1.本发明涉及疫苗领域，特别涉及一种同时诱导抗包括流感在内的多种病毒(例如冠状病毒，尤其是新冠病毒)的免疫应答的方法。
背景技术：
：：2.流行性感冒简称流感，是一种由流感病毒引发的急性呼吸道传染性疾病，主要分为季节性和大流行性(seasonalandpandemic)流感。据估计，全球流感感染患者中，成人占5-10％，儿童占20-30％。流感不仅造成了严重的疾病负担，还会造成巨大的直接与间接经济负担。3.流感病毒基因组分为8个节段，分别编码血凝素(ha)、神经氨酸酶(na)、基质蛋白1和2(m1和m2)、非结构蛋白1和2(ns1和ns2)、核衣壳蛋白(np)以及三个聚合酶复合体(pb1、pb2和pa)等10种蛋白质。根据核蛋白、m1和m2的抗原性差异，可将流感病毒分为甲、乙、丙三型，例如禽流感病毒(aiv)为甲型流感病毒(甲流病毒)。根据ha和na的抗原性不同，甲型流感可以分为18个h亚型和9个n亚型。这18个h亚型可以分为groupi类(h1、h2、h5、h6、h8、h9、h11、h12、h13、h16、h17、h18)和groupii类(h3、h4、h7、h10、h14、h15)。在这些亚型中已知可直接感染人的亚型为h1、h2、h3、h5、h7、h9和h10，引发高致病性禽流感的病毒均为h5和h7亚型。4.大多数针对流感病毒产生的保护性抗体都以ha蛋白为靶点，ha蛋白是一种由ha1和ha2结构域组成的三聚体表面糖蛋白。大多数ha1链形成球状的冠部，它包含受体结合部位，而ha2则形成茎部，支撑ha1且形成三聚体。虽然，ha冠部(ha1)在诱导中和抗体的产生时具有显著的免疫优势，但其自身极易发生变异导致病毒产生抗原飘移及至抗原变异，形成新的流感病毒亚型。ha2区域相对于ha1更为保守，目前分离出的针对h7n9ha2的中和抗体中3gbn对于甲型流感有广谱性保护，3sdy对于甲型流感groupii有广谱性保护，而4fqv则对甲型及乙型流感有广谱性保护。因此，h7n9的ha2作为诱导广谱性的流感中和抗体至关重要。5.目前，虽然有部分疫苗已经进入临床试验阶段，但疫苗的上市、生产和使用仍然是迫在眉睫的巨大挑战。6.冠状病毒包含四种结构蛋白，包括突刺蛋白(s蛋白)、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白。其中，s蛋白在病毒的附着、融合和进入过程中起着最重要的作用，也是抗体、进入抑制剂和疫苗的主要靶点。s蛋白介导病毒进入宿主细胞，首先通过s1亚基的受体结合域(rbd)与宿主受体结合，然后通过s2亚基融合病毒和宿主细胞膜。据who报道：冠状病毒疫苗免疫后的动物，再次暴露于活病毒时，可能发生更严重的症状。疫苗免疫产生的非中和抗体或较低的抗体水平可能会引起抗体依赖性增强效应(antibody-dependentenhancement,ade)，增强病毒致病性。因此，为了减少ade副作用，新冠病毒s蛋白中的rbd区将是最为有效的疫苗研发靶点。7.秋冬季是呼吸道疾病的高发季节，其中就包括了流感病毒感染，如何防范流感与新冠等呼吸道传染病叠加流行的风险成为重中之重。在感染性疾病的预防中，疫苗自问世以来就是最为有效和经济的措施，而目前常用的预防疫苗大部分都是以活化中和抗体为目标。因此，设计一种免疫原，使其能够同时活化针对多种流感病毒或同时抗流感病毒及其他病毒(诸如新冠病毒)的中和抗体是我们迫切需要探索和开发的方向。技术实现要素：8.本公开中提供了能够同时诱导针对包括流感病毒在内的多种病毒的免疫应答的免疫原性肽、其编码核苷酸分子、载体、宿主细胞、疫苗及其应用。9.在本公开的一个方面中，提供了一种免疫原性肽，其包含如下部分：10.(a)免疫原茎部：其包含流感病毒血凝素ha的ha2区域；11.(b)免疫原冠部：其包含病毒膜蛋白或其免疫原性片段，其中所述病毒膜蛋白的来源病毒不同于(a)中ha2区域的来源病毒；12.(c)可任选地，与前述部分连接的其他部分。13.在一些实施方式中，所述ha2区域的来源选自下组：h1～h18中任一种，尤其是来自于广泛流行的人流感h1、h2、h3以及多次出现的人感染禽流感h5与h7，例如源自2009年流行的h1(h1n1)、2013年流行的h7(h7n9)。14.在一些实施方式中，所述ha2区域的氨基酸序列如seqidno:1所示，或由具有seqidno:2所示序列的核苷酸分子编码。15.在一些实施方式中，所述病毒膜蛋白是免疫原性膜蛋白。16.在一些实施方式中，所述免疫原冠部的来源选自：来源不同于(a)中ha2区域的流感病毒；非流感病毒的其他病毒。17.在一些实施方式中，所述免疫原冠部的来源选自下组：冠状病毒(如新冠病毒)、艾滋病毒、流感病毒(例如流感病毒血凝素ha的ha1区域)、狂犬病毒、猪瘟病毒、蓝耳病病毒、麻疹病毒、埃博拉病毒、疱疹病毒、虫媒病毒(例如，寨卡病毒、流行性乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、登革病毒、汉坦病毒、出血热病毒)。18.在一些实施方式中，所述免疫原冠部的来源选自：冠状病毒sars-cov-2、sars-cov、mers-cov、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、bat-cov，例如包含冠状病毒的受体结合域的s1蛋白、或受体结合域(rbd)、或经改造的受体结合域(例如rbd区经末段半胱氨酸修饰形成srbd区)或其免疫原性片段。19.在一些实施方式中，所述免疫原冠部选自冠状病毒sars-cov-2的s1，尤其是来自于s1的rbd区(例如其序列如seqidno:3所示或由seqidno:4的核苷酸分子编码)或其修饰的rbd区(例如经末端cys修饰改造的srbd区，如seqidno:5所示肽段或由seqidno:6所示核苷酸分子编码)、或者rbd区的免疫原性片段(例如如seqidno:21所示肽段或由seqidno:22所示核苷酸分子编码)。20.在一些实施方式中，所述其他部分选自：免疫调节序列，例如il-2、il-7、il-12、il-18、il-21、gm-csf、cd40l、cd40刺激抗体、pd-1与pd-l1抗体、ctla4抗体、趋化因子cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl3、xcl1、ccl4、ccl20、霍乱毒素及其亚单位、细菌鞭毛蛋白、fimh、hivp24、hivgp41。21.在一些实施方式中，所述其他部分选自：使免疫原性肽能够形成纳米颗粒的部分，例如转铁蛋白(fn，例如seqidno:7所示的肽分子或由seqidno:8所示核苷酸分子编码)。22.在一些实施方式中，所述其他部分选自：信号肽，例如cd33、cd8、cd16、小鼠igg1抗体。23.在一些实施方式中，所述其他部分选自：使免疫原性肽能够表达在病毒载体表面的跨膜区，例如cd8跨膜区(cd8tm，例如seqidno:17所示的肽分子或由seqidno:18所示核苷酸分子编码)、ha2跨膜区、cd4跨膜区、gp41跨膜区。24.在一些实施方式中，所述其他部分选自：连接肽，例如(g4s)3、(g4s)n、gsagsaagsgef、(gly)6、efpkpstppgssggap、kesgsvsseqlaqfrsld、(gly)8、egkssgsgseskst。25.在一些实施方式中，所述其他部分选自：标签，例如his-tag、avitag、calmodulintag、polyglutamatetag、e-tag、flagtag、ha-tag、myc-tag、s-tag、sbp-tag、sof-tag1、sof-tag3、strep-tag、tctag、v5tag、t7tag、vsvtag、xpresstag、3xflagtag、isopeptag、spytag、snooptag和pnetag。26.在一些实施方式中，所述免疫原性肽包含：与ha2区域连接的rbd区或srbd区或其免疫原性片段，以及可任选的与前述部分连接的其他部分。27.在一些实施方式中，所述免疫原性肽包含：与ha2区域连接的rbd区或srbd区(例如seqidno:5所示的肽分子或由seqidno:6所示核苷酸分子编码)以及fn区(例如seqidno:7所示的肽分子或由seqidno:8所示核苷酸分子编码)；与ha2区域连接的rbd区或srbd区以及cd8跨膜区(例如seqidno:17所示的肽分子或由seqidno:18所示核苷酸分子编码)；与ha2区域连接的rbd区免疫原性片段(例如seqidno:21所示的肽分子或由seqidno:22所示核苷酸分子编码)以及fn区。28.在一些实施方式中，所述免疫原性肽的氨基酸序列如seqidno:9或15或25所示，或者所述免疫原性肽的编码序列如seqidno:10或16或26所示。29.在一些实施方式中，本技术采用h7n9病毒的ha2区连接新冠病毒的rbd区或其免疫原性片段作为免疫原，同时对免疫原进行进一步修饰，例如rbd区加入二硫键、融合蛋白、融合细胞因子，进而同时诱导抗流感病毒和新冠病毒的中和抗体。30.在一些实施方式中，本技术提供了一种同时针对流感及新冠的免疫原性肽，其包括h7n9病毒血凝素ha的ha2区及sars-cov-2病毒刺突蛋白s的rbd区，所述rbd区可进一步经半胱氨酸修饰形成srbd区。31.在一些实施方式中，所述经半胱氨酸修饰为在rbd结构域的根部增加一对半胱氨酸，使之能够形成二硫键。32.在本公开的一个方面中，提供了一种核苷酸分子，其编码本文的免疫原性肽。33.在一些实施方式中，所述ha2区域的编码序列包含seqidno:2所示的核苷酸序列；所述免疫原冠部的编码序列包含seqidno:4所示核苷酸序列或seqidno:6所示的核苷酸序列或seqidno:22所述的核苷酸序列；和/或所述其他部分的编码序列包含seqidno:8所示或seqidno:18所示的核苷酸序列。34.在一些实施方式中，所述核苷酸分子的序列如seqidno:10或16或26所示。35.在本公开的一个方面中，提供了一种载体，其包含本文的核苷酸分子。36.在本公开的一个方面中，提供了一种宿主细胞，其包含本文核苷酸分子或载体或能表达本文所述的免疫原性肽。37.在一些实施方式中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞或昆虫细胞，如hek293、hela、k562、cho、ns0、sp2/0、per.c6、vero、rd、bhk、ht1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5细胞；highfive、sf9、se301、seizd2109、seucr1、sf9、sf900 、sf21、bti-tn-5b1-4、mg-1、tn368、hzam1、bm-n、ha2302、hz2e5以及ao38。38.在本公开的一个方面中，提供了一种能同时诱导针对流感病毒和另一非流感病毒或非同种流感病毒的免疫应答的疫苗，其包含本文所述的免疫原性肽、核苷酸分子、载体和/或宿主细胞。39.在一些实施方式中，所述疫苗为核酸疫苗(dna或rna疫苗)、重组蛋白亚单位疫苗、重组病毒载体疫苗、重组细菌载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、纳米颗粒疫苗、细胞载体疫苗。40.在一些实施方式中，所述疫苗为病毒载体疫苗，所述病毒载体选自：痘病毒(例如天坛株、北美疫苗株、惠氏衍生株、李斯特株、安卡拉衍生株、哥本哈根株和纽约株)、腺病毒(ad5、ad11、ad26、ad35、adc68或其修饰变体)、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、呼肠弧病毒、弹状病毒、森林脑炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒。41.在一些实施方式中，所述疫苗包含佐剂或与佐剂联合使用，例如所述佐剂选自：铝佐剂、霍乱毒素及其亚单位、寡脱氧核苷酸、锰离子佐剂、胶体锰佐剂、弗氏佐剂、mf59佐剂、qs-21佐剂、polyi:c及其他tlr配体、gm-csf、il-2、il-3、il-7、il-11、il-12、il-18、il-21。42.在一些实施方式中，所述疫苗的形式适于肌肉接种、皮内接种、皮下接种、滴鼻、雾化吸入、生殖道、直肠、口服或上述不同接种方式的组合(例如肌肉注射 滴鼻)。43.在一些实施方式中，所述疫苗的形式适于进行2种或以上的组合接种(例如联合接种或序贯接种)，如与冠状病毒(例如sars-cov-2、sars-cov、mers-cov、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、bat-cov)的s或s1疫苗进行前后序贯接种，或与流感病毒的ha或ha2(例如源自h1～h18中任一种的ha或ha2)疫苗进行前后序贯接种。44.在本公开的一个方面中，提供了本文所述的免疫原性肽、核苷酸分子、载体和/或宿主细胞在制备用于同时预防或治疗流感病毒和另一非流感病毒的药物中的应用。45.在本公开的一个方面中，还提供了本公开的免疫原性肽、核苷酸分子、载体和/或宿主细胞，其用于同时预防或治疗流感及新冠病毒感染。46.在本公开的一个方面中，还提供了一种同时预防或治疗流感及新冠病毒感染的方法，所述方法包括给予有需要的对象本公开的免疫原性肽、核苷酸分子、载体、宿主细胞和/或疫苗。47.在一些实施方式中，所述疫苗为核酸疫苗(dna或rna疫苗)、重组蛋白亚单位疫苗、重组病毒载体疫苗、重组细菌载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、纳米颗粒疫苗、细胞载体疫苗。48.在一些实施方式中，所述疫苗包含佐剂或与佐剂联用，所述佐剂包括但不限于：铝佐剂、霍乱毒素及其亚单位、寡脱氧核苷酸、锰离子佐剂、胶体锰佐剂、弗氏佐剂、sas佐剂、mf59佐剂、qs-21佐剂、polyi:c及其他tlr配体、gm-csf、il-2、il-3、il-7、il-11、il-12、il-18、il-21等。49.在一些实施方式中，所述疫苗的形式适于如下接种方式：肌肉接种、皮内接种、皮下接种、滴鼻、雾化吸入、生殖道、直肠、口服或其任意组合。50.在一些实施方式中，采用一种或多种所述疫苗进行接种，例如联合接种或前后序贯接种。51.在一些实施方式中，采用一种或多种所述疫苗与其他针对新型冠状病毒或流感的疫苗进行接种，例如所述其他疫苗包括针对冠状病毒s或s1的疫苗，例如所述的s或s1来自于包括但不限于sars-cov-2、sars-cov、mers-cov、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、bat-cov等；所述其他疫苗包括针对流感病毒ha或ha2的疫苗，例如所述的ha或ha2来自包括但不限于h1-h18。52.在一些实施方式中，所述疫苗包含核酸疫苗(dna或rna疫苗)与腺病毒载体疫苗的组合。53.在一些实施方式中，所述疫苗包含pcdna3.1-s与adc68-rhaf的组合。在一些实施方式中，所述疫苗组合中的组分前后序贯接种，优选先接种dna疫苗。54.在本公开的一个方面中，提供了一种制备同时针对流感及新冠病毒感染的疫苗的方法，所述方法包括：55.(a)提供本公开的免疫原性肽、核苷酸分子和载体；56.(b)将(a)中所提供的活性物质与免疫学上或药学上可接受的载体组合。57.在本公开的一个方面中，提供了一种同时诱导抗流感以及包含冠状病毒在内的其他病毒免疫应答的方法，其中，采用流感病毒血凝素ha的ha2区域作为免疫原茎部与其他病毒或毒株膜蛋白作为冠部组成的融合蛋白作为疫苗免疫原，以同时诱导抗流感及其他病毒免疫应答。58.在一些实施方式中，ha2免疫原选自包括但不限于h1-h18，尤其是来自于广泛流行的人流感h1、h2、h3以及多次出现的人感染禽流感h5与h7；59.在一些实施方式中，ha2免疫原来自于2009年流行的h1、2013年流行的h7。60.在一些实施方式中，ha2免疫原来自于2013年流行h7的早期毒株的ha2序列以及与该序列同源性超过80％全长或片段。在一些实施方式中，ha2免疫原可包含seqidno:1所示的氨基酸序列或可由具有seqidno:2的编码序列所编码。61.在一些实施方式中，与ha2连接的冠部免疫原来自于包括但不限于冠状病毒、艾滋病毒、流感病毒、狂犬病毒、猪瘟病毒、蓝耳病病毒、麻疹病毒、埃博拉病毒、疱疹病毒、虫媒病毒(寨卡病毒、流行性乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、登革病毒、汉坦病毒、出血热病毒)。62.在一些实施方式中，与ha2连接的冠部免疫原选自冠状病毒包括但不限于sars-cov-2、sars-cov、mers-cov、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、bat-cov等，尤其是包含冠状病毒的受体结合域的s1蛋白、或受体结合域(receptorbindingdomain,rbd)、或经改造的受体结合域。63.在一些实施方式中，与ha2连接的冠部免疫原选自冠状病毒sars-cov-2的s1，尤其是来自于s1的rbd区或与其同源性超过90％的全长与片段。在一些实施方式中，rbd区免疫原可包含seqidno:3所示的氨基酸序列或可由具有seqidno:4的编码序列所编码。在一些实施方式中，rbd区免疫原可包含seqidno:5所示的氨基酸序列或可由具有seqidno:6的编码序列所编码。64.在本公开的一个方面中，提供了一种同时诱导抗流感及包含冠状病毒在内的其他病毒免疫应答的方法，其包括，将本技术的免疫原与其他序列共表达，共表达方式可以为融合表达，也可以是单独阅读框架表达，从而进一步增加抗病毒种类，或提高免疫原诱导免疫应答能力，预防多种病毒感染。65.在一些实施方式中，与本技术的免疫原连接的序列：来自于包括但不限于不同的冠状病毒、流感病毒、艾滋病毒、狂犬病毒、猪瘟病毒、蓝耳病病毒、麻疹病毒、埃博拉病毒、疱疹病毒、虫媒病毒(寨卡病毒、流行性乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、登革病毒、汉坦病毒、出血热病毒)，尤其是与活化t细胞应答的免疫原共表达，制备能够同时激活中和抗体与t细胞应答的复合疫苗；为免疫调节序列，包括但不限于il-2、il-7、il-12、il-18、il-21、gm-csf、cd40l、cd40刺激抗体、pd-1与pd-l1抗体、ctla4抗体、趋化因子cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl3、xcl1、ccl4、ccl20、霍乱毒素及其亚单位、细菌鞭毛蛋白、fimh等；提供形成纳米颗粒的特征，包括但不限于转铁蛋白(ferritin)。66.在本公开的一个方面中，提供了一种同时诱导抗流感及包含冠状病毒在内的其他病毒免疫应答的方法，其包括将本文所述的免疫原单独、或与本文所述的共表达分子联合，用于制备包括但不限于核酸疫苗(dna或rna疫苗)、重组蛋白亚单位疫苗、重组病毒载体疫苗、重组细菌载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、纳米颗粒疫苗、细胞载体疫苗等。67.在本公开的一个方面中，提供了一种同时诱导抗流感及包含冠状病毒在内的其他病毒免疫应答的方法，其包括给予本文所述的免疫原性肽、其编码核苷酸分子、载体、宿主细胞或疫苗。68.在一些实施方式中，用2种或以上所述疫苗的组合进行接种，既可以联合接种，也可以前后序贯接种。在一些实施方式中，将本文的疫苗与冠状病毒s或s1所制备的疫苗进行前后序贯接种，所述的s或s1来自于包括但不限于sars-cov-2、sars-cov、mers-cov、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、bat-cov等；或将本文的疫苗与流感病毒ha或ha2所制备的疫苗进行前后序贯接种，所述的ha或ha2来自于包括但不限于h1-h18。69.本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本公开的发明构思和保护范围。本公开的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明70.下面结合附图对本公开作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本公开的实施方案，而不是为了局限本公开的范围。71.图1：s蛋白真核表达载体及srbd-ha2-hfn(rhaf)腺病毒的构建及融合蛋白的表达：72.a：pcdna3.1-s及padc68xy3-rhaf质粒构建图谱；73.b：pcdna3.1-s蛋白在293t细胞中成功表达，且腺病毒adc68-rhaf能成功表达rhaf蛋白。74.图2:adc68-rhaf在c57bl/6小鼠体内的免疫原性：75.实验所用小鼠为6-8周龄雌性c57bl/6，免疫原为质粒pcdna3.1-s及腺病毒adc68-rhaf。76.a：elisa方法检测免疫结束后第2周小鼠血清中结合抗体的滴度。横坐标为免疫组intc-fn的数量明显减少，且能看到切割生成副产物intn-pab(17kda)和gb1-intc(11kda)，表明形成纳米颗粒r545haf。105.图9：纳米颗粒r545haf在icr小鼠体内的免疫原性：106.实验所用小鼠为6-8周龄hace2 转基因小鼠，免疫原为质粒pcdna3.1-s及纳米颗粒r545haf。107.a：elisa方法检测免疫结束后第4周小鼠血清中结合抗体的滴度。横坐标为免疫组别，纵坐标为结合抗体的滴度，*表示p《0.05。108.b：第一针免疫后与第三针免疫后针对rbd蛋白的结合抗体数据，左图为整体提升，右图为单只小鼠的相应提升，*表示p《0.05。109.c：293t-ace2细胞检测免疫结束后第4周小鼠血清中中和抗体的滴度。横坐标为免疫组别，纵坐标为中和抗体的滴度(id50)，*表示p《0.05。110.d：第一针免疫后与第三针免疫后针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度，左图为整体提升，右图为单只小鼠的相应提升，*表示p《0.05。具体实施方式111.本公开涉及疫苗领域，特别涉及一种同时诱导抗流感以及包含冠状病毒在内的其他病毒免疫应答的方法。动物实验结果证实，本公开的疫苗安全，可持续产生高效价中和抗体，可用于流感及新冠的预防和治疗。112.本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本公开提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。113.如本文所用，在数值或范围上下文中的“约”表示所引用或要求保护的数值或范围的±10％。114.应理解，当提供参数范围时，本发明同样提供了在该范围内的所有整数及其十分位小数。例如，“0.1-2.5毫克/天”包括0.1毫克/天、0.2毫克/天、0.3毫克/天等直至2.5毫克/天。115.如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。116.免疫原性肽及其编码分子117.如本文所用，术语“免疫原性肽”是指能够同时诱导针对流感病毒和另一非流感病毒的免疫应答的肽，其包含如下部分：(a)免疫原茎部：其包含流感病毒血凝素ha的ha2区域；(b)免疫原冠部：其包含病毒膜蛋白或其免疫原性片段，其中所述病毒膜蛋白的来源病毒不同于(a)中ha2区域的来源病毒；(c)可任选地，与前述部分连接的其他部分。118.如本文所用，术语“连接”具有其广义含义，可包括例如融合、共表达、共价连接、偶联等各种方式。119.例如，如本文所用，术语“srbd-ha2免疫原性肽”、“针对流感病毒及新型冠状病毒sars-cov-2的免疫原性肽”可互换使用，是指包括流感血凝素ha的ha2区融合sars-cov-2病毒刺突蛋白s的rbd区、且具有激发针对流感病毒和新型冠状病毒sars-cov-2的结合抗体和中和抗体作用以及相应t细胞应答的肽。120.在一些实施方式中，免疫原性肽可为：(a)具有seqidno：1所示氨基酸序列和seqidno:3或5或21所示氨基酸序列的多肽；(b)(a)中所述多肽的同源或序列相似且具有相同或相似免疫原性的多肽，例如其中的各区段与seqidno：1所示氨基酸序列和seqidno:3或5或21所示氨基酸序列分别具有高于或等于80％，高于或等于85％，高于或等于90％，高于或等于95％，高于或等于96％，高于或等于97％，高于或等于98％，高于或等于99％的同源性或序列相同性，或者与(a)中的多肽具有高于或等于80％，高于或等于85％，高于或等于90％，高于或等于95％，高于或等于96％，高于或等于97％，高于或等于98％，高于或等于99％的同源性或序列相同性；(c)在(a)或(b)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有相同或相似免疫原性的由(a)或(b)衍生的蛋白质或多肽。121.在一些实施方式中，免疫原性肽可为：(a')具有seqidno：9或15或25所示氨基酸序列的多肽；(b')由seqidno:10或16或26所示核苷酸序列编码的多肽；(c')(a')和(b')中所述多肽同源或序列相似且具有相同或相似免疫原性的多肽，例如与(a')和(b')中的多肽具有高于或等于80％，高于或等于85％，高于或等于90％，高于或等于95％，高于或等于96％，高于或等于97％，高于或等于98％，高于或等于99％的同源性或序列相同性；(d')在(a')或(b')或(c')限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有相同或相似免疫原性的由(a')或(b')或(c')衍生的蛋白质或多肽。122.在一些实施方式下，免疫原性肽可包括与免疫原茎部或冠部连接的其他部分，以例如增强免疫原茎部或冠部或融合蛋白的稳定性、提高中和抗体应答、形成多聚体、增加细胞应答等。在一些实施方式中，其他部分可包括但不限于：病毒或宿主来源的蛋白，转铁蛋白(fn)、il-2、il-7、il-12、il-18、il-21、gm-csf、cd40l、cd40刺激抗体、pd-1与pd-l1抗体、ctla4抗体、趋化因子cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl3、xcl1、ccl4、ccl20、霍乱毒素及其亚单位、细菌鞭毛蛋白、fimh等。123.在一些实施方式中，免疫原性肽中还可包括信号肽、接头、分子标签等元件。例如，信号肽元件可指具有引导蛋白质分泌、定位和/或输送功能的氨基酸序列，其长度通常为5-30个氨基酸。在一些实施方式中，信号肽元件可选自：蛋白自身信号肽、cd33蛋白信号肽、cd8蛋白信号肽、cd16蛋白信号肽、小鼠igg1抗体信号肽、流感ha蛋白信号肽。例如，连接肽序列(或称接头)可指在本文的融合蛋白中起到连接不同元件作用的短肽，其长度通常为1～50(如5～50、5～40、10～40)个氨基酸。通常，连接肽不影响或严重影响本发明肽形成正确的折叠和空间构象。在一些实施方式中，连接肽元件可选自：(g4s)3接头、(g4s)n、gsagsaagsgef、(gly)6、efpkpstppgssggap、kesgsvsseqlaqfrsld、(gly)8、egkssgsgseskst。124.免疫原性肽也可包括其变异形式，例如一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能。125.免疫原性肽可在适当的环境和条件下通过重组表达产生，例如由本公开的编码核苷酸分子、载体、宿主细胞产生；也可通过化学合成等方式获得，只要其具有所需的氨基酸序列和免疫原性和反应性。126.如本文所用，术语“免疫原性肽编码分子”、“编码序列”等可互换使用，均是指编码本公开所述的免疫原性肽的核苷酸分子。127.在一些实施方式中，核苷酸分子可选自，例如：(i)具有seqidno：2所示核苷酸序列和seqidno:4或6或22所示核苷酸序列的核苷酸分子；(ii)在严格条件下与(i)杂交的分子；(iii)与(i)中序列同源或序列相似且能表达功能性免疫原性肽的核苷酸分子，例如其中的各区段与seqidno：2所示核苷酸序列和seqidno:4或6或22所示核苷酸序列分别具有高于或等于80％，高于或等于85％，高于或等于90％，高于或等于95％，高于或等于96％，高于或等于97％，高于或等于98％，高于或等于99％的同源性或序列相同性，或者与(i)或(ii)中序列具有高于或等于80％，高于或等于85％，高于或等于90％，高于或等于95％，高于或等于96％，高于或等于97％，高于或等于98％，高于或等于99％的同源性或序列相同性且能够表达功能性免疫原性肽的核苷酸分子；(iv)在(i)或(ii)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且能够表达功能性免疫原性肽的核苷酸分子。128.在一些实施方式中，所述核苷酸分子可选自，例如：(i)具有seqidno：10或16或26所示序列的核苷酸分子；(ii)在严格条件下与(i)杂交的分子；(iii)与(i)或(ii)中序列具有高于或等于80％，高于或等于85％，高于或等于90％，高于或等于95％，高于或等于96％，高于或等于97％，高于或等于98％，高于或等于99％的同源性或序列相同性且能够表达功能性免疫原性肽的核苷酸分子；(iv)在(i)或(ii)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且能够表达功能性免疫原性肽的核苷酸分子。129.如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×ssc，0.1％sds，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。130.本公开的核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本公开所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。131.载体和宿主细胞132.本公开还涉及包含本技术免疫原性肽编码核苷酸分子的载体，以及用该载体经基因工程产生的宿主细胞。133.通过常规的重组dna技术(science，1984；224：1431)，可利用本公开的编码序列可用来表达或生产重组的免疫原性肽。一般来说有以下步骤：134.(1)将本公开的编码核苷酸分子，或将含有核苷酸分子的重组表达载体转入合适的宿主细胞；135.(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；136.(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质或多肽。137.本公开中，术语“载体”与“重组表达载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、动物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。138.可采用本领域常规方法构建含免疫原性肽编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本公开中可采用诸如pcdna3.1载体、pires2-egfp载体、admaxtm、adc68等表达系统。139.此外，表达载体可包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。140.包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质或多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；动物细胞等。在本公开中，可采用例如选自下组的宿主细胞：hek293、hela、cho、k562、ns0、sp2/0、per.c6、vero、rd、bhk、ht1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5细胞；highfive、sf9、se301、seizd2109、seucr1、sf9、sf900 、sf21、bti-tn-5b1-4、mg-1、tn368、hzam1、bm-n、ha2302、hz2e5以及ao38。141.本公开的核苷酸分子在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是dna的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。142.在上面的方法中的重组多肽可在细胞内或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。143.疫苗和免疫偶联物144.本文中还提供了一种包含本公开的免疫原性肽、核苷酸分子、载体和/或宿主细胞的疫苗，或免疫组合物。该疫苗包含其形式能够被给予脊椎动物(优选哺乳动物)的本公开的免疫原性肽和/或核酸分子的配制品，并且其诱导提高免疫力的保护性免疫应答以预防和/或减轻流感病毒感染和其他非流感病毒感染(例如新型冠状病毒感染)和/或其至少一种症状。145.术语“保护性免疫应答”或“保护性应答”是指通过免疫原介导的针对传染原或疾病的免疫应答，通过脊椎动物(例如人)展现，预防或减轻感染或减少其至少一种疾病症状。146.术语“脊椎动物”或“对象”或“患者”是指脊索动物亚门的任何成员，包括但不限于：人和其他灵长类动物，包括非人灵长类动物诸如黑猩猩和其他猿和猴物种；家畜诸如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物诸如狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物诸如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟包括驯养、野生和猎鸟诸如鸡、火鸡和其他鹑鸡类鸟、鸭、鹅。术语“哺乳动物”和“动物”被包括在这个定义中，旨在涵盖成年、幼年以及新生个体。147.本文的疫苗可为重组蛋白疫苗、重组dna疫苗、重组病毒载体疫苗(例如腺病毒载体、痘病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、巨细胞病毒载体)、重组细菌载体疫苗、重组酵母载体疫苗或重组病毒样颗粒疫苗。在一些实施方式中，本文的疫苗选自重组dna疫苗、重组腺病毒载体或其中一种或两种的组合。148.在一些实施方式中，可采用选自下组的一种或多种疫苗或其组合：重组质粒疫苗(dna)，如包含rbd区的sars-cov2病毒刺突蛋白s编码序列的dna疫苗(例如pcdna3.1-s)；重组腺病毒载体疫苗，如adc68-rhaf；重组蛋白亚单位疫苗，例如纳米颗粒，r545haf。149.本文的疫苗组合物中包含有效量的本文免疫原。本公开的疫苗组合物中包含足以实现希望的生物效应的量的免疫原。术语“有效量”通常是指可以诱导足以诱导免疫力的保护性免疫应答以预防和/或减轻感染或疾病和/或以减少感染或疾病的至少一种症状的免疫原的量。150.本文的疫苗中还可包含佐剂。可采用本领域普通技术人员已知的佐剂，例如vogel等人，“acompendiumofvaccineadjuvantsandexcipients”(第2版)中所记载的佐剂(通过引用以其全文结合在此)。已知佐剂的例子包括但不限于：铝佐剂、霍乱毒素及其亚单位、寡脱氧核苷酸、锰离子佐剂、胶体锰佐剂、弗氏佐剂、mf59佐剂、qs-21佐剂、polyi:c及其他tlr配体、gm-csf、il-2、il-3、il-7、il-11、il-12、il-18、il-21等。151.本文的疫苗组合物还可包括药学上可接受的载体、稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂等辅料。例如，药学上可接受的载体是已知的，并且包括但不限于注射用水、盐溶液、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、无菌等渗水缓冲液及其组合。药学上可接受的载体、稀释剂和其他赋形剂可例如参见《雷明顿药物科学》(remngton'spharmaceutcalsciences)中。152.本文疫苗组合物的形式可适于系统性或局部(尤其是呼吸道内)给予。给予疫苗组合物的方法包括但不限于：肌肉接种、皮内接种、皮下接种、滴鼻、雾化吸入、生殖道、直肠、口服或其任意组合，例如先肌肉注射后滴鼻。153.在一些实施方式中，本文的疫苗预防、消除或减轻对象中的流感病毒及新型冠状病毒感染或其至少一种症状，例如呼吸道症状(如鼻塞、咽喉痛、声嘶)、头痛、咳嗽、痰、发热、啰音、喘息、呼吸困难、因感染引起的肺炎、严重急性呼吸综合症、肾衰竭等。154.本文中还涉及了一种免疫偶联物(也可称免疫缀合物)，其包含本文的免疫原以及与其偶联的其他物质。所述的其他物质可为靶向性物质(如特异性识别特定靶标的部分)、治疗性物质(如药物、毒素、细胞毒剂)、标记性物质(如荧光标记物、放射性同位素标记物)。155.在本公开中还提供了一种组合产品，其包括本公开的免疫原性肽、核苷酸分子、载体、宿主细胞和/或疫苗，且还可包含一种或多种有助于更好发挥预防和/或治疗流感病毒感染以及其他非流感病毒感染(例如新型冠状病毒感染)或其症状的功能或增强前述物质稳定性的其他物质。例如，其他物质可包括针对冠状病毒s或s1的其他疫苗，如来自于包括但不限于sars-cov-2、sars-cov、mers-cov、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、bat-cov的s或s1疫苗；针对流感病毒ha或ha2的其他疫苗，所述的ha或ha2来自于包括但不限于h1-h18；受益于t细胞活化和/或与t细胞的记忆性免疫反应的疾病或病症的其他活性物质。156.免疫方法157.本文还提供了一种用于预防和/或治疗流感病毒感染以及其他非流感病毒感染(例如新型冠状病毒感染)和/或其症状的方法，其包括：至少一次给予预防和/或治疗有效量的本公开的一种或多种疫苗。可采用的接种方式包括但不限于：系统性免疫接种方式，如肌肉注射、皮下注射和皮内注射等；呼吸道内免疫接种方式，如雾化、滴鼻等。在一些实施方式中，初次免疫采用系统性接种或呼吸道内接种，优选系统性接种。158.在本公开的一些实施方式中，每两次接种之间的间隔至少为1周，例如2周、4周、2个月、3个月、6个月或更长间隔。159.在一些实施方式中，采用dna疫苗进行初次免疫，并采用重组病毒疫苗进行一次或多次加强免疫。本公开的免疫方法可采用“初免-加强”或“初免-加强-再加强”的方式，可采用单一的全身系统免疫或呼吸道局部免疫方式，或采用两种免疫方式的组合。160.根据不同载体疫苗的特点，在一些优选的实施方式中，采用重组dna疫苗进行系统性初免，从而建立全身系统免疫应答，再用其他疫苗(例如重组腺病毒疫苗或重组痘病毒疫苗)进行一次或多种免疫加强，所述免疫加强可包括至少一次呼吸道内免疫加强(例如，采用腺病毒疫苗)。161.采用本文的免疫方法可在呼吸道局部和全身系统有效建立的疫苗特异性免疫应答，有助于增强疫苗保护的有效性。162.以药物包或试剂盒的形式提供本文的组合产品可，例如可将本文的一种或多种疫苗组合物或其一种或多种成分包装在一个或多个容器中，例如包装在指明组合物的量的密封容器诸如安瓿或小药囊中。可以液体、无菌冻干粉或无水浓缩物等形式提供疫苗组合物，可在临用前用适当液体(例如水、盐水等)对其进行稀释、复原和/或配制以获得用于给予至对象的适当浓度和形式。163.本公开中的组合产品可用于在呼吸道内局部诱导高水平抗原特异性cd8 t细胞应答的特征，使得其在预防呼吸道病原体感染、降低呼吸道病原体致病力和呼吸道肿瘤的预防治疗中均有应用前景。164.实施例165.下面结合具体实施例，进一步阐述本公开。应理解，这些实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。本领域技术人员可对本公开做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本公开的范围之内。166.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)或按照供应商所建议的条件。dna的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。167.除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本公开方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。168.下述实验中涉及到的实验动物、免疫方式、免疫原、假病毒及检测方法如下：169.i.实验动物：170.6-8周龄雌性c57/bl6及balb/c小鼠，购自上海吉辉实验动物饲养有限公司)；171.6-8周龄雌性hace2 icr小鼠，购自北京唯尚立拓科技有限公司)。172.ii.免疫方式：173.对小鼠左、右后肢分别进行肌肉注射；或进行滴鼻。具体剂量见实施例。174.iii.免疫原的选择：175.ha2序列来自于genebank:agi60292.1，s及rbd序列均来自genebank:nc_045512.2；hfn序列(人转铁蛋白)来自于genebank:m97164.1，具体序列见序列表。176.1.重组质粒疫苗(dna)：pcdna3.1-s、pcdna3.1(空载)；177.2.重组腺病毒载体疫苗：adc68、adc68-srbd-ha2-hfn(adc68-rhaf)、adc68-rbd-ha2-cd8tm。178.3.重组蛋白亚单位疫苗(纳米颗粒，protein)：r545haf179.iv.免疫原制备及免疫剂量：180.免疫原的制备参见实施例1181.在实施例中所采用的免疫原免疫剂量如下：182.1.重组质粒疫苗(dna)：100μg/只小鼠，100μl，溶于无菌生理盐水中；183.2.重组腺病毒载体疫苗：5e10vp/只小鼠，100μl(肌肉注射)；5e10vp/只小鼠，40μl(滴鼻)。184.3.重组蛋白亚单位疫苗(纳米颗粒，protein)：蛋白质(溶于无菌pbs中)与铝佐剂(aluminium，invivogen，货号5200)按照体积比1:1混合后进行免疫，20μg/只小鼠，100μl；185.v.免疫间隔：186.具体免疫间隔见下文表格。187.vi.sars-cov2包膜假病毒(pseudovirus)包装：188.1.转染前一天准备293t细胞，用于包装质粒的转染与表达。用dmem完全培养基将细胞稀释至5×106个/ml细胞，取1ml稀释好的细胞，铺在10cm的皿中，37℃，5％co2，培养过夜；189.2.吸取sars-cov2膜蛋白质粒pcdna3.1-s4μg和pnl4-3δenv骨架质粒8μg(nihaidsreagentprogram,3418)加入500μl双无(无血清、无双抗，双抗为青链霉素混合液)的dmem中，室温孵育5min；190.3.用双无dmem将24μlturbofect(thermofisherscientific)稀释，终体积为500μl/样品，室温孵育5min；191.4.将2与3两者混匀，1000μl/样品终体积，室温孵育20min，孵育结束后加到10cm培养皿的293t细胞中。6h后更换新鲜的15ml完全培养基，继续在细胞培养箱中培养48h；192.5.培养结束后，收集10cm皿的细胞培养上清，于15ml离心管里，然后4000g，4℃，离心10min，用0.45μm的滤器过滤到新的15ml离心管中，冻存于-80℃保存，滴定后备用。193.vii.构建稳定表达hace2受体的293t细胞：194.1.人工合成人源ace2(hace2)序列(genebank#ncbi_np_001358344.1),如seqidno:13所示，序列5’端带有age1酶切位点，3’端带有xba1酶切位点，合成片段与载体质粒phage-mcs-puro使用age1酶切(thermoscientific公司，货号fd1464)与xba1酶切(thermoscientific公司，fd0685)，并通过凝胶电泳后切胶回收，采用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(promega公司，货号a9282)回收酶切片段。195.2.基因回收产物与酶切线性化载体用t4dna连接酶的方法连接(thermoscientific公司，货号2011a)：将连接产物转化至大肠杆菌e.colistable，在含氨苄霉素的培养板上过夜生长。第2天，随机挑取单菌落进行测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出hace2基因的慢病毒表达质粒(phage-hace2-puro)。196.3.取10cm皿，在每个皿中接种约5×106个293t细胞，保证第二天转染时使细胞密度达90％为宜；将phage-hace2-puro、慢病毒包装质粒pspax以及vsvg三种质粒，按照质量比1：2：1的比例转染293t细胞。197.4.37℃，5％的孵箱培养48小时左右，具体时间根据细胞情况而定，收集细胞上清。将收集的细胞上清用0.45μm的滤器进行过滤，再用peg8000进行浓缩，即可得到较为纯化的hace2慢病毒。198.5.提前一天铺5×105个的293t细胞于12孔板的一个孔内，次日向铺好的细胞中加入步骤2中浓缩的病毒500μl，1000g，离心2小时。199.6.离心感染结束后，继续在37℃，5％的孵箱培养12小时左右，将培养基换成添加1μg/ml嘌呤霉素(puro)的细胞培养基培养，最后能够存活的细胞便是整合有hace2基因的293t细胞，并通过流式分选筛选出稳定表达hace2的293t细胞(能与s蛋白结合)。200.viii.检测方法：201.采血：202.最后一次免疫结束后第2/4周，将小鼠脱颈处死前，通过摘眼球的方法采集小鼠外周全血，收集于1.5mlep管中，室温静置使其自然凝血，凝固后的小鼠血清于7000g，离心15min。将小鼠血清转移至新的1.5mlep管中。实验前需要将样品在56℃灭活30min，来破坏血清内的补体活性。灭活前短暂离心，避免管壁和瓶盖上的样品残存。水浴液面要没过样品液面，但不能超过瓶盖。203.elsia检测结合抗体：204.1.用4℃预冷的elisa包被液稀释检测的抗原蛋白(s1，购自北京义翘神州科技有限公司；rbd，购自上海近岸生物科技有限公司)，至终浓度为1μg/ml。在elisa板的每孔加入100μl包被抗原溶液，4℃过夜；205.2.第二天，取出elisa板，弃掉包被液，用0.05％的pbst缓冲液洗板3次，每次220μl；206.3.洗涤完毕后，在吸水纸上拍干，每孔用200μlelisa封闭液(0.5％脱脂奶粉，pbst溶解)进行封闭，室温封闭2h；207.4.封闭结束后，用0.05％的pbst洗板3次，每次220μl；208.5.对于血清或者血浆，用elisa样品稀释液(0.5％脱脂奶粉，pbst溶解)稀释，从1:100起始，进行2倍比稀释。用未免疫的小鼠血清设置为阴性对照。设置空白孔，只加样品稀释液，每个样品需做2个复孔，每孔终体积为100μl，室温孵育3h；209.6.样品孵育结束后，继续用pbst洗板5次，每次220μl；210.7.用elisa封闭液(0.5％脱脂奶粉，pbst溶解)稀释相对应比例的二抗(山羊抗鼠，购自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号zb-2305)，每孔加入100μl，室温孵育1-1.5h；211.8.二抗孵育结束后，用0.05％的pbst洗板5次，每次220μl；212.9.取一对金银片opd底物，溶解于20ml去离子水中，随后每孔加入100μl，避光反应5min；213.10.显色结束后，用50μl2nmh2so4进行终止，在酶标仪上读取od492-od630值；214.11.以最后一个稀释度od492大于2倍的(negativemean sd)值对应的血清稀释比的倒数作为抗体滴度。215.293t-ace2细胞检测中和抗体：216.1.取96孔透明底黑板进行中和实验，第一列设置细胞对照(cc)(150μl)，第二列设置病毒对照(vc)(100μl)，其他均为样品孔，对血清样品进行倍比稀释，最终孔中体积为100μl。217.2.除细胞对照组外，每孔加50μlsars-cov-2假病毒稀释液，使每孔最终含假病毒为200tcid50。218.3.轻轻震荡混匀，将上述96孔底黑板置于细胞培养箱中，37℃，5％co2孵育1h。219.4.当孵育时间至20min时，开始准备293t-hace2靶细胞，并用完全培养基将细胞稀释至105个细胞/ml。220.5.当孵育时间至1h，向96孔透明底黑板中每孔加100μl靶细胞，使每孔细胞为104个。221.6.前后左右轻轻晃动96孔透明底黑板，使孔中的细胞均匀分散，再将板子放入细胞培养箱中，37℃，5％co2培养48h。222.7.培养48h后，从细胞培养箱中取出96孔透明底黑板，吸掉孔中上清，每孔加入100μlpbs清洗一遍，吸去pbs，每孔加入50μl1×的裂解缓冲液(购自promega公司cat#e153a)，室温在水平摇床上孵育30min使细胞充分裂解；223.8.加30μl荧光素酶的底物(购自promega公司，cat#e1501)于96孔黑板中，用仪器96微孔板发光-检测仪检测荧光素酶活性。224.9.导出荧光素读值，计算中和抑制率，结合中和抑制率结果，利用graphpadprism5.0软件计算id50。[0225][0226]elispot检测t细胞应答：[0227]小鼠脾脏单细胞分离：[0228]1)将小鼠仰卧，剖开右侧腹部皮肤，打开腹膜，取下小鼠脾脏，放入加有5ml完全rpim1640培养基的小平皿中；[0229]2)用无菌镊子将脾脏用无菌纱布包裹起来，用小弯镊夹起纱布，轻轻磨碎脾脏，可使脾细胞全部释放到培养基中；[0230]3)随后用5ml移液器将脾细胞悬液经纱布吸到无菌的15ml离心管中，800g，离心5min；[0231]4)弃掉离心后的上清，轻敲15ml离心管重悬细胞沉淀，每个离心管中加入3ml红细胞裂解液裂解红细胞，颠倒混匀后室温静置5min，使红细胞充分裂解又不会损伤脾细胞；[0232]5)裂红结束后，用5mlrpim1640培养基终止裂红。800g，离心5min；[0233]6)弃掉离心后的上清，用5mlrpim1640培养基洗1次，800g离心5min；[0234]7)弃离心后上清，脾细胞放于冻存液(90％fbs和10％dmso)中进行冻存备用。[0235]elispot实验操作按照mouseifn-γ/monkeyifn-γ说明书进行。[0236]1)用纯化ifn-γ抗体包被试剂盒(购自bd，货号551083)提供的millipore板，比例1：250，4℃过夜包被；[0237]2)甩掉板中的包被抗体溶液，用200μlrpmi1640完全培养基洗板一遍，随后用200μlrpmi1640完全培养基封闭液封闭millipore板，室温孵育2h；[0238]3)弃掉孔板中的封闭液，根据不同的实验设计，在millipore板中加入刺激肽库，50μl/孔，每条肽的浓度为5μg/ml。在阴性对照孔加入50μlrpmi1640完全培养基；阳性对照孔中加入50μl佛波醇酯类多克隆刺激剂(pma，购自sigma，货号fxp012)(终浓度100ng/ml)和离子霉素(ionomycin，终浓度2μg/ml)的rpmi1640完全培养基；[0239]其中，刺激肽库由苏州强耀生物科技有限公司合成，每条单肽为15个氨基酸，覆盖rbd序列，每五个单肽一个肽库，即总共13个肽库。其中，第1条肽为mptesivrfpnitnl(seqidno:19)，第2条肽为seqidno:3的rbd肽序列中的aa8-22，后面每条肽相比于其他肽氨基酸后移四位，即第3条肽为seqidno:3的rbd肽序列中的aa12-26，第4条肽为seqidno:3的rbd肽序列中的aa16-30……以此类推到第64条肽为seqidno:3的rbd肽序列中的aa256-270，第65条肽为avrdpqtleilditp(seqidno:20)。[0240]4)对小鼠脾细胞进行计数，将细胞调整为4×106个细胞/ml，每孔加入50μl细胞，最终使每孔的细胞数为2×105个细胞。将millipore板放入湿盒，在37℃5％co2培养箱中孵育20-22h，期间切勿摇动板子，以免造成细胞的偏移；[0241]5)培养孵育结束后，从培养箱中取出millipore板，将板中的液体弃掉，用预冷的去离子水洗两遍，每次220μl，每次清洗孵育3min；[0242]6)用0.05％的pbst(pbs 0.05％tween-20)洗板3次，每次200μl；[0243]7)用10％fbs的pbs抗体稀释液稀释生物素化检测抗体(biotinylateddetectionantibody，比例1：200)，每孔加入100μl，室温孵育2h；[0244]8)孵育结束后，再用0.05％的pbst洗板3次，每次220μl；[0245]9)将链霉亲和素-hrp偶联抗体用抗体稀释液进行稀释(比例1：100)，每孔加入100μl，室温孵育1h；[0246]10)孵育结束后，用0.05％的pbst洗板4次，每次220μl；[0247]11)再用pbs清洗板子2次，每次220μl；[0248]12)准备底物溶液(1ml的底物缓冲液加1滴底物溶液)，每孔加入100μl底物溶液。反应5-60min，孵育时间根据斑点形成的情况而定。[0249]13)用去离子水冲洗终止反应，室温晾干后进行计数；[0250]14)利用champspotiii型酶联斑点图像分析仪进行斑点形成细胞sfc(spotformingcell，sfc)的计数以及qc。[0251]实施例1：s蛋白真核表达载体及rhaf与rbd-ha2-cd8tm腺病毒表达载体的构建及蛋白质表达[0252]为了研究rbd的功能，我们构建了s蛋白的真核表达载体，并在体外细胞系中真核表达出成熟的蛋白质。[0253]首先，我们人工合成了s基因(其对应氨基酸序列如seqidno:11所示，基因序列如seqidno:12所示)，合成片段与载体质粒pcdna3.1(购自优宝生物)使用bamhi酶切(thermoscientific公司，fd0054)与not1酶切(thermoscientific公司，fd0596)，并通过凝胶电泳后切胶回收，采用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(promega公司，货号a9282)回收酶切片段。[0254]随后，基因回收产物与酶切线性化载体用t4dna连接酶的方法连接(thermoscientific公司，货号2011a)：将连接产物转化至大肠杆菌e.colistable，在含氨苄霉素的培养板上过夜生长。第2天，随机挑取单菌落进行测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出s蛋白的真核表达载体pcdna3.1-s，质粒构建图谱如图1a。[0255]我们进一步检测了s蛋白能否在真核细胞系293t中表达。[0256]首先，取6孔板，在每个孔中接种约6×105个293t细胞，保证第二天转染时使细胞密度达90％为宜；用pcdna3.1及pcdna3.1-s分别转染293t细胞(转染试剂turbofect)。37℃，5％的孵箱培养48小时左右，具体时间根据细胞情况而定，收集细胞，进行蛋白质免疫印迹(wb)鉴定，发现s蛋白在细胞中表达，大小为200kd左右；而pcdna3.1对照转染的细胞中不能检测到s蛋白的表达(图1b左图)。[0257]为了研究ha2的功能，我们构建了rhaf(即srbd-ha2-hfn融合蛋白)的腺病毒表达载体，并构建了腺病毒adc68-rhaf，且验证了腺病毒中rhaf的表达。[0258]首先，我们人工合成了rhaf基因(具体序列如seqidno:10所示，其中ha2部分基于如seqidno:2所示，srbd部分基于如seqidno:6所示的序列，hfn部分基于如seqidno:8所示的序列)。srbd-ha2表达在hfn的n端，两者之间采用g4s接头连接。合成片段与载体质粒padc68xy3(根据专利申请号201910777937.2中所记载方法构建，其中e1/e3缺失的复制缺陷型adc68载体的e4部分替换为adhu5的对应e4部分，该改造可增加重组黑猩猩腺病毒的产量而不改变腺病毒的血清学特性)，使用srfi酶切(neb公司，#r0629s)，并通过凝胶电泳后切胶回收，采用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(promega公司，货号a9282)回收酶切片段。[0259]随后，基因回收产物与酶切线性化载体用t4dna连接酶的方法连接(thermoscientific公司，货号2011a)：将连接产物转化至大肠杆菌e.colistable，在含氨苄霉素的培养板上过夜生长。第2天，随机挑取单菌落进行测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出rhaf的腺病毒表达载体padc68xy3-rhaf，质粒构建图谱如图1a。[0260]为了研究究竟是将rbd-ha2与hfn融合分泌出去还是将rbd-ha2通过cd8跨膜区(cd8tm)表达在腺病毒表面的效果更优越，我们构建了rbd-ha2-cd8tm的腺病毒表达载体，并构建了腺病毒adc68-rbd-ha2-cd8tm。其构建方法与adc68-rhaf一致，其氨基酸序列如seqidno：15所示，编码序列如seqidno:16所示。质粒构建图谱如图1a。[0261]我们进一步对重组腺病毒进行了包装及扩增。[0262]构建好的重组质粒padc68xy3-rhaf与padc68xy3-rbd-ha2-cd8tm分别经限制性内切酶pac1在37℃水浴中线性化3.5h，65℃灭活内切酶。用293a细胞铺六孔板，将线性化后的重组质粒分别以2.5μg、2μg、1.5μg/孔的量转染至293a细胞，培养11天左右噬斑出现，14天左右至细胞均被病毒感染时收样，细胞上清一起收集，置于-80℃反复冻融三次后，取少量感染293a细胞，westernblot验证目的蛋白的表达，发现有正确大小的蛋白表达(图1b)。[0263]将上述收集的腺病毒样品感染至1个t175细胞培养瓶的293a细胞，24h后收样，置于-80℃反复冻融三次后，感染至6个t175细胞培养瓶的293a细胞，以此类推进行大量扩增，扩增至36个t175细胞培养瓶时，收集细胞沉淀，弃上清，用10ml左右无血清无抗性的dmed培养基重悬，-80℃反复冻融三次后，采用氯化铯密度梯度离心法纯化腺病毒，分装后，-80℃保存。[0264]氯化铯密度梯度纯化腺病毒步骤：[0265](1)将扩增冻融后的腺病毒4℃，4000g，离心30min，取上清，用0.8μm的滤膜过滤；[0266](2)向超速离心管中加入3ml1.2mcsc溶液，将3ml1.4csc溶液用注射器从底部轻轻缓慢打入，铺好氯化铯梯度；[0267](3)将过滤后的腺病毒溶液轻轻加入超速离心管中，用pbs将液面补满，配平后放入sw41套筒中；[0268](4)选取sw41转子，4℃，25000rpm，离心2.5h，降速调为nobrake自然降速；[0269](5)待离心结束后，轻轻取出超速离心管，可见两条白色病毒条带，用注射器从侧面戳如超立管中，将下层条带吸出，注意避免吸到上层条带；[0270](6)将bio-gelp-6pggel脱盐胶注入液相色谱柱(liquidchromatographycolumns)中，待液体落完，留下2-3cm左右的胶为宜，加入pbs洗涤两遍；[0271](7)将上述吸出的病毒液加入脱盐胶，待液体落完后，加入2ml左右pbs洗脱，每个1.5mlep管收集3-4滴洗脱液；[0272](8)nanogrop2000测定每管洗脱液的od260值，将od260大于2的洗脱液合并，加入10％无菌甘油，分装；[0273](9)nanogrop2000测定分装后腺病毒溶液的od260值，od260值×1.1×1012/ml即为纯化后腺病毒的滴度；[0274](10)最终adc68-rhaf滴度为1.76×1013/ml，adc68-rbd-ha2-cd8tm滴度为1.48×1013/ml。[0275]实施例2：adc68-rhaf在c57bl/6小鼠体内的免疫原性[0276]分别采用dna-pcdna3.1-s及腺病毒adc68-rhaf免疫c57bl/6小鼠，在完成免疫2周后，评价免疫组合诱导针对rbd蛋白及h7蛋白的结合抗体滴度及针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度。同时评价针对rbd肽库的t细胞应答水平。[0277]将小鼠随机分为2组，根据免疫原分别命名为对照组、adc68-rhaf组。具体免疫组合如表1所示，免疫方式为肌肉注射。[0278]adc68-rhaf组产生针对rbd蛋白及h7蛋白的结合抗体滴度如图2a所示：针对rbd蛋白的结合抗体滴度均在10,000以上，最高的能够到50,000；针对h7的结合抗体滴度均值在6,000左右，最高的能够到达10,000。同时比较第二针免疫前后针对rbd蛋白的结合抗体数据可以发现，结合抗体滴度有了明显的提升(图2b)。[0279]adc68-rhaf组产生针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度如图2c所示：大部分滴度都在1000以上，均值在1360，有一小鼠中和抗体滴度高达12808，小鼠间存在个体差异性。同时比较第二针免疫前后针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度的数据可以发现，中和抗体滴度有了明显的提升(图2d)。[0280]adc68-rhaf组产生针对rbd肽库的t细胞应答如图2e所示：每百万个脾细胞里面分泌ifn-γ的细胞数在3,000左右。[0281]该实验证实，在c57bl/6小鼠体内，adc68-rhaf能够同时诱导针对流感及新冠的抗体，且能诱导针对新冠病毒的中和抗体及针对新冠病毒的t细胞应答。[0282]表1.adc68-rhaf在c57bl/6小鼠体内免疫原性测试的免疫方案[0283][0284]实施例3：adc68-rhaf在hace2 icr小鼠体内的免疫原性[0285]根据实施例2得出的结论，为了后续能够采用新冠病毒对小鼠进行攻毒保护验证，我们在hace2 icr小鼠体内验证了adc68-rhaf的免疫原性，在完成免疫2周后，评价免疫组合诱导针对rbd蛋白、h3蛋白及h7蛋白的结合抗体滴度和针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度。[0286]本实施例中所用hace2 icr小鼠是一种covid-19临床前模型，其为icr小鼠背景下构建的sars-cov-2易感人血管紧张素转换酶2(hace2)转基因小鼠，主要在其肺、心、肾和小肠中表达hace2。该小鼠模型是sars-cov-2治疗药物和疫苗研发的重要工具。[0287]实验步骤如下：将小鼠随机分为2组，根据免疫原分别命名为对照组和adc68-rhaf组。具体免疫组合如表2所示，免疫方式为肌肉注射。[0288]adc68-rhaf组合产生针对rbd蛋白、h3蛋白及h7蛋白的结合抗体滴度如图3a所示：针对rbd蛋白的结合抗体滴度大多在10,000以上，部分能够达到100,000；针对h3蛋白的结合抗体滴度大多在100以上，部分能够达到1000；针对h7蛋白的结合抗体滴度大多在6,400左右。[0289]第二针免疫结束后2周，adc68-rhaf组产生针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度如图3b所示：大部分都在1000左右，最高能到达2253。[0290]该实验证实，adc68-rhaf能够在hace2 icr小鼠体内同时诱导针对新冠及流感的结合抗体，且能够同时诱导针对流感h3及h7的结合抗体，验证了ha2抗体的广谱性。同时adc68-rhaf能够有效诱导针对新冠的中和抗体，具有开发为抗流感及新冠疫苗的良好前景。[0291]表2.adc68-rhaf在hace2 icr小鼠体内免疫原性测试的免疫方案[0292][0293]实施例4：adc68-rhaf和adc68-rbd-ha2-cd8tm在balb/c小鼠体内的免疫原性[0294]分别采用腺病毒adc68-rhaf及adc68-rbd-ha2-cd8tm免疫balb/c小鼠，在完成免疫2周后，评价免疫组合诱导针对rbd蛋白及h7蛋白的结合抗体滴度及针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度。同时评价针对rbd肽库的t细胞应答水平。[0295]将小鼠随机分为3组，根据免疫原分别命名为adc68组、adc68-rhaf组和adc68-rbd-ha2-cd8tm组。具体免疫组合如表3所示，免疫方式为肌肉注射。[0296]免疫结束后一周采集血清检测了针对rbd蛋白的结合抗体滴度，如图4a所示：adc68-rhaf组针对rbd蛋白的结合抗体滴度均值为4031，最高能到12,800；adc68-rbd-ha2-cd8tm组针对rbd蛋白的结合抗体滴度均值为10,160，最高的能够到25,600，此时adc68-rhaf组与adc68-rbd-ha2-cd8tm组之间没有显著差别。[0297]免疫结束后一周检测了针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度，如图4b所示：adc68-rhaf组中和抗体滴度均值为128，最高能到274；adc68-rbd-ha2-cd8tm组中和抗体滴度均值为97，最高的能够到348，此时adc68-rhaf组与adc68-rbd-ha2-cd8tm之间没有显著差别。[0298]随后持续检测免疫结束后两周针对rbd的结合抗体滴度及针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度。[0299]同时，试验进一步证明两种腺病毒adc68-rhaf及adc68-rbd-ha2-cd8tm：可有效诱导产生针对流感病毒针h7的结合抗体；可有效诱导针对sars-cov-2假病毒的中和抗体；同时，可诱导针对rbd肽库的t细胞应答。[0300]表3.adc68-rhaf和adc68-rbd-ha2-cd8tm在balb/c小鼠体内的免疫原性测试方案[0301][0302]实施例5：adc68-rhaf在balb/c小鼠体内不同接种方式产生的免疫原性[0303]分别采用dna-pcdna3.1-s及腺病毒adc68-rhaf免疫balb/c小鼠，在完成免疫2周后，评价免疫组合诱导针对rbd蛋白及h7蛋白的结合抗体滴度及针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度。同时评价针对rbd肽库的t细胞应答水平。[0304]将小鼠随机分为4组，根据免疫原及免疫方式分别命名为adc68肌肉组、adc68滴鼻组、adc68-rhaf肌肉组和adc68-rhaf滴鼻组。具体免疫组合如表4所示。[0305]免疫结束后两周采集血清及肺灌洗液检测针对rbd蛋白和针对流感病毒h7蛋白的结合抗体，包括igg和iga；同时检测针对sars-cov-2假病毒的中和抗体及针对rbd肽库的t细胞应答。[0306]表4.adc68-rhaf在balb/c小鼠体内不同接种方式产生的免疫原性测试方案[0307][0308][0309]实施例6.新冠病毒攻毒试验[0310]小鼠：南模生物ace2-转基因小鼠(c57bl/6-tgtn(cag-humanace2-ires-luciferase-wpre-polya)smoc)，雌性。[0311]毒株：sars-cov-2/human/chn/shanghai_ch-02/2020。[0312]委托第二军医大学进行攻毒试验[0313]免疫程序：将小鼠随机分为2组，根据免疫原分别命名为对照组和adc68-rhaf组。具体免疫组合如表5所示，免疫方式为肌肉注射。[0314]攻毒程序：免疫结束后1-2周对小鼠进行攻毒试验，攻毒后观察至5天，记录体重变化；攻毒后第三天每组各取3只小鼠处死，取肺组织，每只小鼠的左半边肺组织(一个大叶)用4％多聚甲醛固定48小时后做病理切片(h&e染色和组化)；每只小鼠的右半边肺组织(4个小叶)研磨测病毒载量qpcrrnacopies或者病毒滴度pfu/ml；第五天，若还有小鼠存活，则称完体重后全部处死。[0315]结果显示：从病毒载量来看，adc68-rhaf组相比于对照组降低了3.7个log，其中adc68-rhaf三只中有两只检测不到病毒载量(图5a)。同时，从h&e染色的结果来看，adc68-rhaf组肺组织病理要明显好于对照组，损伤更小且炎性浸润更少(图5b)。从体重来看，adc68-rhaf组没有改变，而对照组在第三天出现急剧下降(图5c)。从生存来看，adc68-rhaf组百分之百存活，而对照组全部死亡(图5d)。总体而言，所有数据均证明了adc68-rhaf疫苗对新冠有极佳的保护作用。[0316]表5.adc68-rhaf在hace2 c57bl/6小鼠体内免疫方案[0317][0318]实施例7.小鼠流感病毒攻毒试验[0319]小鼠：hace2 icr小鼠和balb/c小鼠，雌性。[0320]毒株：h7n9(a/shanghai/4664t/2013)、h3n2(a/hongkong/8/68)。[0321]在上海市公共卫生临床中心p2及p3实验室进行攻毒试验。[0322]免疫程序：将小鼠随机分为2组，根据免疫原分别命名为对照组和adc68-rhaf组。具体免疫组合如表6所示，免疫方式为肌肉注射。[0323]攻毒程序：免疫结束后对小鼠进行滴鼻攻毒，攻毒后持续观察14天，每日称重，记录体重变化，并得出生存曲线。[0324]结果显示，对于h7n9攻毒，adc68-rhaf组小鼠体重在第七天就出现回升，而对照组则一直在下降(图6a)。而从生存来看，adc68-rhaf组完全存活，而对照组则在第十天全部死亡(图6b)。对于h3n2的攻毒，该剂量对于小鼠是不致死的，因此只看体重变化，可以发现，adc68-rhaf组的体重下降明显少于对照组(图6c)。总的来说，adc68-rhaf可有效针对各试验毒株产生保护效果，具有广谱性。[0325]表6.adc68-rhaf在hace2 c57bl/6小鼠体内免疫方案[0326][0327]实施例8.r545-ha2-intn-pab-7xhis真核表达载体的构建及r545-ha2-intn-pab-7xhis蛋白表达[0328]从前面的实验中，我们发现腺病毒载体疫苗adc68-rhaf能够诱导针对新冠和流感的抗体，且均有保护效果。在后续的实验中，我们尝试更换载体，即直接采用纯化出的纳米颗粒来进行测试。为了提升蛋白的溶解度和复性率，我们选用了一个更短的rbd肽段(r545，其对应氨基酸序列如seqidno:21所示，基因序列如seqidno:22所示)，比前文的rbd更利于用于蛋白质的包涵体纯化。[0329]为了表达r545-ha2-intn蛋白，我们构建了r545-ha2-intn(r545ha-intn)的供体质粒，通过转座获得能在昆虫细胞系sf9中高效表达r545-ha2-intn的重组杆状病毒，并在昆虫细胞系sf9中真核表达出了成熟的蛋白质。[0330]首先，我们对r545-ha2-intn基因进行了昆虫sf9细胞密码子优化并加入了促溶标签pab(proteinabdomin)和7xhis标签，人工合成了r545-ha2-intn-pab-7xhis基因片段(擎科，其对应氨基酸序列如seqidno:23所示，基因序列如seqidno:24所示)，并插入至pfastbac-dual质粒(赛默飞thermo，10712024)ph启动子下游的酶切位点bamhi(thermoscientific公司，fd0054)和hindiii(thermoscientific公司，fd0504)之间，获得供体质粒pfbd-r545ha-intn-pab-7xhis(图7a)。[0331]随后我们用供体质粒pfbd-r545ha-intn-pab-7xhis转化至含有bacmid的dh10bac感受态(唯地)，涂含有x-gal、iptg、卡那霉素和庆大霉素抗性的平板，37℃培养2天后，挑取白色菌落获得并用m13-f/r引物进行pcr验证，挑取阳性克隆获得br545ha-intn-pab-7xhis。[0332]接着我们用br545ha-intn-pab-7xhis转染贴壁sf9(spodopterafrugiperdaclone9，atcc)细胞，具体步骤见cellfectiniireagent(invitrogen公司，货号10362100)转染步骤，获得p1代重按组杆状病毒vacr545ha-intn-pab-7xhis，将p1代vacr545ha-intn-pab-7xhis以1:100的体积比感染600mlsf-sfm培养基(沃美生物，sf10111-2)中悬浮培养的sf9细胞系，细胞密度2×106/ml，5天后收获细胞培养物，对r545ha-intn-pab-7xhis蛋白表达情况和分布进行检测(图7b)。结果显示，融合蛋白多在细胞内表达，因此后续采用包涵体纯化的方式进行纯化。[0333]实施例9.r545-ha2-intn-pab-7xhis蛋白纯化[0334]为了获取展示r545-ha2的纳米颗粒，我们首先对r545ha-intn-pab-7xhis蛋白进行了纯化，纯化步骤如下：[0335](1)将vacr545ha-intn-pab-7xhis感染后5天的600mlsf9细胞2000g，10min离心，收集细胞沉淀；[0336](2)将500μl100x蛋白酶复合物抑制剂(生工生物，货号：600387)加入50ml细胞裂解液(50mmtris-hclph＝8,0.5mnacl,1％np40)，超声波细胞粉碎机(scientz-iid)，15s打，20s停，20min，显微镜镜检至细胞完全破碎。[0337](3)8000g4℃离心20min，收集沉淀，用50mlph＝8.5的50mmtris-hcl重悬沉淀，加入50μl超级核酸酶(天地人和，pe001b)，室温孵育20min。[0338](4)8000g4℃离心20min，收集沉淀，用50ml2m尿素(50mmtris-hclph＝8，0.5mnacl，0.5％np40，0.05％tween)重悬沉淀，冰置5min。[0339](5)8000g4℃离心20min，收集沉淀，重复步骤(4)。[0340](6)8000g4℃离心20min，用50ml8m尿素(50mmtris-hclph＝8，0.5mnacl)重悬沉淀，冷库旋转过夜，充分溶解沉淀。[0341](7)8000g4℃离心20min，收集上清，过0.22μm的滤膜。[0342](8)取4mlhighaffinityni-chargedresinff(金斯瑞,l00666),用10ml平衡液(8m尿素，50mmtris-hclph＝8，0.5mnacl)混匀，800g，离心5min，收集beads，反复清洗3次。[0343](9)用2ml平衡液重悬beads，加入至8m尿素溶解物中，4℃旋转4h，2000g4℃离心10min，收集beads。[0344](10)用10ml的平衡液完全收集beads上重力柱，收集部分流传液检测挂柱效率。[0345](11)加入20ml平衡液洗柱，至完全流尽。[0346](12)加入20ml洗柱液(80mm咪唑，8m尿素，50mmtris-hclph＝8，0.5mnacl)，至完全流尽。[0347](13)加入11ml洗脱液(300mm咪唑，8m尿素，50mmtris-hclph＝8，0.5mnacl)，弃最开始1ml的流传液，收集10ml洗脱液。[0348](14)加入dtt至终浓度20mm，4℃旋转过夜。[0349](15)将洗脱液稀释10倍(蛋白浓度小于50μg/ml)，如下进行梯度复性：[0350]i.4m尿素，50mmtris-hclph＝8，0.5mnacl，0.4mm还原型谷胱甘肽，0.2mm氧化型谷胱甘肽，0.1％peg6000，5％甘油，4h。[0351]ii.2m尿素，50mmtris-hclph＝8，0.5mnacl，0.4mm还原型谷胱甘肽，0.2mm氧化型谷胱甘肽，0.1％peg6000，5％甘油，4h。[0352]iii.1m尿素，50mmtris-hclph＝8，0.5mnacl，0.4mm还原型谷胱甘肽，0.2mm氧化型谷胱甘肽，0.1％peg6000，5％甘油，4h。[0353]iv.50mmtris-hclph＝8，0.5mnacl，2mmdtt，0.1％peg6000，5％甘油，4h。[0354]v.50mmtris-hclph＝8，0.5mnacl，2mmdtt,5％甘油，4h。[0355]vi.pbsph＝7.4，2mmdtt，5％甘油4h。[0356](16)透析复性后的蛋白质用bca(赛默飞，货号：23235)法检测浓度。分装，存于4℃备用(长存于-80℃)。[0357]纯化后的蛋白质用wb和考马斯亮蓝染色均可看到正确大小(约70kda)的条带(图8a)。[0358]实施例10.纳米颗粒r545haf的组装[0359]内含肽(intein)是一种可以自我剪切的肽段。如前所述，r545-ha2的c端融合内含肽的n端形成重组蛋白r545ha-intn-pab-7xhis。铁蛋白(ferritin，fn)的n端与接头gbl-intein(gb1为proteing的bdomin在此作为促溶标签)的c端融合形成重组蛋白gbl-intc-ferrtin后自装配成24聚体构成纳米颗粒；内含肽的n端特异性识别并切除暴露在所述纳米颗粒表面的铁蛋白；外源蛋白与铁蛋白共价交联而得r545-ha2-hfn，其也呈24聚体的纳米颗粒状态。[0360]为了探究这一连接反应的有效性，我们先纯化了7xhis-gb1-intc-fn(按照专利申请号201910421408.9进行)，具体纯化方式如下：[0361](1)将pet28a7xhis-gb1-intc-fn转化至bl21(擎科生物，货号：cd901-02)表达菌株。[0362](2)挑取单克隆菌株，接种至20ml的卡纳氯霉素双抗lb培养基中，37℃摇床过夜培养。[0363](3)第二天1:25接种至500ml的卡纳氯霉素双抗的lb培养基，37℃、250rpm。[0364](4)培养至od为0.8-1.0时，加入0.2mmiptg进行诱导。25℃、250rpm诱导5h后，4000rpm、4℃、30分钟离心收集菌体，弃上清。[0365](5)用30ml的裂解液(50mmtris，ph7.5，150mmnacl，1％tritonx-100)重悬500ml的lb培养细菌，而后超声破碎。[0366](6)超声结束后，12000rpm、4℃、30分钟离心，收集上清。[0367](7)每30ml的溶液加入4.5g的硫酸铵，4℃混匀15min。[0368](8)12000rpm、4℃、30分钟离心，收集沉淀。[0369](9)加入30ml的tris-hcl溶液(0mmtris，ph7.5，150mmnacl)溶解4℃过夜。[0370](10)bca(赛默飞，货号：23235)测7xhis-gb1-intc-fn蛋白浓度，分装，存于4℃备用(长存于-80℃)。[0371]将纯化的7xhis-gb1-intc-fn与纯化的r545ha-intn-pab-7xhis(实施例9中所纯化)在dtt浓度2mm的条件下进行连接，结果如图8b。可见r545ha-intn-pab能通过连接fn形成大小约70kda(糖基化修饰前67kda)的连接产物r545haf(图8b左二泳道70kda条带)，并切割生成副产物intn-pab(17kda)和gb1-intc(11kda)。[0372]实施例10:纳米颗粒r545haf在hace2 小鼠体内的免疫原性[0373]我们在hace2 icr小鼠体内验证了纳米颗粒疫苗r545haf的免疫原性，在完成免疫后4周，评价免疫组合诱导针对rbd蛋白及h7蛋白的结合抗体滴度和针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度。[0374]本实施例中所用hace2 icr小鼠是一种covid-19临床前模型，其为icr小鼠背景下构建的sars-cov-2易感人血管紧张素转换酶2(hace2)转基因小鼠，主要在其肺、心、肾和小肠中表达hace2。该小鼠模型是sars-cov-2治疗药物和疫苗研发的重要工具。[0375]实验步骤如下：将小鼠随机分为2组，根据免疫原分别命名为对照组和纳米颗粒组。具体免疫组合如表7所示，免疫方式为肌肉注射。[0376]纳米颗粒组，即r545haf产生针对rbd蛋白的结合抗体滴度如图9a所示，免疫结束后第四周，针对rbd蛋白的结合抗体滴度大多在400,000以上，部分能够达到3,000,000；同时比较第一针免疫后与第三针免疫后针对rbd蛋白的结合抗体数据可以发现，结合抗体滴度有了明显的提升(图9b)。同时，r545haf也显示可有效诱导针对流感病毒h7的结合抗体。[0377]免疫结束后4周，纳米颗粒组产生针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度如图9c所示：大部分都在10,000左右，最高能到达92,172；同时比较第一针免疫后与第三针免疫后针对rbd蛋白的结合抗体数据可以发现，结合抗体滴度有了明显的提升(图9d)。[0378]该实验证实，纳米颗粒疫苗r545haf能够在hace2 icr小鼠体内同时诱导针对新冠及流感的结合抗体。同时纳米颗粒疫苗r545haf能够有效诱导针对新冠的中和抗体，具有开发为抗流感及新冠疫苗的良好前景。[0379]表7.r545haf在hace2 icr小鼠体内免疫原性测试的免疫方案[0380][0381]在本公开提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本公开的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本公开作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。[0382]附录：序列表信息[0383]当前第1页12当前第1页12
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：：2.流行性感冒简称流感，是一种由流感病毒引发的急性呼吸道传染性疾病，主要分为季节性和大流行性(seasonalandpandemic)流感。据估计，全球流感感染患者中，成人占5-10％，儿童占20-30％。流感不仅造成了严重的疾病负担，还会造成巨大的直接与间接经济负担。3.流感病毒基因组分为8个节段，分别编码血凝素(ha)、神经氨酸酶(na)、基质蛋白1和2(m1和m2)、非结构蛋白1和2(ns1和ns2)、核衣壳蛋白(np)以及三个聚合酶复合体(pb1、pb2和pa)等10种蛋白质。根据核蛋白、m1和m2的抗原性差异，可将流感病毒分为甲、乙、丙三型，例如禽流感病毒(aiv)为甲型流感病毒(甲流病毒)。根据ha和na的抗原性不同，甲型流感可以分为18个h亚型和9个n亚型。这18个h亚型可以分为groupi类(h1、h2、h5、h6、h8、h9、h11、h12、h13、h16、h17、h18)和groupii类(h3、h4、h7、h10、h14、h15)。在这些亚型中已知可直接感染人的亚型为h1、h2、h3、h5、h7、h9和h10，引发高致病性禽流感的病毒均为h5和h7亚型。4.大多数针对流感病毒产生的保护性抗体都以ha蛋白为靶点，ha蛋白是一种由ha1和ha2结构域组成的三聚体表面糖蛋白。大多数ha1链形成球状的冠部，它包含受体结合部位，而ha2则形成茎部，支撑ha1且形成三聚体。虽然，ha冠部(ha1)在诱导中和抗体的产生时具有显著的免疫优势，但其自身极易发生变异导致病毒产生抗原飘移及至抗原变异，形成新的流感病毒亚型。ha2区域相对于ha1更为保守，目前分离出的针对h7n9ha2的中和抗体中3gbn对于甲型流感有广谱性保护，3sdy对于甲型流感groupii有广谱性保护，而4fqv则对甲型及乙型流感有广谱性保护。因此，h7n9的ha2作为诱导广谱性的流感中和抗体至关重要。5.目前，虽然有部分疫苗已经进入临床试验阶段，但疫苗的上市、生产和使用仍然是迫在眉睫的巨大挑战。6.冠状病毒包含四种结构蛋白，包括突刺蛋白(s蛋白)、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白。其中，s蛋白在病毒的附着、融合和进入过程中起着最重要的作用，也是抗体、进入抑制剂和疫苗的主要靶点。s蛋白介导病毒进入宿主细胞，首先通过s1亚基的受体结合域(rbd)与宿主受体结合，然后通过s2亚基融合病毒和宿主细胞膜。据who报道：冠状病毒疫苗免疫后的动物，再次暴露于活病毒时，可能发生更严重的症状。疫苗免疫产生的非中和抗体或较低的抗体水平可能会引起抗体依赖性增强效应(antibody-dependentenhancement,ade)，增强病毒致病性。因此，为了减少ade副作用，新冠病毒s蛋白中的rbd区将是最为有效的疫苗研发靶点。7.秋冬季是呼吸道疾病的高发季节，其中就包括了流感病毒感染，如何防范流感与新冠等呼吸道传染病叠加流行的风险成为重中之重。在感染性疾病的预防中，疫苗自问世以来就是最为有效和经济的措施，而目前常用的预防疫苗大部分都是以活化中和抗体为目标。因此，设计一种免疫原，使其能够同时活化针对多种流感病毒或同时抗流感病毒及其他病毒(诸如新冠病毒)的中和抗体是我们迫切需要探索和开发的方向。技术实现要素：8.本公开中提供了能够同时诱导针对包括流感病毒在内的多种病毒的免疫应答的免疫原性肽、其编码核苷酸分子、载体、宿主细胞、疫苗及其应用。9.在本公开的一个方面中，提供了一种免疫原性肽，其包含如下部分：10.(a)免疫原茎部：其包含流感病毒血凝素ha的ha2区域；11.(b)免疫原冠部：其包含病毒膜蛋白或其免疫原性片段，其中所述病毒膜蛋白的来源病毒不同于(a)中ha2区域的来源病毒；12.(c)可任选地，与前述部分连接的其他部分。13.在一些实施方式中，所述ha2区域的来源选自下组：h1～h18中任一种，尤其是来自于广泛流行的人流感h1、h2、h3以及多次出现的人感染禽流感h5与h7，例如源自2009年流行的h1(h1n1)、2013年流行的h7(h7n9)。14.在一些实施方式中，所述ha2区域的氨基酸序列如seqidno:1所示，或由具有seqidno:2所示序列的核苷酸分子编码。15.在一些实施方式中，所述病毒膜蛋白是免疫原性膜蛋白。16.在一些实施方式中，所述免疫原冠部的来源选自：来源不同于(a)中ha2区域的流感病毒；非流感病毒的其他病毒。17.在一些实施方式中，所述免疫原冠部的来源选自下组：冠状病毒(如新冠病毒)、艾滋病毒、流感病毒(例如流感病毒血凝素ha的ha1区域)、狂犬病毒、猪瘟病毒、蓝耳病病毒、麻疹病毒、埃博拉病毒、疱疹病毒、虫媒病毒(例如，寨卡病毒、流行性乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、登革病毒、汉坦病毒、出血热病毒)。18.在一些实施方式中，所述免疫原冠部的来源选自：冠状病毒sars-cov-2、sars-cov、mers-cov、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、bat-cov，例如包含冠状病毒的受体结合域的s1蛋白、或受体结合域(rbd)、或经改造的受体结合域(例如rbd区经末段半胱氨酸修饰形成srbd区)或其免疫原性片段。19.在一些实施方式中，所述免疫原冠部选自冠状病毒sars-cov-2的s1，尤其是来自于s1的rbd区(例如其序列如seqidno:3所示或由seqidno:4的核苷酸分子编码)或其修饰的rbd区(例如经末端cys修饰改造的srbd区，如seqidno:5所示肽段或由seqidno:6所示核苷酸分子编码)、或者rbd区的免疫原性片段(例如如seqidno:21所示肽段或由seqidno:22所示核苷酸分子编码)。20.在一些实施方式中，所述其他部分选自：免疫调节序列，例如il-2、il-7、il-12、il-18、il-21、gm-csf、cd40l、cd40刺激抗体、pd-1与pd-l1抗体、ctla4抗体、趋化因子cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl3、xcl1、ccl4、ccl20、霍乱毒素及其亚单位、细菌鞭毛蛋白、fimh、hivp24、hivgp41。21.在一些实施方式中，所述其他部分选自：使免疫原性肽能够形成纳米颗粒的部分，例如转铁蛋白(fn，例如seqidno:7所示的肽分子或由seqidno:8所示核苷酸分子编码)。22.在一些实施方式中，所述其他部分选自：信号肽，例如cd33、cd8、cd16、小鼠igg1抗体。23.在一些实施方式中，所述其他部分选自：使免疫原性肽能够表达在病毒载体表面的跨膜区，例如cd8跨膜区(cd8tm，例如seqidno:17所示的肽分子或由seqidno:18所示核苷酸分子编码)、ha2跨膜区、cd4跨膜区、gp41跨膜区。24.在一些实施方式中，所述其他部分选自：连接肽，例如(g4s)3、(g4s)n、gsagsaagsgef、(gly)6、efpkpstppgssggap、kesgsvsseqlaqfrsld、(gly)8、egkssgsgseskst。25.在一些实施方式中，所述其他部分选自：标签，例如his-tag、avitag、calmodulintag、polyglutamatetag、e-tag、flagtag、ha-tag、myc-tag、s-tag、sbp-tag、sof-tag1、sof-tag3、strep-tag、tctag、v5tag、t7tag、vsvtag、xpresstag、3xflagtag、isopeptag、spytag、snooptag和pnetag。26.在一些实施方式中，所述免疫原性肽包含：与ha2区域连接的rbd区或srbd区或其免疫原性片段，以及可任选的与前述部分连接的其他部分。27.在一些实施方式中，所述免疫原性肽包含：与ha2区域连接的rbd区或srbd区(例如seqidno:5所示的肽分子或由seqidno:6所示核苷酸分子编码)以及fn区(例如seqidno:7所示的肽分子或由seqidno:8所示核苷酸分子编码)；与ha2区域连接的rbd区或srbd区以及cd8跨膜区(例如seqidno:17所示的肽分子或由seqidno:18所示核苷酸分子编码)；与ha2区域连接的rbd区免疫原性片段(例如seqidno:21所示的肽分子或由seqidno:22所示核苷酸分子编码)以及fn区。28.在一些实施方式中，所述免疫原性肽的氨基酸序列如seqidno:9或15或25所示，或者所述免疫原性肽的编码序列如seqidno:10或16或26所示。29.在一些实施方式中，本技术采用h7n9病毒的ha2区连接新冠病毒的rbd区或其免疫原性片段作为免疫原，同时对免疫原进行进一步修饰，例如rbd区加入二硫键、融合蛋白、融合细胞因子，进而同时诱导抗流感病毒和新冠病毒的中和抗体。30.在一些实施方式中，本技术提供了一种同时针对流感及新冠的免疫原性肽，其包括h7n9病毒血凝素ha的ha2区及sars-cov-2病毒刺突蛋白s的rbd区，所述rbd区可进一步经半胱氨酸修饰形成srbd区。31.在一些实施方式中，所述经半胱氨酸修饰为在rbd结构域的根部增加一对半胱氨酸，使之能够形成二硫键。32.在本公开的一个方面中，提供了一种核苷酸分子，其编码本文的免疫原性肽。33.在一些实施方式中，所述ha2区域的编码序列包含seqidno:2所示的核苷酸序列；所述免疫原冠部的编码序列包含seqidno:4所示核苷酸序列或seqidno:6所示的核苷酸序列或seqidno:22所述的核苷酸序列；和/或所述其他部分的编码序列包含seqidno:8所示或seqidno:18所示的核苷酸序列。34.在一些实施方式中，所述核苷酸分子的序列如seqidno:10或16或26所示。35.在本公开的一个方面中，提供了一种载体，其包含本文的核苷酸分子。36.在本公开的一个方面中，提供了一种宿主细胞，其包含本文核苷酸分子或载体或能表达本文所述的免疫原性肽。37.在一些实施方式中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞或昆虫细胞，如hek293、hela、k562、cho、ns0、sp2/0、per.c6、vero、rd、bhk、ht1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5细胞；highfive、sf9、se301、seizd2109、seucr1、sf9、sf900 、sf21、bti-tn-5b1-4、mg-1、tn368、hzam1、bm-n、ha2302、hz2e5以及ao38。38.在本公开的一个方面中，提供了一种能同时诱导针对流感病毒和另一非流感病毒或非同种流感病毒的免疫应答的疫苗，其包含本文所述的免疫原性肽、核苷酸分子、载体和/或宿主细胞。39.在一些实施方式中，所述疫苗为核酸疫苗(dna或rna疫苗)、重组蛋白亚单位疫苗、重组病毒载体疫苗、重组细菌载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、纳米颗粒疫苗、细胞载体疫苗。40.在一些实施方式中，所述疫苗为病毒载体疫苗，所述病毒载体选自：痘病毒(例如天坛株、北美疫苗株、惠氏衍生株、李斯特株、安卡拉衍生株、哥本哈根株和纽约株)、腺病毒(ad5、ad11、ad26、ad35、adc68或其修饰变体)、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、呼肠弧病毒、弹状病毒、森林脑炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒。41.在一些实施方式中，所述疫苗包含佐剂或与佐剂联合使用，例如所述佐剂选自：铝佐剂、霍乱毒素及其亚单位、寡脱氧核苷酸、锰离子佐剂、胶体锰佐剂、弗氏佐剂、mf59佐剂、qs-21佐剂、polyi:c及其他tlr配体、gm-csf、il-2、il-3、il-7、il-11、il-12、il-18、il-21。42.在一些实施方式中，所述疫苗的形式适于肌肉接种、皮内接种、皮下接种、滴鼻、雾化吸入、生殖道、直肠、口服或上述不同接种方式的组合(例如肌肉注射 滴鼻)。43.在一些实施方式中，所述疫苗的形式适于进行2种或以上的组合接种(例如联合接种或序贯接种)，如与冠状病毒(例如sars-cov-2、sars-cov、mers-cov、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、bat-cov)的s或s1疫苗进行前后序贯接种，或与流感病毒的ha或ha2(例如源自h1～h18中任一种的ha或ha2)疫苗进行前后序贯接种。44.在本公开的一个方面中，提供了本文所述的免疫原性肽、核苷酸分子、载体和/或宿主细胞在制备用于同时预防或治疗流感病毒和另一非流感病毒的药物中的应用。45.在本公开的一个方面中，还提供了本公开的免疫原性肽、核苷酸分子、载体和/或宿主细胞，其用于同时预防或治疗流感及新冠病毒感染。46.在本公开的一个方面中，还提供了一种同时预防或治疗流感及新冠病毒感染的方法，所述方法包括给予有需要的对象本公开的免疫原性肽、核苷酸分子、载体、宿主细胞和/或疫苗。47.在一些实施方式中，所述疫苗为核酸疫苗(dna或rna疫苗)、重组蛋白亚单位疫苗、重组病毒载体疫苗、重组细菌载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、纳米颗粒疫苗、细胞载体疫苗。48.在一些实施方式中，所述疫苗包含佐剂或与佐剂联用，所述佐剂包括但不限于：铝佐剂、霍乱毒素及其亚单位、寡脱氧核苷酸、锰离子佐剂、胶体锰佐剂、弗氏佐剂、sas佐剂、mf59佐剂、qs-21佐剂、polyi:c及其他tlr配体、gm-csf、il-2、il-3、il-7、il-11、il-12、il-18、il-21等。49.在一些实施方式中，所述疫苗的形式适于如下接种方式：肌肉接种、皮内接种、皮下接种、滴鼻、雾化吸入、生殖道、直肠、口服或其任意组合。50.在一些实施方式中，采用一种或多种所述疫苗进行接种，例如联合接种或前后序贯接种。51.在一些实施方式中，采用一种或多种所述疫苗与其他针对新型冠状病毒或流感的疫苗进行接种，例如所述其他疫苗包括针对冠状病毒s或s1的疫苗，例如所述的s或s1来自于包括但不限于sars-cov-2、sars-cov、mers-cov、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、bat-cov等；所述其他疫苗包括针对流感病毒ha或ha2的疫苗，例如所述的ha或ha2来自包括但不限于h1-h18。52.在一些实施方式中，所述疫苗包含核酸疫苗(dna或rna疫苗)与腺病毒载体疫苗的组合。53.在一些实施方式中，所述疫苗包含pcdna3.1-s与adc68-rhaf的组合。在一些实施方式中，所述疫苗组合中的组分前后序贯接种，优选先接种dna疫苗。54.在本公开的一个方面中，提供了一种制备同时针对流感及新冠病毒感染的疫苗的方法，所述方法包括：55.(a)提供本公开的免疫原性肽、核苷酸分子和载体；56.(b)将(a)中所提供的活性物质与免疫学上或药学上可接受的载体组合。57.在本公开的一个方面中，提供了一种同时诱导抗流感以及包含冠状病毒在内的其他病毒免疫应答的方法，其中，采用流感病毒血凝素ha的ha2区域作为免疫原茎部与其他病毒或毒株膜蛋白作为冠部组成的融合蛋白作为疫苗免疫原，以同时诱导抗流感及其他病毒免疫应答。58.在一些实施方式中，ha2免疫原选自包括但不限于h1-h18，尤其是来自于广泛流行的人流感h1、h2、h3以及多次出现的人感染禽流感h5与h7；59.在一些实施方式中，ha2免疫原来自于2009年流行的h1、2013年流行的h7。60.在一些实施方式中，ha2免疫原来自于2013年流行h7的早期毒株的ha2序列以及与该序列同源性超过80％全长或片段。在一些实施方式中，ha2免疫原可包含seqidno:1所示的氨基酸序列或可由具有seqidno:2的编码序列所编码。61.在一些实施方式中，与ha2连接的冠部免疫原来自于包括但不限于冠状病毒、艾滋病毒、流感病毒、狂犬病毒、猪瘟病毒、蓝耳病病毒、麻疹病毒、埃博拉病毒、疱疹病毒、虫媒病毒(寨卡病毒、流行性乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、登革病毒、汉坦病毒、出血热病毒)。62.在一些实施方式中，与ha2连接的冠部免疫原选自冠状病毒包括但不限于sars-cov-2、sars-cov、mers-cov、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、bat-cov等，尤其是包含冠状病毒的受体结合域的s1蛋白、或受体结合域(receptorbindingdomain,rbd)、或经改造的受体结合域。63.在一些实施方式中，与ha2连接的冠部免疫原选自冠状病毒sars-cov-2的s1，尤其是来自于s1的rbd区或与其同源性超过90％的全长与片段。在一些实施方式中，rbd区免疫原可包含seqidno:3所示的氨基酸序列或可由具有seqidno:4的编码序列所编码。在一些实施方式中，rbd区免疫原可包含seqidno:5所示的氨基酸序列或可由具有seqidno:6的编码序列所编码。64.在本公开的一个方面中，提供了一种同时诱导抗流感及包含冠状病毒在内的其他病毒免疫应答的方法，其包括，将本技术的免疫原与其他序列共表达，共表达方式可以为融合表达，也可以是单独阅读框架表达，从而进一步增加抗病毒种类，或提高免疫原诱导免疫应答能力，预防多种病毒感染。65.在一些实施方式中，与本技术的免疫原连接的序列：来自于包括但不限于不同的冠状病毒、流感病毒、艾滋病毒、狂犬病毒、猪瘟病毒、蓝耳病病毒、麻疹病毒、埃博拉病毒、疱疹病毒、虫媒病毒(寨卡病毒、流行性乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、登革病毒、汉坦病毒、出血热病毒)，尤其是与活化t细胞应答的免疫原共表达，制备能够同时激活中和抗体与t细胞应答的复合疫苗；为免疫调节序列，包括但不限于il-2、il-7、il-12、il-18、il-21、gm-csf、cd40l、cd40刺激抗体、pd-1与pd-l1抗体、ctla4抗体、趋化因子cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl3、xcl1、ccl4、ccl20、霍乱毒素及其亚单位、细菌鞭毛蛋白、fimh等；提供形成纳米颗粒的特征，包括但不限于转铁蛋白(ferritin)。66.在本公开的一个方面中，提供了一种同时诱导抗流感及包含冠状病毒在内的其他病毒免疫应答的方法，其包括将本文所述的免疫原单独、或与本文所述的共表达分子联合，用于制备包括但不限于核酸疫苗(dna或rna疫苗)、重组蛋白亚单位疫苗、重组病毒载体疫苗、重组细菌载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、纳米颗粒疫苗、细胞载体疫苗等。67.在本公开的一个方面中，提供了一种同时诱导抗流感及包含冠状病毒在内的其他病毒免疫应答的方法，其包括给予本文所述的免疫原性肽、其编码核苷酸分子、载体、宿主细胞或疫苗。68.在一些实施方式中，用2种或以上所述疫苗的组合进行接种，既可以联合接种，也可以前后序贯接种。在一些实施方式中，将本文的疫苗与冠状病毒s或s1所制备的疫苗进行前后序贯接种，所述的s或s1来自于包括但不限于sars-cov-2、sars-cov、mers-cov、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、bat-cov等；或将本文的疫苗与流感病毒ha或ha2所制备的疫苗进行前后序贯接种，所述的ha或ha2来自于包括但不限于h1-h18。69.本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本公开的发明构思和保护范围。本公开的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明70.下面结合附图对本公开作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本公开的实施方案，而不是为了局限本公开的范围。71.图1：s蛋白真核表达载体及srbd-ha2-hfn(rhaf)腺病毒的构建及融合蛋白的表达：72.a：pcdna3.1-s及padc68xy3-rhaf质粒构建图谱；73.b：pcdna3.1-s蛋白在293t细胞中成功表达，且腺病毒adc68-rhaf能成功表达rhaf蛋白。74.图2:adc68-rhaf在c57bl/6小鼠体内的免疫原性：75.实验所用小鼠为6-8周龄雌性c57bl/6，免疫原为质粒pcdna3.1-s及腺病毒adc68-rhaf。76.a：elisa方法检测免疫结束后第2周小鼠血清中结合抗体的滴度。横坐标为免疫组intc-fn的数量明显减少，且能看到切割生成副产物intn-pab(17kda)和gb1-intc(11kda)，表明形成纳米颗粒r545haf。105.图9：纳米颗粒r545haf在icr小鼠体内的免疫原性：106.实验所用小鼠为6-8周龄hace2 转基因小鼠，免疫原为质粒pcdna3.1-s及纳米颗粒r545haf。107.a：elisa方法检测免疫结束后第4周小鼠血清中结合抗体的滴度。横坐标为免疫组别，纵坐标为结合抗体的滴度，*表示p《0.05。108.b：第一针免疫后与第三针免疫后针对rbd蛋白的结合抗体数据，左图为整体提升，右图为单只小鼠的相应提升，*表示p《0.05。109.c：293t-ace2细胞检测免疫结束后第4周小鼠血清中中和抗体的滴度。横坐标为免疫组别，纵坐标为中和抗体的滴度(id50)，*表示p《0.05。110.d：第一针免疫后与第三针免疫后针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度，左图为整体提升，右图为单只小鼠的相应提升，*表示p《0.05。具体实施方式111.本公开涉及疫苗领域，特别涉及一种同时诱导抗流感以及包含冠状病毒在内的其他病毒免疫应答的方法。动物实验结果证实，本公开的疫苗安全，可持续产生高效价中和抗体，可用于流感及新冠的预防和治疗。112.本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本公开提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。113.如本文所用，在数值或范围上下文中的“约”表示所引用或要求保护的数值或范围的±10％。114.应理解，当提供参数范围时，本发明同样提供了在该范围内的所有整数及其十分位小数。例如，“0.1-2.5毫克/天”包括0.1毫克/天、0.2毫克/天、0.3毫克/天等直至2.5毫克/天。115.如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。116.免疫原性肽及其编码分子117.如本文所用，术语“免疫原性肽”是指能够同时诱导针对流感病毒和另一非流感病毒的免疫应答的肽，其包含如下部分：(a)免疫原茎部：其包含流感病毒血凝素ha的ha2区域；(b)免疫原冠部：其包含病毒膜蛋白或其免疫原性片段，其中所述病毒膜蛋白的来源病毒不同于(a)中ha2区域的来源病毒；(c)可任选地，与前述部分连接的其他部分。118.如本文所用，术语“连接”具有其广义含义，可包括例如融合、共表达、共价连接、偶联等各种方式。119.例如，如本文所用，术语“srbd-ha2免疫原性肽”、“针对流感病毒及新型冠状病毒sars-cov-2的免疫原性肽”可互换使用，是指包括流感血凝素ha的ha2区融合sars-cov-2病毒刺突蛋白s的rbd区、且具有激发针对流感病毒和新型冠状病毒sars-cov-2的结合抗体和中和抗体作用以及相应t细胞应答的肽。120.在一些实施方式中，免疫原性肽可为：(a)具有seqidno：1所示氨基酸序列和seqidno:3或5或21所示氨基酸序列的多肽；(b)(a)中所述多肽的同源或序列相似且具有相同或相似免疫原性的多肽，例如其中的各区段与seqidno：1所示氨基酸序列和seqidno:3或5或21所示氨基酸序列分别具有高于或等于80％，高于或等于85％，高于或等于90％，高于或等于95％，高于或等于96％，高于或等于97％，高于或等于98％，高于或等于99％的同源性或序列相同性，或者与(a)中的多肽具有高于或等于80％，高于或等于85％，高于或等于90％，高于或等于95％，高于或等于96％，高于或等于97％，高于或等于98％，高于或等于99％的同源性或序列相同性；(c)在(a)或(b)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有相同或相似免疫原性的由(a)或(b)衍生的蛋白质或多肽。121.在一些实施方式中，免疫原性肽可为：(a')具有seqidno：9或15或25所示氨基酸序列的多肽；(b')由seqidno:10或16或26所示核苷酸序列编码的多肽；(c')(a')和(b')中所述多肽同源或序列相似且具有相同或相似免疫原性的多肽，例如与(a')和(b')中的多肽具有高于或等于80％，高于或等于85％，高于或等于90％，高于或等于95％，高于或等于96％，高于或等于97％，高于或等于98％，高于或等于99％的同源性或序列相同性；(d')在(a')或(b')或(c')限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有相同或相似免疫原性的由(a')或(b')或(c')衍生的蛋白质或多肽。122.在一些实施方式下，免疫原性肽可包括与免疫原茎部或冠部连接的其他部分，以例如增强免疫原茎部或冠部或融合蛋白的稳定性、提高中和抗体应答、形成多聚体、增加细胞应答等。在一些实施方式中，其他部分可包括但不限于：病毒或宿主来源的蛋白，转铁蛋白(fn)、il-2、il-7、il-12、il-18、il-21、gm-csf、cd40l、cd40刺激抗体、pd-1与pd-l1抗体、ctla4抗体、趋化因子cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl3、xcl1、ccl4、ccl20、霍乱毒素及其亚单位、细菌鞭毛蛋白、fimh等。123.在一些实施方式中，免疫原性肽中还可包括信号肽、接头、分子标签等元件。例如，信号肽元件可指具有引导蛋白质分泌、定位和/或输送功能的氨基酸序列，其长度通常为5-30个氨基酸。在一些实施方式中，信号肽元件可选自：蛋白自身信号肽、cd33蛋白信号肽、cd8蛋白信号肽、cd16蛋白信号肽、小鼠igg1抗体信号肽、流感ha蛋白信号肽。例如，连接肽序列(或称接头)可指在本文的融合蛋白中起到连接不同元件作用的短肽，其长度通常为1～50(如5～50、5～40、10～40)个氨基酸。通常，连接肽不影响或严重影响本发明肽形成正确的折叠和空间构象。在一些实施方式中，连接肽元件可选自：(g4s)3接头、(g4s)n、gsagsaagsgef、(gly)6、efpkpstppgssggap、kesgsvsseqlaqfrsld、(gly)8、egkssgsgseskst。124.免疫原性肽也可包括其变异形式，例如一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能。125.免疫原性肽可在适当的环境和条件下通过重组表达产生，例如由本公开的编码核苷酸分子、载体、宿主细胞产生；也可通过化学合成等方式获得，只要其具有所需的氨基酸序列和免疫原性和反应性。126.如本文所用，术语“免疫原性肽编码分子”、“编码序列”等可互换使用，均是指编码本公开所述的免疫原性肽的核苷酸分子。127.在一些实施方式中，核苷酸分子可选自，例如：(i)具有seqidno：2所示核苷酸序列和seqidno:4或6或22所示核苷酸序列的核苷酸分子；(ii)在严格条件下与(i)杂交的分子；(iii)与(i)中序列同源或序列相似且能表达功能性免疫原性肽的核苷酸分子，例如其中的各区段与seqidno：2所示核苷酸序列和seqidno:4或6或22所示核苷酸序列分别具有高于或等于80％，高于或等于85％，高于或等于90％，高于或等于95％，高于或等于96％，高于或等于97％，高于或等于98％，高于或等于99％的同源性或序列相同性，或者与(i)或(ii)中序列具有高于或等于80％，高于或等于85％，高于或等于90％，高于或等于95％，高于或等于96％，高于或等于97％，高于或等于98％，高于或等于99％的同源性或序列相同性且能够表达功能性免疫原性肽的核苷酸分子；(iv)在(i)或(ii)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且能够表达功能性免疫原性肽的核苷酸分子。128.在一些实施方式中，所述核苷酸分子可选自，例如：(i)具有seqidno：10或16或26所示序列的核苷酸分子；(ii)在严格条件下与(i)杂交的分子；(iii)与(i)或(ii)中序列具有高于或等于80％，高于或等于85％，高于或等于90％，高于或等于95％，高于或等于96％，高于或等于97％，高于或等于98％，高于或等于99％的同源性或序列相同性且能够表达功能性免疫原性肽的核苷酸分子；(iv)在(i)或(ii)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且能够表达功能性免疫原性肽的核苷酸分子。129.如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×ssc，0.1％sds，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。130.本公开的核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本公开所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。131.载体和宿主细胞132.本公开还涉及包含本技术免疫原性肽编码核苷酸分子的载体，以及用该载体经基因工程产生的宿主细胞。133.通过常规的重组dna技术(science，1984；224：1431)，可利用本公开的编码序列可用来表达或生产重组的免疫原性肽。一般来说有以下步骤：134.(1)将本公开的编码核苷酸分子，或将含有核苷酸分子的重组表达载体转入合适的宿主细胞；135.(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；136.(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质或多肽。137.本公开中，术语“载体”与“重组表达载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、动物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。138.可采用本领域常规方法构建含免疫原性肽编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本公开中可采用诸如pcdna3.1载体、pires2-egfp载体、admaxtm、adc68等表达系统。139.此外，表达载体可包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。140.包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质或多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；动物细胞等。在本公开中，可采用例如选自下组的宿主细胞：hek293、hela、cho、k562、ns0、sp2/0、per.c6、vero、rd、bhk、ht1080、a549、cos-7、arpe-19和mrc-5细胞；highfive、sf9、se301、seizd2109、seucr1、sf9、sf900 、sf21、bti-tn-5b1-4、mg-1、tn368、hzam1、bm-n、ha2302、hz2e5以及ao38。141.本公开的核苷酸分子在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是dna的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。142.在上面的方法中的重组多肽可在细胞内或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。143.疫苗和免疫偶联物144.本文中还提供了一种包含本公开的免疫原性肽、核苷酸分子、载体和/或宿主细胞的疫苗，或免疫组合物。该疫苗包含其形式能够被给予脊椎动物(优选哺乳动物)的本公开的免疫原性肽和/或核酸分子的配制品，并且其诱导提高免疫力的保护性免疫应答以预防和/或减轻流感病毒感染和其他非流感病毒感染(例如新型冠状病毒感染)和/或其至少一种症状。145.术语“保护性免疫应答”或“保护性应答”是指通过免疫原介导的针对传染原或疾病的免疫应答，通过脊椎动物(例如人)展现，预防或减轻感染或减少其至少一种疾病症状。146.术语“脊椎动物”或“对象”或“患者”是指脊索动物亚门的任何成员，包括但不限于：人和其他灵长类动物，包括非人灵长类动物诸如黑猩猩和其他猿和猴物种；家畜诸如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物诸如狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物诸如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟包括驯养、野生和猎鸟诸如鸡、火鸡和其他鹑鸡类鸟、鸭、鹅。术语“哺乳动物”和“动物”被包括在这个定义中，旨在涵盖成年、幼年以及新生个体。147.本文的疫苗可为重组蛋白疫苗、重组dna疫苗、重组病毒载体疫苗(例如腺病毒载体、痘病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、巨细胞病毒载体)、重组细菌载体疫苗、重组酵母载体疫苗或重组病毒样颗粒疫苗。在一些实施方式中，本文的疫苗选自重组dna疫苗、重组腺病毒载体或其中一种或两种的组合。148.在一些实施方式中，可采用选自下组的一种或多种疫苗或其组合：重组质粒疫苗(dna)，如包含rbd区的sars-cov2病毒刺突蛋白s编码序列的dna疫苗(例如pcdna3.1-s)；重组腺病毒载体疫苗，如adc68-rhaf；重组蛋白亚单位疫苗，例如纳米颗粒，r545haf。149.本文的疫苗组合物中包含有效量的本文免疫原。本公开的疫苗组合物中包含足以实现希望的生物效应的量的免疫原。术语“有效量”通常是指可以诱导足以诱导免疫力的保护性免疫应答以预防和/或减轻感染或疾病和/或以减少感染或疾病的至少一种症状的免疫原的量。150.本文的疫苗中还可包含佐剂。可采用本领域普通技术人员已知的佐剂，例如vogel等人，“acompendiumofvaccineadjuvantsandexcipients”(第2版)中所记载的佐剂(通过引用以其全文结合在此)。已知佐剂的例子包括但不限于：铝佐剂、霍乱毒素及其亚单位、寡脱氧核苷酸、锰离子佐剂、胶体锰佐剂、弗氏佐剂、mf59佐剂、qs-21佐剂、polyi:c及其他tlr配体、gm-csf、il-2、il-3、il-7、il-11、il-12、il-18、il-21等。151.本文的疫苗组合物还可包括药学上可接受的载体、稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂等辅料。例如，药学上可接受的载体是已知的，并且包括但不限于注射用水、盐溶液、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、无菌等渗水缓冲液及其组合。药学上可接受的载体、稀释剂和其他赋形剂可例如参见《雷明顿药物科学》(remngton'spharmaceutcalsciences)中。152.本文疫苗组合物的形式可适于系统性或局部(尤其是呼吸道内)给予。给予疫苗组合物的方法包括但不限于：肌肉接种、皮内接种、皮下接种、滴鼻、雾化吸入、生殖道、直肠、口服或其任意组合，例如先肌肉注射后滴鼻。153.在一些实施方式中，本文的疫苗预防、消除或减轻对象中的流感病毒及新型冠状病毒感染或其至少一种症状，例如呼吸道症状(如鼻塞、咽喉痛、声嘶)、头痛、咳嗽、痰、发热、啰音、喘息、呼吸困难、因感染引起的肺炎、严重急性呼吸综合症、肾衰竭等。154.本文中还涉及了一种免疫偶联物(也可称免疫缀合物)，其包含本文的免疫原以及与其偶联的其他物质。所述的其他物质可为靶向性物质(如特异性识别特定靶标的部分)、治疗性物质(如药物、毒素、细胞毒剂)、标记性物质(如荧光标记物、放射性同位素标记物)。155.在本公开中还提供了一种组合产品，其包括本公开的免疫原性肽、核苷酸分子、载体、宿主细胞和/或疫苗，且还可包含一种或多种有助于更好发挥预防和/或治疗流感病毒感染以及其他非流感病毒感染(例如新型冠状病毒感染)或其症状的功能或增强前述物质稳定性的其他物质。例如，其他物质可包括针对冠状病毒s或s1的其他疫苗，如来自于包括但不限于sars-cov-2、sars-cov、mers-cov、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、bat-cov的s或s1疫苗；针对流感病毒ha或ha2的其他疫苗，所述的ha或ha2来自于包括但不限于h1-h18；受益于t细胞活化和/或与t细胞的记忆性免疫反应的疾病或病症的其他活性物质。156.免疫方法157.本文还提供了一种用于预防和/或治疗流感病毒感染以及其他非流感病毒感染(例如新型冠状病毒感染)和/或其症状的方法，其包括：至少一次给予预防和/或治疗有效量的本公开的一种或多种疫苗。可采用的接种方式包括但不限于：系统性免疫接种方式，如肌肉注射、皮下注射和皮内注射等；呼吸道内免疫接种方式，如雾化、滴鼻等。在一些实施方式中，初次免疫采用系统性接种或呼吸道内接种，优选系统性接种。158.在本公开的一些实施方式中，每两次接种之间的间隔至少为1周，例如2周、4周、2个月、3个月、6个月或更长间隔。159.在一些实施方式中，采用dna疫苗进行初次免疫，并采用重组病毒疫苗进行一次或多次加强免疫。本公开的免疫方法可采用“初免-加强”或“初免-加强-再加强”的方式，可采用单一的全身系统免疫或呼吸道局部免疫方式，或采用两种免疫方式的组合。160.根据不同载体疫苗的特点，在一些优选的实施方式中，采用重组dna疫苗进行系统性初免，从而建立全身系统免疫应答，再用其他疫苗(例如重组腺病毒疫苗或重组痘病毒疫苗)进行一次或多种免疫加强，所述免疫加强可包括至少一次呼吸道内免疫加强(例如，采用腺病毒疫苗)。161.采用本文的免疫方法可在呼吸道局部和全身系统有效建立的疫苗特异性免疫应答，有助于增强疫苗保护的有效性。162.以药物包或试剂盒的形式提供本文的组合产品可，例如可将本文的一种或多种疫苗组合物或其一种或多种成分包装在一个或多个容器中，例如包装在指明组合物的量的密封容器诸如安瓿或小药囊中。可以液体、无菌冻干粉或无水浓缩物等形式提供疫苗组合物，可在临用前用适当液体(例如水、盐水等)对其进行稀释、复原和/或配制以获得用于给予至对象的适当浓度和形式。163.本公开中的组合产品可用于在呼吸道内局部诱导高水平抗原特异性cd8 t细胞应答的特征，使得其在预防呼吸道病原体感染、降低呼吸道病原体致病力和呼吸道肿瘤的预防治疗中均有应用前景。164.实施例165.下面结合具体实施例，进一步阐述本公开。应理解，这些实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。本领域技术人员可对本公开做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本公开的范围之内。166.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)或按照供应商所建议的条件。dna的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。167.除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本公开方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。168.下述实验中涉及到的实验动物、免疫方式、免疫原、假病毒及检测方法如下：169.i.实验动物：170.6-8周龄雌性c57/bl6及balb/c小鼠，购自上海吉辉实验动物饲养有限公司)；171.6-8周龄雌性hace2 icr小鼠，购自北京唯尚立拓科技有限公司)。172.ii.免疫方式：173.对小鼠左、右后肢分别进行肌肉注射；或进行滴鼻。具体剂量见实施例。174.iii.免疫原的选择：175.ha2序列来自于genebank:agi60292.1，s及rbd序列均来自genebank:nc_045512.2；hfn序列(人转铁蛋白)来自于genebank:m97164.1，具体序列见序列表。176.1.重组质粒疫苗(dna)：pcdna3.1-s、pcdna3.1(空载)；177.2.重组腺病毒载体疫苗：adc68、adc68-srbd-ha2-hfn(adc68-rhaf)、adc68-rbd-ha2-cd8tm。178.3.重组蛋白亚单位疫苗(纳米颗粒，protein)：r545haf179.iv.免疫原制备及免疫剂量：180.免疫原的制备参见实施例1181.在实施例中所采用的免疫原免疫剂量如下：182.1.重组质粒疫苗(dna)：100μg/只小鼠，100μl，溶于无菌生理盐水中；183.2.重组腺病毒载体疫苗：5e10vp/只小鼠，100μl(肌肉注射)；5e10vp/只小鼠，40μl(滴鼻)。184.3.重组蛋白亚单位疫苗(纳米颗粒，protein)：蛋白质(溶于无菌pbs中)与铝佐剂(aluminium，invivogen，货号5200)按照体积比1:1混合后进行免疫，20μg/只小鼠，100μl；185.v.免疫间隔：186.具体免疫间隔见下文表格。187.vi.sars-cov2包膜假病毒(pseudovirus)包装：188.1.转染前一天准备293t细胞，用于包装质粒的转染与表达。用dmem完全培养基将细胞稀释至5×106个/ml细胞，取1ml稀释好的细胞，铺在10cm的皿中，37℃，5％co2，培养过夜；189.2.吸取sars-cov2膜蛋白质粒pcdna3.1-s4μg和pnl4-3δenv骨架质粒8μg(nihaidsreagentprogram,3418)加入500μl双无(无血清、无双抗，双抗为青链霉素混合液)的dmem中，室温孵育5min；190.3.用双无dmem将24μlturbofect(thermofisherscientific)稀释，终体积为500μl/样品，室温孵育5min；191.4.将2与3两者混匀，1000μl/样品终体积，室温孵育20min，孵育结束后加到10cm培养皿的293t细胞中。6h后更换新鲜的15ml完全培养基，继续在细胞培养箱中培养48h；192.5.培养结束后，收集10cm皿的细胞培养上清，于15ml离心管里，然后4000g，4℃，离心10min，用0.45μm的滤器过滤到新的15ml离心管中，冻存于-80℃保存，滴定后备用。193.vii.构建稳定表达hace2受体的293t细胞：194.1.人工合成人源ace2(hace2)序列(genebank#ncbi_np_001358344.1),如seqidno:13所示，序列5’端带有age1酶切位点，3’端带有xba1酶切位点，合成片段与载体质粒phage-mcs-puro使用age1酶切(thermoscientific公司，货号fd1464)与xba1酶切(thermoscientific公司，fd0685)，并通过凝胶电泳后切胶回收，采用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(promega公司，货号a9282)回收酶切片段。195.2.基因回收产物与酶切线性化载体用t4dna连接酶的方法连接(thermoscientific公司，货号2011a)：将连接产物转化至大肠杆菌e.colistable，在含氨苄霉素的培养板上过夜生长。第2天，随机挑取单菌落进行测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出hace2基因的慢病毒表达质粒(phage-hace2-puro)。196.3.取10cm皿，在每个皿中接种约5×106个293t细胞，保证第二天转染时使细胞密度达90％为宜；将phage-hace2-puro、慢病毒包装质粒pspax以及vsvg三种质粒，按照质量比1：2：1的比例转染293t细胞。197.4.37℃，5％的孵箱培养48小时左右，具体时间根据细胞情况而定，收集细胞上清。将收集的细胞上清用0.45μm的滤器进行过滤，再用peg8000进行浓缩，即可得到较为纯化的hace2慢病毒。198.5.提前一天铺5×105个的293t细胞于12孔板的一个孔内，次日向铺好的细胞中加入步骤2中浓缩的病毒500μl，1000g，离心2小时。199.6.离心感染结束后，继续在37℃，5％的孵箱培养12小时左右，将培养基换成添加1μg/ml嘌呤霉素(puro)的细胞培养基培养，最后能够存活的细胞便是整合有hace2基因的293t细胞，并通过流式分选筛选出稳定表达hace2的293t细胞(能与s蛋白结合)。200.viii.检测方法：201.采血：202.最后一次免疫结束后第2/4周，将小鼠脱颈处死前，通过摘眼球的方法采集小鼠外周全血，收集于1.5mlep管中，室温静置使其自然凝血，凝固后的小鼠血清于7000g，离心15min。将小鼠血清转移至新的1.5mlep管中。实验前需要将样品在56℃灭活30min，来破坏血清内的补体活性。灭活前短暂离心，避免管壁和瓶盖上的样品残存。水浴液面要没过样品液面，但不能超过瓶盖。203.elsia检测结合抗体：204.1.用4℃预冷的elisa包被液稀释检测的抗原蛋白(s1，购自北京义翘神州科技有限公司；rbd，购自上海近岸生物科技有限公司)，至终浓度为1μg/ml。在elisa板的每孔加入100μl包被抗原溶液，4℃过夜；205.2.第二天，取出elisa板，弃掉包被液，用0.05％的pbst缓冲液洗板3次，每次220μl；206.3.洗涤完毕后，在吸水纸上拍干，每孔用200μlelisa封闭液(0.5％脱脂奶粉，pbst溶解)进行封闭，室温封闭2h；207.4.封闭结束后，用0.05％的pbst洗板3次，每次220μl；208.5.对于血清或者血浆，用elisa样品稀释液(0.5％脱脂奶粉，pbst溶解)稀释，从1:100起始，进行2倍比稀释。用未免疫的小鼠血清设置为阴性对照。设置空白孔，只加样品稀释液，每个样品需做2个复孔，每孔终体积为100μl，室温孵育3h；209.6.样品孵育结束后，继续用pbst洗板5次，每次220μl；210.7.用elisa封闭液(0.5％脱脂奶粉，pbst溶解)稀释相对应比例的二抗(山羊抗鼠，购自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号zb-2305)，每孔加入100μl，室温孵育1-1.5h；211.8.二抗孵育结束后，用0.05％的pbst洗板5次，每次220μl；212.9.取一对金银片opd底物，溶解于20ml去离子水中，随后每孔加入100μl，避光反应5min；213.10.显色结束后，用50μl2nmh2so4进行终止，在酶标仪上读取od492-od630值；214.11.以最后一个稀释度od492大于2倍的(negativemean sd)值对应的血清稀释比的倒数作为抗体滴度。215.293t-ace2细胞检测中和抗体：216.1.取96孔透明底黑板进行中和实验，第一列设置细胞对照(cc)(150μl)，第二列设置病毒对照(vc)(100μl)，其他均为样品孔，对血清样品进行倍比稀释，最终孔中体积为100μl。217.2.除细胞对照组外，每孔加50μlsars-cov-2假病毒稀释液，使每孔最终含假病毒为200tcid50。218.3.轻轻震荡混匀，将上述96孔底黑板置于细胞培养箱中，37℃，5％co2孵育1h。219.4.当孵育时间至20min时，开始准备293t-hace2靶细胞，并用完全培养基将细胞稀释至105个细胞/ml。220.5.当孵育时间至1h，向96孔透明底黑板中每孔加100μl靶细胞，使每孔细胞为104个。221.6.前后左右轻轻晃动96孔透明底黑板，使孔中的细胞均匀分散，再将板子放入细胞培养箱中，37℃，5％co2培养48h。222.7.培养48h后，从细胞培养箱中取出96孔透明底黑板，吸掉孔中上清，每孔加入100μlpbs清洗一遍，吸去pbs，每孔加入50μl1×的裂解缓冲液(购自promega公司cat#e153a)，室温在水平摇床上孵育30min使细胞充分裂解；223.8.加30μl荧光素酶的底物(购自promega公司，cat#e1501)于96孔黑板中，用仪器96微孔板发光-检测仪检测荧光素酶活性。224.9.导出荧光素读值，计算中和抑制率，结合中和抑制率结果，利用graphpadprism5.0软件计算id50。[0225][0226]elispot检测t细胞应答：[0227]小鼠脾脏单细胞分离：[0228]1)将小鼠仰卧，剖开右侧腹部皮肤，打开腹膜，取下小鼠脾脏，放入加有5ml完全rpim1640培养基的小平皿中；[0229]2)用无菌镊子将脾脏用无菌纱布包裹起来，用小弯镊夹起纱布，轻轻磨碎脾脏，可使脾细胞全部释放到培养基中；[0230]3)随后用5ml移液器将脾细胞悬液经纱布吸到无菌的15ml离心管中，800g，离心5min；[0231]4)弃掉离心后的上清，轻敲15ml离心管重悬细胞沉淀，每个离心管中加入3ml红细胞裂解液裂解红细胞，颠倒混匀后室温静置5min，使红细胞充分裂解又不会损伤脾细胞；[0232]5)裂红结束后，用5mlrpim1640培养基终止裂红。800g，离心5min；[0233]6)弃掉离心后的上清，用5mlrpim1640培养基洗1次，800g离心5min；[0234]7)弃离心后上清，脾细胞放于冻存液(90％fbs和10％dmso)中进行冻存备用。[0235]elispot实验操作按照mouseifn-γ/monkeyifn-γ说明书进行。[0236]1)用纯化ifn-γ抗体包被试剂盒(购自bd，货号551083)提供的millipore板，比例1：250，4℃过夜包被；[0237]2)甩掉板中的包被抗体溶液，用200μlrpmi1640完全培养基洗板一遍，随后用200μlrpmi1640完全培养基封闭液封闭millipore板，室温孵育2h；[0238]3)弃掉孔板中的封闭液，根据不同的实验设计，在millipore板中加入刺激肽库，50μl/孔，每条肽的浓度为5μg/ml。在阴性对照孔加入50μlrpmi1640完全培养基；阳性对照孔中加入50μl佛波醇酯类多克隆刺激剂(pma，购自sigma，货号fxp012)(终浓度100ng/ml)和离子霉素(ionomycin，终浓度2μg/ml)的rpmi1640完全培养基；[0239]其中，刺激肽库由苏州强耀生物科技有限公司合成，每条单肽为15个氨基酸，覆盖rbd序列，每五个单肽一个肽库，即总共13个肽库。其中，第1条肽为mptesivrfpnitnl(seqidno:19)，第2条肽为seqidno:3的rbd肽序列中的aa8-22，后面每条肽相比于其他肽氨基酸后移四位，即第3条肽为seqidno:3的rbd肽序列中的aa12-26，第4条肽为seqidno:3的rbd肽序列中的aa16-30……以此类推到第64条肽为seqidno:3的rbd肽序列中的aa256-270，第65条肽为avrdpqtleilditp(seqidno:20)。[0240]4)对小鼠脾细胞进行计数，将细胞调整为4×106个细胞/ml，每孔加入50μl细胞，最终使每孔的细胞数为2×105个细胞。将millipore板放入湿盒，在37℃5％co2培养箱中孵育20-22h，期间切勿摇动板子，以免造成细胞的偏移；[0241]5)培养孵育结束后，从培养箱中取出millipore板，将板中的液体弃掉，用预冷的去离子水洗两遍，每次220μl，每次清洗孵育3min；[0242]6)用0.05％的pbst(pbs 0.05％tween-20)洗板3次，每次200μl；[0243]7)用10％fbs的pbs抗体稀释液稀释生物素化检测抗体(biotinylateddetectionantibody，比例1：200)，每孔加入100μl，室温孵育2h；[0244]8)孵育结束后，再用0.05％的pbst洗板3次，每次220μl；[0245]9)将链霉亲和素-hrp偶联抗体用抗体稀释液进行稀释(比例1：100)，每孔加入100μl，室温孵育1h；[0246]10)孵育结束后，用0.05％的pbst洗板4次，每次220μl；[0247]11)再用pbs清洗板子2次，每次220μl；[0248]12)准备底物溶液(1ml的底物缓冲液加1滴底物溶液)，每孔加入100μl底物溶液。反应5-60min，孵育时间根据斑点形成的情况而定。[0249]13)用去离子水冲洗终止反应，室温晾干后进行计数；[0250]14)利用champspotiii型酶联斑点图像分析仪进行斑点形成细胞sfc(spotformingcell，sfc)的计数以及qc。[0251]实施例1：s蛋白真核表达载体及rhaf与rbd-ha2-cd8tm腺病毒表达载体的构建及蛋白质表达[0252]为了研究rbd的功能，我们构建了s蛋白的真核表达载体，并在体外细胞系中真核表达出成熟的蛋白质。[0253]首先，我们人工合成了s基因(其对应氨基酸序列如seqidno:11所示，基因序列如seqidno:12所示)，合成片段与载体质粒pcdna3.1(购自优宝生物)使用bamhi酶切(thermoscientific公司，fd0054)与not1酶切(thermoscientific公司，fd0596)，并通过凝胶电泳后切胶回收，采用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(promega公司，货号a9282)回收酶切片段。[0254]随后，基因回收产物与酶切线性化载体用t4dna连接酶的方法连接(thermoscientific公司，货号2011a)：将连接产物转化至大肠杆菌e.colistable，在含氨苄霉素的培养板上过夜生长。第2天，随机挑取单菌落进行测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出s蛋白的真核表达载体pcdna3.1-s，质粒构建图谱如图1a。[0255]我们进一步检测了s蛋白能否在真核细胞系293t中表达。[0256]首先，取6孔板，在每个孔中接种约6×105个293t细胞，保证第二天转染时使细胞密度达90％为宜；用pcdna3.1及pcdna3.1-s分别转染293t细胞(转染试剂turbofect)。37℃，5％的孵箱培养48小时左右，具体时间根据细胞情况而定，收集细胞，进行蛋白质免疫印迹(wb)鉴定，发现s蛋白在细胞中表达，大小为200kd左右；而pcdna3.1对照转染的细胞中不能检测到s蛋白的表达(图1b左图)。[0257]为了研究ha2的功能，我们构建了rhaf(即srbd-ha2-hfn融合蛋白)的腺病毒表达载体，并构建了腺病毒adc68-rhaf，且验证了腺病毒中rhaf的表达。[0258]首先，我们人工合成了rhaf基因(具体序列如seqidno:10所示，其中ha2部分基于如seqidno:2所示，srbd部分基于如seqidno:6所示的序列，hfn部分基于如seqidno:8所示的序列)。srbd-ha2表达在hfn的n端，两者之间采用g4s接头连接。合成片段与载体质粒padc68xy3(根据专利申请号201910777937.2中所记载方法构建，其中e1/e3缺失的复制缺陷型adc68载体的e4部分替换为adhu5的对应e4部分，该改造可增加重组黑猩猩腺病毒的产量而不改变腺病毒的血清学特性)，使用srfi酶切(neb公司，#r0629s)，并通过凝胶电泳后切胶回收，采用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(promega公司，货号a9282)回收酶切片段。[0259]随后，基因回收产物与酶切线性化载体用t4dna连接酶的方法连接(thermoscientific公司，货号2011a)：将连接产物转化至大肠杆菌e.colistable，在含氨苄霉素的培养板上过夜生长。第2天，随机挑取单菌落进行测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出rhaf的腺病毒表达载体padc68xy3-rhaf，质粒构建图谱如图1a。[0260]为了研究究竟是将rbd-ha2与hfn融合分泌出去还是将rbd-ha2通过cd8跨膜区(cd8tm)表达在腺病毒表面的效果更优越，我们构建了rbd-ha2-cd8tm的腺病毒表达载体，并构建了腺病毒adc68-rbd-ha2-cd8tm。其构建方法与adc68-rhaf一致，其氨基酸序列如seqidno：15所示，编码序列如seqidno:16所示。质粒构建图谱如图1a。[0261]我们进一步对重组腺病毒进行了包装及扩增。[0262]构建好的重组质粒padc68xy3-rhaf与padc68xy3-rbd-ha2-cd8tm分别经限制性内切酶pac1在37℃水浴中线性化3.5h，65℃灭活内切酶。用293a细胞铺六孔板，将线性化后的重组质粒分别以2.5μg、2μg、1.5μg/孔的量转染至293a细胞，培养11天左右噬斑出现，14天左右至细胞均被病毒感染时收样，细胞上清一起收集，置于-80℃反复冻融三次后，取少量感染293a细胞，westernblot验证目的蛋白的表达，发现有正确大小的蛋白表达(图1b)。[0263]将上述收集的腺病毒样品感染至1个t175细胞培养瓶的293a细胞，24h后收样，置于-80℃反复冻融三次后，感染至6个t175细胞培养瓶的293a细胞，以此类推进行大量扩增，扩增至36个t175细胞培养瓶时，收集细胞沉淀，弃上清，用10ml左右无血清无抗性的dmed培养基重悬，-80℃反复冻融三次后，采用氯化铯密度梯度离心法纯化腺病毒，分装后，-80℃保存。[0264]氯化铯密度梯度纯化腺病毒步骤：[0265](1)将扩增冻融后的腺病毒4℃，4000g，离心30min，取上清，用0.8μm的滤膜过滤；[0266](2)向超速离心管中加入3ml1.2mcsc溶液，将3ml1.4csc溶液用注射器从底部轻轻缓慢打入，铺好氯化铯梯度；[0267](3)将过滤后的腺病毒溶液轻轻加入超速离心管中，用pbs将液面补满，配平后放入sw41套筒中；[0268](4)选取sw41转子，4℃，25000rpm，离心2.5h，降速调为nobrake自然降速；[0269](5)待离心结束后，轻轻取出超速离心管，可见两条白色病毒条带，用注射器从侧面戳如超立管中，将下层条带吸出，注意避免吸到上层条带；[0270](6)将bio-gelp-6pggel脱盐胶注入液相色谱柱(liquidchromatographycolumns)中，待液体落完，留下2-3cm左右的胶为宜，加入pbs洗涤两遍；[0271](7)将上述吸出的病毒液加入脱盐胶，待液体落完后，加入2ml左右pbs洗脱，每个1.5mlep管收集3-4滴洗脱液；[0272](8)nanogrop2000测定每管洗脱液的od260值，将od260大于2的洗脱液合并，加入10％无菌甘油，分装；[0273](9)nanogrop2000测定分装后腺病毒溶液的od260值，od260值×1.1×1012/ml即为纯化后腺病毒的滴度；[0274](10)最终adc68-rhaf滴度为1.76×1013/ml，adc68-rbd-ha2-cd8tm滴度为1.48×1013/ml。[0275]实施例2：adc68-rhaf在c57bl/6小鼠体内的免疫原性[0276]分别采用dna-pcdna3.1-s及腺病毒adc68-rhaf免疫c57bl/6小鼠，在完成免疫2周后，评价免疫组合诱导针对rbd蛋白及h7蛋白的结合抗体滴度及针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度。同时评价针对rbd肽库的t细胞应答水平。[0277]将小鼠随机分为2组，根据免疫原分别命名为对照组、adc68-rhaf组。具体免疫组合如表1所示，免疫方式为肌肉注射。[0278]adc68-rhaf组产生针对rbd蛋白及h7蛋白的结合抗体滴度如图2a所示：针对rbd蛋白的结合抗体滴度均在10,000以上，最高的能够到50,000；针对h7的结合抗体滴度均值在6,000左右，最高的能够到达10,000。同时比较第二针免疫前后针对rbd蛋白的结合抗体数据可以发现，结合抗体滴度有了明显的提升(图2b)。[0279]adc68-rhaf组产生针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度如图2c所示：大部分滴度都在1000以上，均值在1360，有一小鼠中和抗体滴度高达12808，小鼠间存在个体差异性。同时比较第二针免疫前后针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度的数据可以发现，中和抗体滴度有了明显的提升(图2d)。[0280]adc68-rhaf组产生针对rbd肽库的t细胞应答如图2e所示：每百万个脾细胞里面分泌ifn-γ的细胞数在3,000左右。[0281]该实验证实，在c57bl/6小鼠体内，adc68-rhaf能够同时诱导针对流感及新冠的抗体，且能诱导针对新冠病毒的中和抗体及针对新冠病毒的t细胞应答。[0282]表1.adc68-rhaf在c57bl/6小鼠体内免疫原性测试的免疫方案[0283][0284]实施例3：adc68-rhaf在hace2 icr小鼠体内的免疫原性[0285]根据实施例2得出的结论，为了后续能够采用新冠病毒对小鼠进行攻毒保护验证，我们在hace2 icr小鼠体内验证了adc68-rhaf的免疫原性，在完成免疫2周后，评价免疫组合诱导针对rbd蛋白、h3蛋白及h7蛋白的结合抗体滴度和针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度。[0286]本实施例中所用hace2 icr小鼠是一种covid-19临床前模型，其为icr小鼠背景下构建的sars-cov-2易感人血管紧张素转换酶2(hace2)转基因小鼠，主要在其肺、心、肾和小肠中表达hace2。该小鼠模型是sars-cov-2治疗药物和疫苗研发的重要工具。[0287]实验步骤如下：将小鼠随机分为2组，根据免疫原分别命名为对照组和adc68-rhaf组。具体免疫组合如表2所示，免疫方式为肌肉注射。[0288]adc68-rhaf组合产生针对rbd蛋白、h3蛋白及h7蛋白的结合抗体滴度如图3a所示：针对rbd蛋白的结合抗体滴度大多在10,000以上，部分能够达到100,000；针对h3蛋白的结合抗体滴度大多在100以上，部分能够达到1000；针对h7蛋白的结合抗体滴度大多在6,400左右。[0289]第二针免疫结束后2周，adc68-rhaf组产生针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度如图3b所示：大部分都在1000左右，最高能到达2253。[0290]该实验证实，adc68-rhaf能够在hace2 icr小鼠体内同时诱导针对新冠及流感的结合抗体，且能够同时诱导针对流感h3及h7的结合抗体，验证了ha2抗体的广谱性。同时adc68-rhaf能够有效诱导针对新冠的中和抗体，具有开发为抗流感及新冠疫苗的良好前景。[0291]表2.adc68-rhaf在hace2 icr小鼠体内免疫原性测试的免疫方案[0292][0293]实施例4：adc68-rhaf和adc68-rbd-ha2-cd8tm在balb/c小鼠体内的免疫原性[0294]分别采用腺病毒adc68-rhaf及adc68-rbd-ha2-cd8tm免疫balb/c小鼠，在完成免疫2周后，评价免疫组合诱导针对rbd蛋白及h7蛋白的结合抗体滴度及针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度。同时评价针对rbd肽库的t细胞应答水平。[0295]将小鼠随机分为3组，根据免疫原分别命名为adc68组、adc68-rhaf组和adc68-rbd-ha2-cd8tm组。具体免疫组合如表3所示，免疫方式为肌肉注射。[0296]免疫结束后一周采集血清检测了针对rbd蛋白的结合抗体滴度，如图4a所示：adc68-rhaf组针对rbd蛋白的结合抗体滴度均值为4031，最高能到12,800；adc68-rbd-ha2-cd8tm组针对rbd蛋白的结合抗体滴度均值为10,160，最高的能够到25,600，此时adc68-rhaf组与adc68-rbd-ha2-cd8tm组之间没有显著差别。[0297]免疫结束后一周检测了针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度，如图4b所示：adc68-rhaf组中和抗体滴度均值为128，最高能到274；adc68-rbd-ha2-cd8tm组中和抗体滴度均值为97，最高的能够到348，此时adc68-rhaf组与adc68-rbd-ha2-cd8tm之间没有显著差别。[0298]随后持续检测免疫结束后两周针对rbd的结合抗体滴度及针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度。[0299]同时，试验进一步证明两种腺病毒adc68-rhaf及adc68-rbd-ha2-cd8tm：可有效诱导产生针对流感病毒针h7的结合抗体；可有效诱导针对sars-cov-2假病毒的中和抗体；同时，可诱导针对rbd肽库的t细胞应答。[0300]表3.adc68-rhaf和adc68-rbd-ha2-cd8tm在balb/c小鼠体内的免疫原性测试方案[0301][0302]实施例5：adc68-rhaf在balb/c小鼠体内不同接种方式产生的免疫原性[0303]分别采用dna-pcdna3.1-s及腺病毒adc68-rhaf免疫balb/c小鼠，在完成免疫2周后，评价免疫组合诱导针对rbd蛋白及h7蛋白的结合抗体滴度及针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度。同时评价针对rbd肽库的t细胞应答水平。[0304]将小鼠随机分为4组，根据免疫原及免疫方式分别命名为adc68肌肉组、adc68滴鼻组、adc68-rhaf肌肉组和adc68-rhaf滴鼻组。具体免疫组合如表4所示。[0305]免疫结束后两周采集血清及肺灌洗液检测针对rbd蛋白和针对流感病毒h7蛋白的结合抗体，包括igg和iga；同时检测针对sars-cov-2假病毒的中和抗体及针对rbd肽库的t细胞应答。[0306]表4.adc68-rhaf在balb/c小鼠体内不同接种方式产生的免疫原性测试方案[0307][0308][0309]实施例6.新冠病毒攻毒试验[0310]小鼠：南模生物ace2-转基因小鼠(c57bl/6-tgtn(cag-humanace2-ires-luciferase-wpre-polya)smoc)，雌性。[0311]毒株：sars-cov-2/human/chn/shanghai_ch-02/2020。[0312]委托第二军医大学进行攻毒试验[0313]免疫程序：将小鼠随机分为2组，根据免疫原分别命名为对照组和adc68-rhaf组。具体免疫组合如表5所示，免疫方式为肌肉注射。[0314]攻毒程序：免疫结束后1-2周对小鼠进行攻毒试验，攻毒后观察至5天，记录体重变化；攻毒后第三天每组各取3只小鼠处死，取肺组织，每只小鼠的左半边肺组织(一个大叶)用4％多聚甲醛固定48小时后做病理切片(h&e染色和组化)；每只小鼠的右半边肺组织(4个小叶)研磨测病毒载量qpcrrnacopies或者病毒滴度pfu/ml；第五天，若还有小鼠存活，则称完体重后全部处死。[0315]结果显示：从病毒载量来看，adc68-rhaf组相比于对照组降低了3.7个log，其中adc68-rhaf三只中有两只检测不到病毒载量(图5a)。同时，从h&e染色的结果来看，adc68-rhaf组肺组织病理要明显好于对照组，损伤更小且炎性浸润更少(图5b)。从体重来看，adc68-rhaf组没有改变，而对照组在第三天出现急剧下降(图5c)。从生存来看，adc68-rhaf组百分之百存活，而对照组全部死亡(图5d)。总体而言，所有数据均证明了adc68-rhaf疫苗对新冠有极佳的保护作用。[0316]表5.adc68-rhaf在hace2 c57bl/6小鼠体内免疫方案[0317][0318]实施例7.小鼠流感病毒攻毒试验[0319]小鼠：hace2 icr小鼠和balb/c小鼠，雌性。[0320]毒株：h7n9(a/shanghai/4664t/2013)、h3n2(a/hongkong/8/68)。[0321]在上海市公共卫生临床中心p2及p3实验室进行攻毒试验。[0322]免疫程序：将小鼠随机分为2组，根据免疫原分别命名为对照组和adc68-rhaf组。具体免疫组合如表6所示，免疫方式为肌肉注射。[0323]攻毒程序：免疫结束后对小鼠进行滴鼻攻毒，攻毒后持续观察14天，每日称重，记录体重变化，并得出生存曲线。[0324]结果显示，对于h7n9攻毒，adc68-rhaf组小鼠体重在第七天就出现回升，而对照组则一直在下降(图6a)。而从生存来看，adc68-rhaf组完全存活，而对照组则在第十天全部死亡(图6b)。对于h3n2的攻毒，该剂量对于小鼠是不致死的，因此只看体重变化，可以发现，adc68-rhaf组的体重下降明显少于对照组(图6c)。总的来说，adc68-rhaf可有效针对各试验毒株产生保护效果，具有广谱性。[0325]表6.adc68-rhaf在hace2 c57bl/6小鼠体内免疫方案[0326][0327]实施例8.r545-ha2-intn-pab-7xhis真核表达载体的构建及r545-ha2-intn-pab-7xhis蛋白表达[0328]从前面的实验中，我们发现腺病毒载体疫苗adc68-rhaf能够诱导针对新冠和流感的抗体，且均有保护效果。在后续的实验中，我们尝试更换载体，即直接采用纯化出的纳米颗粒来进行测试。为了提升蛋白的溶解度和复性率，我们选用了一个更短的rbd肽段(r545，其对应氨基酸序列如seqidno:21所示，基因序列如seqidno:22所示)，比前文的rbd更利于用于蛋白质的包涵体纯化。[0329]为了表达r545-ha2-intn蛋白，我们构建了r545-ha2-intn(r545ha-intn)的供体质粒，通过转座获得能在昆虫细胞系sf9中高效表达r545-ha2-intn的重组杆状病毒，并在昆虫细胞系sf9中真核表达出了成熟的蛋白质。[0330]首先，我们对r545-ha2-intn基因进行了昆虫sf9细胞密码子优化并加入了促溶标签pab(proteinabdomin)和7xhis标签，人工合成了r545-ha2-intn-pab-7xhis基因片段(擎科，其对应氨基酸序列如seqidno:23所示，基因序列如seqidno:24所示)，并插入至pfastbac-dual质粒(赛默飞thermo，10712024)ph启动子下游的酶切位点bamhi(thermoscientific公司，fd0054)和hindiii(thermoscientific公司，fd0504)之间，获得供体质粒pfbd-r545ha-intn-pab-7xhis(图7a)。[0331]随后我们用供体质粒pfbd-r545ha-intn-pab-7xhis转化至含有bacmid的dh10bac感受态(唯地)，涂含有x-gal、iptg、卡那霉素和庆大霉素抗性的平板，37℃培养2天后，挑取白色菌落获得并用m13-f/r引物进行pcr验证，挑取阳性克隆获得br545ha-intn-pab-7xhis。[0332]接着我们用br545ha-intn-pab-7xhis转染贴壁sf9(spodopterafrugiperdaclone9，atcc)细胞，具体步骤见cellfectiniireagent(invitrogen公司，货号10362100)转染步骤，获得p1代重按组杆状病毒vacr545ha-intn-pab-7xhis，将p1代vacr545ha-intn-pab-7xhis以1:100的体积比感染600mlsf-sfm培养基(沃美生物，sf10111-2)中悬浮培养的sf9细胞系，细胞密度2×106/ml，5天后收获细胞培养物，对r545ha-intn-pab-7xhis蛋白表达情况和分布进行检测(图7b)。结果显示，融合蛋白多在细胞内表达，因此后续采用包涵体纯化的方式进行纯化。[0333]实施例9.r545-ha2-intn-pab-7xhis蛋白纯化[0334]为了获取展示r545-ha2的纳米颗粒，我们首先对r545ha-intn-pab-7xhis蛋白进行了纯化，纯化步骤如下：[0335](1)将vacr545ha-intn-pab-7xhis感染后5天的600mlsf9细胞2000g，10min离心，收集细胞沉淀；[0336](2)将500μl100x蛋白酶复合物抑制剂(生工生物，货号：600387)加入50ml细胞裂解液(50mmtris-hclph＝8,0.5mnacl,1％np40)，超声波细胞粉碎机(scientz-iid)，15s打，20s停，20min，显微镜镜检至细胞完全破碎。[0337](3)8000g4℃离心20min，收集沉淀，用50mlph＝8.5的50mmtris-hcl重悬沉淀，加入50μl超级核酸酶(天地人和，pe001b)，室温孵育20min。[0338](4)8000g4℃离心20min，收集沉淀，用50ml2m尿素(50mmtris-hclph＝8，0.5mnacl，0.5％np40，0.05％tween)重悬沉淀，冰置5min。[0339](5)8000g4℃离心20min，收集沉淀，重复步骤(4)。[0340](6)8000g4℃离心20min，用50ml8m尿素(50mmtris-hclph＝8，0.5mnacl)重悬沉淀，冷库旋转过夜，充分溶解沉淀。[0341](7)8000g4℃离心20min，收集上清，过0.22μm的滤膜。[0342](8)取4mlhighaffinityni-chargedresinff(金斯瑞,l00666),用10ml平衡液(8m尿素，50mmtris-hclph＝8，0.5mnacl)混匀，800g，离心5min，收集beads，反复清洗3次。[0343](9)用2ml平衡液重悬beads，加入至8m尿素溶解物中，4℃旋转4h，2000g4℃离心10min，收集beads。[0344](10)用10ml的平衡液完全收集beads上重力柱，收集部分流传液检测挂柱效率。[0345](11)加入20ml平衡液洗柱，至完全流尽。[0346](12)加入20ml洗柱液(80mm咪唑，8m尿素，50mmtris-hclph＝8，0.5mnacl)，至完全流尽。[0347](13)加入11ml洗脱液(300mm咪唑，8m尿素，50mmtris-hclph＝8，0.5mnacl)，弃最开始1ml的流传液，收集10ml洗脱液。[0348](14)加入dtt至终浓度20mm，4℃旋转过夜。[0349](15)将洗脱液稀释10倍(蛋白浓度小于50μg/ml)，如下进行梯度复性：[0350]i.4m尿素，50mmtris-hclph＝8，0.5mnacl，0.4mm还原型谷胱甘肽，0.2mm氧化型谷胱甘肽，0.1％peg6000，5％甘油，4h。[0351]ii.2m尿素，50mmtris-hclph＝8，0.5mnacl，0.4mm还原型谷胱甘肽，0.2mm氧化型谷胱甘肽，0.1％peg6000，5％甘油，4h。[0352]iii.1m尿素，50mmtris-hclph＝8，0.5mnacl，0.4mm还原型谷胱甘肽，0.2mm氧化型谷胱甘肽，0.1％peg6000，5％甘油，4h。[0353]iv.50mmtris-hclph＝8，0.5mnacl，2mmdtt，0.1％peg6000，5％甘油，4h。[0354]v.50mmtris-hclph＝8，0.5mnacl，2mmdtt,5％甘油，4h。[0355]vi.pbsph＝7.4，2mmdtt，5％甘油4h。[0356](16)透析复性后的蛋白质用bca(赛默飞，货号：23235)法检测浓度。分装，存于4℃备用(长存于-80℃)。[0357]纯化后的蛋白质用wb和考马斯亮蓝染色均可看到正确大小(约70kda)的条带(图8a)。[0358]实施例10.纳米颗粒r545haf的组装[0359]内含肽(intein)是一种可以自我剪切的肽段。如前所述，r545-ha2的c端融合内含肽的n端形成重组蛋白r545ha-intn-pab-7xhis。铁蛋白(ferritin，fn)的n端与接头gbl-intein(gb1为proteing的bdomin在此作为促溶标签)的c端融合形成重组蛋白gbl-intc-ferrtin后自装配成24聚体构成纳米颗粒；内含肽的n端特异性识别并切除暴露在所述纳米颗粒表面的铁蛋白；外源蛋白与铁蛋白共价交联而得r545-ha2-hfn，其也呈24聚体的纳米颗粒状态。[0360]为了探究这一连接反应的有效性，我们先纯化了7xhis-gb1-intc-fn(按照专利申请号201910421408.9进行)，具体纯化方式如下：[0361](1)将pet28a7xhis-gb1-intc-fn转化至bl21(擎科生物，货号：cd901-02)表达菌株。[0362](2)挑取单克隆菌株，接种至20ml的卡纳氯霉素双抗lb培养基中，37℃摇床过夜培养。[0363](3)第二天1:25接种至500ml的卡纳氯霉素双抗的lb培养基，37℃、250rpm。[0364](4)培养至od为0.8-1.0时，加入0.2mmiptg进行诱导。25℃、250rpm诱导5h后，4000rpm、4℃、30分钟离心收集菌体，弃上清。[0365](5)用30ml的裂解液(50mmtris，ph7.5，150mmnacl，1％tritonx-100)重悬500ml的lb培养细菌，而后超声破碎。[0366](6)超声结束后，12000rpm、4℃、30分钟离心，收集上清。[0367](7)每30ml的溶液加入4.5g的硫酸铵，4℃混匀15min。[0368](8)12000rpm、4℃、30分钟离心，收集沉淀。[0369](9)加入30ml的tris-hcl溶液(0mmtris，ph7.5，150mmnacl)溶解4℃过夜。[0370](10)bca(赛默飞，货号：23235)测7xhis-gb1-intc-fn蛋白浓度，分装，存于4℃备用(长存于-80℃)。[0371]将纯化的7xhis-gb1-intc-fn与纯化的r545ha-intn-pab-7xhis(实施例9中所纯化)在dtt浓度2mm的条件下进行连接，结果如图8b。可见r545ha-intn-pab能通过连接fn形成大小约70kda(糖基化修饰前67kda)的连接产物r545haf(图8b左二泳道70kda条带)，并切割生成副产物intn-pab(17kda)和gb1-intc(11kda)。[0372]实施例10:纳米颗粒r545haf在hace2 小鼠体内的免疫原性[0373]我们在hace2 icr小鼠体内验证了纳米颗粒疫苗r545haf的免疫原性，在完成免疫后4周，评价免疫组合诱导针对rbd蛋白及h7蛋白的结合抗体滴度和针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度。[0374]本实施例中所用hace2 icr小鼠是一种covid-19临床前模型，其为icr小鼠背景下构建的sars-cov-2易感人血管紧张素转换酶2(hace2)转基因小鼠，主要在其肺、心、肾和小肠中表达hace2。该小鼠模型是sars-cov-2治疗药物和疫苗研发的重要工具。[0375]实验步骤如下：将小鼠随机分为2组，根据免疫原分别命名为对照组和纳米颗粒组。具体免疫组合如表7所示，免疫方式为肌肉注射。[0376]纳米颗粒组，即r545haf产生针对rbd蛋白的结合抗体滴度如图9a所示，免疫结束后第四周，针对rbd蛋白的结合抗体滴度大多在400,000以上，部分能够达到3,000,000；同时比较第一针免疫后与第三针免疫后针对rbd蛋白的结合抗体数据可以发现，结合抗体滴度有了明显的提升(图9b)。同时，r545haf也显示可有效诱导针对流感病毒h7的结合抗体。[0377]免疫结束后4周，纳米颗粒组产生针对sars-cov-2假病毒的中和抗体滴度如图9c所示：大部分都在10,000左右，最高能到达92,172；同时比较第一针免疫后与第三针免疫后针对rbd蛋白的结合抗体数据可以发现，结合抗体滴度有了明显的提升(图9d)。[0378]该实验证实，纳米颗粒疫苗r545haf能够在hace2 icr小鼠体内同时诱导针对新冠及流感的结合抗体。同时纳米颗粒疫苗r545haf能够有效诱导针对新冠的中和抗体，具有开发为抗流感及新冠疫苗的良好前景。[0379]表7.r545haf在hace2 icr小鼠体内免疫原性测试的免疫方案[0380][0381]在本公开提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本公开的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本公开作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。[0382]附录：序列表信息[0383]当前第1页12当前第1页12
再多了解一些
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