺入来测量胸苷激酶活性。在一些情况下，可以基于血液中的氧气水平进行血液检查以评价肺功能。可替代地或另外，可以使用荧光标记的葡聚糖溶液进行离体灌注以定量血管内葡聚糖保留，其指示血管完整性和可灌注性。新鲜分离的尸体大鼠肺具有100％的血管内葡聚糖保留。6小时冷局部缺血后的尸体肺(为与移植相容的临床相关低级损伤模型)通常具有约87.0％
±
5.4％(例如，80.6％至92.9％的范围)的血管内葡聚糖保留。
[0126]
为了促进培养期间的功能性测定，本文所述的生物反应器装置的任何管线可以包括采样端口以允许功能参数(例如，ph、葡萄糖、乳酸盐、na、k、ca、cl、bicarb、o2、co2、sat)的单次或实时测量。也可以使用代谢物以使用比色测定来监测细胞数目和活力，并且可以使
用生化测定来监测细胞成熟(例如，测量表面活性剂蛋白等)。例如，表面活性剂浓度增加可以指示培养肺具有足够的上皮细胞以承受干式通气。在一些情况下，可以使用内皮屏障功能作为血管成熟的标记物。肺可以灌注不同大小的分子(如定义大小的葡聚糖和白蛋白)、微珠或微球体(尺寸从0.2um增加到5um)以及分离的红细胞。然后可以对支气管肺泡灌洗液采样来评估这些标记物向肺泡腔内的泄漏。例如，可以将500-kda葡聚糖与支气管肺泡灌洗测定组合使用以确定保留在血管隔室内的葡聚糖的百分比。保留的葡聚糖百分比的增加指示屏障功能的改进，因为对葡聚糖的屏障功能取决于有活力和功能性的内皮，而葡聚糖将随着时间在连续灌注期间跨裸露的血管基底膜(例如，在无细胞肺中)扩散。例如，尸体肺可基本保留血管隔室内的所有葡聚糖，而无细胞肺可保留小百分比的葡聚糖(例如，10.0％
±
8.0％，例如3％
–
20％，例如3.1％至18.7％)。这些标记物到肺泡空间的泄漏大于可耐受的最小值(例如》10％的4um微珠(例如，10％至100％或20％至100％将指示肺不足以承受干式通气)，或大于20％的0.2um微珠(20％至100％或30％至100％将指示肺不足以承受干式通气)指示肺不够成熟来承受干式通气)。
[0127]
在一些情况下，可使用分子生物学技术如rt-pcr来定量代谢标记物(例如，表面活性剂蛋白、粘蛋白-1)和分化标记物(例如，ttf-1、p63、表面活性剂蛋白c)的表达。可以使用任何适当的rt-pcr方案。简而言之，可以通过以下方式收集总rna：将生物样品(例如，肌腱样品)均质化，进行氯仿提取，并且使用旋转柱(例如，mini旋转柱(奇杰公司(qiagen))，巴伦西亚，加利福尼亚州)或其他核酸结合底物提取总rna。在其他情况下，可以使用抗体和标准免疫测定来检测与肺细胞类型和这样的细胞类型的不同分化阶段相关联的标记物。
[0128]
实例
[0129]
以下具体实例进一步说明本发明。
[0130]
实例1
[0131]
无细胞肺血管床的研究
[0132]
本实例的目的是使用体外微球体灌注测定来鉴定全肺支架中无细胞血管床的灌注特性。通过量化从pv、气管和肺外周采集的微球体，我们证明了去细胞化后血管基底膜的连续性和完整性二者，并且由此确认了在无细胞肺支架中隔室特异性细胞递送的可能性。微球体量化进一步暗示流体驱动的静水压力损失而非颗粒泄漏是导致低通过效率的主要原因。通过将这些发现应用于再细胞化，通过联合动脉和静脉细胞递送实现有效且均匀的内皮覆盖。
[0133]
方法
[0134]
在全身肝素化后，从雄性sprague-dawley大鼠(250-300g，查尔斯河实验室(charles river laboratories))移出尸体肺。用18g插管(mcmaster-carr)对肺动脉(pa)进行插管，使用具有尖端篮状体(1.9mm id)的迷你球插管(哈佛装置公司(harvard apparatus))通过左心耳(laa)对肺静脉(pv)进行插管，并将主动脉结扎。通过用肝素化(10单位/ml)磷酸盐缓冲盐水(pbs，10分钟)、去离子水中0.1％十二烷基硫酸钠(2小时)、去离子水(15分钟)和去离子水中1％triton x-100(10分钟)依序灌注pa(恒定压力，40mmhg)来进行去细胞化。将得到的支架用含有抗生素和抗真菌剂的pbs洗涤72小时以除去残留的洗涤剂和细胞碎片。所有试剂都来自西格玛奥德里奇公司。
[0135]
对于从pa的微球体灌注之后去细胞化大鼠肺的整装成像，将去细胞化肺在20mmhg下用含有1:100稀释的绿色fluospheres(0.2μm，505/515，英杰公司(invitrogen))的30ml pbs灌注通过pa。对于自pa和pv的微球体灌注后去细胞化肺的整装成像，将去细胞化的肺在pv插管打开的情况下用30ml包含1:100稀释的绿色fluospheres(0.2μm，505/515)的pbs灌注通过pa，并且然后在pa插管打开的情况下用含有1:100稀释的红色fluospheres(0.2μm，580/605)的30ml pbs灌注通过pv。在微球体灌注后从去细胞化肺解剖单个叶，并使用nikon eclipse te200显微镜在4x放大下成像。
[0136]
为了量化去细胞化大鼠肺中的微球体灌注和泄漏，还用18g插管(mcmaster-carr)对气管进行插管。将去离子肺在40mmhg下用含有1:10稀释的绿色fluospheres(0.2μm，505/515)和红色fluospheres(0.02μm，580/605)的混合物的30ml pbs灌注通过pa。在灌注期间，收集从pv插管和肺外周引流出的流体。在灌注期间关闭气管插管，并在灌注后通过释放气管插管来收集积聚在气道中的流体。测量从所有三个隔室(pv、气管和外周)收集的流体的体积，并且使用spectramax microplate reader在485nm(ex)/538nm(em)针对0.2-μm绿色fluospheres测量其荧光强度，并且在544nm(ex)/590nm(em)针对0.02-μm红色fluospheres测量其荧光强度。
[0137]
结果：
[0138]
为了检查得到的全肺支架中的无细胞肺血管床的性质，经由左心耳、气管和pa对pv进行插管(图5a)。正如预期的，去细胞化导致屏障功能几乎完全丧失，并且晶体溶液如磷酸盐缓冲盐水(pbs)从pa和pv跨越血管基底膜自由过滤至间质空间，跨越胸膜并进入肺泡空间和气道。注入pa的大部分pbs从肺外周围和气管引流出，而仅可从pv收集12.4％
±
0.7％的体积(图11)。这与在去细胞化过程中观察到的一致，灌注通过pa的洗涤剂使肺脉管系统透化并有效地溶解整个肺实质中的细胞组分。
[0139]
为了检查血管基底膜的连续性和完整性并用含有微粒元素的溶液对灌注建模，用含有荧光微球体(0.2μm)的pbs灌注无细胞全肺。在生理压力(20mmhg)下灌注通过pa期间既没有观察到微球体明显地泄漏到气道或跨越胸膜，也没有观察到自pv的明显微球体引流。使用肺全装，确认了灌注微球体的肺内截留(图5b)。当通过pa的灌注压力从20mmhg增加到40mmhg时，可以在接近输入(74.6％
±
20.8％)并且显著高于从气管(tr，22.7％
±
12.2％，p《0.05)和肺外周(peri，5.7％
±
5.1％，p《0.05)收集的流体的浓度从pv收集微球体(图5c)。这一发现确认去细胞化后保存了肺血管基底膜的完整性和连续性。然而，从pv收集的微球体总量仅为注入总量的10.3％
±
0.9％。这指示当从动脉侧灌注时微球体没有有效地通过毛细血管床。由于水相扩散通过非常可渗透的基底膜，并且剩余溶液中的血管内微球体浓度增加(图5d)，所以这种低效率可能与血管床内静水压力的快速损失有关。
[0140]
通过将标记有不同颜色的微球体相继灌注通过pa和pv，显然动脉微球体和静脉微球体都不会泄漏到肺泡空间或气道中。相反，微球体不透明的血管通道通常是相互排斥的(图5e)。这指示有效的血管细胞递送将受益于从动脉侧和静脉侧灌注到达整个肺血管床。
[0141]
结论：
[0142]
发现微米直径的颗粒在生理压力下不能有效地通过无细胞肺毛细血管床。
[0143]
实例2
[0144]
内皮递送的改善
[0145]
本实例的目的是在无证明细胞大鼠肺支架上活性内皮细胞的重建并确认去细胞化后血管基底膜的完整性。
[0146]
方法
[0147]
在生物反应器中向去细胞化大鼠肺中进行细胞接种，类似于本文所述的那些，允许自pa和pv的细胞递送和灌注。对气管进行插管并通过位于pa水平上方约5cm的端口对生物反应器内部开放。通过用含人纤连蛋白(2.5μg/ml)的100ml汉克氏平衡盐溶液以1ml/min灌注1小时来填装去细胞化的肺支架，用汉克氏平衡盐溶液洗涤1小时，并在细胞接种前在各自的培养基中平衡至少1小时。对于通过pa的内皮递送，将4000万个huvec重悬于具有100ml egm-2的单个接种室中，并且在30mmhg重力下通过pa接种(n＝3)。对于通过pa和pv的内皮递送，将4,000万个huvec重悬于两个单独的接种室(每个具有在100ml egm-2中的2000万个huvec)，并且在30mmhg重力下通过pa和pv同时接种(n＝3)。进行2小时静态培养，使细胞附着，并且然后从pa和pv二者以1ml/min起始灌注。在培养1天后收获重接种的肺进行组织学分析。
[0148]
使用nikon eclipse te200显微镜从相同视野分别拍摄cd31和层粘连蛋白的荧光图像。图像被转换为二进制图像，画出轮廓并使用imagej(nih)扩张。使用imagej对加工图像的像素数进行计数，其指示在整个视野中内皮细胞(cd31)或肺基质(层粘连蛋白)的覆盖度。再生肺的内皮覆盖度被定义为cd31覆盖度，其被归一化为层粘连蛋白覆盖度。对于每个再生的肺，在4x放大下从5个代表性视野拍摄照片。每个肺的内皮覆盖度表示为来自5个视野的平均覆盖度。在从pa接种了huvec和培养1天后的无细胞大鼠肺(n＝3)上，在从pa&pv接种了huvec和培养1天后的无细胞大鼠肺(n＝3)上定量内皮覆盖度。
[0149]
结果：
[0150]
为了在无细胞大鼠肺支架上重建活性内皮，由灌注通过pa来接种荧光标记的人脐静脉内皮细胞(huvec)。这产生了与先前用微球体灌注观察到的类似的移植细胞分布模式(图6和图5b)。这也通过组织学评估得到确认，该组织学评估显示在仅从pa递送huvec后1天时的斑状内皮分布(图5f)。
[0151]
为了改善细胞植入和分布，由灌注通过pa和pv将递送的内皮细胞递送至无细胞肺支架中。为了定量地评估重新接种的无细胞大鼠肺的内皮覆盖度，测量了丰富的肺细胞外基质蛋白层粘连蛋白与由cd31染色标记的再内皮化区域的免疫染色之间的重叠程度(图5f-i)。
[0152]
联合动脉和静脉递送导致更大的覆盖度和更均匀的内皮细胞分布(图5f-iv，5h)。对在接种后1天得到的内皮覆盖度的定量指示从联合动脉和静脉递送获得的内皮覆盖度显著高于单独动脉递送产生的内皮覆盖度(33.2％
±
2.9％对16.3％
±
1.4％，p《0.01)(图5g)。如在微球体灌注下所观察到的，在主要气道分支中不存在内皮细胞的情况下，在恒定压力下的联合动脉和静脉内皮递送对血管隔室是具有高度特异性的(图8)，从而确认去细胞化后血管基底膜的完整性。
[0153]
实例3
[0154]
体外培养期间的血管成熟
[0155]
本实例的目的是证明在复杂的三维支架(例如，无细胞肺支架)中的有效和活跃的血管重塑，其密切模拟体内血管发育。在细胞递送和保留后，从充满内皮细胞的无细胞血管
床到可灌注血管腔的转变依赖于活跃的血管重塑，其密切模拟体内血管发育。
[0156]
方法
[0157]
为了长期体外培养用huvec再生的无细胞大鼠肺，如上所述将约4000万个huvec从pa和pv二者接种到无细胞肺支架中，并且在egm-2中培养14天(n＝3)，伴随着从每侧以1ml/min从pa和pv二者灌注。培养基每隔一天进行更换。
[0158]
对于用huvec和hmsc再生的无细胞大鼠肺(称为huvec-hmsc肺)的两阶段培养，将4000万个huvec与2000万个hmsc混合并如上所述从pa和pv二者接种到无细胞肺支架中。静态培养2小时后，从pa和pv二者以1ml/min重新起始灌注。从第1天开始，pv插管被释放，并且灌注切换到仅从pa以4ml/min，这保持到培养结束。将huvec-hmsc再生肺培养共8天，最初6天在血管生成培养基中培养，并且随后在稳定化培养基中培养2天。
[0159]
血管生成培养基为补充有以下项的培养基199(吉博科公司)：10％fbs，1％胰岛素-转铁蛋白-硒(吉博科公司)，抗坏血酸(50mg/ml，干细胞技术公司)，重组人vegf(40ng/ml)、bfgf(40ng/ml)，和1％p/s。
[0160]
稳定化培养基是补充有以下项的培养基199：2％fbs，1％胰岛素-转铁蛋白-硒，抗坏血酸(50mg/ml)，重组人vegf(20ng/ml)、bfgf(20ng/ml)，毛喉素(10μm，开曼化学品公司(cayman chemical))，氢化可的松(110nm，西格玛奥德里奇公司)和1％p/s。在第8天收获huvec-hmsc再生肺以用于进行功能和组织学评估。
[0161]
结果：
[0162]
在阶段i期间，肺暴露于高水平的血清和血管生成生长因子(称为血管生成培养基)以促进内皮存活、迁移和血管重塑。然而，促血管生成因子可导致内皮渗透性增加和屏障功能降低。为了抵消这种趋势，使用含有较低水平的血清和血管生成生长因子(例如，毛喉素和氢化可的松)的稳定化培养基(其降低内皮渗透性并改进屏障功能)，第2阶段的培养稳定了预先形成的脉管系统并增强了屏障功能(图7a)。血管生成培养基为补充有以下项的培养基199(吉博科公司)：10％fbs，1％胰岛素-转铁蛋白-硒(吉博科公司)，抗坏血酸(50mg/ml，干细胞技术公司)，重组人vegf(40ng/ml)、bfgf(40ng/ml)，和1％p/s。稳定化培养基是补充有以下项的培养基199：2％fbs，1％胰岛素-转铁蛋白-硒，抗坏血酸(50mg/ml)，重组人vegf(20ng/ml)、bfgf(20ng/ml)，毛喉素(10μm，开曼化学品公司(cayman chemical))，氢化可的松(110nm，西格玛奥德里奇公司)和1％p/s。
[0163]
为了在短时间暴露于例如血管生成诱导剂或抑制剂后测试培养基对屏障功能的影响，使用葡聚糖跨孔渗透性测定。为了评价在再生肺的长期体外培养期间培养基对内皮渗透性的作用，通过将huvec单层暴露于血管生成培养基和稳定化培养基2天以研究它们的慢性作用来修饰葡聚糖跨孔渗透性测定。与在血管生成培养基中培养的那些相比，在稳定化培养基中培养的huvec单层展示显著改进的屏障功能(图7b)。
[0164]
为了基于无细胞大鼠肺支架来再生肺脉管系统，将huvec和血管周支持性hmsc共同接种并在再生的肺(称为huvec-hmsc肺)中在血管生成培养基中培养6天，并且然后在稳定化培养基中培养2天。为了评估这种共同接种和培养策略对血管重塑和再生的功效，对内皮覆盖度进行定量。与内皮递送后1天相比，在两阶段培养结束时huvec-hmsc肺内皮覆盖度显著增加(54.0％
±
5.0％对33.2％
±
2.9％，p《0.01)(图7c)。大的视界拼接图像进一步确认了整个肺中内皮覆盖的均匀性(图7d)。比较而言，无细胞大鼠肺支架仅接种了huvec而没
有血管周细胞，并且再生肺(称为huvec肺)在常规egm-2培养基中培养14天。尽管内皮细胞在整个培养期间在huvec肺中仍然存活，但常规培养结束时的内皮覆盖度与接种后1天的相比仅略微增加(34.5％
±
1.6％对33.2％
±
2.9％，p＝0.55)，并且显著低于在两阶段培养后huvec-hmsc肺中的内皮覆盖度(34.5％
±
1.6％比54.0％
±
5.0％，p《0.01)。这证明了包括血管周支持细胞和生长因子刺激在再生肺培养中促进血管重塑中的益处(图7c)。
[0165]
在两阶段培养结束时的huvec-hmsc再生肺中，在内皮细胞相互连接形成网络时，hmsc显现为粘附于血管网络的单独细胞(图7e-i)。这密切模拟了天然肺中的内皮周细胞组织结构。顶端-基底极性的建立是血管腔形成的主要形态学里程碑之一。在培养结束时，可以在huvec-hmsc再生肺中观察到足糖萼蛋白样蛋白(podxl)在血管腔表面上以及胶原蛋白iv(coliv)在基底表面上的特定定位(图7e-ii)。这确认了在大血管和毛细血管二者水平上的腔形成。为了评估屏障特性，通过在两阶段培养结束时zo-1染色以及观察到在内皮边界富集zo-1蛋白来检查紧密连接(图7e-iii)。
[0166]
实例4
[0167]
血管功能的体外和体内评估
[0168]
本实例的目的是证明用以评估在分离的器官培养过程中再生肺的血管功能的非侵入性方法。
[0169]
方法
[0170]
将正在测试的肺放置在俯卧位的150-cm皮氏培养皿的顶部，使pa连接灌注管线，并且pv插管打开至肺的水平，并且气管插管打开至比pa的高约5cm的水平。在重力等于20mmhg的情况下，将25ml含有500-kda葡聚糖(0.2mg/ml)的pbs或培养基灌注到肺中。在灌注期间，收集从pv插管和肺外周引流出的流体，分别为pv流体和外周流体。灌注后，气管插管被降低，允许积聚在气道中的流体作为气管流体被引流到单独的皮氏培养皿中。然后使用注射器将5ml空白灌注液施加到气管插管中。将移除注射器后被动地从气管插管引流出的流体作为bal流体收集。通过测量荧光强度和体积来定量pv、外周、气管和bal流体中的葡聚糖的总量。
[0171]
基于标准曲线从荧光强度计算葡聚糖浓度。pv流体中的葡聚糖被称为血管内葡聚糖，而外周、气管和bal流体中的葡聚糖被称为血管外葡聚糖。在新鲜分离的尸体大鼠肺(n＝3)、无细胞大鼠肺(n＝3)和暴露于6小时冷局部缺血后的尸体大鼠肺(n＝4)上进行葡聚糖灌注和bal测定。6小时冷局部缺血是通过将新鲜分离的大鼠肺在冰冷的pbs中在4℃下孵育6小时产生的。还在培养的第3、6和8天对huvec-hmsc再生大鼠肺(n＝3)进行葡聚糖灌注和bal测定，并且在培养的第2、4和6天对hipsc再生大鼠肺(n＝3)进行葡聚糖灌注和bal测定。
[0172]
使用pressuremat一次性使用传感器(pendotech)，每天测量在huvec-hmsc(n＝3)和hipsc(n＝3)再生大鼠肺中的pa压力，并使用hart-regen软件(哈佛装置公司)记录。在每次测量之前，pa灌注暂停5至10分钟，使压力回到并稳定在基线，并且记录基线压力5分钟。然后，以4ml/min重新起始pa灌注，并且记录pa压力持续2小时。在每次测量结束时，pa灌注再次暂停5分钟以确保记录前后压力基线没有显著的漂移。通过将灌注期间的平均压力减去基线压力来计算pa压力。
[0173]
为了测量湿/干比，将每只肺的副肺叶解剖出来，并放置在干燥的塑料表面上持续
30秒，使流体从主血管引流出，并且然后测量湿重。在冻干过夜后测量相同的副肺叶的干重。通过将湿重除以干重计算湿/干比。在葡聚糖灌注和bal测定之后即对尸体大鼠肺(n＝3)、无细胞大鼠肺(n＝3)和暴露于6小时冷局部缺血后的尸体大鼠肺(n＝4)进行湿/干比的测量。在培养结束时对huvec-hmsc(n＝3)和hipsc(n＝3)再生肺进行湿/干比的测量。
[0174]
对在免疫抑制下的sprague-dawley大鼠(350-400g)进行再生大鼠肺的原位移植。免疫抑制是通过从移植前一天开始以10mg/kg/天皮下注射在90％橄榄油(西格玛奥德里奇公司)和10％乙醇(西格玛奥德里奇公司)中制备的环孢菌素a(西格玛奥德里奇公司)来实现。如前所述并作修饰2来进行原位移植。简言之，就在移植前在20mmhg下用100ml冰冷的肝素化(10单位/ml)pbs冲洗再生肺移植物(对于huvec-hmsc再生肺n＝3，对于hipsc再生肺n＝3)。解剖再生的左肺，将左主支气管结扎，并在左主pa和pv中放置16g套箍。将受体鼠以右侧卧位放置于加热垫上，用5％异氟烷(雅培公司(abbott))麻醉，插入16g气管内管(贝克顿迪金森公司(becton-dickinson))，并用啮齿动物呼吸机(哈佛装置公司)通气，供给100％o2(airgas)。通过皮下注射进行全身肝素化。左前胸廓切开术后，鉴定左主支气管，将其结扎并在结扎的远侧切开。鉴定左主pa和pv，周围解剖并靠近左门切开。将肺动脉和肺静脉套箍插入受体的血管，并用7-0丝线缝合(爱惜康公司(ethicon))。在移植后2小时皮下给予依诺肝素(2mg/kg，novapuls)，并且然后每天两次给予。移植后3天，将受体大鼠安乐死，并将再生的移植物解剖出来。通过荧光微血管造影术分析移植物的可灌注性。
[0175]
结果
[0176]
使用系列支气管肺泡灌洗液(bal)来进行用以评估在培养分离的器官的过程中再生肺的血管功能的非侵入性方法，以研究再生肺的可灌注性和屏障功能。500-kda葡聚糖已被用作研究肺微血管水渗透性和血管可灌注性的示踪剂，并且其外渗指示大分子泄漏。fitc缀合的500-kda葡聚糖被用作体外肺灌注的示踪剂，以评价去细胞化前后的肺血管可灌注性和泄漏并评估无细胞支架再内皮化后的潜在变化。将葡聚糖溶液在20mmhg下灌注通过pa，并且然后将5ml空白灌注液施加到气管中以收集泄漏到气道隔室中的葡聚糖(图7f)。然后通过测量荧光强度和体积来定量从pv、气管(包括bal)和肺外周引流出的葡聚糖的总量。
[0177]
作为原理论证，这种体外灌注和bal测定是对新鲜分离的尸体肺、暴露于6小时冷局部缺血后的肺和无细胞肺进行的。尸体肺在血管隔室内保留了100.0％
±
0.0％的葡聚糖，而无细胞肺为10.0％
±
8.0％(p《0.01，与尸体肺相比)(图7g)，这是预期的，因为对葡聚糖的屏障功能依赖于有活力和功能性的内皮，而在恒定灌注过程中随着时间葡聚糖跨裸露的血管基底膜扩散。6小时冷局部缺血后的肺显示出受损的屏障功能和87.0％
±
5.4％的葡聚糖保留，其显著低于尸体肺(p《0.05)并显著高于无细胞肺(p《0.01)的葡聚糖保留(图7g)。接下来，在两阶段体外培养期间在3个不同时间点(第3、6和8天)对huvec-hmsc再生肺进行体外灌注和bal测定。随着培养时期的推移，huvec-hmsc再生肺的葡聚糖保留从第3天的52.8％
±
4.2％、第6天的75.9％
±
3.1％到第8天的80.2％
±
5.3％逐渐增加(图7h)。在培养结束时，huvec-hmsc再生肺中葡聚糖保留显著高于无细胞肺(p《0.01)、显著低于尸体肺(p《0.05)且略低于(但不是显著不同于)6小时冷局部缺血后的肺(p＝0.16)的葡聚糖保留。在观察到的培养中，血管隔室内葡聚糖保留的增加指示屏障功能与血管成熟的改进。
[0178]
在改进屏障功能的同时，血管阻力在培养过程中发生稳步下降。例如，恒定速率灌
注(4ml/min)下的每日pa压力监测揭示随着培养时期的推移pa压力的稳步下降，并且与第1天相比，培养结束时达到48.2％
±
15.0％(p《0.05)(图7i)。作为全局移植物流体稳态的标记物，测量了在培养分离的器官结束时的湿干比。再生肺的湿/干比为26.6
±
1.9，显著低于无细胞肺(55.7
±
7.9，p《0.05)、并且显著高于尸体肺(9.2
±
0.2，p《0.01)和6小时冷局部缺血后的肺(12.8
±
2.0，p《0.01)的湿/干比(图7j)。这可以通过以下事实来解释，即肺流体平衡依赖于内皮、间质和上皮功能，如肺泡内流体的主动吸收和间质流体通过淋巴清除
26,27
。在本实验中，只有一种活性组分即内皮再生。
[0179]
在另一个实验中，将huvec-hmsc再生的左肺移植到在免疫抑制下的sprague-dawley大鼠的原位位置中。再灌注后即可观察到遍及整个再生移植物的均匀血液灌注(图7k)。如通过荧光微血管造影术确认的，肺血管在移植后3天保持可灌注(图7l)。
[0180]
实例5
[0181]
衍生临床相关的内皮细胞和血管周细胞及其在小动物模型中用于肺血管再生的用途
[0182]
本实例的目的是基于二维培养证明可放大规模的细胞分化方案。示例性可放大规模的细胞分化方案将以下并入：在分化前用chir99021进行的wnt活化、在分化结束时用sb431542进行的tgf-β抑制和在整个分化过程中的低氧培养。低氧培养条件被定义为在培养细胞的孵育器中4％o2。
[0183]
方法-衍生临床相关的内皮细胞和血管周细胞
[0184]
在低氧(4％)条件下进行内皮细胞和血管周细胞分化。在第2天，将bjrips细胞通过accutase(干细胞技术公司)解离成单个细胞，重悬于含10μm rock抑制剂(y-27632，开曼化学品公司)的mtesr
tm
1中，并以200,000个细胞/孔接种到涂覆有胶原iv(bd生物科学公司)的6孔板上。在第1天，将bjrips细胞用mtesr
tm
1中的chir99021(12μm，斯泰姆特公司)处理24小时。从第0天开始，将bjrips细胞在完全分化培养基中分化，培养基每隔一天进行更换。完全分化培养基是补充有以下项的imdm(吉博科公司)：20％bit 9500(干细胞技术公司)，单硫代甘油(450μm，西格玛奥德里奇公司)，1％mem非必需氨基酸(吉博科公司)，1％glutamax，1％p/s，重组人bmp4(50ng/ml，派普泰克公司)、vegf(50ng/ml，派普泰克公司)和bfgf(50ng/ml，派普泰克公司)1。从第4天到第6天，完全分化培养基进一步补充sb431542(10μm，斯泰姆特公司)。
[0185]
在分化的第6天，将细胞使用tryple(吉博科公司)解离为单个细胞，用人cd31-bv605和cd140b-pe抗体(bd生物科学公司)或适当的同种型对照进行染色，并通过荧光活化细胞分选(facs)使用facsariaii(bd生物科学公司)分离。bjrips衍生的内皮细胞(hipsc-ec)被定义为cd31

cd140b-群体，并且bjrips衍生的血管周祖细胞(hipsc-ppc)被定义为cd31-cd140b

群体。facs分离后，将hipsc-ec和hipsc-ppc在胶原蛋白i(bd生物科学公司)涂覆的烧瓶中使用egm-fbs-sb培养基培养，该培养基为不含氢化可的松的egm-2，补充有20％限定fbs(海克隆公司)、sb431542(10μm)和1％p/s。为了朝着平滑肌细胞样表型分化，将hipsc-ppc在平滑肌生长培养基-2(smgm2，龙沙公司)中培养6天。
[0186]
为了产生hipsc-ec的生长曲线，将150,000个hipsc-ec一式三份接种到胶原蛋白i涂覆的t75烧瓶上，并在egm-fbs-sb培养基中培养。在每次细胞传代过程中，对每个烧瓶的细胞数目进行计数并接种150,000个hipsc-ec以用于下一次传代。
[0187]
结果-衍生临床相关的内皮细胞和血管周细胞
[0188]
在成体肺中，cd31和cd140b分别标记内皮细胞和周细胞。通过流式细胞术针对两种标记物的表达测定分化的细胞。在分化结束时，所得细胞混合物由两个主要细胞类型组成：cd31

cd140b-内皮细胞(hipsc-ec，55.1％
±
4.2％)和cd31-cd140b

血管周祖细胞(hipsc-ppc，22.1％
±
2.9％)。这两个血管细胞类型构成了整个分化的77.2％
±
6.3％(图9b，c)，证明了这种朝着血管细胞类型分化的高效率和高特异性。hipsc-ec均匀地表达内皮标记物(cd31，ve-钙粘蛋白和kdr)，但不表达血管周标记物(cd140b)、平滑肌标记物(α-平滑肌肌动蛋白，α-sma)或造血标记物(cd45)(图9d和图10a-c)。
[0189]
已显示补充fbs的egm-2培养基可支持人血液衍生的内皮祖细胞的扩增。(melero-martin等人in vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells[人血液衍生的内皮祖细胞的体内血管发生潜力].blood[血液]109,4761-4768(2007))。已显示sb431542改进人胚胎干细胞衍生的内皮细胞的体外扩增。(james等人,expansion and maintenance of human embryonic stem cell-derived endothelial cells by tgfbeta inhibition is id1 dependent[通过tgfβ抑制来扩增和维持人胚胎干细胞衍生的内皮细胞是id1依赖性的].nat biotechnol.[自然生物技术]28,161-166(2010))。预计人肺含有2200亿个细胞，其中30％是毛细血管内皮细胞。在本文中所描述的培养基将20％fbs和sb431542二者组合，作为egm-2的补充剂(称为egm-fbs-sb培养基)。此egm-fbs-sb培养基允许将纯化的hipsc-ec有效扩增至足以用于工程化人尺寸的肺的水平(图9e)。
[0190]
在扩增结束时，hipsc-ec维持内皮标记物的均匀表达。纯化的hipsc-ppc均匀地表达cd140b，但不表达内皮cd31。超过一半的hipsc-ppc也表达周细胞标记物ng2(图9f)。
[0191]
周细胞是具有成为平滑肌细胞和其他间充质细胞的可塑性的多能细胞，这已在体内血管重塑和体外分化过程中观察到。为了显示这种潜力，通过将培养基转换为平滑肌生长培养基-2(smgm-2)，在hipsc-ppc中诱导平滑肌分化。取决于扩增细胞的目标数量，当在扩增培养基(egm-fbs-sb)中培养数天至数周时，hipsc-ppc保持增殖性并表达低水平的平滑肌标记物(α-sma和钙调理蛋白)。培养时期范围可以是从数天至数周，取决于有待从扩增实现的目标细胞数目。在smgm-2中培养6天后，hipsc-ppc变得较少增殖并表达高水平的α-sma和钙调理蛋白(图9g，9h)。
[0192]
方法-用hipsc-ec和hipsc-ppc再生的无细胞大鼠肺叶的两阶段培养
[0193]
将4000万个hipsc-ec与2000万个mcherry标记的hipsc-ppc混合，并如上所述从pa和pv二者接种到无细胞肺支架中。静态培养2小时后，从pa和pv二者以1ml/min重新起始灌注。从第1天开始，pv插管被释放，并且灌注切换到仅从pa以4ml/min，这保持到培养结束。在最初4天期间，将hipsc再生肺在补充有佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸酯(pma，50ng/ml，细胞信号传导技术公司(cell signaling technology))的血管生成培养基中培养，并且然后在稳定化培养基中再培养2天。在第6天收获hipsc再生肺以用于进行功能和组织学评估。
[0194]
为了使用hipsc衍生的细胞再生肺脉管系统，用hipsc-ec和ppc共同接种无细胞大鼠肺，并且依序将这些hipsc再生的肺在连续灌注下用血管生成培养基培养4天并且在稳定下再培养2天。已显示佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)协助有效的血管重塑，并且因此将血管生成培养基补充pma以用于hipsc再生肺培养，以促进内皮存活和血管重塑。
[0195]
结果：用hipsc-ec和hipsc-ppc再生的无细胞大鼠肺叶的两阶段培养
[0196]
培养结束时，遍及整个肺存在有活力的内皮网络。此外，通过转基因mcherry标记和cd140b表达确认hipsc-ppc到血管周空间的归巢(图11a，11b)。在hipsc再生肺中重建生理学顶端-基底极性，指示使用hipsc衍生的血管细胞形成血管腔(图11c)。与huvec-hmsc再生肺中的功能读出类似，随着培养时期的推移，hipsc再生肺中的葡聚糖保留逐渐增加，第2天达到39.6％
±
1.2％，第4天达到61.2％
±
4.2％并且第6天达到67.3％
±
2.5％(图11d)。每日pa压力监测指示，在培养的最初3天期间，相比于第1天，pa压力稳步下降，在第3天达到64.8％
±
10.6％，此后保持稳定(图11e)。hipsc再生肺的湿/干比为25.1
±
6.1(图11f)，与huvec-hmsc再生肺的湿/干比无显著差异(p＝0.83)。如通过荧光微血管造影术所指示，可在原位移植后3天检测到hipsc再生左肺内的可灌注血管(图11g)。
[0197]
总之，使用hipsc衍生的血管细胞，基于无细胞大鼠肺再生肺脉管系统，并实现与使用原代人内皮细胞和血管周细胞实现的那些相似的形态和功能里程碑。
[0198]
实例6
[0199]
再生人体尺度的肺脉管系统并评估肺组织的功能性
[0200]
本实例的目的是证明再生人体尺度的肺脉管系统的能力并评估肺组织的功能性。可放大规模的细胞分化方案将以下并入：在分化前用chir99021进行的wnt活化、在分化结束时用sb431542进行的tgf-β抑制和在整个分化过程中的低氧培养。
[0201]
方法-用hipsc-ec和hipsc-ppc再生的无细胞人肺叶的两阶段培养
[0202]
解剖去细胞化人肺的右上叶，并且使用带倒钩的鲁尔适配器(cole-parmer)对主pa和pv二者进行插管。通过用含人纤连蛋白(2.5μg/ml)的1l汉克氏平衡盐溶液以10ml/min从pa和pv二者灌注1小时来填装无细胞人肺叶，随后在汉克氏平衡盐溶液中洗涤并在培养基中平衡。将2.82亿个hipsc-ec和1.25亿个mcherry标记的hipsc-ppc混合并重悬于1l培养基中，并分到两个接种室中(每个接种室含有500ml细胞悬浮液)。在等于50mmhg的重力下同时从pa和pv二者接种细胞。静态培养2小时后，从pa和pv二者以10ml/min重新起始灌注。在最初4天期间将hipsc再生人肺叶在血管生成培养基(含有pma，50ng/ml)中培养，并且然后在稳定化培养基中再培养2天。在第6天收获hipsc再生人肺叶以用于进行功能和组织学评估。
[0203]
方法-在再生人肺中的刃天青灌注
[0204]
为了使hipsc再生人肺叶中的活细胞可视化，在培养的第6天进行刃天青灌注。简言之，将40ml的prestoblue试剂(分子探针公司(molecular probes))稀释在约1.5l的培养基中，并以10ml/min从pa和pv二者灌注通过再生人肺叶持续2小时。
[0205]
结果-在再生人肺中的刃天青灌注
[0206]
使用啮齿动物模型，将本文所述的方法放大以再生人体尺寸的肺的肺脉管系统。例如，将如上所述产生的2.82亿个hipsc-ec和1.25亿个hipsc-ppc的混合物递送至无细胞人肺叶的主pa和pv中(图12a，12b)。将重新接种的人肺叶在血管生成培养基(含有pma)中培养4天，并且然后在稳定化培养基中再培养2天。为了使整个肺叶中血管细胞的总体分布可视化并评价其活性，开发了刃天青灌注测定。基于刃天青的试剂在被活细胞代谢时变红，并因此指示活细胞的分布。在刃天青灌注2小时后，由红色突出显示再生人肺叶的超过60％的估计值，指示细胞化(图12b-iv)。这通过培养结束时的组织学分析确认，显示与大鼠肺再生
中实现的相似的最佳内皮分布(图12c)。还在再生人肺叶中重演了hipsc-ppc在血管网络周围的紧密缔合，由转基因mcherry标记和cd140b染色显示(图12d)。可以容易地检测血管腔结构(图12c)，并且通过荧光微血管造影术证明了它们的可灌注性(图12e)。总之，本文描述的和基于无细胞大鼠肺的细胞递送和器官培养策略可以放大以使用hipsc衍生的细胞再生人肺脉管系统。
[0207]
其他实施例
[0208]
应理解，虽然已经结合其详细描述对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围。应理解的是，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可做出诸多改变。因此，其他实施例也处于以下权利要求书的范围内。