一种胰岛素或其类似物前体的制作方法

1.本技术涉及一种胰岛素或其类似物前体，以及制备胰岛素或其类似物的方法。


背景技术：

2.糖尿病是当今世界严重危害人类健康的疾病之一，胰岛素是目前临床上用于治疗糖尿病的重要药物。人类的天然胰岛素由21个氨基酸连接而成的a链和30个氨基酸连接而成的b链构成的多肽，a链内有1个二硫键，a和b链之间由两个二硫键连接。
3.胰岛素是在胰脏中胰岛的β细胞核糖体上最初作为前胰岛素原合成出来。前胰岛素原是含有由24个氨基酸组成的前导肽链(sp)、b链(b)、31个氨基酸组成的c肽（c）以及a链(a)按照以“sp-b-c-a”这个顺序直线排列的分子。当前胰岛素原进入内质网时，前导肽链被切掉，成为胰岛素原(b-c-a)。胰岛素原在内质网内形成二硫键。形成三维结构之后，激素原转化酶pc1/3将胰岛素原在b-c结合位点切断，然后转化酶pc2又将c-a结合位点切断。最后，当用pc1/3酶切时仍保留在b链的c末端，即，c肽上的n末端的2个碱性氨基酸被羧肽酶h剪切后成为胰岛素。
4.目前胰岛素及其类似物的生产主要采用两套系统，一套是酵母表达系统，另一套是大肠杆菌系统。us4430266中公开了一种采用大肠杆菌宿主直接表达胰岛素原（b-c-a），通过体外复性，然后利用trypsin、cpb进行切割，获得正确序列和结构的胰岛素。
5.大肠杆菌表达系统具有发酵时间短，工艺较简单，表达水平高，生产成本低等优点。但大肠杆菌表达系统的高表达使表达产物以包涵体形式聚集在细胞内，需要将细胞破碎后对包涵体进行变复性等操作才能得到正确折叠的胰岛素及其类似物前体，包涵体复性效率直接影响着产量的高低。此外，从胰岛素及其类似物前体中切割去除前导肽和c肽获得成熟体的过程通常使用trypsin、cpb等蛋白酶。使用trypsin或多或少会导致各种错切，产生各类杂质，对后续精细纯化造成难度，不利于生产成本的降低。
6.因此，需要提高现有技术中胰岛素或胰岛素类似物前体的复性得率和酶切效率，提高产量，降低生产成本。


技术实现要素：

7.本技术旨在提供一种新的胰岛素或胰岛素类似物前体，以及使用该前体制备胰岛素或其类似物的方法，该前体具有高复性得率，有助于在胰岛素或胰岛素类似物生产过程中获得高产量。
8.在本技术的第一个方面，本技术提供了一种胰岛素或其类似物的前体，该前体包含第一肽段和第二肽段，其中第一肽段的氨基酸序列为mivef，第二肽段中包含通过第一连接肽连接的胰岛素或其类似物的a链和b链，第一肽段通过第二连接肽连接于第二肽段的n端。本技术中惊奇的发现，在对该胰岛素或其类似物前体进行复性操作时，第一肽段有助于前体的正确折叠，从而显著提高前体的复性得率。
9.在本技术的第二个方面，本技术的胰岛素或其类似物前体中，所述第二连接肽的
氨基酸序列为[gmsn]
x
r，其中，m为2-10之间的整数，n为0或1，x为1-10之间的整数，具有该氨基酸序列的第二连接肽包含能够被位点特异性蛋白酶，例如胰蛋白酶识别并切割的位点。
[0010]
在本技术的第三个方面，本技术还提供一种制备胰岛素或胰岛素类似物的方法，该方法包括以下步骤：在适合表达所述胰岛素或其类似物前体的培养条件下，培养包含编码本技术胰岛素或其类似物前体的核酸和/或表达载体的宿主细胞；对宿主细胞表达的胰岛素或其类似物前体进行变性后再复性，得到正确折叠的胰岛素或其类似物前体；切割所述胰岛素或其类似物前体，收集胰岛素或其类似物。
[0011]
相比于现有技术中直接表达胰岛素原(b-c-a)的技术方案，在本技术的胰岛素或其类似物制备方法中，胰岛素或其类似物前体中的第一肽段有助于复性过程中前体的正确折叠，提高了前体的复性得率，进而提升胰岛素或其类似物的产率。
[0012]
在本技术的另一些方面，本技术还提供了编码本技术胰岛素或其类似物前体的核酸、含有所述核酸的载体和宿主细胞。
具体实施方式
[0013]
下面结合实施例对本技术作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。
[0014]
需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0015]
需要说明的是，在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0016]
实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0017]
根据本技术的第一方面，本技术提供了一种胰岛素或其类似物前体，该前体包含第一肽段和第二肽段，其中第一肽段的氨基酸序列mivef，第二肽段中包含通过第一连接肽连接的胰岛素或胰岛素类似物的a链和b链，第一肽段通过第二连接肽连接于第二肽段的n端。本技术发现，该胰岛素或其类似物前体被宿主细胞表达后，通过先变性后复性的过程可获得折叠成正确结构的前体，而后通过切割去除第一肽段和第一连接肽可获得成熟胰岛素多肽。在其中先变性后复性的过程中，第一肽段可以帮助前体进行正确折叠，使得前体的复性得率明显提高，有助于提升胰岛素或其类似物的产率。
[0018]
本文使用的术语“胰岛素类似物”是指修饰的胰岛素，其中胰岛素的a和/或b链的氨基酸序列中被取代、缺失和/或添加了一个或几个氨基酸残基，且仍具有与胰岛素相似的生物学功能。
[0019]
本文中，胰岛素分子中的修饰表示为链（a或b）、位置和取代氨基酸残基的氨基酸残基的单字母编码。术语如“a1”、“a2”和“a3”等分别是指在胰岛素的a链中（自n-末端开始
id no.16)。第一连接肽序列为eaedlqvgqvelgggpgagslqplalegslqkr（seq id no.15)。
[0029]
在一些实施方式中，本技术胰岛素或其类似物前体的b链序列为fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt（seq id no.17），a链序列为giveqcctsicslyqlenycn（seq id no.19)，第一连接肽序列为rreaedlqvgqvelgggpgagslqplalegslqkr（seq id no.18）。
[0030]
在一些实施方式中，本技术胰岛素或其类似物前体中的第二肽段为胰岛素原或胰岛素原类似物。
[0031]
在本技术的第二个方面，本技术的胰岛素或其类似物前体中，第二连接肽的氨基酸序列为[gmsn]
x
r，其中，m为2-10之间的整数，n为0或1，x为1-10之间的整数。第二连接肽可被位点特异性蛋白酶，例如胰蛋白酶识别并切割。
[0032]
在一些实施方式中，n为0或1，第二连接肽的氨基酸序列为[gms]
x
r，其中，m为2-10之间的整数，x为1-10之间的整数，所述的第一肽段 第二连接肽序列优选为seq id no. 1-7。本技术意外的发现，在采用某些特定的第二连接肽序列时，胰岛素或其类似物前体被蛋白酶酶切的效率明显提高，酶切过程中产生的杂质较少，有利于进行后续精细纯化，生产成本得以降低。
[0033]
本技术还提供了编码本技术胰岛素或其类似物前体的核酸、含有所述核酸的载体和宿主细胞。
[0034]
本技术的核酸可以是 dna分子或rna分子，也可以是核酸类似物。在本技术中的核酸分子可以包含天然存在的核酸残基或人工生成的核酸残基。本技术的核酸分子可以是单链或双链的、线性或环状的、天然的或合成的，并且若没有另外指出，则没有任何大小限制。核酸分子还可以包含启动子，启动子可以是同源或异源的。
[0035]
本技术的核酸分子可以克隆到载体中。本技术的“载体”包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体和其它在遗传工程中通常使用的载体。在一些实施方式中，这些载体适用于转化细胞、真核生物细胞如真菌细胞、微生物的细胞诸如酵母或原核细胞。在一个优选的实施方案中，这些载体适用于细菌细胞的稳定转化，例如以转录本技术的核酸分子。
[0036]
本技术的载体可以是表达载体。已经在文献中广泛描述的合适的表达载体都可用于本技术。在一个实施方案中，表达载体可以含有标志基因和确保在选择的宿主中复制的复制起点，以及启动子和转录终止信号。在启动子和终止信号之间，优选地，有至少一个能够插入期望表达的核酸序列/分子的限制性位点。优选的，本技术的表达载体选自pet系列表达载体、pgex系列表达载体、pcdna系列表达载体，更优选本技术的表达载体是pet22b表达载体或pet26b表达载体。
[0037]
本文中的术语“宿主细胞”是指用于表达目标多肽的微生物。宿主细胞包括亲本细胞的因复制期间发生突变所致与亲本细胞不相同的任何后代。
[0038]
本技术的宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞，优选是原核细胞。在一些实施方式中，本技术的宿主细胞是大肠杆菌，例如大肠杆菌bl21。
[0039]
在一些实施方式中，在宿主细胞中表达胰岛素或其类似物前体，随后分离胰岛素或其类似物前体。对于蛋白质表达，通过标准方法将编码蛋白质的核酸插入表达载体中。在合适的稳定宿主细胞中实施表达，并且从所述细胞(上清液或裂解后的细胞)中收集蛋白质。
[0040]
在另一个实施方式中，可以将本技术的核酸和/或其中含有本技术核酸的载体转导、转化或转染、或者以其它方式导入宿主细胞中。
[0041]
在本技术的第三个方面，本技术还提供一种制备胰岛素或胰岛素类似物的方法，该方法包括在适合表达胰岛素或其类似物前体的培养条件下，培养包含编码本技术胰岛素或其类似物前体的核酸和/或表达载体的宿主细胞。
[0042]
在一些实施方式中，本技术的制备胰岛素或其类似物的方法还包括以下步骤：对宿主细胞表达的胰岛素或其类似物前体进行变性后再复性，得到正确折叠的胰岛素或其类似物前体；切割所述胰岛素或其类似物前体，收集胰岛素或其类似物。
[0043]
在表达胰岛素或其类似物前体时，尤其是在大肠杆菌表达系统中表达时，胰岛素或其类似物前体通常会以包涵体形式聚集在细胞内，需要将细胞破碎后对包涵体进行变复性操作才能得到正确的胰岛素或其类似物前体。相比于现有技术中直接表达胰岛素原(b-c-a)的技术方案，在本技术的胰岛素或其类似物制备方法中，胰岛素或其类似物前体中的氨基酸序列为mivef的第一肽段有助于复性过程中前体的正确折叠，提高了前体的复性得率，进而提升胰岛素或其类似物的产率。
[0044]
在一些实施方式中，本技术的制备胰岛素或胰岛素类似物的方法还包括以下步骤：构建包含编码本技术胰岛素或其类似物前体的核酸的表达载体，通过瞬时转染宿主细胞的方法构建包含表达载体的宿主细胞。
[0045]
适合表达胰岛素或其类似物前体的培养条件对于本领域技术人员来说应该是已知的，本领域技术人员可根据经验选择适用的培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转换或化学诱导）诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的胰岛素或其类似物前体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。
[0046]
在一些实施方式中，本技术的制备胰岛素或胰岛素类似物的方法还包括细胞裂解和收集表达产物的步骤。对于细胞裂解和收集表达产物的方法没有特别的限制，优选使用50 mm pb、1 mm edta溶液破菌，离心收集表达产物。在一些实施方式中，宿主细胞表达的胰岛素或胰岛素类似物以包涵体的方式存在。
[0047]
在一些实施方式中，本技术的制备胰岛素或胰岛素类似物的方法还包括溶解宿主细胞表达的胰岛素或胰岛素类似物的步骤。对于溶解的方法没有特别的限制，优选将收集获得的宿主细胞表达的胰岛素或胰岛素类似物溶解在含7m尿素、20mm甘氨酸的溶液中。
[0048]
在一些实施方式中，本技术的制备胰岛素或胰岛素类似物的方法包括使宿主细胞表达的胰岛素或胰岛素类似物变性后再复性的步骤。对于包涵体胰岛素或胰岛素类似物的变性和复性的方法没有特别的限制。可选地，采用二硫苏糖醇进行变性。可选的，采用10倍稀释的含1mm氧化型谷胱甘肽、5mm还原型谷胱甘肽和20mm甘氨酸的复性液进行复性。
[0049]
在一些实施方式中，进行复性处理前可对变性处理后的蛋白采用阴离子交换色谱进行蛋白的富集和浓缩。
[0050]
在一些实施方式中，本技术的制备胰岛素或胰岛素类似物的方法包括切割胰岛素或其类似物前体以获得胰岛素或其类似物的步骤。优选的，通过胰蛋白酶酶切胰岛素或其类似物前体以获得胰岛素或其类似物。
[0051]
在一些实施方式中，本技术的制备胰岛素或胰岛素类似物的方法还包括通过羧肽
酶进行酶切的步骤。将胰蛋白酶切割后的产物用羧肽酶消化以从b链去除其c末端的精氨酸。
[0052]
在一些实施方式中，本技术的制备胰岛素或胰岛素类似物的方法还包括采用反相色谱从消化的样品中纯化出成熟胰岛素或胰岛素类似物的步骤。
[0053]
本技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本技术的实践了解到。
[0054]
实施例1一、表达载体构建利用大肠杆菌表达系统构建基因工程菌，选择大肠杆菌偏爱密码子，以pet22b为表达载体，在其多克隆位点ndei和hind iii插入编码甘精胰岛素前体的核酸序列。
[0055]
本实施例中甘精胰岛素前体的第一肽段序列为mivef，第二连接肽的序列为ggr，即第一肽段 第二连接肽的序列为mivefggr（seq id no.1）。第二肽段为b-c-a结构，其中b的氨基酸序列为fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpktrr（seq id no.14）；c的氨基酸序列为eaedlqvgqvelgggpgagslqplalegslqkr（seq id no.15）；a的氨基酸序列为giveqcctsicslyqlenycg（seq id no.16）。
[0056]
二、宿主细胞构建将bl21（de3）菌株使用cacl2法制备感受态，将构建完成后的表达载体转化入bl21（de3）感受态中，涂布在amp抗性的lb琼脂培养基上37℃过夜培养。分别挑取单克隆于添加了amp抗性的lb液体培养基中培养后进行保种。
[0057]
三、摇瓶表达甘精胰岛素前体将获得的菌株使用sob进行摇瓶培养，待培养至od600约1.0时加入终浓度为0.5mm的iptg进行诱导表达。诱导12小时后收获发酵菌体。取20μl发酵菌体加入5xsdsloadingbuffer20μl，纯化水60μl，沸水浴10-15min后进行sds-page电泳检测表达情况，显示能正常表达。
[0058]
四、甘精胰岛素前体的收集、变性及复性正常表达产物的发酵菌体经10 mm磷酸盐（后文简称pb）、0.9%氯化钠溶液洗菌；采用50 mm pb、1 mm edta溶液破菌；采用20mmol/l pb、1mm edta、1.0mol/l尿素、1%氯化钠溶液洗涤菌体并离心得到甘精胰岛素前体包涵体；用7m尿素、20mm甘氨酸（ph10.5）溶解甘精胰岛素前体包涵体并加入浓度为4mg/g（二硫苏糖醇/包涵体）的二硫苏糖醇室温进行变性1h；变性后使用1mm氧化型谷胱甘肽、5mm还原型谷胱甘肽、20mm甘氨酸溶液（ph10.5）稀释10倍，于2-8℃进行复性，最后得到正确折叠的产物。
[0059]
分别取变性液上清和复性液上清进行液相分析，分析柱为agilent plrp-s 300a 5μm 150*4.6mm，分析条件30%b，0-2.5min；30～60%b，2.5-25min；100%b，25-29.5min；30%b，29.5-35min（流动相a：0.1% tfa，流动相b: 0.1% tfa 80�n），流速1ml/min，柱温35℃，检测波长214nm，变性液上清稀释10倍，进样体积为20μl，复性液上清进样体积为20 μl，根据以下公式计算复性率：复性得率= 复性样品峰面积 / 变性样品峰面积
×
100%。
[0060]
结果显示，本实施例方法获得的甘精胰岛素前体复性得率为79.5%，复性效果较
5μm 150*4.6mm，分析条件30%b，0-2.5min；30～60%b，2.5-25min；100%b，25-29.5min；30%b，29.5-35min（流动相a：0.1% tfa，流动相b: 0.1% tfa 80�n），流速1ml/min，柱温35℃，检测波长214nm，变性液上清稀释10倍，进样体积为20μl，复性液上清进样体积为20 μl。结果显示人胰岛素前体的复性得率为92.61%，复性效果较好。
[0067]
实施例4取实施例1和实施例2收集的甘精胰岛素前体分别经过等电点沉淀后使用20mm碳酸氢钠缓冲液进行溶解，使用胰蛋白酶进行酶切，按酶量：目的蛋白1:1000加入胰蛋白酶，于常温ph8.5条件下进行酶切，获得甘精胰岛素。
[0068]
经计算，甘精胰岛素前体的酶切得率约为56%-86%。
[0069]
对比例以实施例1所述的方法制备甘精胰岛素，不同的是采用与实施例1不同的第一肽段序列和/或第二连接肽序列，其中，所采用的第一肽段 第二连接肽的序列如下表所示：序列名称氨基酸序列seqidno.8mhksspqgpdkllirlkhlidivesksrsksrasgsdvggrseqidno.9mkkmnlavkiatlkgtaglkgtavaggrseqidno.10mgtavaggrseqidno.11mkwvtfllllsggrseqidno.12mgwsliilflvatatggrseqidno.13megntrednfkhllgndnvkrpseagrsds-page电泳检测表达情况如下表所示：序列表达情况seqidno.8正常表达seqidno.9正常表达seqidno.10未表达seqidno.11正常表达seqidno.12正常表达seqidno.13正常表达复性率结果如下表所示：序列名称复性得率/%seqidno.8复性得率《20seqidno.9复性得率《20seqidno.11复性得率《20seqidno.12复性得率《20seqidno.1321.4在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本技术的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技
术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0070]
尽管上面已经示出和描述了本技术的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本技术的限制，本领域的普通技术人员在本技术的范围内可以对上述实施例进行修改、替换和变型。