一株白蚁来源的生防链霉菌W7及其应用的制作方法

一株白蚁来源的生防链霉菌w7及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，涉及一株白蚁来源的生防链霉菌w7及其应用。


背景技术：

2.白蚁(termit)，属蜚蠊目(blattaria)白蚁科(termitidae)，亦称虫尉、大水蚁等，是一种社会性昆虫且在世界范围发生的杂食性的害虫。白蚁广泛生活在热带和亚热带地区，温带地区也有发现。我国主要分布在南部地区，其中在云南、广东、海南大量分布，只有少数分布在华北和东北地区。白蚁不仅在地域上广泛分布，其危害范围也很广。据报道，白蚁能够对房屋建筑、园林树木、水利工程、交通设施、电信设备等重要物质产生危害。白蚁一年之内能产生200 只左右的卵，作为一个发育成熟的群体，其繁殖速度是呈几何数速度增长的，一旦外界气候条件适宜，有翅的雄蚁和雌蚁便会找寻配偶进行交配。海南省建筑、通信、园林、道路等每年因白蚁危害损失不少于1.5亿元人民币，严重影响农作物种植生产及其经济效益。
3.自然环境中，白蚁的筑巢和觅食活动主要在土壤和腐烂的木材上进行，营养物质少且易受环境病原微生物入侵。因此，白蚁要依赖肠道密集多样的微生物菌群产生的天然产物获取营养和形成防御体系。放线菌是这些菌群中一个重要的类群。在高等白蚁和低等白蚁的肠道内、巢穴及其周围土壤均含有大量的共生放线菌。
4.放线菌是生物活性化合物的主要来源之一，最广为人知的便是具有抗生素活性的代谢产物，约有70％的天然抗生素来源于放线菌。对人类贡献最大的是制成抗菌剂。白蚁共附生放线菌是一个相对研究较少的特殊环境微生物，是新颖天然产物的来源之一，其研究尚处于起步阶段。胡松英等发现一株黑翅白蚁土白蚁共生放线菌菌株by02，对苹果腐烂菌、杨树溃疡病菌和番茄早疫病菌具有抑制效果。
5.真菌侵染位居植物病害起因的首位，能导致作物大量减产。目前实际生产中，化学方法仍是防治植物病害一种必不可少的措施。然而，化学农药的广泛使用对生态环境伤害极大，也会增强作物抗药性，化学农药残留对人体健康也有影响。随着环保意识不断加强，寻求环保、高效的防治方法成为世界各国研发目标。微生物农药具有对作物安全性高、对环境友好、不易产生抗药性等特点而受到广泛关注。我国科学家也提出了多个研究方向，其中包括活体微生物活体农药和代谢产物农药。放线菌是最早发现的具有生物防治作用的一类微生物，如阿维菌素、井岗霉素、嗜肽酶素，在植物病虫害防治上发挥了重要作用。链霉菌在放线菌中占据着重要地位。利用白蚁来源的共生放线菌对热带作物的病原真菌的抑制作用防治植物病害，以菌治菌，符合绿色环保理念，达到高效防治目的。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一株白蚁来源的生防链霉菌(streptomyces sp.)w7 及其生防制品，该白蚁来源的生防链霉菌(streptomyces sp.)w7及其生防制品对多种植物病原菌具有抑菌效果。
7.本发明的第二个目的在于提供上述白蚁来源的生防链霉菌(streptomyces sp.) w7及其生防制品在防治植物病原菌中的应用。
8.本发明的最后一个目的在于提供一种生物防治方法。
9.本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一株白蚁来源的生防链霉菌(streptomyces sp.)w7，保藏编号为gdmcc no：61902，保藏日期为 2021年8月30日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心。
10.本技术发明人采集海南省中国热带农业科学院园区内的白蚁，分离获得多株放线菌，通过平板对峙法，筛选获得1株能够有效抑制多种植物病原真菌的拮抗菌株，在本发明实施例中将其编号为生防链霉菌(streptomyces sp.)w7，简称 w7。
11.本发明还提供了一种防治植物病原菌的生防制品，包括所述白蚁来源的生防链霉菌(streptomyces sp.)w7和/或所述白蚁来源的生防链霉菌(streptomyces sp.) w7的发酵提取物。
12.本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：所述白蚁来源的生防链霉菌(streptomyce sp)w7或所述的生防制品在防治植物病原菌中的应用。
13.优选的，所述植物病原菌包括火龙果果腐病菌、小叶龙船叶点病菌、小叶龙船拟盘多毛孢叶斑病菌、龙船花炭疽病菌、芦笋茎枯病菌、辣椒炭疽病菌、辣椒棒孢叶斑病菌、木瓜溃疡病菌、椰子茎干腐烂病菌、芒果炭疽病菌、木瓜叶斑病菌、木瓜炭疽病菌、香蕉炭疽病菌、豇豆轮纹病菌、豇豆绵腐病菌、荔枝霜疫霉病菌中一种或几种的组合。
14.优选的，所述的发酵提取物通过以下方法制备获得：
15.(1)将所述生防链霉菌(streptomyces sp.)w7经平板活化后接种至tsb 培养基中，在26℃～30℃以140～180rpm转速振荡培养3～5d；
16.(2)再接种到液体培养基中，26℃～30℃，140～180rpm转速振荡培养12～15 d，得到发酵液；
17.(3)用乙酸乙酯萃取发酵液，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩至干，得到粗提取物，即得发酵提取物。
18.优选的，步骤(1)中所述的tsb培养基按照以下比例配备：每1l水中，胰酪胨17～19g、大豆木瓜蛋白酶水解物(市售)3～4g、氯化钠4～5g、磷酸氢二钾2～3g、葡萄糖2～3g，ph 7.0～7.3。
19.更佳的，步骤(1)中所述的tsb培养基按照以下比例配备：每1l水中，胰酪胨17g、大豆木瓜蛋白酶水解物(市售)3g、氯化钠5g、磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g，ph 7.3。
20.更佳的，步骤(1)中在28℃以160rpm转速振荡培养3～5d。
21.优选的，步骤(2)中按照8～12％(体积百分含量)的接种量接种到液体培养基中。
22.更佳的，步骤(2)中按照10％(体积百分含量)的接种量接种到液体培养基中。
23.优选的，步骤(2)中所述液体培养基按照以下比例配备：每1l水中，可溶性淀粉18～20g，蛋白胨4～5g，麦芽提取物(市售)3～4g，酵母提取物(市售)3～4g，葡萄糖10～13g，caco
3 0.5～1g，ph7.0～7.3。
24.更佳的，步骤(2)中所述液体培养基按照以下比例配备：每1 l水中，可溶性淀粉20g，蛋白胨5g，麦芽提取物(市售)3g，酵母提取物(市售)3g，葡萄糖10g，caco31g，ph7.0。
25.更佳的，步骤(2)中28℃，160rpm转速振荡培养12～15d。
26.优选的，步骤(3)中所述乙酸乙酯与所述发酵液的体积比为0.9～1.1∶1。
27.更佳的，步骤(3)中所述乙酸乙酯与所述发酵液的体积比为1∶1。
28.本发明的最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种生物防治方法，采用所述生防链霉菌(streptomyces sp.)w7和/或所述生防链霉菌(streptomycessp.)w7的发酵提取物对植物进行生物防治。
29.优选的，所述植物包括火龙果、龙船花、芦笋、辣椒、芒果、香蕉、椰子、木瓜、豇豆、荔枝中一种或几种的组合。
30.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
31.(1)本发明获得的生防链霉菌(streptomyces sp.)w7抗菌效果好、防治效果稳定、抑菌谱较广，具有较好的开发前景，生物防治潜力大，如将其发酵提取物中的抑菌活性组分通过分离纯化等技术可进一步作为生物农药被开发应用于多种植物病害的防治；
32.(2)本发明中的生防链霉菌株w7及其生防制品如发酵提取物等较化学农药比，具有无残留、低毒性、对环境友好等优点，更符合当下绿色环保理念。
附图说明
33.图1为实施例2中筛选获得的放线菌w7的菌落形态图(培养7天)；
34.图2为实施例3中菌株w7及相关菌株的系统发育树；
35.图3为实施例4中菌株w7活菌对芒果炭疽病菌的抑制效果；
36.图4为实施例7中菌株w7发酵提取物在40℃、50℃、60℃水浴1h下对芒果炭疽病菌的抑制效果。
具体实施方式
[0037][0038]
实施例1菌株筛选
[0039]
从中国海南省海口市中国热带农业科学院园区内采集白蚁样品，选用高氏合成一号培养基，采用多浓度梯度稀释涂布法中分离筛选，每天观察并挑取符合放线菌菌落形态的菌株转移至isp2培养基，分离纯化后，于甘油管-20℃保存。
[0040]
所述高氏合成一号培养基按以下按质量体积比例的组分配备：可溶性淀粉 20g/l，nacl 0.5g/l，feso
4 0.01g/l，kno
3 1g/l，k2hpo
4 0.5g/l，mgso
4 0.5 g/l，琼脂15g/l，最终ph 7.3
±
0.2。
[0041]
isp2培养基按以下按质量体积比例的组分配备：酵母浸粉4g/l，麦芽浸粉 10g/l，葡萄糖4g/l，琼脂20g/l，ph7.2
±
0.2。
[0042]
实施例2放线菌抗植物病原菌活性测定
[0043]
将分离得到的所有放线菌株转入pda培养基培养，待各菌株产生足量孢子后，以芒果炭疽病菌为指示菌，通过平板对峙法培养测定放线菌的抑菌活性：制备直径7mm的芒果炭疽病菌菌饼接种在pda平板(直径90mm)中央，距离菌饼上下2cm处为培养3d的放线菌带，以不接种放线菌的芒果炭疽病菌平板为对照组，28℃恒温培养至对照组长满至整个平板后测量，每个处理重复3次。采用十字交叉法测量菌落直径，求出菌株对芒果炭疽病菌的抑菌率。
[0044]
抑菌率(％)＝[(对照组病原菌生长直径-病原菌块直径)-(处理组病原菌生长直
径-病原菌块直径)]/(对照组病原菌生长直径-病原菌块直径)*100％。
[0045]
根据结果将拮抗活性最强的菌株w7作为入选菌株进行抑菌谱的测定。
[0046]
放线菌菌株w7在isp2培养基上生长良好，28℃培养1-3d时，菌落光滑，无孢子生成，5d后开始产生孢子，培养7d后孢子堆颜色接近白色，其菌落形态图(培养7天)如图1所示。
[0047]
实施例3菌株w7的分子鉴定
[0048]
将放线菌w7接种至isp2固体平板，28℃培养5d，挑取单菌落至isp2进行二次纯化。
[0049]
采用tsingke dna提取试剂盒(通用型)提取总dna。选用通用引物 27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’)和1492r(5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’)进行16s rrna扩增。
[0050]
pcr扩增反应体系总体积50μl体系，包括1
×
金牌mix dna聚合酶45μl，引物27f 2μl，引物1492r2μl，dna模板1μl。
[0051]
扩增条件为预变性98℃，2min，变性98℃，10s，退火56℃，10s，延伸 72℃，10s，35个循环；终延伸72℃，5min。
[0052]
0.8％琼脂糖凝胶用于检测pcr反应后获得的片段(电压300v，时间12min)，使用凝胶成像仪观察电泳结果，阳性结果交由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司测序。
[0053]
该菌株的16s rrna基因序列(具体如seq id no：1所示)为：
[0054]
gatgaaccac ttcggtgggg attagtggcg aacgggtgag tacacgtggg caatctgccc 60
[0055]
ttcactctgg gacaagccct ggaaacgggg tctaataccg gatacaaccg ctgaccgcat 120
[0056]
ggtcgggcgg tggaaagctc cggcggtgaa ggatgagccc gcggcctatc agcttgttgg 180
[0057]
tgaggtaatg gctcaccaag gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggcg accggccaca 240
[0058]
ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat 300
[0059]
gggcgaaagc ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct 360
[0060]
ctttcagcag ggaagaagcg aaagtgacgg tacctgcaga agaagcgccg gctaactacg 420
[0061]
tgccagcagc cgcggtaata cgtagggcgc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag 480
[0062]
agctcgtagg cggcttgtca cgtcggttgt gaaagcccga ggcttaacct cgggtctgca 540
[0063]
gtcgatacgg gcaggctaga gtgtggtagg ggagatcgga attcctggtg tagcggtgaa 600
[0064]
atgcgcagat atcaggagga acaccggtgg cgaaggcgga tctctgggcc attactgacg 660
[0065]
ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 720
[0066]
acggtgggaa ctaggtgttg gcgacattcc acgtcgtcgg tgccgcagct aacgcattaa 780
[0067]
gttccccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg 840
[0068]
cacaagcagc ggagcatgtg gcttaattcg acgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg 900
[0069]
acatacaccg gaaagcatta gagatagtgc cccccttgtg gtcggtgtac aggtggtgca 960
[0070]
tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct1020
[0071]
tgttctgtgt tgccagcatg cccttcgggg tgatggggac tcacaggaga ctgccggggt1080
[0072]
caactcggag gaaggtgggg acgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgtc ttgggctgca1140
[0073]
cacgtgctac aatggcaggt acaatgagct gcgaaaccgt gaggtagagc gaatctcaaa1200
[0074]
aagcctgtct cagttcggat tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg gagttgctag1260
[0075]
taatcgcaga tcagcattgc tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt1320
[0076]
cacgtcacga aagtcggtaa cacccgaagc cggtggccca acccc 1365。
[0077]
将获得的序列在ncbi网站进行blast进行相似性比对，选择相似度大于 98％的菌株的16s rrna基因序列作为参比对象，在mega-x软件中进行多序列比对，通过邻接法进行聚类分析和构建系统发育树(菌株w7及相关菌株的系统发育树分析结果如图2所示)，根据kimura two parameter模型评估系统进化矩阵，自展值设定1000次用于评估进化树拓扑结构的稳定性。经过分子生物学研究鉴定为链霉菌streptomyces sp.，保藏编号：gdmcc no：61902，保藏日期： 2021年08月30日，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
[0078]
实施例4放线菌w7抗菌谱测定
[0079]
以火龙果果腐病菌g.persicaria、小叶龙船叶点病菌phyllosticta capitalensis、小叶龙船拟盘多毛孢叶斑病菌neopestalotiopsis clavispora、龙船花炭疽病菌 colletotrichum australianum、芦笋茎枯病菌phomopsis asparagi、辣椒炭疽病菌 colletotrichum sp.、辣椒棒孢叶斑病菌corynespora cassiicola、豇豆轮纹病菌 corynespora sp.、豇豆绵腐病菌pythium aphanidermatum(edson)fitzp、椰子茎干腐烂病菌thielaviopsis paradoxa、芒果炭疽病菌c.gloeosporioides、木瓜溃疡病菌l.theobromae、木瓜叶斑病菌phomopsis caricae-papayae fetrak&cif.、木瓜炭疽病菌colletotrichum gloeosporioides penz.、香蕉炭疽病菌colletotrichum musae、荔枝霜疫霉病菌peronophythora litchii作为抗菌谱测定的指示菌(由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供)。
[0080]
采用平板对峙法测定放线菌w7的抗菌谱，将放线菌株w7转入pda培养基培养，待菌株产生足量孢子后，以上述植物病原菌为指示菌，通过平板对峙法培养测定放线菌的抑菌活性：每个植物病原菌株制备直径7mm的菌饼接种在 pda平板(直径90mm)中央，距离菌饼上下2cm处为培养3d的放线菌带，以不接种放线菌的植物病原菌平板为对照组，28℃恒温培养至对照组长满至整个平板后测量，每个处理重复3次。采用十字交叉法测量菌落直径，求出菌株对各病原真菌的抑菌率。抑菌率(％)＝[(对照组病原菌生长直径-病原菌块直径)
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(处理组病原菌生长直径-病原菌块直径)]/(对照组病原菌生长直径-病原菌块直径)*100％。对各植物病原真菌的抑菌率如下表1所示：
[0081]
表1放线菌w7的抗菌谱测定
[0082][0083][0084]
从表1数据可以看出，菌株w7活菌对供试的16种植物病原真菌均具有一定程度的抑菌效果，其中菌株w7活菌对香蕉炭疽病菌colletotrichum musae抑制作用最强，抑制率达到了78.26
±
0.23％；其次为椰子茎干腐烂病菌thielaviopsisparadoxa、小叶龙船拟盘多毛孢叶斑病菌neopestalotiopsis clavispora和芒果炭疽病菌c.gloeosporioides(菌株w7活菌对芒果炭疽病菌的抑制效果如图3所示)，抑制率均在68％以上；对荔枝霜疫霉病
菌peronophythora litchii和芦笋茎枯病菌 phomopsis asparagi抑制作用最弱，抑制率分别为18.18
±
1.02％和16.28
±
1.18％。
[0085]
实施例5菌株w7拮抗作用持效性
[0086]
将菌株w7转入pda培养基培养，待产生足量孢子后，以芒果炭疽病菌为指示菌，通过平板对峙法培养测定放线菌的抑菌活性：制备直径7mm的芒果炭疽病菌菌饼接种在pda平板(直径90mm)中央，距离菌饼上下2cm处为培养 3d的放线菌带，以不接种放线菌的芒果炭疽病菌平板为对照组，28℃恒温培养 7d、15d、30d、40d，每个处理重复3次。计算每个时期的抑菌率如下表2所示：
[0087]
表2菌株w7在不同对峙培养时间内的抑菌率
[0088][0089]
注：对表中数据同行进行比较，数据后面小写字母不同表示在p＜0.05水平差异显著。
[0090]
从表2数据可以看出，在对峙40天内，菌株w7活菌对供试的芒果炭疽病菌均具有强抑制效果，抑制率在67％以上，其中在对峙培养7天时的抑制效果最强，抑制率达到72.73
±
0.35％；在对峙培养30天后，其抑制效果与15天的抑制效果相比，下降明显，但抑菌率仍然高于67％。结果表明菌株w7活菌对芒果炭疽病菌的拮抗作用具有良好的持续性。
[0091]
实施例6放线菌w7的发酵及其发酵物样品前处理方法
[0092]
将链霉菌streptomyces sp.w7经平板活化，接种于tsb培养基中，28℃、 160rpm振荡培养3d；按照10％(体积百分含量)接种量接种到10l液体发酵培养基中，28℃、160rpm振荡培养15d，得到发酵液；用等体积的乙酸乙酯(1 l)萃取发酵液，反复萃取3遍，合并3次乙酸乙酯萃取液，并在50℃下将其减压浓缩至干品，得到提取物(2.3g)，即为放线菌w7发酵提取物。
[0093]
所述tsb培养基按以下按重量体积比例的组分配备：胰酪胨17g/l、大豆木瓜蛋白酶水解物3g/l、氯化钠5g/l、磷酸氢二钾2.5g/l、葡萄糖2.5g/l，ph7.3
±
0.2。
[0094]
液体发酵培养基按以下按重量体积比例的组分配备：可溶性淀粉20g/l，蛋白胨5g/l，麦芽提取物3g/l，酵母提取物3g/l，葡萄糖10g/l，caco31g/l， ph7.0。
[0095]
实施例7菌株w7发酵提取物抗植物病原菌的热稳定性
[0096]
将发酵提取物配制成浓度为500μg/ml的样品液，分别置于40℃、50℃、 60℃下水浴1h。以芒果炭疽病菌为指示菌，通过平板滤纸片法测定放线菌的抑菌活性：制备直径7mm的芒果炭疽病菌菌饼接种在pda平板(直径90mm) 中央，距离菌饼上下左右2em处放置一张直径8mm滤纸片，以无菌水和dmso 作阴性对照，以不接种放线菌的芒果炭疽病菌平板为对照组，每个处理重复3 次，28℃恒温倒置培养10d。
[0097]
计算每个温度下的抑菌率如下表3所示：
[0098]
表3不同温度处理的发酵提取物的抑菌率
[0099][0100]
菌株w7发酵提取物在40℃、50℃、60℃水浴处理1h下对芒果炭疽病菌的抑制效果如图4所示。
[0101]
从表3和图4可以看出，菌株w7的发酵提取物在室温条件下对芒果炭疽病菌具有最强的抑菌效果，抑制率达到69.40
±
1.54％；3个高温处理过的发酵提取物，对芒果炭疽病菌均具有较强的抑菌效果，其中，最高处理温度60℃处理1 小时的发酵提取物对芒果炭疽病菌的抑菌率亦达到了56.72
±
1.23％，表明该发酵提取物的抗芒果炭疽病菌活性具有较好的热稳定性，在田间生物防治植物病原真菌病害中可发挥稳定防效。
[0102]
需要指出的是，上述实施例仅是对本发明的进一步说明，而不是限制，本领域技术人员在与本发明技术方案的相当的含义和范围内的任何调整或改变，都应认为是包括在本发明的保护范围内。