一种忍冬花绿原酸的提取方法与流程

1.本发明涉及植物提取技术领域，尤其涉及一种忍冬花绿原酸的提取方法。


背景技术：

2.忍冬花，正名为忍冬(学名：lonicera japonica thunb.)。“忍冬花”一名出自《本草纲目》，其中描述忍冬花：“其花长瓣垂须，黄白相半，而藤左缠，故有金银、鸳鸯以下诸名”。属多年生半常绿缠绕及匍匐茎的灌木。小枝细长，中空，藤为褐色至赤褐色。卵形叶子对生，枝叶均密生柔毛和腺毛。忍冬花的主要有效成份为挥发油类、黄酮类、有机酸类等。其中，绿原酸是其重要的有机酸成分，具有抗炎、修复、抗病毒、抗肿瘤、提高免疫等功效。此外，绿原酸是透明质酸酶(haase)和gle-6-p位移酶的天然特异性抑制剂，也是选择性羟基自由基和过氧自由基的清除剂，可作为保健品、食品、药品、化妆品等工业的重要原料。
3.常见的绿原酸提取和纯化过程包括醇沉、无机盐沉淀、溶剂萃取、离子交换树脂分离、凝胶色谱分离、高效液相色谱分离以及大孔吸附树脂分离等方式。综合考虑成本、提取过程的简单和便捷性，超声醇提依然在植物提取中占据优势。然而，在提取过程中，由于缺乏对工艺参数的系统性研究和考察，使得得到的绿原酸含量偏低。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种忍冬花绿原酸的提取方法，提取得到的绿原酸具有较高的含量。
5.为达到上述目的，本发明提供了一种忍冬花绿原酸的提取方法，包括以下步骤：
6.采用乙醇溶液对干燥的忍冬花粉末进行超声提取；所述忍冬花粉末和乙醇溶液的固液比为1：(10～50)g/ml。
7.本发明优选的，所述忍冬花为湖南花瑶忍冬花。
8.本发明对不同产地忍冬花绿原酸含量进行筛选，确定隆回花瑶忍冬花药性好，品质优，具有最高的绿原酸含量。以该地区忍冬花为基础，通过对超声辅助中乙醇浓度、固液比、超声温度、超声时间等因素进行正交实验设计，从而实现绿原酸含量的富集和优化。该工艺过程便捷，最佳参数下绿原酸的含量提升了41.17％。
9.本发明优选的，所述固液比为1:10g/ml。
10.本发明优选的，所述超声提取的温度为40～60℃。更优选为40℃。
11.本发明优选的，所述超声提取的时间为10～20min。更优选为10min。
12.本发明优选的，所述乙醇溶液的浓度为20％～60％。更优选为40％。
13.本发明优选的，在超声提取结束后，离心5min，得上清液进行hplc色谱分析，确定绿原酸含量。
14.所述色谱的条件优选为：
15.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为a流动相、0.4％磷酸溶液为b流动相，(a：b＝13:87)等度洗脱。
16.与现有技术相比，本发明提供了一种忍冬花绿原酸的提取方法，包括以下步骤：采用乙醇溶液对干燥的忍冬花粉末进行超声提取；所述忍冬花粉末和乙醇溶液的固液比为1：(10～50)g/ml。
17.本发明采用乙醇水溶液耦合超声过程，对忍冬花进行提取和绿原酸提纯富集。通过乙醇浓度、固液比、超声温度、超声时间等因素进行正交实验设计，优化出最佳的提取工艺参数。通过正交实验设计确定了忍冬花绿原酸最佳的提取工艺条件为：40％的乙醇浓度，1：10g/ml的固液比，超声温度40℃，超声时间10min。在最佳提取工艺条件下，忍冬花绿原酸最高含量为绿原酸平均提取量为249.14μg(n＝3)，rsd值为0.62％，工艺稳定性良好。同时，本发明中的提取工艺步骤简单便捷、在较低温度下能够提取和富集绿原酸，防止有效成分在高温下的分解和失活。经过最佳工艺处理后提取的绿原酸含量为14.95％，相较于优化前的工艺绿原酸含量增加了41.17％，因此该优化工艺能起到富集绿原酸的效果。
附图说明
18.图1为不同地区忍冬花中绿原酸含量的色谱测试结果；
19.图2为乙醇浓度对绿原酸含量的影响色谱测试结果；
20.图3为固液比对绿原酸含量的影响色谱测试结果；
21.图4为超声温度对绿原酸含量的影响色谱测试结果；
22.图5为超声时间对绿原酸含量的影响色谱测试结果；
23.图6为优化前后绿原酸含量对比色谱测试结果；
24.图7为本发明实施例7和对比例1的绿原酸含量对比色谱测试结果。
具体实施方式
25.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的忍冬花绿原酸的提取方法进行详细描述。
26.以下实施例中的湖南花瑶忍冬花产地为湖南隆回小沙江。
27.实施例1
28.不同产地忍冬花绿原酸含量研究
29.分别选取湖南花瑶忍冬花、广西忻城县忍冬花、山东平邑县忍冬花、河南封丘县忍冬花、重庆秀山县忍冬花。将各个产地干燥后的忍冬花粉末0.5g，分别放入具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称重。超声处理(300w/40khz)40min，放冷称重，加50％甲醇补足至原重量，摇匀过滤，精密量取滤液5ml，放入25ml棕瓶定容，取滤液备用。吸取供试样品10ul，注入液相色谱仪。在色谱测定中，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为a流动相、0.4％磷酸溶液为b流动相，(a：b＝13:87)等度洗脱，绿原酸检测波长337nm。其中，取绿原酸标准品加入50％甲醇100ml，制备成40微克/ml的标准品溶液，作为对照样品溶液。
30.从图1的色谱测试结果来看，被检测物质即绿原酸在液相色谱中有很好的响应效果，目标峰与杂质峰分离度好，峰型完整。根据进样浓度与峰面积的线性关系：y＝38.45x 5.1836，r2＝0.9997可计算出不同产地忍冬花中绿原酸的含量(表1)。由表1可以看出，花瑶忍冬花中绿原酸含量显著高于其他产地的忍冬花，具有显著优势。
31.表1不同产地忍冬花中绿原酸含量
[0032][0033][0034]
实施例2
[0035]
乙醇浓度对绿原酸含量的影响
[0036]
取实施例1中湖南花瑶忍冬花为优化后的提取对象。依次选取乙醇浓度为20％、30％、40％、50％、60％的乙醇水溶液。准确称量0.5g干燥的忍冬花粉末，按照1:20g/ml的比例加入10ml不同浓度的乙醇溶液，然后放置在40℃超声环境中超声提取30min。超声结束后，离心5min，得上清液，稀释300倍，进行hplc色谱分析，根据绿原酸标准曲线确定绿原酸含量，忍冬花中绿原酸含量计算公式如下所示：
[0037][0038]
试验结果表明，乙醇浓度是影响绿原酸萃取效果的重要因素。如图2所示，通过研究20％-60％浓度范围的乙醇溶液可以看出，在20％-40％的范围内，绿原酸浓度逐渐升高，但乙醇浓度继续增加，绿原酸浓度迅速降低。可能原因是绿原酸的分子结构中含多个羟基和羧基的大极性基团，随着乙醇浓度的增加，促进绿原酸的溶出；但乙醇浓度过高，会使一些醇溶性杂质、色素等溶出量增大，导致绿原酸提取效果不佳。40％的乙醇浓度为最佳浓度。
[0039]
以下实施例及对比例中的忍冬花均为湖南花瑶忍冬花，产地为湖南隆回小沙江。
[0040]
实施例3
[0041]
固液比对绿原酸含量的影响
[0042]
选择60％乙醇浓度，准确称量0.5g干燥的忍冬花粉末，分别按照1:10，1:20，1:30，1:40，1:50g/ml的比例加入60％乙醇水溶液，然后放置在40℃超声环境中超声提取30min。超声结束后，离心5min，得上清液，稀释300倍，进行hplc色谱分析，根据绿原酸标准曲线确定绿原酸含量。
[0043]
以1：10-1：50g/ml的固液比为考察指标。从图3可以看出，在1：10-1：50g/ml的范围内，绿原酸含量随液量的增加而增加，但是随液量的进一步增加，绿原酸含量变化不大。这可能是由于不足的液体量会导致萃取不足，萃取效果差；而过量的液体量会使绿原酸的浓度因大量溶剂的加入而被稀释导致下降。因此固液比1:10g/ml为最佳比例。
[0044]
实施例4
[0045]
超声温度对绿原酸含量的影响
[0046]
准确称量0.5g干燥的忍冬花粉末，按照1:20g/ml加入60％的乙醇水溶液，然后分别放置30℃，40℃，50℃，60℃，70℃超声环境中超声提取30min。超声结束后，离心5min，得上清液，稀释300倍，进行hplc色谱分析，根据绿原酸标准曲线确定绿原酸含量。
[0047]
在图4中考察了30-70℃的萃取温度对绿原酸含量的影响。绿原酸浓度随温度的升高而升高，60℃以上略有下降。这可以解释为，较高的温度可以加速分子的扩散，使细胞结构更容易被破坏，从而使更多的绿原酸溶解在萃取介质中。然而绿原酸本身不稳定，过高的温度可能会导致其结构中的羧酸、邻二酚基官能团发生反应或氧化分解，而导致其提取率下降。综合考虑后，超声温度选择在60℃以下。
[0048]
实施例5
[0049]
超声时间对绿原酸含量的影响
[0050]
准确称量0.5g干燥的忍冬花粉末，按照1:20g/ml加入60％浓度的乙醇水溶液，然后分别放置在最佳温度的超声环境中(60℃)分别超声10min，20min，30min，40min，50min，不改变体系ph。超声结束后，离心5min，得上清液，稀释300倍，进行hplc色谱分析，根据绿原酸标准曲线确定绿原酸含量。
[0051]
进一步研究了10-50min的超声时间对绿原酸含量的影响。图5的结果表明，在10-20min的时间范围内，绿原酸含量随着超声时间的增加而增加；一旦超声时间继续延长，绿原酸含量呈现下降趋势。这可以解释为，这可能因为提取时间过长，绿原酸可能会逐渐溶出，绿原酸结构不稳定，可能发生了异构化反应，而使提取率有所降低。
[0052]
实施例6
[0053]
提取工艺的正交实验优化
[0054]
借助正交试验设计助手，按l9(34)正交表进一步进行超声提取忍冬花绿原酸的实验，正交试验因素水平表如表2所示。综合考察了影响忍冬花绿原酸的四个因素：乙醇浓度(a)、固液比(b)、超声温度(c)、超声时间(d)。正交实验结果如表3所示。
[0055]
表2 l9(34)正交试验因素水平表
[0056][0057]
表3超声辅助提取忍冬花绿原酸正交实验结果(稀释倍数：300倍)
[0058][0059]
表4正交实验方差分析表
[0060][0061]
由表3的极差结果可以看出，影响超声提取忍冬花绿原酸含量多少的因素依次为b》c》d》a，即固液比对绿原酸含量的影响最大。综合极差分析表3以及方差分析表4，绿原酸提取最佳工艺条件为a3b1c1d2，即乙醇浓度为40％，固液比1:10g/ml，超声温度40℃，超声时间10min。
[0062]
实施例7
[0063]
最佳工艺验证
[0064]
由于最佳的工艺条件即a3b1c1d2，并不属于l9(34)正交表中的实验，需要对其进行验证性实验。采用a3b1c1d2的工艺条件提取绿原酸，平行3次，结果如表5所示，三次平性实验绿原酸的含量分别为249.47μg、250.49μg、247.46μg，绿原酸平均提取量为249.14μg(n＝3)，rsd值为0.62％(n＝3)。计算结果表明，在该最佳工艺条件下，绿原酸含量最高，且该提取工艺稳定性良好。
[0065]
表5.验证实验结果(稀释倍数：300倍)
[0066][0067]
实验结果如图6所示，单因素实验组中最高的绿原酸含量为10.59％，最佳工艺优化后提取的绿原酸含量为14.95％，绿原酸的含量提升了41.17％。
[0068]
对比例1
[0069]
取0.5g干燥的忍冬花粉末，按照1:8g/ml的比例加入60％的乙醇溶液，然后放置在50℃超声环境中超声提取30min，提取3次。提取结束后，离心5min，得上清液进行hplc色谱分析，根据绿原酸标准曲线确定绿原酸含量。
[0070]
实验结果如图7所示，其中黑色柱形图(左)为实施例7的绿原酸含量，灰色柱形图(右)为对比例1的绿原酸含量。
[0071]
从数据结果来看，实施例7提取的绿原酸含量显著高于对比例1工艺参数提取的绿原酸，绿原酸的提取量增加了18.7％。这表明在绿原酸提取过程中，乙醇浓度过高不利于绿原酸的提取，这可能是由于醇浓度过高，会使一些醇溶性杂质、色素等溶出量增大，导致绿原酸提取效果不佳；另一方面，提取时间过长也不利于绿原酸提取，由于提取时间过长，绿原酸逐渐溶出，但由于其结构不稳定，可能发生了异构化反应，而使提取率有所降低。
[0072]
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。