一种具有抗肿瘤活性的对映-贝壳杉烷型二萜化合物及其制备方法与应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种从番荔枝果皮中分离得到的对映-贝壳杉烷型二萜化合物，及其与生物碱组合后增效抗肿瘤作用的应用。


背景技术：

2.肝癌在我国是高发癌种，因其隐匿性高，发现时多已到达晚期。对于无法手术治疗的患者，临床上常采用介入法(局部化疗)进行治疗，但是当前化疗药多为单一成分，其毒副作用严重危害了患者的健康，因此，挖掘天然产物依然是肝癌研究的重要方向。
3.传统文献记载番荔枝果实可治恶疮肿痛，其果皮提取物具有很好的抗肝癌活性。现代研究表明，番荔枝果皮中具有多种对映-贝壳杉烷型二萜和异喹啉型生物碱。此类化合物均具有一定的抗肿瘤活性。
4.番荔枝果皮作为潜在抗肝癌药材，一直作为废弃物丢弃，本发明对番荔枝果皮小极性成分进行分离，以期从中挖掘出更多抗肿瘤成分。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明的第一个目的在于从番荔枝果皮中分离得到一个新的对映-贝壳杉烷型二萜化合物(16α-17-acetoxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol)，分子式为c
21h34
o3，结构式为：
[0006][0007]
本发明的第二个目的在于提供从番荔枝果皮提取分离16α-17-acetoxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol的制备方法，包括如下步骤：
[0008]
(1)番荔枝果皮粉碎成粗粉后，提取，提取液经浓缩后以硅胶拌样并干燥成细粉，采用硅胶吸附色谱分离，石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，合并相同流分得15个部位段，编号为f1～f15；
[0009]
(2)取f5部位，经干法拌样后，继续以硅胶吸附色谱分离，石油醚：丙酮系统洗脱，所得相同流分经合并为5个流分段：f5-1，f5-2，f5-3，f5-4和f5-5；5-1和f5-2段量相对较少且重叠较多，合并后以石油醚-丙酮梯度洗脱后，得对映-贝壳杉烷型二萜化合物16α-17-acetoxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol。
[0010]
作为优选方案，以上所述的具有抗肿瘤活性的对映-贝壳杉烷型二萜化合物的提取分离方法，步骤(1)提取方法为浸渍法、渗滤法、回流法、连续回流提取法或超声提取法；提取溶剂为醇类溶剂或亲脂性溶剂。
[0011]
作为优选方案，从番荔枝果皮提取分离对映-贝壳杉烷型二萜化合物16α-17-acetoxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol的制备方法，包括以下步骤：
[0012]
(1)取风干的番荔枝果皮8kg并粉碎成粗粉，适当润湿后转移至渗漉筒中，采用10倍体积的95％etoh室温下渗漉提取三次。合并提取液，于旋转蒸发器中减压浓缩提取液得到乙醇浸膏400g。乙醇浸膏用乙酸乙酯溶解后，以400g硅胶(100-200目)拌样成干燥细粉，采用2kg硅胶(200-300目)湿法装柱，上样后，以石油醚-乙酸乙酯(1:0，50:1，25:1，10:1，5:1，2:1，1:1，1:2，1:5，0:1)、乙酸乙酯-甲醇(100:1，50:1，10:1，0:1)梯度洗脱，每1l作为一个流分，薄层分析展板检测合并相同流分，得到15个部位段，依次编号为f1～f15。
[0013]
(2)取f5部位，经干法拌样后，装入硅胶柱并以石油醚：丙酮系统洗脱，再次分为5个段，分别为f5-1，f5-2，f5-3，f5-4和f5-5。f5-1和f5-2段合并后，以石油醚-丙酮(100:1～20:1)梯度洗脱后，得对映-贝壳杉烷型二萜化合物16α-17-acetoxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol(3.9mg)。
[0014]
本发明的第三个目的是把对映-贝壳杉烷型二萜化合物和鹅掌揪碱组合，以增强组合物的抗肿瘤效果；同时，将组合物与临床上可接受的载体制备成外用制剂、口服制剂及注射剂，实现上述化合物及其组合物预防和治疗肿瘤方面的药物用途。
[0015]
有益效果：
[0016]
本发明通过对番荔枝果皮的渗漉提取、正相硅胶柱色谱分离，从中鉴定出具有显著抗癌活性的对映-贝壳杉烷型二萜化合物16α-17-acetoxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol。并且该二萜化合物与鹅掌揪碱的组合，在抗肿瘤方面表现出协同与增效作用。本发明提供的制备工艺，设计合理，可操作性强，可以实现废弃番荔枝果皮的资源利用，具有重要的应用价值。
附图说明
[0017]
图1为化合物的hresi-ms图；
[0018]
图2为化合物的1hnmr图；
[0019]
图3为化合物的
13
c nmr图；
[0020]
图4为化合物的hsqc图；
[0021]
图5为化合物的hmbc图；
[0022]
图6为化合物的noesy图；
[0023]
图7为化合物的结构示意图。
具体实施例
[0024]
下列实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0025]
实施例1
[0026]
番荔枝果皮中对映-贝壳杉烷型二萜化合物16α-17-acetoxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol的提取分离方法，包括以下步骤：
[0027]
(1)番荔枝果皮8kg风干后粉碎成粗粉，润湿后，于渗漉筒中，采用10倍体积的95％etoh渗漉提取。提取液经旋转蒸发器浓缩后得乙醇浸膏400g。
[0028]
(2)采用乙酸乙酯溶解400g乙醇浸膏，分散于400g硅胶(100-200目)中拌样干燥，以2kg硅胶(200-300目)湿法装柱，上样后，以石油醚-乙酸乙酯(体积比1:0，50:1，25:1，10:1，5:1，2:1，1:1，1:2，1:5，0:1)、乙酸乙酯-甲醇(体积比100:1，50:1，10:1，0:1)梯度洗脱，每1l作为一个流分并采用薄层色谱法检测，合并相同流分后得15个部位段：f1～f15。
[0029]
(3)取f5部位，经干法拌样后，加入装好的硅胶柱中并以石油醚：丙酮系统洗脱，再次分为5个段，分别为f5-1，f5-2，f5-3，f5-4和f5-5。f5-1和f5-2段量相对较少且重叠较多，故合并，以石油醚-丙酮(体积比100:1～20:1)梯度洗脱后，得对映-贝壳杉烷型二萜化合物16α-17-acetoxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol。
[0030]
运用核磁共振谱(1h nmr、
13
c nmr、hsqc、hmbc、noesy)和高分辨质谱鉴定该化合物的结构。
[0031]
该化合物为淡黄色油状物，易溶于二氯甲烷。附图2中1h nmr(400mhz,cdcl3)显示有三个甲基δ
h 0.98(s,3h,h-20),1.13(s,3h,h-19),2.06(s,3h,h-1’)。结合附图3和附图4中
13
c nmr(101mhz,cdcl3)和hsqc可确认有21个碳信号，包括3个甲基，9个亚甲基，4个次甲基以及5个季碳。结合文献可知该化合物为对映-贝壳杉烷型二萜且与化合物6相似。附图5hmbc谱中，根据h-3(δ
h 1.33)、h-5(δ
h 1.09)和h-19(δ
h 1.13)与c-4(δ
c 72.36)的相关可以推断出oh位于c-4上；h-17(δ
h 4.18)和h-1’(δ
h 2.06)对c-2’(δ
c 171.40)的相关可以推断出ch2ococh3的存在；h-13(δ
h 2.28)和h-15(δ
h 1.13)对c-17(δ
c 65.95)的相关可以推断出ch2ococh3位于c-16上。同样，根据hmbc谱中其他数据间的相关可对化合物各碳的数值进行归属，具体数值见表。从附图6noesy谱中可知，h-19(δ
h 1.13)与h-20(δ
h 0.98)相关，则c-4位的ch3在平面下方，为α构型。所以c-4位的oh在平面上方，为β型；h-17(δ
h 4.18)/h-13(δ
h 2.28)，h-17(δ
h 4.18)/h-14(δ
h 2.18)的相关信号表明c-17在平面下，为α型。综合以上分析，鉴定为16α-17-acetoxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol，经scifinder数据库系统检索，该化合物未见相关文献报道，表明该化合物为一新的对映-贝壳杉烷型二萜，其结构式如图7所示。
[0032]
表1化合物的氢、碳核磁共振波谱数据
[0033][0034][0035]
实施例2：二萜16α-17-acetoxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol与鹅掌揪碱组合对
smmc-7721细胞的细胞毒活性增效作用
[0036]
将指数分裂期的smmc-7721肝癌细胞均匀接种到96孔板中，每孔8000个细胞，24h后，给药不同浓度的化合物16α-17-acetoxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol(最高浓度200μg/ml)，并设置空白对照，48h后，每孔加20μl的mtt溶液，孵育4h后，除去培养液，加150μl dmso，摇匀后于酶标仪上490nm下检测吸光度值，计算ic
50
值。以上实验重复三次，最终得化合物16α-17-acetoxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol的ic
50
为15.75μmol/l，显示具有较好的抗肿瘤活性。
[0037]
二萜a(16α-17-acetoxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol)和生物碱b(鹅掌揪碱)按照摩尔比例组合后，不同比例混合物对smmc-7721肝癌细胞的细胞毒作用差异较大，其中，二萜a和生物碱b摩尔比为8:2的混合物，其ic
50
值达到6.52μmol/l，远小于二萜a和生物碱b单用时的ic
50
值，表明二萜a和生物碱b组合存在增效作用，且增效作用明显。
[0038]
表2不同比例二萜a和生物碱b组合后对smmc-7721肝癌细胞的ic
50
值
[0039]
序号a：bic
50
值(μmol/l)10:1061.0821:946.3532:834.9943:727.4654:626.2165:521.3476:412.3187:36.7898:26.52109:115.071110:015.75
[0040]
。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。