鼠李糖乳杆菌菌株LRa90及其制备治疗过敏和/或抑制病原菌的制品方面的用途与制品的制作方法

乳球蛋白诱发的过敏小鼠体内的ifn-γ水平、或，降低β-乳球蛋白诱发的过敏小鼠体内的il-4水平、或，降低卵白蛋白诱发的过敏小鼠体内的卵白蛋白特异性ige水平、或，提高卵白蛋白诱发的过敏小鼠体内的ifn-γ/il-4比值、或，提高卵白蛋白诱发的过敏小鼠体内的ifn-γ水平、或，降低卵白蛋白诱发的过敏小鼠体内的il-4水平、或，缓解卵白蛋白诱发的过敏小鼠体重减轻。
8.一种食品，包括cctcc no: m 2022573的鼠李糖乳杆菌（lacticaseibacillus rhamnosus）菌株lra90。
9.所述的一种食品还包括食用辅料。
10.所述食品选自：保健食品、发酵乳制品、发酵豆制品、发酵果蔬制品、发酵肉制品、发酵饮料、益生菌发酵剂、益生菌固体饮料、发酵酒制品、发酵醋制品中的一种或两种或两种以上。
11.一种治疗过敏或抑制病原菌的药物，包括治疗过敏或抑制病原菌的活性成分，所述活性成分包括cctcc no: m 2022573的鼠李糖乳杆菌（lacticaseibacillus rhamnosus）菌株lra90。
12.所述的一种治疗过敏或抑制病原菌的制品还包括：药用辅料。
13.所述药物的剂型选自：粉剂、片剂、液体剂、胶囊剂中的一种或一种以上。
14.在一些国家或地区专利法允许的前提下，本发明还请求保护保藏编号为cctcc no: m 2022573的鼠李糖乳杆菌（lacticaseibacillus rhamnosus）菌株lra90在治疗过敏和/或抑制病原菌方面的用途。
15.本发明提供鼠李糖乳杆菌lra90在食品或治疗过敏的药物中的应用。
16.本发明涉及的鼠李糖乳杆菌，其分类命名为鼠李糖乳杆菌lacticaseibacillus rhamnosus，该菌株于2022年05月09日在中国典型培养物保藏中心保藏，地址为中国、武汉、武汉大学，保藏编号为cctcc no: m 2022573。
17.本发明的体外实验证明，本发明所述的鼠李糖乳杆菌，具有较好的疏水性、耐受性、黏附能力，对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用。
18.所述的鼠李糖乳杆菌lra90显著提高blg过敏小鼠脾淋巴细胞因子ifn-γ水平，显著降低il-4水平，显著提高ifn-γ/il-4比值，表明鼠李糖乳杆菌lra90能够调节th1/th2的平衡。
19.鼠李糖乳杆菌lra90可显著抑制blg过敏小鼠总ige和blg特异性ige的分泌。
20.鼠李糖乳杆菌lra90可显著减低过敏评分，改善过敏症状。
21.鼠李糖乳杆菌lra90显著降低ova过敏小鼠ova特异性ige水平，显著提高了ifn-γ水平和ifn-γ/il-4比值，il-4水平显著降低。
22.本发明提供了鼠李糖乳杆菌lra90在保健食品中的应用。
23.所述保健食品，包括压片糖果、发酵饮料、软糖、调制乳粉、发酵乳、固体饮料。
24.本发明还提供了鼠李糖乳杆菌lra90在制备治疗过敏药物上的应用，所述药物包括但不限于微生态制剂。
25.本发明所采用的鼠李糖乳杆菌lra90来自健康人体肠道，安全无致病性，通过细胞试验、动物试验证明其具有治疗过敏功效。将其广泛应用到食品领域，增大消费者摄入的可能性，通过日常摄入就可以达到治疗和缓解过敏的目的。当然，所采用的鼠李糖乳杆菌
lra90也可以用于制备治疗和缓解过敏的药物中。
26.本发明李糖乳杆菌菌株lra90的保藏信息如下：菌种保藏名称：lra90保藏号：cctcc no: m 2022573分类命名：鼠李糖乳杆菌拉丁名：lacticaseibacillus rhamnosus保藏单位：中国典型培养物保藏中心保藏地址：中国、武汉、武汉大学保藏日期：2022年05月09日。
附图说明
27.图1为实验例6中各组小鼠blg过敏评分。
28.图2为实验例6中blg过敏小鼠总ige水平。
29.图3为实验例6中blg过敏小鼠blg特异性ige水平。
30.图1-图3横坐标各标记含义列示如下：con代表阴性对照组、blg代表过敏小鼠对照组、lra90代表鼠李糖乳杆菌lra90干预组。
31.图4为实验例7中各组小鼠ova特异性ige水平。
32.图5为实验例7中ova过敏模型各组小鼠ifn-γ水平。
33.图6为实验例7中ova过敏模型各组小鼠il-4水平。
34.图7为实验例7中ova过敏模型各组小鼠ifn-γ/il-4水平。
具体实施方式
35.以下由特定的具体实验例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。以下实验例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
36.生物材料的来源实验例4使用的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌购自广东微生物菌种保藏中心；实验例5使用的ht-29细胞购自中国典型培养物保藏中心；实验例2、5使用的lgg菌株购自中国典型培养物保藏中心；实验例6、7使用的小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
37.第1组实施例、本发明的菌株lra90本组实施例提供一株鼠李糖乳杆菌（lacticaseibacillus rhamnosus）菌株lra90，其保藏编号为cctcc no: m 2022573。
38.任何利用、使用、销售、许诺销售、生产、制备、培养、扩繁、发酵保藏编号为cctcc no: m 2022573的鼠李糖乳杆菌（lacticaseibacillus rhamnosus）菌株lra90的行为均落入本发明的保护范围。
39.本领域技术人员根据本发明的教导和启发，出于实际生产需要，结合微生物工艺领域常用技术手段选择合适的辅料加以调配，将本发明保藏编号为cctcc no: m 2022573
的鼠李糖乳杆菌（lacticaseibacillus rhamnosus）菌株lra90制成各种符合各类符合工艺生产要求的剂型产品，例如，粉剂、片剂、液体剂；还可制成食品，例如，发酵乳制品、发酵豆制品、发酵果蔬制品、发酵肉制品、发酵饮料、益生菌发酵剂、益生菌固体饮料等。所述发酵乳制品包括常温酸奶、低温酸奶、搅拌型酸奶、凝固型酸奶、饮用性酸奶、乳酪、乳酸菌饮料等。
40.本文中，

技术实现要素：
、具体实施方式部分记载的鼠李糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌株、lra90、菌株lra90、lacticaseibacillus rhamnosus、鼠李糖乳杆菌lra90、鼠李糖乳杆菌lra90菌株均指代本发明的保藏编号为cctcc no: m 2022573的鼠李糖乳杆菌（lacticaseibacillus rhamnosus）菌株lra90。
41.第2组实施例、本发明的菌株lra90本组实施例提供保藏编号为cctcc no: m 2022573的鼠李糖乳杆菌（lacticaseibacillus rhamnosus）菌株lra90在制备治疗过敏和/或抑制病原菌的制品方面的用途。
42.在一些实施例中，所述过敏选自：β-乳球蛋白诱发的过敏、或，卵白蛋白诱发的过敏。
43.在另一些实施例中，所述病原菌选自：大肠杆菌、或，沙门氏菌、或，金黄色葡萄球菌；在具体的实施例中，所述治疗过敏指：提高β-乳球蛋白诱发的过敏小鼠体内的ifn-γ/il-4比值、或，降低β-乳球蛋白诱发的过敏小鼠体内的总ige和β-乳球蛋白特异性ige的水平、或，提高β-乳球蛋白诱发的过敏小鼠体内的ifn-γ水平、或，降低β-乳球蛋白诱发的过敏小鼠体内的il-4水平、或，降低卵白蛋白诱发的过敏小鼠体内的卵白蛋白特异性ige水平、或，提高卵白蛋白诱发的过敏小鼠体内的ifn-γ/il-4比值、或，提高卵白蛋白诱发的过敏小鼠体内的ifn-γ水平、或，降低卵白蛋白诱发的过敏小鼠体内的il-4水平、或，缓解卵白蛋白诱发的过敏小鼠体重减轻。
44.第3组实施例、本发明的食品本组实施例提供一种食品。在本组所有的实施例中，所述食品都具备如下共同特征：所述食品包括cctcc no: m 2022573的鼠李糖乳杆菌（lacticaseibacillus rhamnosus）菌株lra90。
45.在进一步的实施例中，所述的一种食品还包括食用辅料。
46.在另一些实施例中，所述食用辅料选自：漂白剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、酸味剂、增味剂、护色剂等。
47.根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合食品生产加工工艺领域的常规技术手段（例如，《食品生产概论》、《食品与食品生产百科全书》、《食品加工技术》等），本领域技术人员可对上述食用辅料进行选择和调配，并将cctcc no: m 2022573的鼠李糖乳杆菌（lacticaseibacillus rhamnosus）菌株lra90制成不同形态、规格、功能的食品，例如保健食品、发酵乳制品、发酵豆制品、发酵果蔬制品、发酵肉制品、发酵饮料、益生菌发酵剂、益生菌固体饮料、发酵酒制品、发酵醋制品等。
48.在具体的实施例中，所述食品选自：保健食品、发酵乳制品、发酵豆制品、发酵果蔬制品、发酵肉制品、发酵饮料、益生菌发酵剂、益生菌固体饮料、发酵酒制品、发酵醋制品中
的一种或两种或两种以上。
49.第4组实施例、本发明的药物本组实施例提供一种治疗过敏或抑制病原菌的药物。在本组所有的实施例中，所述药物都具备如下共同特征：所述药物包括治疗过敏或抑制病原菌的活性成分，所述活性成分包括cctcc no: m 2022573的鼠李糖乳杆菌（lacticaseibacillus rhamnosus）菌株lra90。
50.在进一步的实施例中，所述的一种治疗过敏或抑制病原菌的制品还包括：药用辅料。
51.在更具体的实施例中，所述药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
52.根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备领域的常规技术手段（例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等），本领域技术人员可对上述药用辅料进行选择和调配，并将cctcc no: m 2022573的鼠李糖乳杆菌（lacticaseibacillus rhamnosus）菌株lra90制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、注射剂、口服液等。
53.在具体的实施例中，所述药物的剂型选自：粉剂、片剂、液体剂、胶囊剂中的一种或一种以上。
54.第5组实施例、本发明菌株lra90的适应症用途本组实施例提供保藏编号为cctcc no: m 2022573的鼠李糖乳杆菌（lacticaseibacillus rhamnosus）菌株lra90在治疗过敏和/或抑制病原菌方面的用途。
55.在一些实施例中，所述过敏选自：β-乳球蛋白诱发的过敏、或，卵白蛋白诱发的过敏。
56.在另一些实施例中，所述病原菌选自：大肠杆菌、或，沙门氏菌、或，金黄色葡萄球菌；在具体的实施例中，所述治疗过敏指：提高β-乳球蛋白诱发的过敏小鼠体内的ifn-γ/il-4比值、或，降低β-乳球蛋白诱发的过敏小鼠体内的总ige和β-乳球蛋白特异性ige的水平、或，提高β-乳球蛋白诱发的过敏小鼠体内的ifn-γ水平、或，降低β-乳球蛋白诱发的过敏小鼠体内的il-4水平、或，降低卵白蛋白诱发的过敏小鼠体内的卵白蛋白特异性ige水平、或，提高卵白蛋白诱发的过敏小鼠体内的ifn-γ/il-4比值、或，提高卵白蛋白诱发的过敏小鼠体内的ifn-γ水平、或，降低卵白蛋白诱发的过敏小鼠体内的il-4水平、或，缓解卵白蛋白诱发的过敏小鼠体重减轻。
57.下面通过实验例1-8来证明本发明的技术效果：实验例1、菌株分离及鉴定（1）分离与筛选：采集中国边远牧区的人群粪便样品，无菌生理盐水稀释至合适梯度，涂布于mrs琼脂平板上，37℃养48h。挑选不透明乳白色、圆形有光泽、边缘整齐、表面凸起且湿润的单克隆菌落，在mrs固体培养基上进行反复划线纯化培养，通过光学显微镜观察个体形态，获得
乳杆菌属菌株。
58.mrs培养基成分：蛋白胨10g、牛肉浸粉5g、酵母浸粉4g、k2hpo
4 2g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80 1ml、mgso4·
7h2o 0.58g、mnso4
·
4h2o 0.25g、蒸馏水1000ml；ph值6.2
±
0.2（2）分子生物学鉴定：将乳杆菌菌株采用基因组dna抽提试剂盒提取菌株基因组dna，采用上游引物27f（agagtttgatcctggctcag）和下游引物1492r（ggttaccttgttacgactt），对16s rdna序列进行扩增，得到pcr产物。并对pcr产物进行测序。其中pcr反应体系：10
×
buffer 20μl，引物dntp 4μl，上、下游引物各1μl，dna模板2μl，taq酶0.5μl，ddh2o 34.5μl。pcr反应条件：95℃ 10min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 2min，35个循环；72℃ 10min。将pcr产物通过凝胶电泳检测后送往武汉金开瑞生物工程有限公司测序。将鉴定的基因序列提交至ncbi数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov）中进行blast分析比对。根据分子生物学的鉴定结果，选出鼠李糖乳杆菌种进行下一步筛选试验。
59.实验例2、鼠李糖乳杆菌疏水性筛选试验用bath（菌体对碳氢化合物的黏附）对发酵乳杆菌菌体表面疏水特性进行测定。将活化好的菌株以5000rmp离心5min收集菌体，用pbs缓冲液清洗两次，重悬于 pbs缓冲液中，调整菌悬液od600值在1.0左右，并测定菌悬液在600 nm处的吸光度值（a0）。
60.取上述12 ml菌悬液与4ml二甲苯充分混合，室温放置10min后漩涡混合2min，再于室温下放置20 min分层。取下水相测定600nm处水相的吸光度值（a1）。
61.以缓冲液为空白对照。表面疏水性以细菌黏附有机溶剂的百分率来表示：计算公式为：表明疏水性（%）=（1-a1/a0）
×
100%。
62.a 0和a1分别为与二甲苯混匀前、后菌液在600 nm波长处测得的吸光度。
63.表1. 鼠李糖乳杆菌表面疏水性
从表1中可以看出wh03091的疏水性显著高于lgg和其他鼠李糖乳杆菌，优选出wh03091进行以下试验，并重新命名为lra90，将该菌株送保藏，其保藏信息如下：菌种保藏名称：lra90保藏号：cctcc no: m 2022573分类命名：鼠李糖乳杆菌拉丁名：lacticaseibacillus rhamnosus保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国、武汉、武汉大学保藏日期：2022年05月09日。
64.实验例3、鼠李糖乳杆菌lra90的耐受性试验菌株活化：从-80℃冰箱取出甘油管，解冻后，以2%接种量接种于mrs培养基置于37℃培养12h-24h，生长至菌液浑浊为活化一代。
65.模拟人工胃液：配制pbs溶液，加入0.3%胃蛋白酶，用1mol/l hcl调节ph值至2.5，然后充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。
66.模拟人工肠液：配制pbs溶液，加入0.1%胰蛋白酶和0.3%的牛胆粉，用0.1mol/l naoh调节ph值至8.0，然后充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。
67.鼠李糖乳杆菌lra90在mrs液体培养基中37℃过夜培养，活化培养2代。将活化后的鼠李糖乳杆菌菌液离心，弃上清，收集菌体，调整菌液浓度是108cfu/ml。取1ml菌体悬液离心，收集菌体后，分别接入1ml配制好的ph2.5的模拟人工胃液和ph8.0的模拟人工肠液中混匀，37℃条件下消化，同时分别取0h和3h的消化液检测活菌数，计算存活率，结果见表2。其中，菌株存活率（%）=n
t
/n0×
100%，式中n0表示菌株0h的活菌数（cfu/ml），n
t
表示菌株3h的活菌数（cfu/ml）。
68.表2. 模拟人工胃液和人工肠液试验数据表实验例4、鼠李糖乳杆菌lra90抑制病原菌试验取拮抗菌株按2%（v/v）接种至mrs液体培养基中，37℃恒温静置培养16-24h。将致病菌株大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌分别接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃、转数250rpm、恒温摇床过夜培养，然后制备病原菌悬液。将mrs固体培养基冷却至55℃左右，与病原菌悬液按一定比例混匀，使体系病原菌活菌数在106cfu/ml数量级，然后迅速倾注于预先放置牛津杯的平板中，待培养基冷却凝固后，取出牛津杯，于每孔注入200μl拮抗菌株菌液，将平皿轻盖后正置于37℃恒温培养箱，培养适宜时间后观察，并用游标卡尺测量抑菌圈直径。
69.表3. 鼠李糖乳杆菌lra90发酵液对病原菌的抑制作用
结果如表3所示，鼠李糖乳杆菌lra90对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌拮抗直径分别是32mm、28mm、32mm。表现出对肠道致病菌极强的抑制作用，尤其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制能力。
70.实验例5、鼠李糖乳杆菌lra90对ht-29细胞的粘附实验1）ht-29细胞复苏与活化：（1）从液氮罐中取出保存的细胞冻存管，迅速置于37℃水浴锅中，摇动直至管中液体全部解冻，放入超净台中；（2）将冻存液转至离心管中，加入2-3 ml有三抗培养基，1000
×
g 离心4 min，弃上清；（3）向离心管中加入3ml有三抗培养基，轻轻吹打均匀，使细胞分散均一，然后转至t25细胞培养瓶中，置37℃，5%co
2-95%空气的细胞培养箱中培养；（4）次日换液继续培养；（5）每日用倒置显微镜观察细胞，当细胞在细胞培养瓶底长满80%时，进行传代。
71.2）细胞传代与培养：（1）待细胞长满培养瓶底80%左右，移弃培养基，用pbs漂洗细胞层2遍；（2）加入0.5 ml胰蛋白酶消化液，盖好盖子，放进细胞培养箱中孵育5 min左右，取出细胞培养瓶，用倒置显微镜观察细胞形态，待大部分细胞变圆，细胞边缘略脱离细胞壁；（3）向培养瓶中加入1ml有三抗培养基终止消化，轻轻吹打细胞培养瓶中的细胞，直至细胞分散均一，将消化下来的细胞转入离心管中，在1000
×
g离心4min；（5）取出离心管，弃上清，向离心管中加入适量培养基，充分混匀后，转至多个细胞培养瓶中，37℃，5%co
2-95%空气培养箱中培养。
72.（6）根据实验需要，细胞需要在12孔板中进行培养时，操作如下：取出离心管，弃上清，向离心管中加入1ml含三抗培养基，充分混匀后，采用血球板计数，以接种量为2
×
10
5 cells/well进行铺板，在每孔中补充含三抗培养基至1 ml，混合均匀，置于37℃，5% co
2-95%空气培养箱中培养。每天换液至细胞长满底部面积的80%，获得单层细胞。
73.3）鼠李糖乳杆菌lra90对细胞的黏附试验（1）菌悬液制备：活化的鼠李糖乳杆菌lra90以2%接种量接种于mrs培养基中，培养12h，6000 r/min 室温离心5min收集菌体，并用无菌pbs洗涤两次，最后重悬于dmem培养基，并调节菌体浓度至108cfu/ml，采用mrs固体培养基对初始菌悬液进行平板菌落计数。
74.（2）移除12孔细胞培养板中的培养基，pbs漂洗2次，消化一个孔的细胞进行计数。
75.（3）向单细胞层的细胞培养板中加入制备好的菌悬液1 ml/孔，置于37℃，5% co
2-95%空气培养箱中共孵育2 h；（4）小心移去培养上清，加入无菌pbs漂洗5次；
（5）加入胰蛋白酶细胞消化液0.2ml/孔，消化10min以使细胞从细胞培养板孔壁上脱离下来，加0.8ml pbs终止消化，收集溶液即为样品；（6）将收集的样品进行梯度稀释，采用mrs固体培养基进行平板菌落计数。
76.黏附能力（cfu/cells）=黏附在细胞上的的菌数（cfu）/加入孔中的细胞数表4. 鼠李糖乳杆菌lra90对ht-29细胞的黏附能力结果菌株的黏附能力有助于其在肠道定植，通常认为黏附是定植的关键步骤，益生菌在肠道定植后，能够增强与肠道细胞之间的信号交流、抑制病原菌在肠道的定植，调节肠道菌群。益生菌在肠道定植是发挥功效的前提和基础。
77.实验例6、鼠李糖乳杆菌lra90缓解小鼠β-乳球蛋白过敏1）实验小鼠及模型建立balb/c小鼠（雌性，6-8周龄），饲养条件：动物房温度为（22
±
2）℃，相对湿度为40%~70%，严格按照12h光照/黑暗循环，保证动物自由饮水和充分进食。适应性喂养一周后，随机分为3组，每组10只，分别为空白组、过敏组和益生菌干预组。模型组和益生菌干预组于第1、7、14、21和28天灌服过敏原β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，blg）（1mg/ml）与霍乱毒素（10μg/ml）0.2ml/只；空白组小鼠灌服灭菌pbs 0.2/只；益生菌干预组每天灌服一次0.2ml含109cfu/ml鼠李糖乳杆菌lra90的pbs至第35天。在第35天，灌胃0.2ml浓度为50mg/ml的blg，激发致敏。按照以下评分标准进行评分：0，无症状；1，搔挠头和鼻；2，腹泻，眼周、嘴部水肿，毛发直立，活动频率下降；3，口周紫绀，呼吸困难；4，刺激后无反应或仅有轻度反应，震颤及痉挛；5，死亡。
78.标准饲料：购自万千佳兴生物科技有限公司。
79.3）指标测定（1）细胞因子测定无菌取小鼠脾脏，用玻璃针芯在200目筛网上研磨后，加入rpmi1640培养液制成菌悬液。加入淋巴细胞分离液进行1000
×
g离心10min，再用rpmi1640培养液重悬，重复两次。调整细胞浓度4
×
105cell/ml接种于12孔板中，设过敏小鼠对照组（blg）和鼠李糖乳杆菌lra90干预组（菌液终浓度为107cfu/ml）及空白组小鼠淋巴细胞作为阴性对照组（con）。每孔总体积为1ml，添加blg（20μg/ml），每组3个重复。置于37℃、5% co2-95%空气条件下培养60h，离心收集上清，采用elisa试剂盒检测ifn-γ和il-4的水平。
80.（2）抗体水平测定小鼠处死取血，离心后吸取血清，严格按照各试剂盒说明书检测小鼠血清中总ige、blg特异性ige。
81.4）数据处理每组实验数据以平均数
±
标准差（x
±
δ）表示，多组间比较采用单因素方差分析最小显著差别（least significant difference，lsd）法，p 《 0.05为差异有统计学意义。
82.5）结果分析
经过敏原激发后，观察各组小鼠过敏症状并进行评分（见图1），对照组小鼠无明显症状；模型组小鼠症状明显，经常搔挠头和鼻，眼周、嘴部水肿，腹泻，活动频率下降，甚至有一只死亡；鼠李糖乳杆菌lra90干预组有轻微症状，比对照组有更多的搔挠行为，1只出现水肿和腹泻症状。
83.表5. 鼠李糖乳杆菌lra90对blg过敏小鼠脾淋巴细胞因子分泌的影响注：同一列中字母不同表示差异性显著（p＜0.05）由表5可知，与过敏组对比，鼠李糖乳杆菌lra90显著提高ifn-γ水平，显著降低il-4水平。由于th1、th2细胞的比例同ifn-γ和il-4分泌的水平密切相关，ifn-γ/il-4比值可反应对th1/th2平衡的影响。鼠李糖乳杆菌lra90可显著提高ifn-γ/il-4比值，表明鼠李糖乳杆菌lra90能够调节th1/th2的平衡。
84.由图2、图3可知，blg能够诱导致敏小鼠总ige和blg特异性ige水平显著升高，鼠李糖乳杆菌lra90可显著抑制总ige和blg特异性ige的分泌。
85.实验例7、鼠李糖乳杆菌lra90缓解小鼠卵白蛋白过敏1）实验小鼠及模型建立balb/c小鼠（雌性，6-8周龄），饲养条件：动物房温度为（22
±
2）℃，相对湿度为40%~70%，严格按照12h光照/黑暗循环，保证动物自由饮水和充分进食。适应性喂养一周后进行造模，第1、15天进行腹腔注射含100μg卵白蛋白（ova）和1mg氢氧化铝佐剂溶液0.2ml。第20天、第24天和第28天分别腹腔注射含0.5mg ova的生理盐水注射液进行激发。小鼠出现腹泻提示过敏模型制备成功。造模成功的小鼠随机分为3组，每组10只，分别为过敏组（灌胃0.2ml灭菌pbs）、低剂量组（灌胃0.2ml浓度为108cfu/ml鼠李糖乳杆菌lra90）和高剂量组（灌胃0.2ml浓度为109cfu/ml鼠李糖乳杆菌lra90），另取10只正常小鼠作为空白对照组（灌胃0.2ml灭菌pbs）。四组小鼠连续灌胃21d。
86.2）指标检测第22d观察并记录小鼠的过敏症状评分，评分标准为：0，无症状；1，搔挠头和鼻；2，腹泻，眼周、嘴部水肿，毛发直立，活动频率下降；3，口周紫绀，呼吸困难；4，刺激后无反应或仅有轻度反应，震颤及痉挛；5，死亡。
87.称小鼠体重。
88.小鼠处死取血，离心后吸取血清，严格按照各试剂盒说明书检测小鼠血清中ova特异性ige、ifn-γ和il-4水平。分离脾脏，计算脾脏指数。
89.脾脏指数（mg/g）=脾脏质量/小鼠体质量。
90.与对照组相比，过敏组的体重显著降低，低剂量组和高剂量组无显著性差异。过敏组的过敏评分显著升高，过敏症状明显，提示造模成功，低剂量组和高剂量组均可显著减低过敏评分，改善过敏症状。造模过程对小鼠的脾脏指数影响不显著，组别之间无差异，见下表6。
91.表6. 鼠李糖乳杆菌lra90对ova过敏小鼠症状、体重、脾脏指数的影响注：同一列中字母不同表示差异性显著（p＜0.05）。
92.如图4所示，与对照组相比，过敏组ova特异性ige显著升高，低剂量组和高剂量组可显著降低过敏组ova特异性ige水平，并且高剂量组的降低效果显著高于低剂量组。如图5、图6、图7所示，与对照组相比，过敏组小鼠ifn-γ和ifn-γ/il-4比值显著降低，il-4水平显著升高。与过敏组相比，鼠李糖乳杆菌lra90干预组显著提高了ifn-γ水平和ifn-γ/il-4比值，il-4水平显著降低。
93.实验例8、鼠李糖乳杆菌lra90菌粉制备1）鼠李糖乳杆菌lra90发酵工艺：将保存于甘油管中的鼠李糖乳杆菌lra90菌株接入10ml种子培养基中，37℃静置培养6-8h即为一级种子；将一级种子以5%的接种量接种于200ml种子培养基中，37℃静置培养5-6h即为二级种子；发酵罐培养：发酵罐体积为15l，装入发酵培养基10l，灭菌温度为115℃，20min，以2%（v/v）的接种量将培养获得的二级种子全部接种到发酵罐，在发酵温度为35℃、搅拌转速100rpm、初始ph调节为6.5的条件下开始发酵，发酵过程中用23%（m/v）碳酸钠维持ph为5.8，维持罐压为0.03mpa，培养10h。
94.所述的种子培养基的配方为：20g/l葡萄糖，10g/l牛肉浸粉，5g/l酵母粉，10g/l蛋白胨，5g/l乙酸钠，2g/l柠檬酸钠，3g/l磷酸氢二钾，0.5g/l酸镁，0.1g/l硫酸锰，1g/l吐温80，1g/l l-半光氨酸盐酸盐，115℃灭菌20min。
95.所述发酵培养基配方为：50g/l葡萄糖，15g/l酵母粉，20g/l蛋白胨，5g/l牛肝浸粉，5g/l乙酸钠，3g/l柠檬酸钠，3g/l磷酸氢二钾，0.5g/l硫酸镁，0.1g/l硫酸锰，1g/l吐温80，1g/l l-半光氨酸盐酸盐，115℃灭菌20min。
96.2）所述的鼠李糖乳杆菌lra90菌粉制备工艺：（1）将通过上述鼠李糖乳杆菌lra90高密度发酵的方法得到的发酵液离心，去上清，收集菌泥。所述的离心的方法优选为4℃、8000rpm离心10min。
97.（2）按照菌泥与冻干保护剂质量比1:1-1.2将两者混合均匀，进行真空冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌冻干菌粉。所述的真空冷冻干燥的条件为：预冻温度为-42～-45℃，真空度10-20pa，时间24-28h。
98.所述的冻干保护剂包含如下按质量百分比计的组分：15%海藻糖，5%脱脂奶粉，2%蔗糖，2%甘油，0.5%山梨醇。