一种犏牛瘤胃自然共培养物发酵粗饲料生产漆酶的方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种牦牛瘤胃新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物降解粗饲料生产漆酶的方法。


背景技术：

2.我国牦牛占世界总牦牛数的90％以上，约2000万头，主要分布在我国青海、西藏、四川、甘肃、新疆、云南以及青藏高原及周边国家。黄牛是我国本地品种，具有耐粗饲、适应性强等优点，且肉质嫩度指标要明显优于国外引进品种和杂交品种。犏牛是牦牛的衍生牛种，是牦牛种群不断创新结出的果实。犏牛是牦牛与黄牛或改良牛种间远缘杂交的f1代杂种，公黄牛与母牦牛杂交，其杂种称黄犏牛，公牦牛与母黄牛杂交，其杂种称牦犏牛。无论黄犏牛、牦犏牛雄性均不育，其生长发育、产肉、役力等生产性能上均明显优于牦牛亲代，在高海拔地区适应生态环境的能力高于黄牛亲代。调查发现截止至2012年青海省犏牛占牛总数的3.5％，不少于12万头，且犏牛生长发育快、抗病力强，一般不易得病，适于高山放牧，且犏牛肉、役兼用，产奶性能好，奶质量高，表现出明显的杂种优势。同样饲养条件下，与黄牛和牦牛相比，在体重、体长、体高和胸围以及宰前重、头重、皮重、前二蹄重、后二蹄重、胴体重、胴体肉重、胴体骨重上，犏牛均表现出突出的杂种优势。同一地区生长的黄牛、犏牛和牦牛的饲料转化率、肉品质、乳品质不同，造成这种差异的原因除了遗传差异外，我们也推测与瘤胃微生物之间关系紧密。研究表明，黄牛瘤胃液真菌丰度指数chao，ace以及多样性指数shannon，simpson都显著低于犏牛和牦牛，群落均匀指数simpsoneven显著高于犏牛，极显著高于牦牛。从pcoa结果来看，牦牛和犏牛瘤胃液真菌区系遗传距离更为接近，与黄牛瘤胃液真菌差异较大。
3.反刍动物瘤胃中存在的厌氧真菌在木质纤维素的降解中起到了重要作用。厌氧真菌中的大多数种属都能够通过其假根分泌高活性酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、酯酶和漆酶等，这些酶类协同作用分解利用结构复杂的，晶体状的纤维素、半纤维素、果胶和木质素等物质。一些甲烷菌可以利用厌氧真菌的代谢产物，如氢气、甲烷、甲酸等，与厌氧真菌形成稳定的共培养物，即：厌氧真菌和甲烷菌共培养物，这个过程促进了厌氧真菌和甲烷菌的生长，同时显著提高了厌氧真菌降解木质纤维素所产生的各种木质纤维素降解酶的活性和对木质纤维素的降解能力。
4.传统能源物质面临枯竭的危险，且这些传统能源物质在使用时产生了大量温室气体，污染环境。缓解当今人类而临的“粮食、能源、环境”三大危机是实现农业可持续发展战略的重要途径之一。粗饲料是指天然水分含量在60％以下，干物质中粗纤维含量高于18％，并以风干物形式饲喂的饲料，包括干草、作物秸秆、树叶、果皮、酒糟和秕壳等。粗饲料的纤维含量高，蛋白质、矿物质含低，适口性差。秸秆、干草和秕壳等粗饲料的主要成分是木质纤维素，包括木质素、纤维素和半纤维素。秸秆、干草和秕壳等“用则利，弃则害”，它们作为废弃物会带来环境污染等害处，而作为重要的可再生资源加以充分利用则可实现变废为宝，造福人类。
5.木质素的生物降解在环境和能源科学中具有重要意义。木质纤维素的微生物降解是由于其分泌的一系列酶的共同作用。在这一降解过程中，木聚糖酶、羧甲基纤维素酶和漆酶等酶系相互协同作用，在降解木质纤维素的反应过程中发挥着十分重要的作用。漆酶是木质素降解酶系中的一个重要成员，是木质素降解过程中的关键酶，通过攻击木质素中酚类化合物来实现对木质素的降解，通常从木质素中汲取电子把空气中氧气还原为水。
6.漆酶最早于1883年在日本的漆树中被发现并分离出来，迄今有关漆酶的研究已经持续了 140多年。漆酶在自然界中广泛分布于高等植物、微生物、藻类、昆虫和无脊椎动物中，多种生物都能够产生漆酶，目前主要来源是土壤中的细菌和各类好氧真菌。漆酶是一种可以氧化多种酚类和非酚类化合物的多铜氧化酶，属于铜蓝氧化酶，以分子氧作为最终电子受体，能催化木质素和一大类酚类及芳胺类物质的聚合、降解及转化。漆酶的肽链主要由500个左右的氨基酸组成，糖配基占整个分子的10％-45％。铜离子参与漆酶活性中心的构建，共同构成漆酶结构中最重要的部分，决定着漆酶的活力和特异性，是结合底物及直接参与键断裂形成的区域。由于漆酶的底物十分广泛且具有非底物特异性，催化生成的产物不污染环境，催化反应的副产物只有水，所以漆酶作为一种绿色生物催化剂在各领域中均有巨大的应用潜力，尤其是在食品工业、造纸工业、纺织工业、医药、合成化学、化妆品、土壤生物修复、生物降解、生物燃料电池、环境保护等方面起着重要作用。漆酶作为一种生物酶，能够将酚类、胺类、羧酸类等难降解的污染物在温和的条件下降解为对环境毒性更弱的小分子物质，有着巨大应用潜力和广阔的市场前景。目前人们对漆酶研究主要是担子菌门中的白腐真菌所分泌的漆酶，以及里氏木霉也是工业用漆酶的重要生产菌株。专利cn201210007885.9公开了一种以水稻秸秆为原料固态发酵产漆酶的方法，并具体公开了用于发酵水稻秸秆的密孔菌属菌株；专利cn201810580328.3公开了一种秸秆生物饲料原料的预处理方法，并具体公开了用于发酵的脉孢菌发酵。
7.漆酶在各方面的优越性能使得人们对其关注度越来越高。虽然对于漆酶的研究已经取得较大进展，生化研究、三维结构、催化机理等都有了进一步的研究，但是有关漆酶实际应用的研究还很肤浅，漆酶测定方法及测定体系差异较大，对酶活、产量之间的比较存在一定的难度，有关漆酶的大规模工业化生产报道较少，漆酶的合成成本较高，生产水平较低等，所以筛选优良的高产漆酶菌株、获得性能稳定的漆酶、实现漆酶的高效生产迫在眉睫。
8.犏牛适应高寒生态条件，耐粗饲、耐严寒、耐低氧的恶劣自然环境。犏牛瘤胃内栖息着独特的，复杂多样，大量的微生物群落协同高效降解野牧草为犏牛提供生存能量和营养物质。本发明意外发现，采用从甘肃省天祝藏族自治区的乌鞘岭牧场的放牧犏牛瘤胃中分离出的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(methanobrevibacter olleyae)cattle-yaktz1，所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(methanobrevibacter olleyae)cattle-yaktz1能够发酵粗饲料，且发酵玉米秸秆能够生产高活性漆酶，产生的漆酶活性高达81.3u/ml，取得了良好的效果。


技术实现要素：

9.针对上述技术问题，本发明的首要目的是提供一种犏牛瘤胃新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(methanobrevibacter olleyae)cattle-yaktz1发酵粗饲料生产漆酶的方法，所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(methanobrevibacter olleyae)
cattle-yaktz1于2021年11月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.23971，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编为100101；电话为：010-64807355；传真为：010-64807288；
10.所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(methanobrevibacterolleyae)cattle-yaktz1中的新美鞭菌的it1s序列如seqidno.1所示；所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(methanobrevibacterolleyae)cattle-yaktz1中的甲烷短杆菌的it1s序列如seqidno.2所示。
11.所述的方法包括如下步骤：
12.(1)新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(methanobrevibacterolleyae)cattle-yaktz1菌剂的制备：向以小麦秸秆为底物的厌氧培养基中接入新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(methanobrevibacterolleyae)cattle-yaktz1，加入复合抗生素，厌氧培养，即得到高活力的菌剂；
13.(2)生产漆酶：吸取步骤(1)所得菌剂接入以粗饲料为底物的厌氧培养基中，加入复合抗生素，厌氧培养，即得。
14.优选的，步骤(2)所述的粗饲料为小麦秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆、高粱秸秆、燕麦秸秆、大豆秸秆、棉花秸秆、胡麻秸秆、芝麻秸秆、黄豆秸秆、土豆秸秆、番茄渣、小麦壳、水稻壳、椰子壳、麸皮、苹果皮、黄豆皮、香蕉皮、玉米皮、羊草、剑麻、木屑、芦苇秆、竹子秆的任一种。
15.优选的，步骤(2)所述的粗饲料为小麦秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆、高粱秸秆、燕麦秸秆、大豆秸秆、棉花秸秆、胡麻秸秆、黄豆秸秆、羊草、黄豆皮、玉米皮、芦苇杆和竹子杆中的任一种。
16.优选的，所述步骤(1)中新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(methanobrevibacterolleyae)cattle-yaktz1的接种量为10％v/v；所述步骤(2)中菌剂的接种量为10％v/v，底物中秸秆含量为1％w/v。
17.优选的，所述步骤(1)中厌氧培养的温度为39℃，时间为72h。
18.优选的，所述步骤(2)中厌氧培养的温度为39℃，时间为120h。
19.优选的，步骤(1)所述的复合抗生素由终浓度为1600iu/ml的青霉素钠和2000iu/ml的硫酸链霉素组成；所述复合抗生素的加入量为1％v/v。
20.优选的，所述厌氧培养的培养基配方为：酵母膏1.0g，nahco37.0g，1.0g/l刃天青1.0ml，l-半胱氨酸盐酸盐1.7g，盐溶液ⅰ82.5ml，盐溶液ii16.5ml，蒸馏水定容至1000ml；所述的盐溶液i配制步骤如下：nacl6.0g，(nh4)2so43.0g，kh2po43.0g，cacl2·
2h2o0.4g，mgso4·
2h2o0.6g，蒸馏水定容至1000ml；所述的盐溶液ii配制步骤如下：4.0gk2hpo4，蒸馏水定容至1000ml。
21.优选的，所述的步骤(2)中，接入玉米秸秆杆后除氧，充入二氧化碳，高温高压灭菌。
22.本发明的第二目的是提供犏牛瘤胃新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(methanobrevibacterolleyae)cattle-yaktz1发酵粗饲料制备漆酶的应用，所述的犏牛瘤胃新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(methanobrevibacterolleyae)cattle-yaktz1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：cgmccno.23971。
23.本发明的有益效果是：本发明首先提供了一种新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(methanobrevibacterolleyae)cattle-yaktz1，所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(methanobrevibacterolleyae)cattle-yaktz1能够发酵粗饲料产漆酶，所述的粗饲料为小麦秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆、高粱秸秆、燕麦秸秆、大豆秸秆、棉花秸秆、胡麻秸秆、芝麻秸秆、黄豆秸秆、土豆秸秆、番茄渣、小麦壳、水稻壳、椰子壳、麸皮、苹果皮、黄豆皮、香蕉皮、玉米皮、羊草、剑麻、木屑、芦苇秆和竹子秆共计25种中的任一种，且发酵其中的玉米秸秆所产漆酶的活性最高，达到81.3u/ml，同时，本发明所述的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(methanobrevibacterolleyae)cattle-yaktz1通过保藏在体外存活传代，便于推广，为生产提供了极大的方便。
具体实施方式
24.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
25.下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
26.下述实施例中所使用的培养基为本专利发明人对于常规的厌氧真菌培养基进行了简化后的配方，如下：
27.所述厌氧培养的培养基配方为：酵母膏1.0g，nahco37.0g，1.0g/l刃天青1.0ml，l-半胱氨酸盐酸盐1.7g，盐溶液ⅰ82.5ml，盐溶液ii16.5ml，蒸馏水定容至1000ml；所述的盐溶液i配制步骤如下：nacl6.0g，(nh4)2so43.0g，kh2po43.0g，cacl2·
2h2o0.4g，mgso4·
2h2o0.6g，蒸馏水定容至1000ml；所述的盐溶液ii配制步骤如下：4.0gk2hpo4，蒸馏水定容至1000ml。
28.实施例1新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(methanobrevibacterolleyae)cattle-yaktz1菌剂的制备
29.吸取1ml新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(methanobrevibacterolleyae)cattle-yaktz1接种到含有9.0ml以风干粉碎的小麦秸秆为底物的厌氧培养基的20ml亨氏厌氧管中，同时加入0.1ml复合抗生素(终浓度为1600iu/ml青霉素和2000iu/ml硫酸链霉素)，39℃厌氧培养72h，即达到生长高峰，此时发酵液为高活力菌剂。
30.实施例2新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(methanobrevibacterolleyae)cattle-yaktz1厌氧发酵粗饲料生产漆酶
31.在100ml体积厌氧发酵瓶中盛45ml液体基本培养基，分别以0.5g干燥粉碎后的小麦秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆、高粱秸秆、燕麦秸秆、大豆秸秆、棉花秸秆、胡麻秸秆、芝麻秸秆、黄豆秸秆、土豆秸秆、番茄渣、小麦壳、水稻壳、椰子壳、麸皮、苹果皮、黄豆皮、香蕉皮、玉米皮、羊草、剑麻、木屑、芦苇秆和竹子秆作为底物。除氧，然后高压灭菌。把传代培养72h的新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(methanobrevibacterolleyae)cattle-yaktz1用无菌注射器吸取5.0ml分别接种到上述加有25种底物的厌氧培养基中，同时加入0.5ml复合抗生素(终浓度为1600iu/ml青霉素和2000iu/ml硫酸链霉素)，39℃厌氧培养5天，共设置3个平行实验。
32.实施例3漆酶含量测定
33.隔24h测定实施例2中厌氧瓶中发酵液的漆酶活性。
34.漆酶活力测定方法(采用abts法)：
35.(1)发酵液在4℃，5000r/min条件下离心15min，取上清液即为粗酶液；
36.(2)配制0.5mmol/l abts溶液：试剂一：0.0384gabts定容到10ml；试剂二：0.013 4g过硫酸钾定容到10ml，试剂一与试剂二1：1混合，12h避光后得7mmol/l abts溶液，稀释14倍后得到0.5mol/labts溶液；
37.(3)吸取1.00ml粗酶液加2.00ml乙酸-乙酸钠缓冲液(ph6.8)稀释3倍，将稀释好的酶液在39℃下水浴30min，测定时取2.9ml abts溶液，加入0.1ml已预热的稀释酶液，迅速放入紫外分光光度计中，记录吸光度值从一点(a1)变化到另一个点(a2)的时间t，根据酶活力定义计算酶活力：
[0038][0039]
a1、a2为吸光度值变化的两个端值，t为吸光度值从a1增加到a2经历的时间(s)；酶活力单位定义为每分钟氧化1μmol底物所需的酶量为1个酶活力单单位(u)；酶活力单位为 u/ml。
[0040]
实验结果表明：5天培养期内，犏牛瘤胃新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(methanobrevibacter olleyae)cattle-yaktz1分别降解25种粗饲料产生胞外酶—漆酶的活性达到的最高值分别为：小麦秸秆38.0u/ml、水稻秸秆50.7u/ml、玉米秸秆81.3u/ml、高粱秸秆28.3 u/ml、燕麦秸秆40.1u/ml、大豆秸秆30.0u/ml、棉花秸秆25.6u/ml、胡麻秸秆37.0u/ml、芝麻秸秆16.2u/ml、黄豆秸秆29.5u/ml、土豆秸秆19.1u/ml、番茄渣17.8u/ml、小麦壳9. 2u/ml、水稻壳7.1u/ml、椰子壳2.9u/ml、麸皮9.3u/ml、苹果皮7.9u/ml、黄豆皮25.0u /ml、香蕉皮6.0u/ml、玉米皮20.4u/ml、羊草30.1u/ml、剑麻9.5u/ml、木屑3.9u/ml、芦苇秆30.5u/ml、竹子秆22.6u/ml。其中发酵玉米秸秆所产的漆酶的活性最高，达到81.3 u/ml，显著高于发酵其它底物所产漆酶的活性，具有重要的工业应用价值。其中表1为25 种粗饲料的成份分析，表2为漆酶活性测定结果。
[0041]
表1采用的25种粗饲料底物的木质纤维素成份
[0042]
[0043][0044]
表2新美鞭菌和甲烷短杆菌的自然共培养物(methanobrevibacter olleyae)cattle-yaktz1在5 天培养期分别降解25种粗饲料所产的漆酶活性
[0045][0046][0047]
注:a,b,c,d表示差异显著性(p《0.05)。