一种产雄甾-1,4二烯-3,17-二酮的分枝杆菌及其应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一株用于生产雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的分枝杆菌及其应用。


背景技术：

2.雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(add)是一种重要的类固醇医药中间体，在类固醇工业中占有重要的地位。以add为起始原料，可以合成多种甾体类药物，目前，工业上已实现add向炔诺酮、哒那错、新药诺美孕酮、睾酮、福美司坦等甾体药物的产业化合成。近年来，随着甾体药物的进一步开发和使用，甾体药物中间体add的市场需求量日益增加。传统生产add的方法，是以薯蓣皂素为原料，通过化学的方法加工合成，但原料薯蓣皂素短缺和加工过程污染环境等问题，限制了甾体激素类药物的发展。因此，有研究者提出了以植物甾醇为原料，通过微生物转化获得add的工艺。该工艺可节约生产成本，同时减少了对环境的污染。
3.本发明所涉及的菌株mycobacterium sp.cicc 21097(r)是生物合成add的常用菌株mycobacterium sp.cicc 21097的突变株。mycobacterium sp.cicc 21097(r)已于2021年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 2021383。与亲本菌株相比，mycobacterium sp.cicc 21097(r)转化植物甾醇生产add的能力显著提高，具有较好的应用前景。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一株分枝杆菌mycobacterium sp.cicc 21097(r)，以及其转化植物甾醇生产雄甾-1,4二烯-3,17-二酮(add)的方法。
5.该菌株已于2021年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 2021383，该菌株是从mycobacterium sp.cicc 21097的培养过程中分离出来的突变菌株。mycobacterium sp.cicc 21097是生物合成add的常用菌株。与mycobacterium sp.cicc 21097相比，突变株mycobacterium sp.cicc 21097(r)转化植物甾醇生产add的能力显著增强，且菌落表面更为干燥和粗糙、菌体自凝集特性和菌膜形成能力明显增强。利用突变菌株mycobacterium sp.cicc21097(r)转化植物甾醇生产add的技术方式，具体如下：
6.首先，将-80℃液体冷冻保存的突变株在lb液体培养基中活化培养，lb液体培养基包括：酵母浸粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl 10g/l，lb液体培养条件包括：温度为30℃，转速为200rpm，培养时间为2d。随后，接种于种子培养基，种子培养基包括：果糖25g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母粉6g/l，nacl 10g/l。种子培养条件包括：ph为7.2，温度为30℃，转速为200rpm，培养时间为36h。最后，将制备好的种子培养物以10％的接种量接入发酵培养基，发酵培养基包括：果糖15～25g/l，磷酸氢二铵7.2～12g/l，黄豆饼粉4.8～8g/l，nacl 10g/l，k2hpo
4 3g/l，mgso
4 0.2g/l，mncl
2 5
×
10-4
g/l，tween 80 2.8～5g/l，植物甾醇5g/l。发酵培养条件包括：ph为7.2，温度为30℃，转速为200rpm，培养时间为4d。
具体实施方式
7.实施例1：菌株的鉴定
8.挑取mycobacterium sp.cicc 21097(r)单菌落接种至lb液体培养基中扩大培养，通过基因组试剂盒提取该菌株的全基因组，采用通用引物27f：5'-agagtttgatcctggctcag-3'和1492r：5'-ggttaccttgttacgactt-3'扩增该菌株的16s rdna片段，测序结果比对显示该菌株与mycobacterium sp.cicc 21097高度同源。
9.实施例2:add的测定及产量计算方法
10.将所得发酵液用2倍体积的乙酸乙酯萃取，超声振荡30min，取上相用甲醇稀释10倍，并通过0.22μm的有机膜过滤，将滤液收集于样品瓶中。而后，采用高效液相色谱分析法(hplc)测定发酵液中的add含量，色谱柱采用c18柱，规格：4.6mm
×
250mm
×
5μm，检测波长：254nm，进样量：10μl，流动相：水：甲醇＝30：70，流速：1.0ml/min。最后，根据标准样品add的标准曲线计算发酵液中的add含量。
11.实施例3：mycobacterium sp.cicc 21097(r)转化植物甾醇生产add
12.将-80℃液体冷冻保存的突变株在lb液体培养基中活化培养，lb液体培养基包括：酵母浸粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl 10g/l，lb液体培养条件包括：温度为30℃，转速为200rpm，培养时间为2d。随后，接种于种子培养基，种子培养基包括：果糖25g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母粉6g/l，nacl 10g/l。种子培养条件包括：ph为7.2，温度为30℃，转速为200rpm,培养时间为36h。最后，将制备好的种子培养物以10％的接种量接入发酵培养基，发酵培养基包括：果糖25g/l，磷酸氢二铵12g/l，黄豆饼粉8g/l，nacl 10g/l，k2hpo
4 3g/l，mgso
4 0.2g/l，mncl
2 5
×
10-4
g/l，tween 80 5g/l，植物甾醇5g/l。发酵培养条件包括：ph为7.2，温度为30℃，转速为200rpm，培养时间为4d。发酵结束，提取发酵液，按上述方法检测。add的产量为0.579g/l。同样的条件下，亲本菌株mycobacterium sp.cicc 21097的add产量为0.446g/l，因此，与亲本菌株相比，突变株mycobacterium sp.cicc 21097(r)的产量提高了29.82％。
13.实施例4：mycobacterium sp.cicc 21097(r)转化植物甾醇生产add
14.将-80℃液体冷冻保存的突变株在lb液体培养基中活化培养，lb液体培养基包括：酵母浸粉5g/l,胰蛋白胨10g/l，nacl 10g/l，lb液体培养条件包括：温度为30℃，转速为200rpm，培养时间为2d。随后，接种于种子培养基，种子培养基包括：果糖25g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母粉6g/l，nacl 10g/l。种子培养条件包括：ph为7.2，温度为30℃，转速为200rpm，培养时间为36h。最后，将制备好的种子培养物以10％的接种量接入发酵培养基，发酵培养基包括：果糖15g/l，磷酸氢二铵7.2g/l，黄豆饼粉4.8g/l，nacl 10g/l，k2hpo
4 3g/l，mgso
4 0.2g/l，mncl
2 5
×
10-4
g/l，tween 80 2.8g/l，植物甾醇5g/l。发酵培养条件包括：ph为7.2，温度为30℃，转速为200rpm，培养时间为4d。发酵结束，提取发酵液，按上述方法检测。突变株add的产量浓度为0.355g/l。同样的条件下，亲本菌株的add产量为0.247g/l，因此，与亲本菌株mycobacterium sp.cicc 21097相比，突变株mycobacterium sp.cicc 21097(r)的产率提高了43.72％。