一种用于检测对虾HINV病毒的靶序列、引物及其应用的制作方法

and intestine necrosis virus，hinv)。同时发现hinv对虾苗的感染、致病性强；对大虾感染性虽弱，不会引起爆发性死亡，但仍会导致对虾缓慢死亡，给对虾养殖业带来了巨大的经济损失。
14.本发明根据宏病毒组测序得到的hinv病毒的基因组序列(如seq id no.1所示)，以基因组中第7855～8791位的核苷酸序列为靶序列，设计并开发了hinv病毒的检测引物、试剂盒和方法。
15.本发明首先提供了一种用于检测凡纳滨对虾hinv病毒的靶序列，靶序列如seq id no.2所示。
16.本发明的实验表明，利用此靶序列设计的巢氏pcr引物，可检测样本中是否存在hinv病毒。因此，本发明申请保护所述靶序列在制备检测凡纳滨对虾hinv病毒的产品中的应用。
17.本发明还提供了一种用于检测凡纳滨对虾hinv病毒的引物，用于扩增seq id no.2所示靶序列。
18.优选地，所述引物为巢氏pcr引物，引物序列如seq id no.3～6所示。
19.鉴于上述引物可用于扩增凡纳滨对虾hinv病毒的靶序列，因此，本发明还申请保护所述引物或所述巢氏pcr引物在制备检测凡纳滨对虾hinv病毒的产品中的应用。
20.本发明还提供了一种含有seq id no.2所示靶序列的重组载体。
21.本发明同时申请保护所述重组载体在制备检测凡纳滨对虾hinv病毒的产品中的应用。
22.优选地，所述重组载体为pmd-19t，见实施例1。
23.本发明还提供了一种检测凡纳滨对虾hinv病毒的试剂盒，其含有检测seq id no.2所示靶序列的试剂。
24.优选地，所述检测seq id no.2所示靶序列的试剂中包含上述引物。
25.优选地，所述试剂盒中还含有所述重组载体作为阳性对照，见实施例1。
26.本发明还提供了一种检测凡纳滨对虾hinv病毒的方法，通过提取待测样本的rna并反转录为cdna，利用上述巢氏pcr引物进行pcr扩增，若第一轮出现大小为937bp的特异性条带，或第二轮出现大小为603bp的特异性条带，则表示所检样本中含有hinv病毒。
27.优选地，选取组织样本时，若为虾苗则取甲壳下组织，若为大虾则取肝胰腺，亲虾取游泳足，见实施例1。
28.优选地，反转录成cdna时，20μl的反转录体系中加500～800ng的rna，见实施例1。
29.具体地，巢氏pcr第一轮反应的体系为：2
×
accurate taq master mix 10μl，浓度为5μm的正反向引物各1μl，1μl的cdna模板，灭菌水7μl。
30.具体地，巢氏pcr第一轮反应的程序为：98℃预变性5min；98℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
31.具体地，若第一轮巢氏pcr扩增未检测出阳性条带，则将产物用灭菌水稀释50倍后作为模板，进行第二轮pcr扩增，pcr反应体系及扩增程序同第一轮巢氏pcr。
32.本发明具有以下有益效果：
33.(1)本发明提供了一种用于检测凡纳滨对虾hinv病毒的靶序列，在此序列的基础上，本发明设计并建立了一种高特异性和敏感性的hinv病毒的pcr检测方法，可用于凡纳滨
necrosis virus，hinv)，其基因组序列如seq id no.1所示。本发明根据所测宏病毒得到的序列，在病毒的orf区域内采用primer premier 6设计得到了一组巢氏pcr引物，并通过lasergene 7.1的primer select对设计的引物进行筛选检验，从中筛选出能在富集后的病毒模板中扩增出单一条带的pcr引物。
48.本发明以hinv病毒基因组中第7856～8791位的核苷酸序列为靶序列，靶序列如seq id no.2所示。
49.最终筛选得到的第一轮巢氏pcr的引物序列如下所示：
50.hinv-1-f(seq id no.3)：tgagtctaagtggcagaatcccgtag
51.hinv-1-r(seq id no.4)：ggcgaaatggtagatagtggtgttatc
52.引物hinv-1-f长26bp，从5'起，其位于hinv-1病毒基因组的第7855～7880位，引物hinv-1-r长27bp，其位于病毒基因组序列的第8765～8791位，产物长度为937bp。
53.第二轮巢氏pcr的引物序列如下所示：
54.hinv-2-f(seq id no.5)：cggaccgatgaatacgacagagaa
55.hinv-2-r(seq id no.6)：cgtggtacgaacccaatagcaagg
56.引物hinv-2-f长24bp，从5'起，其位于hinv病毒基因组的第8120～8143位，引物hinv-2-r长24bp，位于病毒基因组序列的第8669～8722位，产物长度为603bp。
57.2、重组载体的制备
58.(1)rna的提取
59.本发明采用trizol法提取样品中的总rna，具体步骤如下：
60.取0.03g组织样品，用匀浆器加1ml trizol进行重复研磨，然后转移至rnase free离心管，混匀后室温放置5min；每管加入200μl氯仿，重复混匀，室温放置10min，4℃、1200rpm离心15min；将上层水相移到新的rnase free离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，4℃放置10min以上；4℃、1200rpm离心10min，弃上清液；沉淀加入1ml预冷75％的乙醇洗涤一次，1200rpm离心10min，小心弃去上清液、风干沉淀；管内加入适量体积的depc处理水溶解rna，直接用于反转录或-20℃冻存备用。
61.选取组织样本时，若为虾苗则取甲壳下组织，若为大虾则取肝胰腺，或亲虾取游泳足。
62.(2)rna反转录成cdna
63.反转录使用艾科瑞公司的evo m-mlv反转录预混型试剂盒(货号ag11728)，参照产品说明书进行。在20μl的反转录体系中加入500～800ng提取的rna，加入5
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evo m-mlv rt master mix 4ul，用水补至20ul。37℃水浴15min后，85℃水浴5s灭活，反转录产物置于-20℃冻存备用。
64.(3)阳性对照重组载体的制备及阴性对照
65.pmd-19t-hinv阳性对照重组载体通过以下制备方法获得：
66.以hinv病毒的cdna为模板，用hinv病毒的巢氏pcr引物hinv-1-f/r进行扩增，得到扩增产物。将扩增产物回收并纯化后克隆至pmd-19t载体，转入dh5α大肠杆菌中，通过筛选及测序，选取含有构建成功的重组载体的菌，提取质粒即得阳性重组载体。
67.阴性对照为pmd-19t空载体。
68.实施例2巢氏pcr方法的建立及灵敏度、特异性检测
69.1、pcr扩增方法的建立
70.(1)pcr扩增体系
71.以反转录合成的cdna为模板，进行巢式pcr检测，第一轮pcr扩增使用的引物为hinv-1-f/r，所用pcr酶为艾科瑞公司的2
×
accurate taq预混液(含染料)(货号ag11019)。pcr反应采用20μl体系：2
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accurate taq master mix 10μl，浓度为5mμ的正反向引物各1μl，1μl的cdna模板，灭菌水7μl。
72.(2)pcr反应程序
73.将装有反应体系的pcr管放入takara pcr thermal c pcr仪中，设置如下程序：98℃预变性5min；98℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸1min，30个循环；再72℃延伸10min，最后4℃保存。
74.pcr扩增产物经琼脂糖电泳检测，引物hinv-1-f/r所扩增片段的大小为937bp。若样品第一轮pcr扩增未检测出阳性条带，则将产物用灭菌水稀释50倍后作为模板，进行第二轮pcr扩增，使用引物为hinv-2-f/r。pcr反应的体系及扩增程序同第一轮pcr反应。
75.巢氏pcr第一轮和第二轮引物的扩增结果分别如图1和2所示。由图1可知，巢氏pcr第一轮引物hinv-1-f/r的扩增产物的条带单一。将一扩产物稀释50倍后作为模板，用巢氏pcr第二轮引物hinv-2-f/r进行扩增，结果如图2所示，由图2可知，出现了单一明亮的条带，阴性对照皆无条带。上述结果表明本发明所设计的巢氏pcr引物可成功检测hinv病毒。
76.2、灵敏度检测
77.为检测所设巢氏pcr引物的灵敏度，分别使用引物hinv-1-f/r和hinv-2-f/r，以不同浓度的阳性重组载体为模板，进行了pcr扩增。将浓度为40ng/μl的pmd-19t-hinv阳性对照重组载体按10倍比稀释9次，稀释后的浓度分别为40ng/μl、4ng/μl、0.4ng/μl、40pg/μl、4pg/μl、0.4pg/μl、40fg/μl、4fg/μl、0.4fg/μl和40ag/μl。依照建立的pcr反应体系和条件进行扩增反应。
78.引物hinv-1-f/r的灵敏度检测结果如图3所示，引物hinv-2-f/r的灵敏度检测结果如图4所示，二者所使用的marker和模板浓度均相同。其中，所使用的marker为ds2000 marker，泳道1～10对应的阳性对照重组载体的浓度依次为40ng/μl、4ng/μl、0.4ng/μl、40pg/μl、4pg/μl、0.4pg/μl、40fg/μl、4fg/μl、0.4fg/μl和40ag/μl。由图3可知，浓度为40fg/μl以上的样本均有明显的目的条带，表明第一轮pcr的最低检测限为40fg/μl。由图4可知，浓度为40ag/μl以上的样本均有明显的目的条带，表明第二轮pcr的最低检测限为40ag/μl。由上述结果可知，本发明所述引物建立的检测hinv病毒的pcr方法具有极高的灵敏度。
79.3、特异性检测
80.为检测所设巢氏pcr引物的特异性，选取分别含有hinv病毒、青蟹呼肠孤病毒(mud crabreovirus，mcrv)、罗氏沼虾小rna样病毒-1(macrobrachiumrosenbergiipicorna-like virus1，mrpv-1)、罗氏沼虾双顺反子样病毒-3(macrobrachiumrosenbergiidicistro-like virus3，mrdv-3)、罗氏沼虾黄病毒(macrobrachiumrosenbergiiflavivirus，mrfv)和神经坏死病毒(nervous necrosis virus，nnv)的不同病料组织进行rna提取，随后反转录为cdna模板，分别使用引物hinv-1-f/r和hinv-2-f/r进行pcr扩增，rna提取及反转录方法参照实施例1，pcr扩增依照建立的pcr反应体系和条件进行扩增反应。
81.巢氏pcr引物hinv-1-f/r的特异性检测结果如图5所示，m为ds2000 marker，泳道1～6分别为hinv、mcrv、mrpv-1、mrdv-3、mrfv和nnv病毒的阳性cdna模板。巢氏pcr引物hinv-2-f/r的特异性检测结果如图6所示，其所用marker以及泳道对应的模板图5相同。由图5和图6可知，针对hinv设计的巢式pcr引物只能在含有hinv病毒cdna的模板中扩增出大小相符的单一条带，表明所设计的巢式pcr引物具有较高的特异性。
82.实施例3凡纳缤对虾中hinv病毒检测
83.为进一步验证所建立的巢氏pcr方法，能否适用于对虾中hinv病毒的检测，我们从有“玻璃”虾出现的养殖塘中选取了6只成虾和8只虾苗，并分别取成虾的肝胰腺和虾苗的甲壳下组织，提取rna并反转录成cdna，采用所建立的巢氏pcr方法进行hinv检测。
84.(1)rna的提取：参照实施例1中的rna提取方法；
85.(2)rna反转录成cdna：参照实施例1中的反转录方法；
86.(3)pcr扩增：pcr扩增体系和反应程序参照实施例2，pcr扩增产物经琼脂糖电泳检测。
87.巢氏pcr第一轮和第二轮引物的扩增结果分别如图7和8所示。由图7可知，第一轮pcr在6只成虾中未检测出条带，在8只虾苗中，有5只检测到大小相符的条带，但条带较暗；以第一轮pcr产物稀释50倍后作为第二轮pcr模板进行扩增，结果如图8所示，6只成虾中有3只在第二轮pcr中检测到了大小相符的条带，8只虾苗有7只在第二轮中检测到大小相符的条带，其中包括第一轮检测到条带的5只虾苗。两轮pcr的阴性对照皆无条带，阳性均检测出条带。上述结果表明，本发明所设计的巢氏pcr引物及检测方法可成功检测对虾中的hinv病毒，可用于hinv病毒的实际检测。
88.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。