靶向CD43的独特癌相关表位的单克隆抗体

靶向cd43的独特癌相关表位的单克隆抗体
1.1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年6月21日提交的第16/449,255号美国申请的优先权权益，其内容通过引用全文纳入本文。
3.2.生物保藏
4.分泌mab umg1的杂交瘤根据布达佩斯条约于2016年8月4日以登录号iclc pd n
°
16001保藏于高级生物技术中心(centro biotecnologie avanzate)(abc)，中间细胞系收集(interlab cell line collection)(iclc)。
3.

背景技术：

5.cd43是一种白细胞标志物，通常仅限于造血系细胞。cd43广泛表达于大多数外周血和骨髓来源的细胞成分中。cd43的前体形式以54kd的表观分子量迁移。在其成熟形式中，cd43是高度糖基化的，具有115至200kd的分子量。cd4 胸腺细胞和单核细胞表达115kd形式，而活化的cd4 和cd8 t细胞、b细胞、中性粒细胞和血小板表达130kd形式。cd43参与多种功能，例如细胞粘附，细胞凋亡和迁移(ostberg等，immunology today 19：546-50，1998)。
6.一种鼠抗人cd43单克隆抗体un1在25年前首次被描述。un1单克隆抗体最初被选为对人类未成熟胸腺细胞具有高反应性(tassone等，tissue antigens 44：73-82，1994)，后来被证明不仅与未成熟胸腺细胞结合，也与各种胎儿组织(cecco等，tissue antigens 51：528-535，1998；tassone等，int.j.oncology 20：707-711，2002)和各种实体瘤结合，包括乳腺癌、结肠癌、胃癌和肺鳞状细胞癌，但不与正常组织和良性病变(tassone等，int.j.oncol.20：707-11，2002；tassone等，anticancer res.22：2333-40，2002)结合。此外，乳腺癌细胞中un1表位的表达水平与疾病的进展阶段相关(tassone等，anticancer res.22：2333-40，2002)。un1识别的表位是癌组织中表达，但不在大多数非肿瘤性成人组织中表达的癌胚抗原，这一证据使un1单克隆抗体成为肿瘤检测和免疫治疗的一个有吸引力的工具(见tuccillo等，mol.cancer ther.13(3)，2014)。
7.使用免疫沉淀和串联质谱法，发现un1抗体识别cd43上的一个表位，该表位包括单糖，galnac，o-连接到cd43的多肽链(de laurentiis等，int.j.biological macromol.39：122-126，2006；de laurentiis等，molecular&cellular proteomics 10：1-12，2011)。
8.然而，尽管对un1抗体进行了广泛的功能表征，但其cdr序列从未确定。分泌un1抗体的杂交瘤从未在生物库中保藏，也没有建立un1杂交瘤主细胞库或工作细胞库。需要与un1抗体结合相同或类似表位的抗体用于癌症治疗，尤其是治疗t细胞急性淋巴细胞性白血病/淋巴母细胞性淋巴瘤，以及用于癌症诊断。
4.

技术实现要素：

9.在过去的25年里，我们培育了最终来源于原始un1杂交瘤的细胞。最近的一个亚克隆分泌一种单克隆抗体，称为umg1，它保留了原始un1抗体的某些结合特征，但不是全部，并且具有独特的结合特异性，提供了特殊的优势。
10.简而言之，umg1抗体与来自健康人供体的外周血单核细胞(pbmc)中的一小部分淋巴细胞结合(实施例1)。umg1阳性淋巴细胞大部分是cd45 cd3 cd4 cd8-cd127 ccr7 t淋巴细胞(实施例2)。
11.与un1一样，umg1抗体与主要属于egil t3分类的t-all细胞系结合(实施例3)。然而，与un1抗体不同，umg1抗体不与乳腺癌细胞结合(实施例3)。在第一次试验中，umg1抗体未显示出与肺癌、结直肠癌和乳腺癌肿瘤中的癌细胞有任何结合(实施例5)，这与之前un1的观察结果形成对比(见de laurentiis等，molecular&cellular proteomics 10：1-12，2011，图9)。然而，umg1确实与多种肿瘤中的细胞免疫浸润相结合，包括肺癌、结直肠癌和乳腺癌肿瘤(实施例5)。尽管umg1不与健康供体pbmc中的髓系来源细胞结合(实施例1)，但umg1表位在肿瘤相关巨噬细胞中表达，并且当巨噬细胞与癌细胞共同培养并相互作用时，umg1表位表达升高(实施例6)。
12.umg1还与一些b细胞源性恶性肿瘤结合，包括瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症细胞系(实施例3)。
13.umg1与健康供体的一小群中性粒细胞结合(实施例9)。umg1不与健康供体的活化t淋巴细胞结合(实施例10)。
14.人类健康组织的组织微阵列显示umg1单克隆抗体结合的特殊分布，主要局限于胸腺(主要在皮质胸腺细胞上)，以及淋巴结、肠道和肺等器官中罕见的散在免疫浸润(实施例11)。
15.组织微阵列数据显示，除了淋巴瘤外，umg1表位也在各种来源的黑色素瘤和睾丸癌中表达(实施例11)。在多个组织微阵列上进行扩大筛查，umg1抗体与肿瘤细胞的结合并且免疫浸润的是不同来源的儿科肿瘤(实施例11)。
16.通过将umg1鼠抗体的可变区与人类igg fc区融合而构建的嵌合抗体(ch-umg1)能够在存在来自人类pbmc的效应细胞的情况下诱导针对t-all细胞系hpb all和t淋巴瘤细胞系h9的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)(实施例17)。ch-umg1抗体也能够诱导针对瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症细胞的adcc(实施例18)。通过将umg1重链和轻链的cdr移植到人类框架中构建的人源化抗体(h-umg1)能够减少nsg小鼠模型中hpb-all异种移植物的生长(实施例21)。最后，第三代嵌合抗原受体(car)t细胞在h9 t淋巴瘤细胞存在的情况下被激活(实施例22)，其中car靶向部分是具有umg1抗体全部6个cdr的scfv，预测umg1指导的car-t治疗将有效治疗t细胞淋巴瘤。
17.umg1-cd3双特异性抗体能够与umg1 或cd3 阳性细胞结合，并将t细胞的细胞毒性重定向至靶癌细胞(实施例23至30)。
18.umg1抗体的特异性使其特别适用于治疗表达其靶表位的肿瘤子集，包括淋巴瘤(如来源于外周b细胞或外周t细胞的非霍奇金淋巴瘤，包括但不限于弥漫性大b细胞淋巴瘤、malt淋巴瘤、t淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套膜细胞淋巴瘤)、睾丸癌(如精原细胞瘤、胚胎癌、卵黄囊瘤和畸胎瘤)，多发性骨髓瘤、黑色素瘤和异常表达抗原表位的实体瘤，如儿童癌症或其中肿瘤相关巨噬细胞的耗竭将显示治疗性益处的实体瘤。
19.因此，在第一方面中，本文提供了一种用于治疗cd43阳性癌症的方法中的抗cd43抗体或其抗原结合片段，包括：向具有cd43阳性癌症的患者给予治疗有效量的抗cd43抗体或抗原结合片段，其中，所述抗cd43抗体或抗原结合片段结合野生型cd43的氨基酸61-91内
的表位，并且其中所述cd43阳性癌症选自以下组：弥漫性大b细胞淋巴瘤、malt淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤，多发性骨髓瘤、黑色素瘤、睾丸癌、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、内胚窦癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、髓母细胞瘤、脉络丛乳头状瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、原始神经外胚层瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、未成熟畸胎瘤和平滑肌肉瘤。
20.在一些实施方式中，抗cd43抗体或抗原结合片段结合野生型cd43的氨基酸71-78。在一些实施方式中，抗cd43抗体或抗原结合片段结合野生型cd43的氨基酸73-78。
21.在一些实施方式中，抗cd43抗体或抗原结合片段包含重链可变(vh)结构域和轻链可变(vl)结构域，其中vh结构域包含：seq id no：1的vhcdr1序列；seq id no：43的vh cdr2序列；以及seq id no：3的vh cdr3序列；其中，vl结构域包括：seq id no：4的vl cdr1序列；seq id no：5的vl cdr2序列；以及seq id no：6的vl cdr3序列。
22.在一些实施方式中，vh序列是seq id no：7，vl序列是seq id no：12。在一些实施方式中，抗cd43抗体是由以iclc登录号iclc pd号16001(umg1)保藏的杂交瘤细胞系产生的鼠抗体。在一些实施方式中，抗cd43抗体是进一步包含人类恒定区结构域的嵌合抗体。在一些实施方式中，人类恒定区结构域是igg结构域。在一些实施方式中，抗体重链序列为seq id no：34，抗体轻链序列为seq id no：35。
23.在一些实施方式中，抗cd43抗体或抗原结合片段包含人类可变结构域框架区域。在一些实施方式中，vh结构域具有选自以下的序列：seq id no：8、seq id no：9、seq id no：10和seq id no：11；并且vl结构域具有选自以下的序列：seq id no：13、seq id no：14、seq id no：15和seq id no：16。
24.在一些实施方式中，抗cd43抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，抗cd43抗体或抗原结合片段为f(ab)、f(ab)’2、scfv、双抗体、单域抗体、tandab或柔性体(flexibody)。
25.在一些实施方式中，抗cd43抗体或抗原结合片段能够在效应细胞存在的情况下诱导抗体依赖性细胞毒性(adcc)。在一些实施方式中，抗cd43抗体或抗原结合片段能够消耗肿瘤相关巨噬细胞(tam)。
26.在一些实施方式中，抗cd43抗体或抗原结合片段与毒性药物偶联。
27.在一些实施方式中，患者具有弥漫性大b细胞淋巴瘤、malt淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤或套细胞淋巴瘤。
28.在一些实施方式中，患者患有多发性骨髓瘤。
29.在一些实施方式中，患者患有黑色素瘤。
30.在一些实施方式中，患者患有睾丸癌。在一些实施方式中，睾丸癌选自以下组：精原细胞瘤、胚胎癌、卵黄囊瘤和畸胎瘤。
31.在一些实施方式中，患者患有肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、内胚层窦癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、髓母细胞瘤、脉络丛乳头状瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、原始神经外胚层瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、未成熟畸胎瘤或平滑肌肉瘤。
32.在另一方面中，本文提供了一种用于治疗cd43阳性癌症的方法中的双特异性抗体，包括：向具有cd43阳性癌症的患者给予治疗有效量的双特异性抗体，其中，所述双特异性抗体对野生型cd43的氨基酸71-78内的表位有第一结合特异性，并且其中所述cd43阳性癌症选自以下组：弥漫性大b细胞淋巴瘤、malt淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴
cdr2序列；以及seq id no：3的vh cdr3序列；其中，vl结构域包括：seq id no：4的vl cdr1序列；seq id no：5的vl cdr2序列；以及seq id no：6的vl cdr3序列。
39.在一些实施方式中，vh序列是seq id no：7，vl序列是seq id no：12。在一些实施方式中，抗cd43抗体是由以iclc登录号iclc pd号16001(umg1)保藏的杂交瘤细胞系产生的鼠抗体。在一些实施方式中，抗cd43抗体是进一步包含人类恒定区结构域的嵌合抗体。在一些实施方式中，人类恒定区结构域是igg结构域。在一些实施方式中，抗体重链序列为seq id no：34，抗体轻链序列为seq id no：35。
40.在一些实施方式中，抗cd43抗体或抗原结合片段包含人类可变结构域框架区域。在一些实施方式中，vh结构域具有选自以下的序列：seq id no：8、seq id no：9、seq id no：10和seq id no：11；并且vl结构域具有选自以下的序列：seq id no：13、seq id no：14、seq id no：15和seq id no：16。
41.在一些实施方式中，抗cd43抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，抗cd43抗体或抗原结合片段为f(ab)、f(ab)’2、scfv、双抗体、单域抗体、tandab或柔性体。
42.在一些实施方式中，抗cd43抗体或抗原结合片段能够在效应细胞存在的情况下诱导抗体依赖性细胞毒性(adcc)。在一些实施方式中，抗cd43抗体或抗原结合片段能够消耗肿瘤相关巨噬细胞(tam)。
43.在一些实施方式中，抗cd43抗体或抗原结合片段与毒性药物偶联。
44.在一些实施方式中，患者具有弥漫性大b细胞淋巴瘤、malt淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤或套细胞淋巴瘤。
45.在一些实施方式中，患者患有多发性骨髓瘤。
46.在一些实施方式中，患者患有黑色素瘤。
47.在一些实施方式中，患者患有睾丸癌。在一些实施方式中，睾丸癌选自以下组：精原细胞瘤、胚胎癌、卵黄囊瘤和畸胎瘤。
48.在一些实施方式中，患者患有肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、内胚层窦癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、髓母细胞瘤、脉络丛乳头状瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、原始神经外胚层瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、未成熟畸胎瘤或平滑肌肉瘤。
49.在另一方面中，本文提供了一种用于治疗cd43阳性癌症的方法，包括：向具有cd43阳性癌症的患者给予治疗有效量的双特异性抗体，其中，所述双特异性抗体对野生型cd43的氨基酸71-78内的表位有第一结合特异性，并且其中所述cd43阳性癌症选自以下组：弥漫性大b细胞淋巴瘤、malt淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤，多发性骨髓瘤、黑色素瘤、睾丸癌、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、内胚窦癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、髓母细胞瘤、脉络丛乳头状瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、原始神经外胚层瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、未成熟畸胎瘤和平滑肌肉瘤。在一些实施方式中，双特异性抗体对cd3具有第二结合特异性。
50.在另一方面中，本文提供了一种用于治疗cd43阳性癌症的方法，包括：向具有cd43阳性癌症的患者给予治疗有效量的car-t细胞，其中，所述car-t细胞结合野生型cd43的氨基酸71-78内的表位，并且其中所述cd43阳性癌症选自以下组：弥漫性大b细胞淋巴瘤、malt淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤，多发性骨髓瘤、黑色素瘤、睾丸癌、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、内胚窦癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞
瘤、髓母细胞瘤、脉络丛乳头状瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、原始神经外胚层瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、未成熟畸胎瘤和平滑肌肉瘤。
51.在另一方面中，本文提供了一种用于鉴定cd43阳性癌症的方法，包括：将包含cd43阳性癌细胞的样品与抗cd43抗体或抗原结合片段可检测地接触，其中，所述抗cd43抗体或抗原结合片段结合野生型cd43的氨基酸71-78内的表位，并且其中所述cd43阳性癌症选自以下组：弥漫性大b细胞淋巴瘤、malt淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤，多发性骨髓瘤、黑色素瘤、睾丸癌、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、内胚窦癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、髓母细胞瘤、脉络丛乳头状瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、原始神经外胚层瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、未成熟畸胎瘤和平滑肌肉瘤。
52.在另一方面中，本文提供了一种用于诊断和治疗cd43阳性癌症的方法，包括：将来自患者的样品与抗cd43抗体或抗原结合片段可检测地接触，如果检测到与抗cd43抗体或抗原结合片段的结合，则诊断患者患有cd43阳性癌症，并且向所述患者给予治疗有效量的抗cd43抗体或抗原结合片段，其中，所述抗cd43抗体或抗原结合片段结合野生型cd43的氨基酸71-78内的表位，并且其中所述cd43阳性癌症选自以下组：弥漫性大b细胞淋巴瘤、malt淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤，多发性骨髓瘤、黑色素瘤、睾丸癌、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、内胚窦癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、髓母细胞瘤、脉络丛乳头状瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、原始神经外胚层瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、未成熟畸胎瘤和平滑肌肉瘤。
5.附图说明
53.专利或申请文件含有至少一幅彩色绘图。在专利局请求并支付必要的费用后，将提供带彩色附图的本专利或专利申请出版物副本。
54.可参考下述说明了示例性实施方式的详述更好地理解本公开的特征和优点，这些详述列出利用本公开原理的说明性情况：
55.图1a和1b展示了umg1抗体识别的表位在一群健康供体的外周血单核细胞上的表达，并与商业cd43抗体进行了比较。图1a的散点图显示了通过流式细胞术获得的数据。x轴表示检测到的前向散射(fsc)，v轴表示侧向散射(ssc)。每个点对应于一个细胞。图1b的直方图在x轴上描绘了藻红蛋白信号强度。y轴将信号强度与未染色样品的最大信号强度(即100％)相关联。红色曲线代表未染色的对照，蓝色曲线代表加扰(scramble)的igg1染色细胞(即阴性对照)，橙色曲线代表单克隆抗体umg1染色的细胞，绿色曲线代表商用抗cd43抗体染色的细胞。
56.图2a-2d显示了由根据本发明保藏的杂交瘤细胞产生的umg1抗体识别的细胞群的四个代表性散点图。图2a和2c显示属于淋巴细胞的两个散点图。图2b和2d来自由根据本发明保藏的杂交瘤细胞产生的umg1抗体检测到的淋巴细胞。在图2a和2b中，x轴代表cd4信号强度，而y轴代表cd8信号强度。在图2c和2d中，x轴代表cd45ro信号强度，而y轴代表ccr7信号强度。
57.图3a-3b显示了两个直方图。图3a显示了在bcwm.1细胞系上通过umg1抗体检测到的umg1表达。图3b显示了在mwcl.1细胞系上的umg1表达。未填充的曲线代表未染色的对照，用水平条纹填充的曲线代表二级mab染色的细胞，填充有垂直条纹的曲线表示加扰的igg加
上二级mab染色的细胞，并且填充有斜条纹的曲线表示由mab un1染色的细胞。
58.图4显示了umg1抗体识别的肿瘤相关巨噬细胞(tam)。箭头显示tam浸润结直肠癌样品。
59.图5a-5b显示了thp1衍生的巨噬细胞。图5显示用以下染色的thp1衍生的巨噬细胞：对照igg1，不存在肿瘤细胞(第一行)，umg1-ch(根据本发明方面2的嵌合抗体，其中原始鼠fc区被完全人igg1 fc替换)，不存在肿瘤细胞(第二行)，和ch-umg1，存在panc1胰腺癌细胞系(第三行，具体显示于图5b)。第一列代表dapi染色，第二列代表抗体加alexa fluor 488标记的二抗，第三列代表叠加图像。
60.图6a-6b是条形图，显示了脱颗粒试验的结果，以评估hpb-all(图6a)和h9细胞系(图6b)中的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。x轴上的数字代表不同的测试样品，表示：无靶标(1)，效应加靶细胞(e t)(2)，阴性对照(nc)200μg/ml(3)，ch-umg110μg/ml(4)，ch-umg150μg/ml(5)，ch-umg1100μg/ml(6)，ch-umg1200μg/ml(7)，阳性对照(pc)200μg/ml(8)。y轴代表受adcc影响的cd107a nk细胞占每个样品的测试的cd107a nk细胞总数的百分比。
61.图7是一个条形图，显示了脱颗粒试验的结果，以评估bcwm.1细胞系中的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。x周上的数字代表不同样品。x轴上的数字代表不同的测试样品，表示：无靶标(1)，效应加靶细胞(e t)(2)，阴性对照(nc)200μg/ml(3)，ch-umg110μg/ml(4)，ch-umg150μg/ml(5)，ch-umg1100μg/ml(6)，ch-umg1200μg/ml(7)，阳性对照(pc)200μg/ml(8)。y轴代表受adcc影响的cd107a nk细胞占每个样品的测试的cd107a nk细胞总数的百分比。
62.图8是一个条形图，显示了在h9细胞存在的情况下，表达cd3 的淋巴细胞(car-t)能够释放显著更高量的干扰素γ(ifnγ)。y轴显示以ng/ml表示的ifnγ浓度。在x轴上，显示的数字代表被测的不同细胞：(1)表示未转导的t细胞(阴性对照)；(2)表示用对照car(载剂对照)转导的t细胞；(3)显示用car-umg1转导的t细胞。
63.图9是一个条形图，显示了在h9细胞存在下，car-t能够释放显著更高量的白细胞介素2(il-2)。y轴显示以ng/ml表示的il2浓度。在x轴上，显示的数字代表被测的不同细胞：(1)表示未转导的t细胞(阴性对照)；(2)表示用对照car(载剂对照)转导的t细胞；(3)显示用car-umg1转导的t细胞。
64.图10是一个条形图，显示了car-t能够诱导对h9细胞的选择性杀伤。y轴表示死/活细胞比。x轴报告：单独的h9(1)，存在非转导的t细胞时的h9(2)，存在用对照car转导的t细胞时的h9(3)和存在用umg-1 car转导的t细胞的h9，也指代umg1-car(4)。
65.图11是表示体内实验的肿瘤体积曲线的线图，其比较了对照igg1(利妥昔单抗)与umg1-mab的人源化形式(h-umg1)和umg1-mab的非岩藻糖化形式(a-h-umg1)。在图中，h-umg1用带正方形的线表示，a-h-umg1用带三角形的线表示，对照igg1用带圆圈的线表示。
66.图12a和12b显示了h-umg1-pe和三种市售cd43抗体直接染色的代表性流式细胞术结果。图12a显示了all-sil人细胞系中的染色。图12b显示了ke-37细胞系中的染色。
67.图13a和13b显示了竞争性结合试验。图13a显示了在cem细胞系上h-umg1、h-umg1-pe和三种商用cd43抗体之间竞争性结合试验的代表性结果。图13b显示了在hpb-all细胞系上h-umg1、h-umg1-pe和三种商用cd43抗体之间竞争性结合试验的代表性结果。
68.图14a-14c显示了三种不同人类肿瘤炎症浸润中m-umg1染色的代表性图像。图14a显示结直肠腺癌中的m-umg1染色。图14b显示肺腺癌中的m-umg1染色。图14c显示乳腺癌中的m-umg1染色。
69.图15a-15f显示了实施例12的代表性结果。图15a显示了全长cd43的氨基酸序列(seq id no：17)。图15b是描述用于转染hek293t细胞的cd43蛋白变体的图示。图无15c和15e显示转染hek293t细胞的蛋白质裂解物的western印迹结果。图15d和15f是条形图，显示转染hek293t细胞的facs结果。
70.图16显示了h-umg1抗体对hpb-all和h9细胞系上抗原亲和力的筛选，已知这些细胞系对umg1表位呈阳性。
71.图17a-17b显示了造血谱系的四个不同细胞系中h-umg1和un1的比较流式细胞术图谱。图17a显示了(tassone等，tissue antigens 44：73-82，1994)提供的造血系细胞系中报告的un1流式细胞术图谱。图17b显示了如实施例8所提供的造血谱系的细胞系中的umg1流式细胞术图谱。
72.图18a-18b显示了使用umg1-cd3双特异性抗体进行治疗的代表性facs图像，以在细胞系all-sil(图18b)和ke-37(图18a)上进行t细胞细胞毒性试验，如实施例23所提供。
73.图19显示了h-umg1单抗与在大肠杆菌载体中表达的重组人cd43分析物(aa 20-253，seq id no：42)结合动力学的评估，该载体是一种非糖基化的cd43蛋白。参见实施例15a。
74.图20描绘了用于制造本文所提供的car-t的各种实施方式的构建体的质粒图谱。
75.图21a-21b显示了a-h-umg1单抗(去岩藻糖基化的h-umg1)和umg1-cd3双特异性抗体对t-all细胞的效力，图21a显示了a-h-umg1单抗和umg1-cd3双特异性抗体对cem细胞系的效力，图21b显示了a-h-umg1单抗和umg1-cd3双特异性抗体对t-all原代母细胞的效力。
76.图22a-22c显示了不同浓度的umg1-cd3双特异性抗体对t-all细胞系的效力，图22a显示了umg1-cd3双特异性抗体对cem细胞系的效力，图22b显示了umg1-cd3双特异性抗体对ke37细胞系的效力，图22c显示了umg1-cd3双特异性抗体对all-sil细胞系的效力。
77.图23显示了与未治疗对照组(nc)相比，不同剂量的umg1-cd3双特异性诱导的细胞凋亡。
78.图24显示了cd8 和cd4 t-细胞在诱导对umg1-cd3双特异性治疗的反应中的作用。
79.图25显示了在不存在或存在浓度增加的umg1-cd3双特异性抗体的情况下pbmc的增殖。
80.图26a-26b显示了在不存在或存在umg1-cd3双特异性抗体的情况下pbmc的增殖，图26a显示了在不存在umg1-cd3双特异性抗体的情况下pbmc的增殖，图26b显示了在存在umg1-cd3双特异性抗体的情况下pbmc的增殖。
81.图27a-27b显示了在不存在或存在浓度增加的umg1-cd3-双特异性抗体的情况下t细胞活化标志物的表达，图27a显示了cd69阳性细胞的百分比，图27b显示了cd25阳性细胞的百分比。
82.图28a-28d显示了在cd4 和cd8 t细胞中诱导ifnγ和tnfα，图28a显示了在cd4 t细胞中诱导ifnγ，图28b显示了在cd8 t细胞中诱导ifnγ，图28c显示了在cd4 t细胞中诱导tnfα，图28d显示了在cd8 t细胞中诱导tnfα。
83.图29显示了umg1-cd3双特异性处理对pbmc和ccrf-cem细胞系中nfκb蛋白表达的作用。
84.图30a-30f显示了umg1-cd3双特异性对多发性骨髓瘤细胞系的体外效力，图30a显示了umg1表位对delta 47细胞系的抑制，图30b显示了umg1-cd3双特异性对delta 47细胞系的体外效力，图30c显示了umg1表位对h929细胞系的抑制，图30d显示umg1-cd3双特异性对h929细胞系的体外效力，图30e显示umg1表位对kms26细胞系的抑制，图30c显示umg1-cd3双特异性对kms26细胞系的体外效力。
85.图31a-31c显示了umg1-cd3双特异性对睾丸癌(精原细胞瘤)细胞系tcam2的体外效力，图31a显示了umg1表位在tcam2细胞系上的表达，图31b显示了与阴性对照(nc)相比，umg1-cd3双特异性对tcam2细胞系的体外效力，图31c显示了与阴性对照(nc)和a-h-umg1单克隆抗体相比，umg1-cd3双特异性对tcam2细胞系的体外效力。
86.图32显示了不同浓度的umg1-cd3双特异性在cem、jurkat和ke37细胞系上的结合活性。
87.图33显示了h-umg1单抗与失活和活化的中性粒细胞的结合。
88.图34a-34d显示了igg同型对照和h-umg1单抗与活化t细胞结合的facs结果，图34a显示了igg同型对照与cd25阳性细胞的结合，图34b显示了igg同型对照与cd69阳性细胞的结合，图34c显示了h-umg1单抗与cd25阳性细胞的结合，图34d显示了h-umg1单抗与cd69阳性细胞的结合。
89.图35显示了h-umg1单抗(人源化抗cd43单抗)与人cd43肽微阵列结合的表位图谱结果。
90.图36显示了h-umg1单抗(人源化抗cd43单抗)与ppstsinegsplwts(seq id no：51)肽微阵列结合的表位图谱结果。
91.图37a-c显示了热图、取代矩阵和氨基酸图，代表h-umg1单抗结合的保守氨基酸，图37a显示了热图，图37b显示了取代矩阵，图37c显示了氨基酸图。
92.图38a-c显示了umg1单克隆抗体在人体组织上的结合，图38a显示了umg1在胸腺细胞上的结合，其特征是在皮质胸腺中阳性细胞的存在增加(入口)，图38b显示了umg1单克隆抗体膜和人类扁桃体上的细胞质结合，图38c显示了在肺组织内巨噬细胞上观察到的细胞质结合。
93.图39a-b显示了umg1单克隆抗体与弥漫性大b细胞淋巴瘤和t细胞淋巴瘤的结合，图39a显示了umg1与弥漫性大b细胞淋巴瘤的结合，图39b显示了umg1与t细胞淋巴瘤的结合。来自ly2084组织微阵列的代表性图像。
94.图40a-b显示了umg1单抗与黑色素瘤和精原细胞瘤组织的结合，图40a显示了umg1与黑色素瘤组织的结合(me2081)，图40b显示了umg1与精原细胞瘤组织的结合(te2081)。
95.6.详细说明
96.6.1.定义
97.除非另外定义，本文使用的所有专业术语、符号和其它科学专有词汇旨在具有本领域技术人员通常所理解的含义。
98.单克隆抗体“umg1”是由以iclc登录号iclc pd号16001保藏的杂交瘤细胞系产生的鼠抗人抗体。
99.如本文所用，除非另有限定，否则术语“抗体”具有其最广泛的本领域公认含义，并包括所有已知形式，包括但不限于：二价单特异性单克隆抗体、二价双特异性抗体、三价三特异性抗体、f(ab)片段、f(ab)’2片段、scfv片段、双抗体、单域抗体，包括骆驼科动物vhh单域抗体、tandab和柔性体。
100.如本文所用，术语“治疗”或“疗法”以其最广泛接受的临床意义使用。这些术语包括但不限于减轻疾病的迹象或症状；改善疾病的迹象或症状；缓解症状；疾病程度的减轻；病情稳定(即不恶化)；延缓或减缓疾病进展；疾病状态的改善或缓解；缓解(无论是部分缓解还是完全缓解)，无论是可检测到的还是不可检测到的；治愈；延长生存期，与如果不接受治疗的预期生存期相比。除非另有明确说明，“治疗”或“疗法”并不意味着预防或防止疾病。
101.述及“对象”或“个体”，其指需要诊断、预防或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括人、家养动物、家畜和动物园动物、竞技动物或宠物，如犬、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。除非另有说明，“患者”是指人类“对象”。
102.术语“足量”指足以产生预期效果的量，例如，足以调节细胞中蛋白质聚集的量。
103.术语“治疗有效量”是指对治疗疾病有效的量。“预防有效量”是指能有效减缓或预防疾病发作的量。
104.在本发明中，“包括”、“包含”、“含有”、“具有”、“有”及其语言变体具有美国专利法赋予它们的含义，允许在明确列举的组件之外存在其他组件。
105.如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代对象，除非文本中另有明确说明。除非另有明确说明，否则术语“包括”、“例如”等旨在不受限制地传达包含。
106.本文提供的范围应理解为该范围内所有值的简写，包括端点。例如，1到50的范围被理解为包括任何数字、数字的组合或选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50。
107.除非特别说明或从上下文中明显可见，否则如本文所用，术语“约”被理解为在本领域的正常公差范围内。
108.6.2.一般概述
109.本发明提供了新的人源化和鼠cd43抗体，以及由此衍生的结合分子，与之前公开的其他商用cd43抗体的性质相比，它们具有不同的表达和结合性质。
110.6.3.cd43结合蛋白
111.6.3.1.小鼠单克隆umg1抗体
112.在第一方面，本发明涉及由以iclc pd n
°
16001保藏的杂交瘤细胞产生的单克隆小鼠抗体。
113.杂交瘤细胞于2016年8月4日以登录号iclc pd n
°
16001保藏于高级生物技术中心(centro biotecnologie avanzate)(abc)，中间细胞系收集(interlabcell line collection)(iclc)，largo rosanna，10，16132热那亚，意大利。在下面给出的实施例中测试的抗体。如实施例所示，抗体在可被唾液酸糖基化的蛋白质部分中结合到cd43上的特定表位。
114.在这第一方面，本发明进一步涉及抗体，其包含含有互补决定区cdrh1，cdrh2和
cdrh3的重链可变区，和含有互补决定区cdrl1，cdrl2和cdrl3的轻链可变区，其中cdrh1，cdrh2，cdrh3，cdrl1，cdrl2和cdrl3分别包含氨基酸序列gftfssfgmh(seq id no：1)、yissgsgnfyyvdtvkg(seq id no：43)、styyhgsrgamdy(seq id no：3)、sasssvssmywy(seq id no：4)、dtskmas(seq id no：5)和qqwssyppit(seq id no：6)。这些序列也在seq id no：1-6中给出。
115.在一些实施方式中，抗体包含来自抗体的所有三个重链互补决定区(cdr)和所有三个轻链cdr。
116.上述cdr序列是由以iclc pd n
°
16001保藏的杂交瘤细胞产生的单克隆小鼠抗体的cdr序列，通过测序确定。
117.如本文所用，术语“cdr”或“互补决定区”是指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定区域已由kabat等，j.biol.chem.252，6609-6616(1977)和kabat等，sequences of protein of immunological interest.(1991)，并且由chothia等，j.mol.biol.196：901-917(1987)并且由maccallum等，j.mol.biol.262：732-745(1996)描述，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。包含上述各引用文献中定义的cdr的氨基酸残基被列出以供比较。优选地，术语“cdr”是kabat基于序列比较定义的cdr。cdrh1、cdrh2和cdrh3表示重链cdr，并且cdrl1、cdrl2和cdrl3表示轻链cdr。
118.这种单克隆抗体可能具有来自任何物种的框架序列。优选地，其可具有小鼠或人框架。
119.如本文所用，术语“框架(fr)氨基酸残基”是指免疫球蛋白链的框架区中的那些氨基酸。本文中使用的术语“框架区”或“fr区”包括作为可变区一部分但不是cdr一部分的氨基酸残基(例如，使用cdr的kabat定义)。
120.用于产生具有如上所述cdr序列的单克隆抗体的方法是本领域已知的，并且包括将编码cdr的核酸序列引入编码所需框架序列的合适表达载体中。下面描述了其他方法。
121.在第二方面，本发明涉及与根据第一方面的抗体识别相同表位的抗体。
122.通常，并且如本领域通常已知的，抗体是属于免疫球蛋白的蛋白质家族的蛋白质，并且其可变区包含如上定义的框架区和互补决定区。自然地，抗体是由浆细胞对某种抗原作出反应而产生的。一般来说，每个抗体都有两个相同的重链免疫球蛋白和两个相同的轻链免疫球蛋白。每个重链和每个轻链可具有可变区和恒定区。重链的恒定区可能是五种哺乳动物ig重链中的一种：α、δ、ε、γ和μ。重链的类型通常定义抗体的类别(同种型)：iga、igd、ige、igg和igm抗体。类似地，轻链的恒定区可能是哺乳动物ig轻链的两种类型之一：κ和λ。重链和轻链的可变区通常由许多蛋白质序列的独特组合构成，允许与特定抗原结合。
123.根据本发明，术语“抗体”还包括分离的抗体。
124.通常，每条重链与轻链中的一条连接，由此重链和轻链的可变区组合形成两个相同的抗原结合位点之一，并且它们的恒定区组合形成抗体的恒定区。此外，一条重链和一条轻链的两种构建体可通过其重链的恒定区连接，形成“y”形分子，其中两条臂描绘抗原结合可变区，茎描绘恒定区。
125.根据第二方面的抗体可以是完整的抗体，这意味着它通常包括三个或四个恒定结构域的重链和一个恒定结构域的轻链以及相应的可变结构域，其中每个结构域可以包括其他修饰，例如突变、缺失或插入，这不会改变整个结构域结构。
126.此外，根据本发明第二方面的抗体可以形成同二聚体或异二聚体或同源或异源多聚体，其中“二聚体”和“多聚体”分别表示两种和至少三种抗体可以组合形成复合物。前缀“homo”表示复合物可以由相同的抗体分子形成，前缀“hetero”表示复合物可以由不同的抗体分子形成。
127.通常，术语“抗体”旨在包括所有上述免疫球蛋白同种型，即抗体可以是iga，igd，ige，igg或igm抗体，包括这些同种型的任何亚类。优选地，抗体是igg抗体。由于抗体可以重组表达和产生，抗体还可以包含两个不同的重链恒定区，例如一个igg1和一个igg2重链，或来自不同物种的重链。然而，重链优选来自相同物种。另外，抗体可包含λ或κ轻链。
128.与本发明的第一方面的抗体之一识别相同表位的抗体还可以是一种抗体，其包含含有互补决定区cdrh1，cdrh2和cdrh3的重链可变区，和含有互补决定区cdrl1，cdrl2和cdrl3的轻链可变区，其中cdrh1，cdrh2，cdrh3，cdrl1，cdrl2和cdrl3分别包含氨基酸序列gftfssfgmh(seq id no：1)、yissgsgnfyyvdtvkg(seq id no：43)、styyhgsrgamdy(seq id no：3)、sasssvssmywy(seq id no：4)、dtskmas(seq id no：5)和qqwssyppit(seq id no：6)。
129.此外，与本发明第一方面抗体之一识别相同表位的抗体可以是其中cdr与上述序列相比具有至少一个保守氨基酸交换的抗体，例如，用化学结构、性质和/或功能与原氨基酸相似的氨基酸。
130.与本发明第一方面的抗体之一相比，与本发明第一方面的一种抗体识别相同的表位的抗体也可以是亲和力或特异性增加或降低的抗体。通过本领域已知并在下文进一步描述的方法容易获得此类抗体。
131.通常，根据本发明第二方面的抗体可具有序列，尤其是在其可变区中，其与由以iclc pd n
°
16001保藏的杂交瘤细胞产生的单克隆小鼠抗体至少75％，80％，85％，90％，95％或100％(例如，至少86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99％)相同。
132.在一些实施方式中，小鼠抗体包含可变重链，其氨基酸序列与seq idno：7具有60-100％序列相同性，例如与dvqlvesggglvqpgsrklscvasgftfsfgmhwvrqapeglewvayissgnfyyvdtvkgrftisrdnpkntlflqmtslrsedtamyycarstyyghsgrggqgtsvtvs(seq id no：7)具有70-100％、80-100％、85-100％、90-100％、95-100％、97-100％，或99-100％的序列相同性。在一些实施方式中，小鼠抗体包含与seq id no：7具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，小鼠抗体包含与seq id no：7具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，小鼠抗体包含与seq id no：7具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，小鼠抗体包含与seq id no：7具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，小鼠抗体包含与seq id no：7具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，小鼠抗体包含与seq id no：7具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，小鼠抗体包含与seq id no：7具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，小鼠抗体包含与seq id no：7具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，小鼠抗体包含与seq id no：7具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，小鼠抗体包含与seq id no：7具有100％序列相同性的氨基酸序列。
133.在一些实施方式中，小鼠抗体包含可变轻链，其氨基酸序列与seq id no：12具有60-100％序列相同性，例如与qialtqspaimsaspgekvtmtcsasssvssmywyqlkpgssprlliydtskmasgvpirfsgsgsgtsfsltvsrveaedaatyycqqwssyppitfgagsklelk(seq id no：12)具有70-100％、80-100％、85-100％、90-100％、95-100％、97-100％，或99-100％的序列相同性。在一些实施方式中，小鼠抗体包含与seq id no：12具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，小鼠抗体包含与seq id no：12具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，小鼠抗体包含与seq id no：12具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，小鼠抗体包含与seq id no：12具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，小鼠抗体包含与seq id no：12具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，小鼠抗体包含与seq id no：12具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，小鼠抗体包含与seq id no：12具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，小鼠抗体包含与seq id no：12具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，小鼠抗体包含与seq id no：12具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，小鼠抗体包含与seq id no：12具有100％序列相同性的氨基酸序列。
134.在一些实施方式中，小鼠抗体包含可变重链和可变轻链，可变重链的氨基酸序列与seq id no：7具有60-100％序列相同性，例如与dvqlvesggglvqpggsrklscvasgftfssfgmhwvrqapekglewvayissgsgnfyyvdtvkgrftisrdnpkntlflqmtslrsedtamyycarstyyhgsrgamdywgqgtsvtvss(seq id no：7)具有70-100％、80-100％、85-100％、90-100％、95-100％、97-100％，或99-100％的序列相同性，可变轻链的氨基酸序列与seq id no：12具有60-100％序列相同性，例如与qialtqspaimsaspgekvtmtcsasssvssmywyqlkpgssprlliydtskmasgvpirfsgsgsgtsfsltvsrveaedaatyycqqwssyppitfgagsklelk(seq id no：12)具有70-100％、80-100％、85-100％、90-100％、95-100％、97-100％，或99-100％的序列相同性。
135.6.3.2.umg1单特异性，双特异性和多特异性抗体
136.通常，根据本发明的抗体可以是单克隆抗体，双特异性抗体或多特异性抗体。这类抗体是本领域已知的。
137.如在本发明的上下文中使用的，术语“单克隆”可以在最广泛的意义上理解为描述由单个b淋巴细胞克隆产生的抗体或具有相同或类似氨基酸序列的抗体。
138.本文使用的术语“双特异性”可以在最广泛的意义上理解为描述与两个不同表位相互作用的抗体。双特异性抗体可以衍生自两个单克隆抗体。任选地，这两个不同的表位可能定位在同一抗原上，但也可能定位在两个不同的抗原上。
139.本文使用的术语“多特异性”可以在最广泛的意义上理解为描述与三个或更多不同类型表位相互作用的抗体。任选地，这些表位可以定位在同一抗原或两个或更多个抗原上。
140.优选地，根据本发明的方面2的抗体是单克隆抗体。
141.此外，根据本发明方面2的抗体优选为双特异性或多特异性抗体。
142.本领域技术人员熟知制备抗体的方法。优选地，通过制造杂交瘤细胞产生抗体。本领域技术人员熟知用于生产杂交瘤细胞的方法以及用于借助杂交瘤细胞生产抗体的方法。
通常，给小鼠注射所需抗原并在几天后杀死，以分离针对所需抗原分泌抗体的脾细胞。一般来说，这些分泌抗体的脾细胞与永生化非分泌骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞。然后通常筛选这些杂交瘤细胞，并选择产生所需抗体的杂交瘤。然后可在体内或体外培养所选杂交瘤，并可分离所需抗体。
143.双功能或双特异性抗体可具有不同特异性的抗原结合位点。本领域技术人员熟知各种形式的双特异性抗体及其制备。例如，这些包括bsigg，其是包含两条不同的重链和两条不同的轻链的igg分子，其由所谓的“杂交杂交瘤”分泌，和通过不同特异性的抗体或抗体片段的化学偶联产生的异源抗体偶联物(segal dm等，current opin.immunol.1999，11：558-562；van spriel ab等，immunology today 2000，21：391-397，其各自通过引用全文纳入本文)。
144.制备：可以产生双特异性抗体以将细胞，细胞毒素或药物递送至特定位点。重要的用途可以是将宿主细胞毒性细胞(例如nk或细胞毒性t细胞)递送至特定细胞靶标(p.j.lachmann，clin.exp.immunol.1990，79：315，其通过引用全文纳入本文)。另一个重要用途可以是将细胞毒性蛋白质递送至特定细胞靶标(v.raso，t.griffin，cancer res.1981，41：2073；s.honda等，cytotechnology，1990，4：59，其各自通过引用全文纳入本文)。另一个重要用途可以是将抗癌非蛋白质药物递送至特定细胞靶标(j.corvalan等，intl.j.cancer suppl.1988，2：22；m.pimm等，british j.of cancer 1990，61：508，其各自通过引用全文纳入本文)。这种双特异性抗体可以通过化学交联(m.brennan等，11985，science229：81；其全文通过引用纳入)、二硫键交换或杂交瘤(四倍体)的产生来制备。可以通过融合针对两种不同抗原分泌两种不同类型抗体的杂交瘤来构建四源杂交瘤(milstein和cuello，nature，1983，305：537-539，其通过引用全文纳入本文)。
145.在本发明的上下文中使用的术语“表位”可以在最广义上理解为能够被由以iclc pd n
°
16001保藏的杂交瘤细胞产生的抗体在一个或多个抗体的抗原结合区处识别并结合的cd43分子的一部分。抗体中与表位结合的部分称为副表位。在许多情况下，表位具有构象特性，特异性生成副表位结合位点。
146.表位通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成且通常有特定的三维结构性质以及特定的电荷性质。
147.此外，本领域技术人员知晓并理解，表位和抗体之间的相互作用通常可以基于抗原的一级结构，即氨基酸的连续序列。通常，这种相互作用也可能基于表位的二级结构、三级结构或四级结构以及翻译后修饰，例如糖基化。表位和抗体之间的相互作用还可以基于抗原的三维结构和由此产生的抗原表面特征，这可能涉及氨基酸序列的不连续部分，其包含位于远处的与抗体相互作用的氨基酸。
148.当两种抗体识别相同或空间上重叠的表位时，抗体识别与第一方面的抗体“相同的表位”。一般来说，用于确定两个表位是否识别相同或空间重叠表位的最广泛和快速的方法是竞争分析，通常可以使用标记抗原或标记抗体以各种不同的形式配置。例如，抗原固定在96孔板上，然后，未标记抗体阻断标记抗体结合的能力使用放射性或酶标记进行测量。
149.与根据第一方面的抗体识别“相同表位”的抗体通常指在竞争分析中阻断参考抗体与其抗原结合50％或更多的抗体，并且相反，参考抗体通常在竞争分析中阻断该抗体与其抗原结合50％或更多。
150.通常，由以iclc pd n
°
16001保藏的杂交瘤细胞产生的抗体识别并结合的表位可以通过本领域已知的任何合适的表位作图方法与由以iclc pd n
°
16001保藏的杂交瘤细胞产生的抗体组合鉴定。
151.这种方法的实例包括针对结合由以iclc pd n
°
16001保藏的杂交瘤细胞产生的抗体对衍生自cd43的不同长度的肽进行筛选，其中可以特异性结合抗体的最小片段通常含有被抗体识别的表位序列。通常，cd43肽可以通过合成产生或通过蛋白水解消化cd43产生。本领域技术人员熟知用于识别与抗体结合的肽的方法，例如质谱分析。在另一实例中，nmr光谱可用于识别与本发明抗体相互作用的残基。例如，已一致地被
15
n和2h标记的cd43肽可与未标记抗体混合，且当其在nmr光谱中的位置改变时，可检测到标记肽中与未标记抗体相互作用的那些氨基酸。通常，两个光谱之间的差异可以识别cd43中与抗体相互作用有关的氨基酸。优选地，质谱分析用于识别与抗体结合的肽。
152.示例性地，由以iclc pd n
°
16001保藏的杂交瘤细胞产生的抗体识别并结合的表位也可以通过包括以下的方法鉴定：聚合酶链式反应(pcr)扩增cd43 dna的各种dna片段，整合这些片段形成包括它们与组氨酸融合蛋白的连接的表达载体，并且在蛋白质表达后，检测表位，例如通过western印迹。
153.在另一个实例中，为了确定由以iclc pd n
°
16001保藏的杂交瘤细胞产生的抗体识别并结合的cd43上的位点，可以通过pcr方法引入具有缺失突变的cd43克隆的表达载体以制备突变系列，如大肠杆菌(e.coli)突变体系列，其表达在cd43中具有各种缺失位点的蛋白质。可培养这些大肠杆菌突变体并诱导表达。可以使用细胞裂解物作为抗原进行western印迹分析。
154.用于鉴定由以iclc pd n
°
16001保藏的杂交瘤细胞产生的抗体识别和结合的表位的其他方法可包括通过免疫测定法检测，例如酶联免疫吸附测定法(elisa)。
155.在本发明的上下文中使用的术语“亲和力”可以在最广义上理解为表位和抗体的表位结合位点之间的相互作用的强度。确定抗体亲和力的绝对值，即亲和常数的方法是本领域技术人员熟知的。然而，通常也可以确定抗体亲和力的相对值，即在不确定其绝对值的情况下比较两种抗体的亲和力。本领域技术人员熟知比较抗体亲和力的方法。例如，可以使用流式细胞术，由此具有所需表位的细胞可以独立地与不同的抗体接触，这些抗体随后用免疫荧光二抗标记。通常，在用流式细胞术检测后，可以比较抗体信号的强度。
156.筛选方法：鉴定根据第二方面的抗体的方法是本领域技术人员熟知的，该抗体与根据第一方面的抗体识别相同的表位。例如，可通过基于抗体文库的噬菌体展示来识别根据第二方面的抗体。
157.因此，识别相同表位的本发明的抗体也可以是人抗体。
158.在另一个优选的实施方式中，根据第二方面的抗体是嵌合抗体。在一个更优选的实施方式中，根据第二方面的抗体是根据第一方面的嵌合抗体。
159.嵌合抗体是这样的抗体，其中通过基因工程将一个物种的免疫球蛋白的至少一个区域与另一物种的免疫球蛋白的另一区域融合以降低其免疫原性(参见，例如，美国专利号4,816,567和美国专利号4,816,397)。
160.6.3.3.人源化umg1抗体
161.在另一个优选的实施方式中，根据第二方面的抗体是人源化抗体。在一个更优选
的实施方式中，根据第二方面的抗体是根据第一方面的抗体的嵌合或人源化抗体。
162.通常，人源化抗体是特定类型的嵌合抗体。例如，人源化抗体可通过将人类抗体的dna移接到编码小鼠抗体框架的dna中或通过将小鼠抗体的dna移接到编码人类抗体框架的dna中来产生。优选地，将人类抗体的dna移接到编码小鼠抗体框架的dna中。一般来说，dna的移接包括将一个或多个dna序列移接到编码目标抗体框架的dna中。可选地，可变和恒定区以及重链和轻链可以部分或完全人源化。优选地，将小鼠抗体的重链可变区和轻链可变区人源化。更优选地，通过改变编码1至50、优选1至30、更优选1至20个氨基酸的dna序列，将小鼠抗体的重链可变区和轻链可变区人源化。被移接的dna中通常可包含确定抗原特异性的六个高变环的dna区域，也称为互补性确定区域(cdr)，或不包含cdr的dna区域，或两者兼而有之。优选地，人源化包括移接不包含cdr的dna。
163.通常，所得dna构建体然后可用于表达和产生与非人类亲本抗体相比通常较低或不具有免疫原性的抗体。这包括生产修饰抗体，如无糖基化抗体或去岩藻糖基化抗体。这些方法是本领域熟知的。因此，识别相同表位的本发明抗体也可以是非糖基化抗体或非岩藻糖基化抗体。
164.6.3.4.工程化的人源化抗体
165.本发明还提供识别cd43的工程化人源化抗体。h-umg1抗体可包含分别在seq id no：8-11和seq id no：13-16中提供的一个或多个可变重链区或轻链区。本领域技术人员可以通过对本发明提供的氨基酸残基进行一个或多个保守取代来生成各种实施方式。
″
保守取代
″
或
″
保守氨基酸取代
″
指以化学或功能相似的氨基酸取代氨基酸。
166.在一些实施方式中，抗体是igg1、igg2、igg4或igm。在一些实施方式中，抗原结合蛋白是fv片段、fab片段、f(ab
′
)2片段、fab
′
片段、scfv片段、scfv fc片段和/或单域抗体。
167.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8具有60-100％序列相同性，例如与evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssfgmhwvrqapgkglewvsyissgsgnfyyvdtvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycarstyyhgsrgamdywgqgtlvtvss(seq id no：8)具有70-100％、80-100％、85-100％、90-100％、95-100％、97-100％，或99-100％的序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seqid no：8具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8具有100％序列相同性的氨基酸序列。
168.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9具有60-100％序列相同性，例如与evqlvesggglvqpggslrlscvasgftfssfgmhwvrqapgkglewvsyissgsgnfyyvdtvkgrftisr
dnaknslylqmnslraedtavyycarstyyhgsrgamdywgqgtlvtvss(seq id no：9)具有70-100％、80-100％、85-100％、90-100％、95-100％、97-100％，或99-100％的序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seqid no：9具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9具有100％序列相同性的氨基酸序列。
169.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10具有60-100％序列相同性，例如与evqlvesggglvqpggslrlscvasgftfssfgmhwvrqapgkglewvayissgsgnfyyvdtvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycarstyyhgsrgamdywgqgtlvtvss(seq id no：10)具有70-100％、80-100％、85-100％、90-100％、95-100％、97-100％，或99-100％的序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10具有100％序列相同性的氨基酸序列。
170.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11具有60-100％序列相同性，例如与qvqlvesgggvvqpggslrlscvasgftfssfgmhwvrqapgkglewvayissgsgnfyyvdtvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstyyhgsrgamdywgqgtlvtvss(seq id no：11)具有70-100％、80-100％、85-100％、90-100％、95-100％、97-100％，或99-100％的序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：
11具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11具有100％序列相同性的氨基酸序列。
171.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：13具有60-100％序列相同性，例如与eivltqspatlslspgeratlscsasssvssmywyqqkpglaprlliydtskmasgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqwssyppitfgqgtrleik(seq id no：13)具有70-100％、80-100％、85-100％、90-100％、95-100％、97-100％，或99-100％的序列相同性的氨基酸序列。
172.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：13具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：13具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：13具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：13具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：13具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：13具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：13具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：13具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：13具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：13具有100％序列相同性的氨基酸序列。
173.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：14具有60-100％序列相同性，例如与eialtqspatlslspgeratlscsasssvssmywyqlkpglaprlliydtskmasgipirfsgsgsgtdftltvsrvepedfavyycqqwssyppitfgqgtrleik(seq id no：14)具有70-100％、80-100％、85-100％、90-100％、95-100％、97-100％，或99-100％的序列相同性的氨基酸序列。
174.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：14具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：14具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：14具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：14具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：14具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：14具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：14具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：14具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：14具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：14具有100％序列相同性的氨基酸序列。
175.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：15具有60-100％序列相同性，例如与qvvmtqspaflsvtpgekvtitcsasssvssmywyqqkpdqapklliydtskmasgvpsrfsgsgsgtdftftissleaedaatyycqqwssyppitfgggtkveik(seq id no：15)具有70-100％、80-100％、85-100％、90-100％、95-100％、97-100％，或99-100％的序列相同性的氨基酸序列。
176.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：15具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：15具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：15具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：15具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：15具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：15具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：15具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：15具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：15具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：15具有100％序列相同性的氨基酸序列。
177.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：16具有60-100％序列相同性，例如与qvvmtqspaflsvtpgekvtitcsasssvssmywyqlkpdqapklliydtskmasgvpirfsgsgsgtdftftvssveaedaatyycqqwssyppitfgggtkveik(seq id no：16)具有70-100％、80-100％、85-100％、90-100％、95-100％、97-100％，或99-100％的序列相同性的氨基酸序列。
178.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：13具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：13具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：13具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：13具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：13具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：13具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：13具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：13具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：13具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：13具有100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：13具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：13具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：13具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：13具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和
seq id no：13具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：13具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：13具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：13具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：13具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：13具有100％序列相同性的氨基酸序列。
179.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：14具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：14具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：14具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：14具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：14具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：14具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：14具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：14具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：14具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：14具有100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：14具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：14具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：14具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：14具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：14具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：14具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：14具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：14具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：14具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：14具有100％序列相同性的氨基酸序列。
180.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：15具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：15具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：15具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方
式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：15具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：15具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：15具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：15具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：15具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：15具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：15具有100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：15具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：15具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：15具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：15具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：15具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：15具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：15具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：15具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：15具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：15具有100％序列相同性的氨基酸序列。
181.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no∶8和seq id no：16具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：16具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：16具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：16具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：16具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：16具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：16具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：16具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：16具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：16具有100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：16具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：16具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实
施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：16具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：16具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：16具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：16具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：16具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：16具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：16具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：8和seq id no：16具有100％序列相同性的氨基酸序列。
182.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：13具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：13具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：13具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：13具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：13具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：13具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：13具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：13具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：13具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：13具有100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：13具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：13具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：13具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：13具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：13具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：13具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：13具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：13具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：13具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：13具有100％序列相同性的氨基酸序列。
183.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：14具有60％或
更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：14具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：14具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：14具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：14具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：14具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：14具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：14具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：14具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：14具有100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：14具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：14具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：14具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：14具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：14具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：14具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：14具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：14具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：14具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：14具有100％序列相同性的氨基酸序列。
184.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：15具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：15具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：15具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：15具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：15具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：15具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：15具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：15具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：15具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：15具
有100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：15具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：15具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：15具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：15具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：15具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：15具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：15具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：15具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：15具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：15具有100％序列相同性的氨基酸序列。
185.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：16具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：16具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：16具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：16具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：16具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：16具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：16具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：16具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：16具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：16具有100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：16具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：16具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：16具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：16具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：16具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：16具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：16具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：16具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：16具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq id no：16具有100％序列相同性的氨基酸序列。
186.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：13具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：13具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：13具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：13具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：13具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：13具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：13具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：13具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：13具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：13具有100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：13具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：13具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：13具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：13具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：13具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：13具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：13具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：13具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：13具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：13具有100％序列相同性的氨基酸序列。
187.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：14具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：14具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：14具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：14具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：14具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：14具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：14具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：14具有99％或更高序列相同性的氨基
酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：14具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：14具有100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：14具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：14具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：14具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：14具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：14具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：14具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：14具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：14具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：14具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：14具有100％序列相同性的氨基酸序列。
188.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：15具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：15具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：15具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：15具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：15具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：15具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：15具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：15具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：15具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：15具有100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：15具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：15具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：15具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：15具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：15具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：15具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：10和seq id no：15具有97％或更高
id no：11和seq id no：14具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：14具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：14具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：14具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：14具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：14具有100％序列相同性的氨基酸序列。
192.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：15具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：15具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：15具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：15具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq idno：15具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：15具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq idno：15具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：15具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：15具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：15具有100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：15具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：15具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：15具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：15具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：15具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：15具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：15具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：15具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：15具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：9和seq idno：15具有100％序列相同性的氨基酸序列。
193.在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：16具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：16具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：16具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方
式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：16具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：16具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：16具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：16具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：16具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：16具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：16具有100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：16具有60％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：16具有70％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：16具有80％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：16具有85％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：16具有90％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：16具有95％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：16具有97％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：16具有99％或更高序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：16具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，h-umg1抗体包含与seq id no：11和seq id no：16具有100％序列相同性的氨基酸序列。
194.在另一个优选的实施方式中，根据方面2的抗体的单克隆抗体能够诱导针对以下细胞的抗体依赖性细胞毒性(adcc)：t细胞急性淋巴细胞白血病(t-all)的egil t3亚组，t细胞淋巴母细胞淋巴瘤细胞和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(wm)细胞。
195.淋巴细胞属于白细胞群，是体液和细胞介导免疫的介质。有两组淋巴细胞，b细胞和t细胞。
196.就像许多其他细胞类型一样，b细胞和t细胞可以异常发育成b细胞和t细胞肿瘤。由于b细胞和t细胞的发育有许多不同的阶段，因此存在各种类型的肿瘤。b细胞和t细胞都起源于淋巴前体细胞。
197.在b细胞的情况下，这种淋巴祖细胞发育经历许多b细胞发育阶段，每个阶段都包含某种可定义的细胞类型，直到形成浆细胞。其中一个阶段包括所谓的“分泌igm的b细胞”，它最终发育为产生抗体的浆细胞。起源于“分泌igm的b细胞”的肿瘤称为“瓦尔登斯特罗姆巨球蛋白血症”(wm)。wm是一种罕见的、懒惰的、不可治愈的疾病。其特征是骨髓中聚集分泌克隆性igm的淋巴浆细胞。
198.t细胞仅在少数发育阶段从淋巴祖细胞发育成成熟t细胞。肿瘤可以特别地从成熟t细胞或淋巴祖细胞进化，后者分别导致b细胞或t细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)和(t-all)。t细胞表型t-all占所有急性淋巴细胞白血病病例的约20％，并且在成人中比在儿童
中更常发生。t-all与t细胞淋巴母细胞淋巴瘤(t-lbl)密切相关，两种疾病之间的区分性诊断基于特定部位的普遍定位，例如t-all中的骨髓或t-lbl中的二级淋巴器官。欧洲白血病免疫学特征研究小组(egil)根据t-all的免疫表型将其分为四个亚组(bene mc，leukemia 1995；9：1783)：
199.1)egil t1(pro-)，以cd3(ccd3)胞浆阳性和cd7表面表达为特征；
200.2)egil t2(pre-)，以cccd3，cd7阳性和cd2或cd5阳性为特征；
201.3)egil t3(皮质)，以ccd3，cd1a阳性和表面cd3(scd3)的存在或缺失为特征，和
202.4)egil t4(成熟白血病)，其特征在于ccd3和scd3阳性和cd1a阴性。
203.如本文所用，术语“抗体依赖性细胞毒性(adcc)”是通过细胞毒性效应细胞(例如天然杀伤(nk)细胞)杀死由抗体结合并标记的细胞。
204.为了检查抗体是否能够诱导adcc，可以使用以下测定。在不同抗体浓度下，通过将来自健康供体(包括效应细胞)的外周血单核细胞(pbmc)与表达表位的靶细胞共同培养，进行脱颗粒试验。4
×
104个靶细胞接种于96孔圆形底板中，在37℃5％co2条件下，在不同浓度抗体(0、10、50、100和200μg/ml)或对照igg1存在下培养30分钟。随后，将来自同一供体的0.4
×
106个pbmc(固定效应细胞(e)∶靶细胞(t)＝10∶1)与20μl/ml藻红蛋白(pe)偶联的抗cd107a单克隆抗体(mab)(bd)一起添加到每个孔中，然后将细胞在37℃5％co2下孵育3小时。1小时后，向每个孔(golgistop，bd)中加入6μg/ml莫能菌素。在孵育期结束时，用别藻蓝蛋白(apc)偶联的抗cd56和周苷叶绿素蛋白复合物(percp)偶联的抗cd3对细胞进行染色，并在attune nxt流式细胞仪(thermo scientific)上进行分析。通过检测cd3-/cd56 /cd107a 细胞，测量诱导靶细胞裂解(cd107a )的nk细胞(cd3-/cd56 )。因此，随着抗体浓度的增加，cd3-/cd56 /cd107a 细胞的增加证实了抗体诱导adcc的潜力。得到的数据允许设计免疫靶向方法，这是，例如t细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴母细胞淋巴瘤的迫切和未满足的临床需求。还可以使用本领域技术人员熟知的用于检测抗体是否能够诱导adcc的其他方法。
205.6.3.5.umg1结合分子
206.在第三方面，本发明提供衍生自根据方面1或方面2的umg1抗体的结合分子。
207.根据本发明，结合分子是衍生自由以iclc pd n
°
16001保藏的杂交瘤细胞产生的单克隆小鼠umg1抗体的分子。优选地，结合分子是包含免疫球蛋白的分子，即，其包含至少一个免疫球蛋白(ig)结构域。
208.在优选的实施方式中，本发明的结合分子选自单链抗体。在更优选的实施方式中，结合分子选自下组：单链可变片段(scfv)、scfv的多聚体(例如双抗体、三抗体或四抗体)、抗体片段、优选fab、tandab和柔性体。
209.抗体的结构，尤其是其cdr的功能通常是本领域熟知的(carter pj.设计的有效抗体疗法(potent antibody therapeutics by design).nature rev.immunol.6：343-357，2006，其通过引用全文纳入本文)。单链fv(scfv)及其多聚体，tandab，双抗体和柔性体通常是本领域已知的标准抗体形式，例如，来自wo1988/001649a1，wo1993/011161a1，wo1999/057150a2和ep1293514b1，其各自通过引用全文纳入本文。
210.在scfv中，抗体的轻链和重链(vh fv和vl fv)的两个抗原结合可变区通常由接头肽人工连接，指定为单链可变片段或单链抗体(bird等，(1988)science 242：423-426；orlandi等，(1989)proc natl acad sci usa 86：3833-3837；clarkson等，nature 352：
624-628(1991)，其各自通过引用全文纳入本文)。抗原结合位点可以由单克隆抗体轻链和重链的可变结构域组成。几项研究表明，scfv片段可能确实与整个抗体的一个结合位点具有完全的内在抗原结合亲和力。
211.在本发明的上下文中，双抗体是具有两种结合特异性的scfv，并且可以是单特异性的和二价的或双特异性的和二价的。
212.tandab和柔性体是其他抗体形式，例如，其分别在us2007031436和ep1293514b1中定义，其通过引用全文纳入本文。
213.包含蛋白质独特型的抗体片段可以通过本领域已知的技术生成。例如，这些片段包括但不限于，可以通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的f(ab
′
)2片段；可以通过还原f(ab
′
)2片段的二硫桥产生的fab
′
片段；可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而产生的fab片段；和fv片段。
214.6.3.6.抗体-药物偶联物(adc)
215.本发明的抗体或结合分子可以进一步与活性物质连接，优选毒素，纳米颗粒，细胞因子或放射性核苷酸。此类抗体药物偶联物(adc)是本领域已知的(wu am，senter pd.nature biotechnol.23：1137-1146，2005，pastan等，annu.rev.med.58：221-237，2007，wo 1990/012592 a1，wo 2007/030642 a2，wo 2004/067038 a1，wo 2004/003183 a1，us 2005/0074426 a1，wo 1994/004189a1；其各自通过引用全文纳入本文)。还参见yaghoubi等，“用于癌症治疗的抗体-药物偶联物(adc)结构中的潜力药物(potential drugs used in the antibody-drug conjugate(adc)architecture for cancer therapy)，”j cell physiol.2019年6月18日.doi：10.1002/jcp.28967.[印刷前电子出版]；arlotta等，“抗体和抗体衍生物作为癌症疗法(antibody and antibody derivatives as cancer therapeutics)，”wiley interdiscip rev nanomed nanobiotechnol.2019年4月9日：e1556.doi：10.1002/wnan.1556.[印刷前电子出版]；wolska-washer等，“抗体药物偶联物在癌症中的安全性和耐受性(safety and tolerability of antibody-drug conjugates in cancer)，”drug saf.2019年2月；42(2)：295-314；johnston等，“抗体偶联纳米颗粒作为抗体药物偶联物化疗的新形式(antibody conjugated nanoparticles as a novel form of antibody drug conjugate chemotherapy)，”drug discov today technol.2018，30：63-69；lyon，“从抗体药物偶联物的临床发展中吸取教训(drawing lessons from the clinical development of antibody-drug conjugates)，”drug discov today technol.2018年12月；30：105-109；和abdollahpour-alitappeh等，“用于癌症治疗的抗体-药物偶联物(adc)：策略、挑战和成功(antibody-drug conjugates(adcs)for cancer therapy：strategies，challenges，and successes)，”j cell physiol.2019年5月；234(5)：5628-5642，其各自公开内容通过引用纳入本文。
[0216]
在各种实施方式中，结合分子与治疗剂(即药物)偶联以形成结合分子-药物偶联物。治疗剂包括但不限于化疗剂、显像剂(如放射性同位素)、免疫调节剂(如细胞因子、趋化因子或检查点抑制剂)和毒素(如细胞毒性剂)。在某些实施方式中，如下文第6.7.3节所详述，治疗剂通过接头肽连接到结合分子。
[0217]
制备抗体-药物偶联物(adc)的方法，所述抗体-药物偶联物(adc)可适于将药物偶联到本文公开的结合分子描述于，例如，美国专利号8,624,003(一锅法)，美国专利号8,
18(4))；在多个实施方式中，car是第三代car(pul
è
等，(2005)molther.12(5)；geiger等，blood(2001)98；wilkie等，(2008)j immunol.180(7))；在多个实施方式中，car是第四代trucks car(chmielewski等，cancer res(2011)71.)；在多个实施方式中，car是武装car代car(pegram等，(2012)blood 119；curran等，(2015)molther.2015年4月；23(4))；在多个实施方式中，car是工程化共刺激的一代car(zhao等(2015)cancer cell 28)；在多个实施方式中，car是synnotch/顺序and门选代car(roybal等，(2016)cell 164)；在多个实施方式中，car是顺式和反式共刺激的一代car(stephan等，(2007)nat med 13(12))；在多个实施方式中，car是双靶向的一代car(wilkie等，(2012)j clin immunol.32(5))；在多个实施方式中，car是组合的car/and门选代car(kloss等，(2013)nat biotechnol 31(1))；在多个实施方式中，car是tancar代car(ahmed等，(2013)molther nucleic acids.2：e105)；在多个实施方式中，car是go-cart代car(foster等，(2014))；其公开内容通过引用全文纳入本文。
[0225]
在特定实施方式中，car是pcar，如美国授权前公开us 2019/0002521中所述，其全文通过引用并入本文。
[0226]
6.3.7.2.具有主要细胞内信号转导结构域(primary intracellular signalingdomain)的car构建体(car-umg1)
[0227]
在一些实施方式中，car构建体包含主要细胞内信号转导结构域。当例如抗原结合结构域融合的细胞外结构域与同源抗原结合时，主要细胞内信号结构域产生细胞内信号。主要细胞内信号转导结构域源自主要刺激分子，例如，它包含主要刺激分子的细胞内序列。主要细胞内信号转导结构域包括足够的主要刺激分子序列，以产生细胞内信号，例如，当与之融合的抗原结合结构域结合同源抗原时。
[0228]
主要刺激分子是一种分子，在与同源配体结合后，介导免疫效应物反应，例如在其表达的细胞中。通常，它产生依赖于与包含抗原的同源配体结合的细胞内信号。tcr/cd3复合物是典型的主要刺激分子；它与同源配体结合时产生细胞内信号，例如，载有肽的mhc分子。通常，例如，在tcr/cd3主要刺激分子的情况下，主要细胞内信号转导结构域产生的细胞内信号取决于主要刺激分子与抗原的结合。
[0229]
主要刺激可介导某些分子表达的改变，例如tgf-β的下调和/或细胞骨架结构的重组等。
[0230]
例如，在存在共刺激的情况下，刺激可导致cart细胞的免疫效应功能的优化，例如增加。例如，在cart细胞的情况下，刺激可介导t细胞反应，例如增殖、激活、分化等。
[0231]
在一些实施方式中，主要细胞内信号转导结构域包含信号转导基序，例如，基于免疫受体酪氨酸的激活基序或itam。主要细胞内信号转导结构域可包含含有来自(例如)tcrζ(cd3 zeta，cdζ)、共同fcrγ(fcer1g)、fcγrlla、fcrβ(fcεrib)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b、cd278(也称为“icos”)、fcsri、dap10、dap 12和cd66d的细胞质信号转导序列的itam。
[0232]
主要细胞内信号转导结构域包含主要刺激分子(例如cd3 zeta、cd3ζ)的功能片段或类似物。主要细胞内信号转导结构域可包括整个细胞内区域或细胞内区域的片段，当其融合到的抗原结合结构域与同源抗原结合时，其足以产生细胞内信号。在一些示例中，主要细胞内信号转导结构域与天然产生的初级刺激分子的整个细胞内区域或足以产生细胞内信号的细胞内区域片段具有至少70、75、80、85、90、95、98或99％的序列相同性，所述天然产
生的初级刺激分子，例如是人，或其他哺乳动物，例如非人类物种，例如啮齿动物、猴、猿或鼠细胞内初级刺激分子。
[0233]
在一些实施方式中，主要细胞内信号转导结构域与天然产生的人类初级刺激分子(例如本文公开的自然产生的人类初级刺激分子)的整个细胞内区域，或足以产生细胞内信号的细胞内区域片段的相应残基具有至少70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％的相同性，或不超过30、25、20、15、10、5、4、3、2或1个氨基酸残基的差异。
[0234]
6.3.7.3.具有共刺激信号转导结构域的car构建体(car-umg1)
[0235]
在一些实施方式中，car构建体包括共刺激信号转导结构域，当其融合到的细胞外结构域(例如抗原结合结构域)结合同源配体时，该共刺激信号转导结构域产生细胞内信号。共刺激信号转导结构域来源于共刺激分子。所述共刺激信号转导结构域包括足够的主要共刺激分子序列，以产生细胞内信号，例如，当与之融合的细胞外结构域(例如抗原结合结构域)结合同源配体时。
[0236]
共刺激结构域可以是优化包括共刺激结构域的car的t细胞的性能(例如，持久性或免疫效应物功能)的结构域。
[0237]
共刺激分子是除抗原受体或其反配体以外的细胞表面分子，是促进免疫效应反应所需的。在某些情况下，它们是高效或增强免疫反应所必需的。通常，共刺激分子产生依赖于与同源配体结合的细胞内信号，在某些实施方式中，同源配体不是抗原，例如由cart细胞的抗原结合域识别的抗原。通常，来自主要刺激分子和共刺激分子的信号转导有助于免疫效应物反应，在某些情况下，这两种信号都是高效或增强免疫效应物反应产生所必需的。
[0238]
共刺激结构域包括共刺激分子(例如icos、cd28或4-1bb)的功能片段或类似物。其可包括整个细胞内区域或细胞内区域的片段，例如，当其融合到的抗原结合结构域与同源抗原结合时，其足以产生细胞内信号。在一些实施方式中，共刺激结构域与整个细胞内区域或足以产生细胞内信号的细胞内区域片段具有至少70、75、80、85、90、95、98或99％的序列相同性，所述细胞内信号结构域来自自然产生的共刺激分子，例如人，或其他哺乳动物，例如非人类物种，例如啮齿动物、猴、猿或鼠细胞内共刺激分子。
[0239]
示例性的共刺激结构域包括但不限于，选自以下的那些：cd27，cd27，cd28，4-1bb(cd137)，qx40，cd30，cd40，icqs(cd278)，icam-1，lfa-1(cdl1a/cd18)，cd2，cd7，light，nkg2c，b7-h3，与以下特异性结合的配体：cd8，cds，gitr，baffr，hvem(lightr)，slamf7，nkp80(klrf1)，cd160(by55)，cd19，cd4，cd8α，cd8β，il2rβ，il2rγ，il7rα，itga4，vla1，cd49a，itga4，ia4，cd49d，itga6，vla-6，c49f,itgad，cdlld，itgae，cd103，itgal，itgam，cdllb，itgax，cdllc，itgbl，cd29，itgb2，cd18，itgb7，tnfr2，trance/rankl，dnaml(cd226)，slamf4(c244，2b4)，cd84，cd96(tactile)，ceacaml，crtam，ly9(cd229)，psgll，cloo(sema4d)，cd69，slamf6(ntb-a，ly108)，slam(slamfl，cd150，ip0-3)，blame(slamf8)，selplg(cd162)，ltbr，lat，gads，和pag/cbp。
[0240]
在一些实施方式中，共刺激信号转导结构域与天然产生的人类共刺激分子(例如本文公开的天然产生的人类共刺激分子)的整个细胞内区域，或足以产生细胞内信号的细胞内区域片段的相应残基具有至少70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％的相同性，或不超过30、25、20、15、10、5、4、3、2或1个氨基酸残基的差异。
[0241]
6.3.7.4.包含嵌合抗原受体(car)的免疫效应细胞
[0242]
在第六方面中，本发明提供一种cd3 淋巴细胞、nk淋巴细胞、细胞因子诱导的杀伤(cik)细胞、γ-δ淋巴细胞、nkt细胞或另一种免疫效应细胞，其包含根据方面4的嵌合抗原-ch-umg1或根据方面5的表达载体。
[0243]
一般来说，cd3是一个由四条信号转导链组成的复合物，与功能性t细胞受体复合物中t细胞受体的α：β异二聚体相关联。t细胞受体信号转导通常需要cd3复合物。一般来说，cd3 淋巴细胞组只包含胸腺细胞和t细胞。例如，可通过流式细胞术检测cd3 细胞。
[0244]
6.3.8.双特异性t细胞接合剂(bite)
[0245]
t细胞重定向的两种主要方法涉及用嵌合抗原受体(car)进行遗传修饰，或使用称为双特异性t细胞接合剂(bite)的重组蛋白。
[0246]
本发明提供bite-umg1构建体的各种实施方式(huehls am等，“用于癌症免疫治疗的双特异性t细胞接合剂(bispecific t-cell engagers for cancer immunotherapy)”，immunol cell biol.2015年3月；93(3)：290-6；93(3)：290-6；zhukovsky ea等，“双特异性抗体和car：利用t细胞重定向的广义免疫疗法(bispecific antibodies and cars：generalized immunotherapeutics harnessing tcell redirection)”curr opin immunol.2016年6月；40：24-35)，其公开的全部内容通过引用并入本文。
[0247]
通常，bite是由两个单链可变片段(scfv)通过柔性接头串联而成。一个scfv与t细胞特异性分子(通常为cd3)结合，而第二scfv与肿瘤相关抗原结合。这种结构和特异性使bite能够将t细胞与肿瘤细胞物理连接起来，最终刺激t细胞活化、肿瘤杀伤和细胞因子的产生。
[0248]
在一些实施方式中，bite-umg1构建体靶向血液癌症。在一些实施方式中，bite-umg1构建体靶向实体瘤癌症类型。在一些实施方式中，bite-umg1构建体靶向实体瘤中的肿瘤相关巨噬细胞。
[0249]
6.4.cd43结合蛋白的药物组合物
[0250]
在第七方面中，本发明提供一种药物组合物，其包含根据方面1或2的单克隆umg1抗体或根据方面3的umg1结合分子或cd3 淋巴细胞、nk淋巴细胞、细胞因子诱导杀伤(cik)细胞、γ-δ淋巴细胞，nkt细胞或其他免疫效应细胞，根据方面6所述。
[0251]
如本文所用，术语“药物组合物”可与术语“药物”互换使用。
[0252]
在药物组合物的一些实施方式中，其为抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗体是单克隆的。在一些实施方式中，单克隆抗体是嵌合抗体。在一些实施方式中，单克隆抗体是人源化抗体。在一些实施方式中，单克隆抗体是人抗体。在一些实施方式中，药物组合物是抗体-药物偶联物。
[0253]
在多个实施方式中，药物组合物详述于美国专利号8,961,964，美国专利号8,945,865，美国专利号8,420,081，美国专利号6,685,940，美国专利号6,171,586，美国专利号8,821,865，美国专利号9,216,219，美国申请号10/813,483，wo 2014/066468，wo 2011/104381和wo 2016/180941，其各自通过引用全文纳入本文。
[0254]
6.5.制备方法
[0255]
本发明提供的umg1结合分子(抗体、蛋白质、抗原等)可使用本领域已知的标准方法制备。
[0256]
例如，umg1结合分子可以通过使用目前用于抗体制备的标准无细胞翻译、瞬时转染和稳定转染方法进行表达来制备。在特定实施方式中，expi293细胞(thermofisher)可用
于生产结合分子，使用来自thermofisher的方案和试剂，例如expifectamine，或本领域技术人员已知的其他试剂，例如聚乙烯亚胺，如fang等(biological procedures online，2017，19：11)详细描述，其全部内容并入本文。可以使用本领域已知的标准方法(例如，ch1亲和树脂，例如captureselect ch1树脂)和thermofisher提供的方案，容易地纯化表达的蛋白质。如本领域常规使用的，可使用离子交换色谱法完成进一步纯化。
[0257]
6.6.给药
[0258]
本发明提供的umg1药物组合物可通过任何合适的给药途径给药。合适的给药途径包括但不限于肠外给药，包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、腹腔内、鼻腔和肺部给药途径。
[0259]
6.7.组合疗法
[0260]
本发明还提供了组合疗法。在一些实施方式中，本文提供的药物组合物与另一种治疗性疗法结合使用。治疗性治疗可以是外科治疗、放射治疗、整体治疗、细胞治疗、组织再生或其他已知用于治疗细胞增殖疾病或癌症的药物组合物。
[0261]
在一些实施方式中，当本发明提供的药物组合物用于治疗组合时，治疗有效剂量不同。通过实验确定用于联合治疗方案的药物和其他药剂的治疗有效剂量的方法包括使用节律剂量，即通过提供更频繁、更低的剂量，以尽量减少毒性副作用。
[0262]
组合治疗方案包括如下治疗方案，其中在使用上述第二剂治疗之前、期间或之后开始给予本文所述化合物，并持续到使用第二剂治疗期间或使用第二剂治疗终止后的任何时间。此类方案还包括在治疗期间同时或在不同时间和/或以减少或增加的间隔给予本文所述化合物和组合使用的第二剂的治疗。
[0263]
组合治疗还包括在不同时间开始和停止的周期性治疗，以协助患者的临床管理。例如，本文所述的组合治疗中的化合物在治疗开始时每周给药一次，减少至每两周一次，并酌情进一步减少。
[0264]
6.8.制剂
[0265]
本发明还提供了各种umg1药物制剂，其包含有效量的umg1抗原、抗体或结合分子或蛋白质。
[0266]
在一些实施方式中，使用一种或多种生理上可接受的运载体以任何常规方式配制药物组合物，所述运载体包含有助于将活性化合物加工成可用于医药的制剂的赋形剂和助剂。正确的配方取决于选择的给药途径。任选地适当使用任何医药上可接受的技术、运载体和赋形剂作。包含umg1抗体或umg1结合分子的药物组合物以常规方式制造，例如，仅作为示例，通过常规混合、溶解、造粒、制备凝胶、粉碎、乳化、封装、包埋或压制过程。
[0267]
umg1药物组合物可任选地包括其他医用或药用试剂、运载体、佐剂，例如保存剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐、缓冲剂和/或其他有治疗价值的物质。制备包含本文所述化合物的组合物的方法包括用一种或多种惰性、医药上可接受的赋形剂或运载体配制化合物以形成固体、半固体或液体。
[0268]
组合物的固体制剂包括但不限于粉末、片剂、分散颗粒、胶囊、扁囊剂和栓剂。
[0269]
液体制剂组合物包括化合物溶解在其中的溶液、包含化合物的乳液、或包含脂质体、胶束或纳米颗粒的溶液，所述脂质体、胶束或纳米颗粒包含本文所公开的化合物。半固体组合物包括但不限于凝胶、悬浮液和乳膏。本文所述的药物组合物的形式包括液体溶液或悬浮液、适于在使用前在液体中溶解或悬浮的固体形式，或作为乳液。这些组合物还任选
地含有少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂等。
[0270]
药物组合物中抗体、结合分子或cd3 淋巴细胞的含量不受限制，只要对治疗或预防有用即可，但优选每种总组合物含有0.0000001-10％(按重量计)。此外，本文所述抗体、结合分子或cd3 淋巴细胞优选用于运载体中。运载体的选择可取决于给药途径和活性剂的浓度，且运载体可为冻干组合物或水溶液的形式。通常，在运载体中使用适当量的医药上可接受的盐以使组合物等渗。运载体的示例包括但不限于生理盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。优选地，可接受的赋形剂、运载体或稳定剂在所使用的剂量和浓度下是无毒的，包括缓冲液，例如柠檬酸盐、磷酸盐和其他有机酸；形成盐的反离子，例如钠和钾；低分子量(＞10个氨基酸残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白或明胶；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如组氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、天冬酰胺、精氨酸或甘氨酸；碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；单糖；双糖；其他糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；螯合剂，如edta；非离子表面活性剂，例如吐温、pluronics或聚乙二醇；抗氧化剂包括蛋氨酸、抗坏血酸和生育酚；和/或防腐剂，例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵、苯索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)。合适的运载体及其制剂在《雷明顿药物科学》，第17版，1985年，马克出版公司(mack publishing co.)中有更详细的描述。该组合物还可包含至少一种其他活性化合物，例如化疗剂。
[0271]
优选地，以有效量包含抗体、结合分子、cd3 淋巴细胞和/或活性化合物。术语“有效量”是指足以在将给药药物组合物的对象中诱导可检测的治疗反应的量。
[0272]
6.9.编码cd43结合蛋白的多核苷酸
[0273]
在第八方面中，本发明提供编码根据方面1或2的umg1抗体或根据方面3的umg1结合分子的核酸或多核苷酸。
[0274]
本文还提供编码抗体的多核苷酸，其例如通过密码子/rna优化、用异源信号序列替换和消除mrna不稳定元件来优化。通过在mrna中引入密码子变化和/或消除抑制区来产生编码抗体或其片段(例如，轻链、重链、vh结构域或vl结构域)以进行重组表达的优化核酸的方法可通过相应地调整所述优化方法来实施，例如，美国专利号5965726；6,174,666；6,291,664；6,414,132；以及6,794,498；其中各自都以引用的方式全部并入。例如，rna中的潜在剪接位点和不稳定元件(例如，富含a/t或a/u的元件)可以在不改变核酸序列编码的氨基酸的情况下发生突变，以增加rna用于重组表达的稳定性。这些改变利用了遗传密码的简并性，例如，使用一个相同氨基酸的替代密码子。在一些实施方式中，可以期望改变一个或多个密码子以编码保守突变，例如具有与原始氨基酸类似的化学结构和性质和/或功能的类似氨基酸。相对于由未优化的多核苷酸编码的抗体的表达，此类方法可将抗体或其片段的表达增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多。
[0275]
在某些实施方式中，编码本文所述抗体或其片段(例如，vl结构域和/或vh结构域)的优化多核苷酸序列可与编码本文所述抗体或其片段(例如，vl结构域和/或vh结构域)的未优化多核苷酸序列的反义(例如，互补)多核苷酸杂交。在特定实施方式中，编码本文所述抗体或片段的优化核苷酸序列在高严格性条件下与编码本文所述抗体或其片段的未优化多核苷酸序列的反义多核苷酸杂交。在特定实施方式中，编码本文所述抗体或其片段的优
化核苷酸序列在高、中或低严格杂交条件下与编码本文所述抗体或其片段的未优化核苷酸序列的反义多核苷酸杂交。关于杂交条件的信息已被描述，参见美国专利申请公开号us 2005/0048549(例如，第72-73段)。
[0276]
可以通过本领域已知的任何方法获得本发明的多核苷酸，并确定多核苷酸的核苷酸序列。编码本文所述抗体以及这些抗体的修改形式的核苷酸序列可以使用本领域众所周知的方法来确定，即，已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子以产生编码抗体的核酸的方式组装。这种编码抗体的多核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸组装而成(例如，如kutmeier g等，(1994)，biotechniques 17：242-6；其通过引用全部并入)，简单地说，包括合成包含编码抗体的序列部分的重叠寡核苷酸，对这些寡核苷酸进行退火和连接，然后通过pcr扩增连接的寡核苷酸。
[0277]
或者，编码本文所述抗体的多核苷酸可以使用本领域众所周知的方法(例如pcr和其他分子克隆方法)从来自合适来源(例如杂交瘤)的核酸生成。例如，可以使用从产生感兴趣抗体的杂交瘤细胞获得的基因组dna，使用可与已知序列的3’端和5’端杂交的合成引物进行pcr扩增。这种pcr扩增方法可用于获得包含编码抗体轻链和/或重链的序列的核酸。此类pcr扩增方法可用于获得包含编码抗体的可变轻链区域和/或可变重链区域的序列的核酸。扩增的核酸可被克隆到载体中，以在宿主细胞中表达，并用于进一步克隆，例如产生嵌合抗体和人源化抗体。
[0278]
如果含有编码特定抗体的核酸的克隆不可用，但抗体分子的序列已知，编码免疫球蛋白的核酸可以化学合成或从合适的来源获得(例如，抗体cdna文库，或由表达所述抗体的任何组织或细胞(例如选择表达本文所述抗体的杂交瘤细胞)产生的cdna文库，或从表达所述抗体的任何组织或细胞(例如选择表达本文所述抗体的杂交瘤细胞)分离的核酸，优选多聚a rna产生的cdna文库)通过使用可与序列的3’端和5’端杂交的合成引物进行pcr扩增，或通过使用特定基因序列的寡核苷酸探针进行克隆来识别，例如，来自编码抗体的cdna文库的cdna克隆。然后，可以使用本领域公知的任何方法将pcr产生的扩增核酸克隆到可复制的克隆载体中。
[0279]
可使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合到编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序编码本文所述的本发明抗体的dna。杂交瘤细胞可以作为这种dna的来源。一旦分离，dna可以被放入表达载体中，然后将其转染到宿主细胞中，如大肠杆菌细胞、猿猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞(例如来自chogssystem
tm
(lonza)的cho细胞)，或否则不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中合成抗体。
[0280]
为了产生完整抗体，包括vh或vl核苷酸序列、限制性位点和保护限制性位点的侧翼序列的pcr引物可用于扩增scfv克隆或其他克隆中的vh或vl序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可以将pcr扩增的vh结构域克隆到表达重链恒定区的载体中，例如人类γ4恒定区，并且可以将pcr扩增的vl结构域克隆到表达轻链恒定区的载体中，例如，人类κ或λ恒定区。在某些实施方式中，用于表达vh或vl结构域的载体包括启动子、分泌信号、可变区克隆位点、恒定结构域和选择标志物，例如新霉素。vh和vl结构域也可以克隆到一个表达必要恒定区的载体中。然后，使用本领域技术人员已知的技术，将重链转换载体和轻链转换载体共转染到细胞系中以产生表达全长抗体(例如igg)的稳定或瞬时细胞系。
[0281]
例如，也可以通过用人类重链和轻链恒定结构域的编码序列代替鼠序列，或通过
将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接到免疫球蛋白编码序列来修饰dna。
[0282]
可变区的定点或高密度诱变或其他诱变方法可用于优化单克隆抗体的特异性、亲和力等。尤其是，亲和力成熟策略和链改组策略(marks等，1992，bio/technology 10：779-783；每种策略均通过引用整体并入)在本领域是已知的，并且可用于产生高亲和力人类抗体。
[0283]
6.10.产生umg1单克隆抗体的杂交瘤细胞
[0284]
在第九方面中，本发明提供一种杂交瘤细胞，其产生根据方面1或2的抗体的单克隆抗体。
[0285]
6.11.杂交瘤组合物
[0286]
本发明还提供了一种杂交瘤组合物，其以iclc pd n
°
16001保藏。
[0287]
6.12.产生umg1单克隆抗体的方法
[0288]
在第十一方面中，本发明提供了一种根据方面1或2制备单克隆抗体的方法，所述方法包括从以iclc pd n
°
16001保藏的杂交瘤细胞中分离所述抗体。
[0289]
6.13.使用umg1抗体和/或结合分子分离细胞
[0290]
在第十二方面中，本发明提供了一种识别或分离t细胞急性淋巴母细胞白血病细胞、t淋巴瘤细胞、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症细胞或肿瘤相关巨噬细胞的方法，包括将包含所述细胞的细胞样品与根据方面1或2的单克隆抗体或根据方面3的结合分子接触。
[0291]
一般来说，巨噬细胞是肿瘤微环境中最具代表性的非恶性细胞。肿瘤相关巨噬细胞(tam)被认为具有促肿瘤炎症和免疫抑制表型，有利于化疗抵抗、血管生成、细胞运动和内/外渗。因此，靶向tam可能代表了一种新的治疗方法，也是一种尚未探索的临床选择，可以提高当前抗癌治疗的疗效。
[0292]
本领域技术人员通常熟知基于抗体或结合分子来识别或分离特定细胞的方法，例如t细胞急性淋巴母细胞白血病细胞、t淋巴瘤细胞、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症细胞或肿瘤相关巨噬细胞，例如基于流式细胞术荧光细胞分选、磁细胞分离或单细胞分选的方法，例如通过细胞分选器。
[0293]
6.14.产生免疫效应细胞的方法
[0294]
在第十三方面中，本发明提供了一种产生cd3 淋巴细胞、nk淋巴细胞、细胞因子诱导杀伤(cik)细胞、γ-δ淋巴细胞、nkt细胞或表达根据方面4的嵌合抗原受体的嵌合抗原受体的其他免疫效应细胞的方法，包括将根据方面5的表达载体的表达载体引入所述cd3 淋巴细胞、nk淋巴细胞、细胞因子诱导的杀伤(cik)细胞，γ-δ淋巴细胞、nkt细胞或其他免疫效应细胞。
[0295]
6.15.表达载体组合物
[0296]
在第五方面中，本发明提供一种表达载体，其包含编码根据方面4的嵌合抗原受体、根据方面1和2的抗体或根据方面3的结合分子的核酸序列。
[0297]
通常，表达载体是用于将所需核酸序列(例如基因)引入靶细胞的质粒，其导致由核酸序列编码的蛋白质(即嵌合抗原受体、抗体或结合分子)的转录和翻译。因此，表达载体通常包括调控序列，例如启动子和增强子区域，以及多聚腺苷酸化位点，以便在表达载体上引导核酸序列的高效转录。表达载体还可包括额外的必要或有用区域，例如用于在真核或原核细胞中选择的可选标志物、用于纯化所得蛋白质的纯化标签、多克隆位点或复制起点。
[0298]
通常，表达载体可以是病毒载体或非病毒载体。通常，可以使用各种病毒载体，例
如逆转录病毒载体，例如慢病毒或腺病毒载体，或质粒。在优选实施方式中，根据方面5的表达载体是病毒载体。在更优选的实施方式中，表达载体是慢病毒载体。
[0299]
6.16.治疗方法
[0300]
在另一方面中，提供了治疗方法，所述方法包括以有效治疗患者的量向患者给予如本文所述的结合分子或抗体。
[0301]
在一些实施方式中，该方法包括向患者给予有效使用car或car-t治疗患者的量的本文所述的结合分子或抗体。
[0302]
在一些实施方式中，所述方法包括向患者给予有效使用bite治疗患者的量的本文所述的结合分子或抗体。
[0303]
在一些实施方式中，该方法包括向患者给予有效使用抗体-药物偶联物治疗患者的量的本文所述的结合分子或抗体。
[0304]
6.16.1.指示
[0305]
在一些实施方式中，本发明的抗体或结合分子可用于治疗增殖疾病或癌症。在一些实施方式中，癌症是实体瘤。在一些实施方式中，癌症是血癌，包括但不限于t细胞恶性肿瘤、t细胞白血病、t细胞淋巴瘤、t细胞急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、b细胞恶性肿瘤、髓系恶性肿瘤、急性髓系白血病和慢性髓系白血病。
[0306]
在一些实施方式中，癌症或增殖疾病可以是来自膀胱、血液、血液免疫细胞(例如，t细胞或b细胞、单核细胞等)、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、结直肠、食管、胃肠道、牙龈、头部、肾、肝、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、胰腺、皮肤、胃、睾丸、舌头或子宫的癌症。
[0307]
在一些实施方式中，用本发明的抗体或结合分子治疗的癌症或肿瘤可以是恶性肿瘤；非恶性；癌；未分化癌；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛样基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；恶性类癌；鳃肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜氧腺癌；嗜碱性细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包裹性硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附件癌；顶泌腺癌；皮脂腺癌；宫颈腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特病；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；恶性胸腺瘤；卵巢间质瘤，恶性；恶性卵泡膜瘤；恶性颗粒细胞瘤；雄性母细胞瘤，恶性；支持细胞癌；间质细胞瘤，恶性；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；乳腺外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；舌癌；恶性黑色素瘤；无色素性黑色素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；蓝色痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡状横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性；苗勒氏混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；brenner肿瘤，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤；牙源性恶性肿瘤；成釉细胞性牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体；脊索瘤；恶性胶质瘤；室管膜瘤；星
形细胞瘤；原生质性星形细胞瘤；纤维状星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；少突胶质母细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金；副肉瘤；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；弥漫性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿；其他非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓系白血病；嗜碱性白血病；嗜酸性白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病；髓样肉瘤；毛细胞白血病和/或瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症。
[0308]
在第十三方面中，本发明提供了一种产生cd3 淋巴细胞、nk淋巴细胞、细胞因子诱导杀伤(cik)细胞、γ-δ淋巴细胞、nkt细胞或表达根据方面4的嵌合抗原受体的嵌合抗原受体的其他免疫效应细胞的方法，包括将根据方面5的表达载体的表达载体引入所述cd3 淋巴细胞、nk淋巴细胞、细胞因子诱导的杀伤(cik)细胞，γ-δ淋巴细胞、nkt细胞或其他免疫效应细胞。
[0309]
在一些实施方式中，本文公开的抗体治疗的癌症是衍生自外周b细胞或外周t细胞的非霍奇金淋巴瘤，包括但不限于弥漫性大b细胞淋巴瘤、malt淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
[0310]
在一些实施方式中，本文公开的抗体治疗的癌症为多发性骨髓瘤。
[0311]
在一些实施方式中，本文公开的抗体治疗的癌症为黑色素瘤。
[0312]
在一些实施方式中，本文公开的抗体治疗的癌症是睾丸癌，包括但不限于精原细胞瘤、胚胎癌、卵黄囊肿瘤和畸胎瘤。
[0313]
在一些实施方式中，本文公开的抗体治疗的癌症是儿科恶性肿瘤，例如肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、内胚层窦癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、髓母细胞瘤、脉络丛乳头状瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、原始神经外胚层肿瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、未成熟畸胎瘤，或平滑肌肉瘤。
6.17.实施例
[0314]
以下实施例旨在说明本发明，但不应被解释为限制本发明。这些实施例包括技术特征，并且应当理解，本发明还涉及实施例中呈现的技术特征的任何组合。
[0315]
6.17.1.实施例1：umg1结合特异性——umg1抗体与淋巴细胞结合，但不与pbmc中的髓源性细胞结合
[0316]
检测umg1与健康供体的外周血单核细胞(pbmc)的结合。
[0317]
方法：采用ficoll梯度分离法获得来自不同健康供体的外周血单核细胞(pbmc)。随后，将细胞接种在5ml试管中，并用1μg/ml的umg1抗体或1μg/ml阴性对照“扰乱”鼠igg1抗体在100μl结合溶液(磷酸盐缓冲盐水(pbs) 0.5％胎牛血清(fbs))中染色，并在4℃下孵育30分钟。然后在结合溶液中洗涤细胞2次，并在4℃的黑暗中用异硫氰酸荧光素(fitc)偶联的二抗染色30分钟。随后，在结合溶液中洗涤细胞2次。在attune nxt流式细胞仪(thermo scientific)上分析细胞。每个供体的一根试管未染色，每个供体的一根试管仅用fitc偶联的二抗染色作为阴性对照。
[0318]
结果：umg1抗体能够识别不同人类供体中具有各患病率(范围：0-15％)的淋巴细胞亚群。umg1抗体与pbmc内的任何其他细胞群(包括髓系衍生细胞)均未显示任何反应性，表明健康对象pbmc中的髓系衍生细胞对于umg1表位的表达呈阴性(见图1a和图1b)。
[0319]
相比之下，当我们使用商用抗cd43抗体(becton dickinson的s7)检测相同pbmc的cd43表达时，发现所有淋巴细胞和髓样细胞均呈阳性(见图1b)。
[0320]
因此，umg1抗体识别的cd43上的表位在pbmc细胞中表现出特定的、受限的表达模式，这与商业抗cd43抗体(s7)识别的表位表达模式不同。
[0321]
6.17.2.实施例2：umg1结合特异性——被umg1抗体结合的pbmc t淋巴细胞亚群
[0322]
本实施例采用对相应淋巴细胞进行免疫磁性分选进一步表征了由umg1抗体检测到的淋巴细胞亚群。
[0323]
方法：简单地说，将15μg umg1抗体与制造商提供的成分(easysep
tm“自己动手”选择试剂盒(stemcell technologies))混合，以获得可用于免疫磁分离的溶液。fcr阻断后，将该溶液添加到3个不同供体的pbmc中，其中至少有10％的淋巴细胞被抗体检测到，并在室温(r.t.)下孵育15分钟。随后，将磁性纳米颗粒添加到溶液中，并将细胞在r.t.下再孵育10分钟。然后将溶液放入磁铁中，去除未结合的细胞。
[0324]
结果：umg1抗体检测到的细胞几乎都是cd45

cd3

cd4

cd8-cd127

ccr7

t淋巴细胞(见图2a-2d和表1)。
[0325][0326][0327]
6.17.3.实施例3：umg1结合特异性——只有t-all和瓦尔登斯特伦氏的巨球蛋白血症癌细胞系表达umg1表位
[0328]
在本实验中，我们评价了各种造血和非造血癌细胞系的umg1表位表达。
[0329]
方法：简单地说，将细胞接种在5ml试管中，并在100μl结合溶液(磷酸盐缓冲盐水(pbs) 0.5％胎牛血清(fbs))中用1μg/ml单克隆抗体umg1或1μg/ml扰乱鼠igg1抗体染色，并在4℃下孵育30分钟。然后在结合溶液中洗涤细胞2次，并在4℃的黑暗中用异硫氰酸荧光素(fitc)偶联的二抗染色30分钟。随后，细胞在结合溶液中洗涤2次，并在attune nxt流式细胞仪(thermo scientific)上采集。每个细胞系的一根试管未染色，每个细胞系的一根试管仅用fitc偶联的二抗染色。
[0330]
结果：观察到属于egil t3分类和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(图3a-3b)的t-all细胞系均对于umg1表位表达呈阳性，而其他被检测的细胞系对于umg1表位均呈阴性(见表2)。umg1抗体识别t-all和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症细胞系，但不识别其他造血肿瘤和非造血肿瘤。
[0331]
[0332][0333]
6.17.4.实施例4：umg1结合特异性——umg1结合t-all人类细胞系，其结合模式不同于商用cd43抗体
[0334]
本实施例展示了umg1抗体在两种不同的t-all人类细胞系all-sil和ke-37中与市售cd43抗体相比的独特结合特性。
[0335]
方法：商用cd43抗体：克隆、cd431g10(becton dickinson)、cd43 mem-59(invitrogen)和cd43 l-10(invitrogen)与umg1抗体进行比较。
[0336]
从各种人类细胞系(100000个细胞/管)收集细胞。通过添加2ml冷染色缓冲液并在室温下以1200rpm离心细胞5分钟来清洗细胞，并丢弃上清液。一抗umg1以浓度(在100μl细胞的最终染色体积中加入1μg/ml添加。通过脉冲漩涡轻轻混合细胞。接下来，细胞在2-8℃下孵育15分钟，避光。细胞清洗两次，加入2ml染色缓冲液，并在室温下以1200rpm的转速离心细胞5分钟，并丢弃上清液。按照制造商的说明，在最终体积为100μl的细胞中稀释荧光标记二抗，并在2-8℃下孵育至少15分钟，避光。如上所述，将细胞洗涤两次，然后将其重新悬浮在500μl pbs 1x中，并通过流式细胞术进行分析。
[0337]
结果：通过facs分析，我们观察到umg1抗体、cd431g10(bectondickinson)、cd43 mem-59(invitrogen)和cd43 l-10(invitrogen)在all-sil和ke-37细胞系中均不同的表达密度和强度。参见图12a和12b。这些观察结果表明，umg1抗体在cd43上的结合位点与三种不同的cd43商业抗体不同。
[0338]
6.17.5.实施例5：umg1结合特异性——umg1反应伴肿瘤免疫浸润
[0339]
与其他特征性cd43抗体相比，本实施例展示了m-umg1在人类结肠癌、肺癌和乳腺癌组织中独特的结合特性和表达。
[0340]
方法：对三种不同人类癌症的石蜡包埋组织样本进行切片、脱蜡，然后使用以下方法通过免疫组织化学分析umg1表位的表达来进行分析。
[0341]
将样品放置在65℃的加热器中脱石蜡30分钟。接下来，将切片在(1)二甲苯中浸泡10分钟，(2)二甲苯中浸泡5分钟，然后通过分级醇重新水合：90％乙醇2分钟；70％乙醇2分钟。在自来水中清洗载玻片，然后用去离子水进行最终清洗。
[0342]
在98℃恒温浴中，使用ph值为9的novocastra表位回收溶液(徕卡生物系统公司)进行抗原暴露30分钟。用过氧化物酶阻断剂中和内源性过氧化物酶10分钟。过氧化物酶阻断剂：3/4％，(v/v)h2o2。接下来，样品在pbs中洗涤2次，每次洗涤5分钟。洗涤后，样品与蛋白质封闭剂一起孵育8分钟。蛋白质封闭剂：在磷酸盐缓冲盐水中的0.4％酪蛋白。封闭后，将载玻片在pbs中洗涤2次，每次洗涤5分钟。
[0343]
切片用一抗umg1(“m-umg1”)在4℃下以1：300的稀释度进行过夜染色。接下来，将
染色切片在pbs中洗涤2次，每次洗涤5分钟。洗涤后，样品与兔抗小鼠igg孵育30分钟，然后在pbs中洗涤2次，每次洗涤5分钟。洗涤后，将样品与novolink聚合物、抗兔聚hrp igg孵育30分钟，然后在pbs中洗涤2次，每次洗涤5分钟。
[0344]
切片上的染色通过aec(3-氨基-9-乙基咔唑)底物显色剂(dako)显示，然后在自来水中冲洗。切片用苏木精复染5分钟，然后在自来水中再次清洗。使用ultramount水性永久固定介质(dako)固定切片。在光学显微镜(徕卡微系统)下对组织切片进行umg1染色分析，并使用数码相机(徕卡)收集显微照片。
[0345]
结果：我们在各种实体瘤的免疫浸润中观察到umg1染色。更具体地说，我们在肺癌、结直肠癌和乳腺癌组织中发现了与肿瘤相关的巨噬细胞的显著反应性。参见图14a(结直肠腺癌(2级，g2)、14b(肺腺癌)和14c(乳腺，三阴性导管浸润性乳腺癌(g2，基底样))。
[0346]
值得注意的是，umg1未能直接对癌细胞进行染色，这与之前描述的其他cd43抗体不同，如un1(见de laurentiis，a.等，《分子细胞蛋白质组学》(molecular cellular proteomics)，2011年，中的un1染色，图9)。
[0347]
这些结果表明，umg1抗体与cd43的结合模式不同于其他表征的cd43抗体，尤其是un1，后者之前已被证明与癌细胞中的cd43结合。
[0348]
6.17.6.实施例6：umg1结合特异性——umg1表位在肿瘤相关巨噬细胞中表达，当巨噬细胞与癌细胞共同培养并相互作用时，umg1表位表达升高
[0349]
在本实施例中，通过免疫组织化学对来自不同种类癌症的标本进行umg1表位表达的评估，发现umg1结合的特异性cd43表位被肿瘤相关巨噬细胞(tam)高度表达。
[0350]
方法：对不同类型的癌症进行染色，如本文实施例中所述。
[0351]
结果：通过免疫组织化学(表3、图4和图14a-14c)对不同类型癌症的标本进行评估，发现umg1 巨噬细胞是大多数肿瘤的高浸润成分，在胰腺癌和卵巢癌中具有特异性和高浸润级别，尽管健康对象的外周血单核细胞中的髓源性细胞缺乏umg1表位。
[0352]
[0353]
为了更好地理解巨噬细胞中umg1表位的意义，在第二个实验中，在有或无共培养癌细胞的巨噬细胞分化模型中评估了umg1表位的表达变化。为此，我们使用了thp-1单核细胞白血病细胞；如实施例3所示，这些细胞不表达umg1表位。
[0354]
方法：在50ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸酯(pma)存在下，在完全合适的培养基中培养48h，以获得分化的人非极化m0巨噬细胞(thp-1m)。然后用不含pma的新鲜培养基替换培养基。接下来，将panc1胰腺癌细胞系细胞以1：1的比例添加到选定的孔中，并孵育48小时。
[0355]
然后准备细胞进行免疫荧光分析。简单地说，固定后，用来源于umg1的嵌合抗体，ch umg1(在实施例16中进一步描述)或人类igg1对照对thp-1m细胞进行染色，并在4℃下培养过夜。然后向细胞中加入fitc抗人单克隆二抗2小时。清洗后，将带有dapi(vectorlabs)的防褪色固定介质添加到细胞和盖玻片中，然后进行分析。
[0356]
结果：如图5a所示，用对照igg1染色的thp-1衍生巨噬细胞为完全阴性，而用ch-umg1染色的巨噬细胞为弱(微弱)阳性。有趣的是，在存在panc1细胞的情况下，thp1衍生的巨噬细胞表现出强烈(明亮)的umg1表达。图中显示了thp-1衍生的巨噬细胞(白色箭头)和panc1细胞(红色箭头)之间的一种特定的相互作用(图5a，左侧)。
[0357]
这些发现表明，当巨噬细胞在重建的肿瘤微环境中与癌细胞共同培养并相互作用时，umg1特异性表位显著上调(即升高)。这种升高的表达意味着umg1表位是用于清除肿瘤相关巨噬细胞的治疗方法的一个合适靶点。除了作为治疗工具的这一相关潜力之外，umg1还可能被证明对检测、预后作用分析和预测性研究有用。
[0358]
6.17.7.实施例7：umg1结合特异性——竞争性结合分析表明，与市售cd43抗体相比，cd43上的umg1结合位点是独特的
[0359]
为了确定umg1的结合位点是否与市售cd43抗体相同或不同，在两种不同的细胞系cem和hpb-all上进行(i)h-umg1(umg1抗体的人源化形式，在下面的实施例19中进一步描述)与藻红蛋白偶联的h-umg1(h-umg1-pe)和(ii)h-umg1与三种市售cd43抗体之间的竞争性结合分析。
[0360]
方法：使用以下抗体进行竞争结合试验，并通过facs分析进行分析：未偶联的h-umg1、h-umg1-pe和市售cd43抗体：mem-59pe(invitrogen)、l-10 pe(invitrogen)和1g10 pe(becton dickinson)。简而言之，cem和hpb-all细胞在冰上黑暗中孵育20分钟，其中h-umg1未偶联，浓度增加(0.016μg/ml、0.08μg/ml、0.4μg/ml、1μg/ml、2μg/ml)，在1μg/ml的cd43克隆或h-umg1-pe(阳性对照)之一存在下。
[0361]
每次测试大约收集50万个细胞并进行染色。细胞用facs canto(becton dickinson)进行分析和测量，并用diva软件(bd facsdiva
tm
软件)进行分析。对于每项测量，使用diva软件对10000个事件进行门选。每个实验以三次重复进行。
[0362]
结果：正如预期的那样，在cem和hpb-all细胞系中，未偶联的h-umg1竞争h-umg1-pe结合。也就是说，通过增加未染色h-umg1的浓度，标记有h-umg1-pe的染色细胞的数量会减少。参见图13a和13b(带圆圈的线)。
[0363]
相比之下，未偶联的h-umg1不竞争其他商用cd43抗体(mem-59(invitrogen)、l-10(invitrogen)和1g10(becton dickinson)的结合。事实上，通过增加未偶联的h-umg1抗体的浓度，用抗cd43标记的染色细胞的数量并没有减少。参见，图13a和13b(带朝上三角形的
线，带朝下三角形的线，带正方形的线)。
[0364]
这些结果表明，h-umg1抗体的结合位点与三种市售cd43抗体的结合位点不同。
[0365]
6.17.8.实施例8：umg1结合特异性——造血系细胞系中h-umg1的流式细胞术图谱与un1历史公布数据的比较
[0366]
如上所述，文献中报告un1可直接与多种癌细胞系结合，而在上文实施例3和实施例5中报告的实验中，umg1并非如此。相反，umg1结合肿瘤相关的巨噬细胞浸润到实体瘤中。
[0367]
由于分泌un1抗体的杂交瘤从未在生物库中保藏，也未建立un1杂交瘤主细胞库或工作细胞库，因此无法对原始un1抗体和umg1进行并行实验比较，通过重复首次在tassone等，tissue antigens 44：73-82，1994中报道的实验，我们进一步探索了un1和umg1结合之间的相似性和差异。在本参考文献中，通过流式细胞术表达评估un1与不同造血系细胞系的结合，如jurkat、molt-4、cem和hpb-all系。
[0368]
方法：以大约100000个细胞/管收集人类细胞系的细胞。然后，通过添加2ml冷染色缓冲液，并在室温下以1200rpm的速度将细胞离心5分钟，以洗涤细胞，并丢弃上清液。
[0369]
在100μl细胞的最终染色体积中，以1μg/ml的浓度添加h-umg1一抗。接下来，通过脉冲漩涡将细胞混合，并在2-8℃温度下孵育15分钟，避光。然后，通过在室温下以1200rpm的转速向颗粒中添加2ml染色缓冲液和离心细胞5分钟，将多余的一抗洗涤两次，并丢弃上清液。在最终体积为100μl的细胞中，以推荐的稀释度添加荧光标记的二抗，并在2-8℃下孵育至少15分钟，避光。
[0370]
然后将多余的二抗从细胞中冲洗两次，方法是在室温下加入2ml染色缓冲液，以1200rpm的速度将细胞离心5分钟，然后丢弃上清液。将洗涤后的沉淀细胞重新悬浮在500μl pbs 1x中，并通过流式细胞术进行分析。
[0371]
结果：图17a显示了1994年由tassone实验室(tassone等，tissue antigens 44：73-82，1994)在jurkat、molt-4、cem和hpb-all细胞系中进行的un1的历史流式细胞术图谱。图17b显示了jurkat、molt-4、cem和hpb-all细胞系中h-umg1抗体的流式细胞术图谱的结果。
[0372]
比较表明，umg1和un1均不与jurkat细胞结合，但与molt-4、cem和hpb-all细胞系结合。
[0373]
值得注意的是，与un1相比，cem细胞系中umg1的流式细胞术图谱显示约1个对数偏移(shift)。un1和umg1曲线的差异表明，在与cem细胞的结合亲和力方面存在差异。
[0374]
6.17.9.实施例9：umg1结合特异性-活化中性粒细胞上的h-umg1单克隆抗体结合
[0375]
在本实施例中，在从人类健康供体外周血分离的失活和活化中性粒细胞上评估umg1表位表达。
[0376]
方法：将两名健康供体的全血收集在肝素抗凝真空罐中，用pbs1∶1稀释，用菲科尔-帕克密度梯度离心法(600rcf，15min，rt，无刹车)分离。将rbc(红细胞颗粒)悬浮在1x pbs中，随后添加6％右旋糖酐溶液。在黑暗中室温下，右旋糖酐沉淀30分钟。收集中性粒细胞上清液并离心(5min，rt，600rcf)。为了获得纯中性粒细胞群，使用10倍裂解缓冲液进行rbc裂解20秒，使用1倍pbs停止裂解。将样品离心10分钟，400rcf，无制动，丢弃上清液，将粒细胞颗粒重新悬浮在培养基中。对于每个健康供体粒细胞样品，一半仅在生长培养基中培养，而另一半用pma(5ng/ml)和离子霉素(250ng/ml)刺激15分钟，37℃，5％co2。收集样品，
在染色溶液中洗涤，并进行fc封闭。将细胞与cd11b pe-cy7(泛粒细胞标志物)、cd55(中性粒细胞活化标志物)和umg1-apc或apc偶联的igg1人类同型对照物一起孵育，并在流式细胞术中获得，以评估失活和活化粒细胞上的h-umg1表达。
[0377]
结果：h-umg1单抗在失活和活化中性粒细胞群上的结合与同种型对照(igg1)相似。只有少数中性粒细胞表达由h-umg1单抗靶向的特定cd43表位(图33)。cd43通常在中性粒细胞上表达，这一结果加强了umg1单克隆抗体靶点的独特性。
[0378]
6.17.10.实施例10：umg1结合特异性——h-umg1单克隆抗体与活化t淋巴细胞结合
[0379]
在本实施例中，在健康供体外周血的活化t淋巴细胞上评估umg1表位表达。
[0380]
方法：在edta抗凝真空采集器中采集健康供体(hd)全血。根据ficoll-paque密度梯度离心法分离外周血单核细胞(pbmc)。用pma(25ng/ml)和离子霉素(1μg/ml)在37℃、5％co2条件下激活3例hd的淋巴细胞24小时。活化后，收集细胞，用1x pbs洗涤，并用早期和晚期t细胞活化标志物，特别是cd25-bv515、cd69-pe和h-umg1-apc或igg同种型对照apc染色。进行流式细胞术分析以评估cd25 t细胞和cd69 t细胞上的h-umg1表达。
[0381]
结果：与活化t淋巴细胞中的igg同种型对照组相比，未观察到h-umg1单抗结合的显著差异(图34a-34d)。因此，h-umg1单克隆抗体不靶向活化的t淋巴细胞。
[0382]
6.17.11.实施例11：umg1结合特异性——健康和肿瘤组织中mumg1结合的免疫组织化学分析
[0383]
方法：用于免疫组织化学分析的组织微阵列(tma)包括：狗雌性正常器官(dgf281)；大鼠正常器官(rat901a)；小鼠正常器官(mo541c)；恒河猴正常器官(rhfda1a)；食蟹猴正常器官(cyfda1c)；多器官癌和正常组织(mc5003c)；恶性黑色素瘤和皮肤组织(me2081)；淋巴瘤调查组织(ly2084)；乳腺癌组织(br1505d)；睾丸疾病(te2081)；胚胎肿瘤试验(t001a)；人类消化系统(gi1441)；人脑肿瘤(gl2082)；人类儿科恶性肿瘤(pc701)，美国biomax公司生产，和biochain公司生产的fda标准石蜡组织阵列人类正常器官(目录号：t8234701)。下文提供了所选tma的说明。
[0384]
fda标准组织阵列(人体组织，t8234701-5)：以五张载玻片提供的正常人体组织微阵列，包含30种不同的人体正常组织类型和3个供体/组织类型。
[0385]
多器官癌和正常组织(mc5003c)：具有正常组织微阵列的高密度多器官肿瘤，包含20种类型的器官，每个器官取自25个个体(20例肿瘤和5例正常组织)，每个病例单核。
[0386]
恶性黑色素瘤(me2081)：恶性黑色素瘤和皮肤组织微阵列，包含88例恶性黑色素瘤，16个皮肤组织，每个病例重复核心。
[0387]
淋巴瘤调查组织(ly2084)：淋巴瘤肿瘤调查组织微阵列(520例淋巴瘤调查载玻片中的载玻片4)，包含104例恶性肿瘤(64例b细胞淋巴瘤，24例粘膜相关淋巴瘤组织，6例t细胞淋巴瘤，4例霍奇金淋巴瘤，4例间变性大细胞淋巴瘤，1例套细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤)，每个病例重复核心。
[0388]
睾丸疾病(te2081)：睾丸肿瘤组织芯片，包含46例精原细胞瘤、8例卵黄囊瘤、16例胚胎癌、5例畸胎瘤、3例结核、6例萎缩、15例邻近正常组织和5例正常组织，每个病例重复核心。
[0389]
人类儿童恶性肿瘤(pc701)：正常组织的儿童恶性肿瘤组织芯片，包括21例肾母细
胞瘤、13例神经母细胞瘤、7例内胚窦癌、4例视网膜母细胞瘤、3例肝母细胞瘤、2例髓母细胞瘤、4例淋巴瘤，脉络丛乳头状瘤、胶质母细胞瘤、肾上腺皮质癌，胚胎性横纹肌肉瘤、室管膜瘤、原始神经外胚层肿瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、未成熟畸胎瘤、平滑肌肉瘤各1例，外加7个正常组织，每个病例单核。
[0390]
为了进行免疫染色，对组织切片进行脱蜡和再水化。使用novocastra抗原表位提取液、ph 9 edta缓冲液在恒温浴(falc instruments s.r.l，特雷维格里奥(bg)意大利，wb-md 5型)中于98℃下进行30分钟的抗原暴露技术。
[0391]
tma与umg1单克隆一抗(本应用使用m-umg1单克隆抗体，稀释度为1∶300)在4℃下孵育过夜。通过聚合物检测方法(novolink聚合物检测系统novocastra-leica biosystems newcastle公司产品编号：re7280-k)或aec(3-氨基-9-乙基咔唑，dako，参考号k3464)即用基质色原显示免疫染色。载玻片用harris苏木精复染(novocastra，徕卡生物系统公司)。
[0392]
在蔡司axio scope a1光学显微镜(蔡司，德国)下分析所有切片，并使用axiocam 503彩色数码相机和zen2成像软件(蔡司，德国)收集显微照片。
[0393]
umg1表达评估：使用aperio cs2 leica扫描切片。通过使用4级量表(负(0)、弱(1)、中等(2)和强(3))确定信号强度，手动对蛋白质表达水平进行评分。参见micke p等，2014，int j cancer，135：2206-2214，全部通过引用纳入本文。
[0394]
结果：在正常人体组织中，在胸腺(图38a)和扁桃体淋巴结(图38b)上观察到umg1单抗的阳性结合。50％以上的淋巴细胞和一小部分具有单核细胞/巨噬细胞形态的成分(element)上的膜染色呈中度/强度阳性(评分2-3)。在其他器官内分散的免疫细胞上观察到罕见的结合，但在这些细胞中，表达与没有膜强化(reinforce)的细胞质表达更为相容(参见图38c和肺组织的示例)。
[0395]
在淋巴瘤疾病谱中，经常观察到细胞质和膜染色，并以不同强度突出显示(图39a-39b，表6)。umg1单克隆抗体靶表位在多个观察点的恶性细胞上的膜表达也很清楚，尽管强度和分布程度不同。
[0396]
关于恶性黑色素瘤，umg1单克隆抗体靶点在恶性细胞膜和tam上表达(图40a，表6)。此外，根据肿瘤相关巨噬细胞表位表达的初步数据，一些样品中的肿瘤内白细胞浸润染色呈阳性。
[0397]
在睾丸肿瘤中，精原细胞瘤中肿瘤克隆的阳性率较高(图40b，表6)，其次是胚胎癌和卵黄囊肿瘤。瘤周健康组织和正常健康睾丸均为阴性。
[0398][0399][0400]1可供评估的样品数量(即认为已正确染色)
[0401]2肿瘤细胞膜上umg1抗体标记的样品数量
[0402]3umg1抗体标记的肿瘤细胞超过10％的样品数量
[0403]4具有umg1抗体标记的肿瘤细胞且强度得分为2 或3 的样品数量
[0404]5在肿瘤微环境中浸润超过10％的免疫细胞的样品数量(用umg1抗体标记)
[0405]6不适用或未评估
[0406][0407]1可供评估的样品数量(即认为已正确染色)
[0408]2肿瘤细胞膜上umg1抗体标记的样品数量
[0409]3umg1抗体标记的肿瘤细胞超过10％的样品数量
[0410]4具有umg1抗体标记的肿瘤细胞且强度得分为2 或3 的样品数量
[0411]5在肿瘤微环境中浸润超过10％的免疫细胞的样品数量(用umg1抗体标记)
[0412]6不适用或未评估
[0413]
另一组肿瘤细胞和免疫浸润均显示umg1单克隆抗体表位表达的癌症是不同来源的儿科肿瘤(见表7)。
[0414]
此外，在代表不同来源的多个实体瘤的某些部位(mc5003c组织微阵列)，观察到癌
细胞或免疫细胞浸润(肿瘤相关巨噬细胞(tam)和其他免疫细胞浸润)上的umg1表位表达。这些样品中的umg1单抗结合具有不同的分布水平和强度(数据未显示)。
[0415]
6.17.12.实施例12：umg1结合特异性-cd43上的表位结合位点
[0416]
通过western印迹和facs分析检测各种cd43蛋白变体与h-umg1抗体的结合，以确定在不表达cd43的hek293t野生型细胞中，h-umg1在cd43上的结合位点。
[0417]
cd43蛋白变体：图15a表4和序列列表中提供了测试的cd43蛋白克隆的序列，如seq id no：17-24所示。野生型cd43，表示为“cd43#1”，是使用完整的400个氨基酸区域生成的。为了工程改造cd43蛋白变体，n末端结构域被顺序截断。第一cd43截短变体“cd43#2”是使用全长cd43的31到400的aa生成的。第二cd43变体显示为“cd43#3”，是使用全长cd43的41到400的aa生成的。第三cd43变体，即“cd43#4”，是使用全长cd43的61到400的aa生成的。第四cd43变体被称为“cd43#5”，由全长cd43的aa 91-400组成。第五cd43变体被标记为“cd43#6”，从aa 64到78缺失。
[0418]
此外，还测试了单一氨基酸缺失变体。第六cd43变体，即“cd43#7”，在aa 69处缺失了一个氨基酸，这被认为是galnac位点。第七cd43变体被标记为“cd43#8”，在aa 69处有一个氨基酸取代，t变为n或“t69n”。
[0419][0420][0421]
构建体：cd43蛋白构建体使用来自applied biological materials(abm)inc.service(加拿大温哥华)的plenti-cmv-(插入)-histag-gfp-2a-puro表达载体表达。his-标记和/或gfp检测作为成功转染和/或蛋白质表达的阳性对照。
[0422]
转染：根据制造商的协议，使用lipofectamine ltx(美国马萨诸塞州赛默飞世尔
科学公司)在hek293t细胞中瞬时表达每个载体。hek293t细胞在补充了10％fbs和1％青霉素/链霉素(美国马萨诸塞州赛默飞世尔科学公司)的dmem中保持在37℃和5％co2下。转染72h后，对细胞进行western印迹或流式细胞术(facs)分析。
[0423]
western印迹：使用umg1抗体进行western分析，以确定umg1抗体是否能够结合并检测预期kda大小的cd43野生型和cd43蛋白变体。his-标记抗体被用作阳性对照。
[0424]
简而言之，使用np40裂解缓冲液补充halt
tm
蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(美国马萨诸塞州赛默飞世尔科学公司)获得全细胞蛋白质提取物。bradford分析(美国加利福尼亚州伯克利伯乐实验室)用于估算蛋白质浓度。以每条泳道60μg的浓度加载细胞裂解物，并使用nupage
tm 3-8％tris-乙酸盐蛋白质凝胶(美国马萨诸塞州invitrogen，thermo scientific)分离。蛋白质通过trans-turbo
tm
转移系统(美国加利福尼亚州伯克利伯乐实验室)电转移30分钟，并用从细胞信号公司(cell signaling)购买的抗肌动蛋白抗体(数据未显示)、从abm(加拿大温哥华)购买的抗his标记抗体(#g020)和h-umg1一抗(均以1∶500稀释)进行免疫印迹。使用山羊抗小鼠和兔抗人hrp偶联的抗体(invitrogen)作为二抗(1∶3000稀释)。免疫反应条带使用supersignal
tm west pico plus化学发光基质(美国马萨诸塞州热科学公司)通过增强化学发光检测法显示。
[0425]
流式细胞术(facs)分析：进行facs以确定抗体是否能够检测hek293t细胞系细胞中表达的cd43野生型和cd43变体。
[0426]
按照标准程序进行facs分析，使用1μg/ml h-umg1-pe偶联的抗体检测gfp阳性细胞中h-umg1阳性细胞的百分比。通过流式细胞术(lsrfortessa
tm x-20，bd)采集样本，并通过diva软件(bd facsdiva
tm
软件)进行分析。每次测量至少有20000个事件被门选。
[0427]
结果：western分析的结果表明，umg1表位结合位点位于aa 61至91之间(如野生型cd43所示)。参见图15a中的加框序列，它显示了h-umg1抗体的假定结合位点。此外，这些研究表明，umg1抗体与umg1特异性结合，而不是与缺乏umg1识别的特定细胞外区域的cd43 his加标蛋白结合。参见图15c和15e。
[0428]
facs观察结果证实了在western印迹中观察到的结果，即umg1表位结合位点位于cd43野生型的aa 61至91之间，因为它不能在cd43#5和cd43#6蛋白变体的gfp表达细胞中检测到。参见图15d和15f。此外，图15e和15f中的western印迹和facs研究表明，如果treonine 69被删除(cd43#7)或被非o-糖基化的氨基酸(cd43#8)取代，则转基因表达cd43的hek293t细胞中的h-umg1抗体也能识别从aa 61到91的cd43 aa区域。这些结果是结合了一个不应该有任何糖基的表位。正如所料，未经cd43转化的野生型hek293t细胞与umg1抗体没有显示任何反应性。
[0429]
6.17.13.实施例13：umg1结合特异性-h-umg1单抗-cd43表位的线性表位映射
[0430]
方法：微阵列内容：在c端和n端用中性gsgsgsg(seq id no：46)接头延长人类cd43(seq id no：17)序列，以避免截短肽。将延长的抗原序列翻译成15个氨基酸的线性肽，肽-肽重叠14个氨基酸。由此产生的cd43肽微阵列包含400种不同的肽，重复打印(800个肽点)，并由额外的ha(ypydvpdyag(seq id no：47)，82个肽点)对照肽构成框架。微阵列的合成和分析由海德堡pepperpprint gmbh进行。
[0431]
用二抗(山羊抗人igg(h l)dylight680(0.2μg/ml))和对照抗体(小鼠单克隆抗ha(12ca5)dylight800(0.5μg/ml))对cd43肽微阵列进行预染色。在洗涤缓冲液(pbs，ph 7.4，
含0.05％吐温20)中预溶胀15分钟并在封闭缓冲液(rockland封闭缓冲液mb-070)中孵育30分钟后，cd43肽微阵列最初与二抗和对照抗体在室温(rt)下在孵育缓冲液(含10％阻断缓冲液的洗涤缓冲液)中孵育45分钟，以研究与线性cd43肽的背景相互作用，这可能干扰主要分析。
[0432]
随后将其他cd43肽微阵列拷贝与人源化单克隆抗cd43抗体(h-umg1单抗)在10μg/ml和100μg/ml浓度的孵育缓冲液中孵育(在4℃和140rpm下孵育16小时)，然后用二抗和对照抗体染色。使用li-cor odyssey成像系统在扫描强度为7/7(红色＝700nm/绿色＝800nm)，扫描偏移为0.65mm，解析为21μm下进行读取。将构成肽微阵列的额外ha对照肽与作为内部质量控制的对照抗体同时染色，以确认分析质量和肽微阵列的完整性。
[0433]
在扫描强度为7/7(红色/绿色)时，即使亮度和对比度显著增加，我们也没有观察到二抗和对照抗体与线性cd43肽的任何背景相互作用。因此省略了使用分析仪进行数据量化。对照抗体染色产生了预期的定义明确的ha对照点模式，形成肽微阵列(绿色)，验证了整体微阵列的完整性和分析质量。
[0434]
点强度和肽注释的量化基于16位灰度tiff文件，该文件显示出比24位彩色tiff文件更高的动态范围。微阵列图像分析使用分析仪进行。软件算法将每个点的荧光强度分解为原始信号、前景信号和背景信号，并计算平均中值前景强度和重复点的点对点偏差。基于平均中值前景强度，生成强度图，并通过强度色码突出显示肽图中的相互作用，高点强度为红色，低点强度为白色。我们允许最大点对点偏差为40％，否则相应的强度值为零。
[0435]
我们进一步绘制了从cd43的n-端到c-端的抗原序列的人源化单克隆抗体检测的平均点强度，以可视化整体点强度和信噪比。强度图与肽和强度映射以及微阵列扫描的目视检查相关，以确定人源化单克隆抗cd43抗体的表位。如果不清楚某个氨基酸是否有助于抗体结合，则相应的字母用灰色书写。为了更好地概述数据，将强度图的基线调平。
[0436]
结果：我们观察到一种弱的抗体反应，其针对的是一种表位样点模式，该模式由具有共有基序inegsplw的相邻肽形成(seq id no：48；人类cd43上的aa 71-78)；此外，我们观察到，由于抗体的非特异性离子结合，与具有高度碱性的共有rrrqkr(seq id no：49)和rrptlttffgrrrk(seq id no：50)的肽的两种更强烈的相互作用(图35)。通过同时对ha对照肽进行染色，可以很好地确定中值信噪比。
[0437]
6.17.14.实施例14：umg1结合特异性-h-umg1单克隆抗体的线性表位映射-表位取代扫描
[0438]
方法：微阵列内容：野生型肽ppstniegsplwts(seq id no：51)的表位取代扫描基于20个主要氨基酸对所有氨基酸位置的交换。由此产生的肽微阵列包含300种不同的野生型肽变体，设三重复(900个肽点)打印，9个点的定制对照肽ppstsvnegspgts(seq id no：52)和一个附加ha对照肽框架(ypydvpdyag，82个点(seq id no：47))。微阵列的合成和分析由海德堡pepperprint gmbh进行。
[0439]
用二抗和对照抗体对肽微阵列进行预染色。在洗涤缓冲液中预溶胀15分钟和在封闭缓冲液中孵育30分钟后，最初将肽微阵列与二抗和对照抗体在室温下孵育45分钟，以分析与可能干扰主要分析的野生型肽变体的背景相互作用。
[0440]
随后在孵育缓冲液中以1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml(数据未显示)和250μg/ml的浓
度将其他肽微阵列拷贝与人源化单克隆抗cd43抗体孵育，然后用二抗和对照抗体染色。清洗后，以7/7(红色/绿色)的扫描强度进行读取。同时对构成肽微阵列的额外ha对照肽进行染色，作为内部质量对照，以确认分析质量和肽微阵列的完整性。
[0441]
在7/7(红色/绿色)的扫描强度下，即使亮度和对比度显著增加，我们也没有观察到二抗和对照抗体与300种野生型肽变体或其他定制肽的任何背景相互作用(见调整后的扫描)。因此省略了使用分析仪进行数据量化。对照抗体染色产生了预期的定义明确的ha对照点图案，用于构建肽微阵列，验证了整体微阵列的完整性和分析质量。
[0442]
点强度和肽注释的量化基于16位灰度tiff文件，该文件显示出比24位彩色tiff文件更高的动态范围。微阵列图像分析使用分析仪进行。软件算法将每个点的荧光强度分解为原始信号、前景信号和背景信号，并计算三个点重复的平均中值前景强度和点对点的偏差。基于平均中值前景强度，生成强度图，并通过强度色码突出显示肽映射中的相互作用，红色表示高强度，白色表示低强度。具有模糊点形态的非常微弱的信号被归零。
[0443]
我们进一步用人源化单克隆抗体在芯片底部从左上到右下以行的方式绘制了针对微阵列内容的分析的平均点强度，以可视化整体点强度和信噪比。强度图与肽和强度映射以及微阵列扫描的目视检查相关，以识别与人源化单克隆抗cd43抗体相互作用的野生型肽的变体。
[0444]
为了深入了解野生型肽的表位取代扫描，我们进一步生成了微阵列扫描的热图以及取代矩阵和氨基酸图，反映了给定位置的氨基酸偏好。对数据集进行分析，以确定野生型肽的保守和可变氨基酸位置。
[0445]
取代矩阵通过色码(红色表示优选氨基酸，蓝色表示不太优选的氨基酸)突出显示对给定氨基酸的偏好，并通过将给定肽的点强度除以在同一位置被取代的所有20个肽的平均点强度来计算。氨基酸图的计算方法是将给定肽的点强度除以野生型肽的点强度。因此，氨基酸的位置反映了与天然野生型肽氨基酸相比的强度比。
[0446]
结果：野生型肽ppstniegsplwts(seq id no：51)的取代扫描显示出一种弱但典型的表位取代模式，具有保守(一行中几乎没有或有单点)和可变(点的连续行)氨基酸位置(见图36)。观察到低信噪比，并且在ha对照肽框架的同时对照染色中得到明确定义。
[0447]
热图，针对野生型肽ppstniegsplwts(人类cd43的seq id no：51，aa 66-80)的取代扫描分析的人源化单克隆抗cd43抗体的取代矩阵和氨基酸图突出显示了由n-和c-末端可变片段ppstin(seq id no：54，人类cd43的aa66-72)和ts(seq id no：55，人类cd43的aa 79-80)框定的保守核心基序egsplw(seq id no：53，人类cd43的aa 73-78)(见图37a-37c)。这一发现与之前针对全长人类cd43蛋白的表位图谱中建议的表位inegsplw一致。
[0448]
人类cd43的76位氨基酸(p)和77位氨基酸(l)是抗体结合所必需的，完全不能耐受任何氨基酸替换。氨基酸位置73(e)和78(w)是高度保守的，仅能分别耐受d和f的保守替换。78位w被f的替换甚至导致抗体结合的明显增加。氨基酸位置74(g)的序列保守程度较低，易被m、酸性氨基酸d和e以及芳香族氨基酸w、f和y取代。
[0449]
包括氨基酸位置75(s)在内的所有其他氨基酸位置均表现出可变特征。在可变氨基酸位置中，我们观察到对酸性和芳香族氨基酸(如e、d、f和w)的普遍偏好。此外，可变氨基酸位置显示对于被碱性氨基酸k和h(但令人惊讶的是，r不在此列)取代的抵抗。
[0450]
6.17.15.实施例15a：umg1结合特异性——与其他cd43抗体相比，与cd43的无糖基化细胞外部分结合
[0451]
该实施例显示了人源化umg1(h-umg1)(h3-l4)和cd43(aa 20-253)细胞外部分之间的结合亲和力测量。结果报告为离解常数kd。
[0452]
方法：在40％湿度下，将溶解在水中的抗体手动打印到裸金涂层(厚度为47nm)plexarray纳米捕获传感器芯片(plexera bioscience，西雅图，华盛顿州，美国)上。检测不同浓度的分析物(cd43)的亲和力。每种浓度都以重复方式打印，每个点含有0.2ul样品溶液。芯片在4℃，80％湿度下孵育过夜，用10
×
pbst冲洗10min，1
×
pbst冲洗10min，去离子水两次冲洗10min。然后用5％(w/v)脱脂乳在水中封闭芯片过夜，用10
×
pbst冲洗10min，1
×
pbst冲洗10min，以及去离子水冲洗两次，持续10分钟，然后在使用前在氮气流下干燥。使用plexaray ht(plexera bioscience，美国华盛顿州西雅图)进行spri测量。准直光(660nm)通过耦合棱镜，从spr活性金表面反射，并被ccd摄像机接收。实验中使用了在cd43的大肠杆菌载体中产生的各种浓度的分析物(人类重组cd43细胞外部分(来自aa 20-253)；seq id no：42)(图19中不同浓度的分析物用不同的彩色线表示)。缓冲液和样品由非脉动活塞泵注入安装在耦合prim上的30μl流动池中。每个测量周期包含四个步骤：以2ul/s的恒定速率用pbst运行缓冲液清洗，以获得稳定的基线；以5ul/s的速率注射样品以进行结合；以2ul/s的速率用pbst清洗表面300s，并在2μl/s下用0.5％(v/v)h3po4再生300s。所有测量均在25℃下进行。结合和洗涤后的信号变化(单位：au)记录为分析值。
[0453]
对spr图像中选定的蛋白质接枝区域进行分析，并绘制所选区域的平均反射率随时间的变化曲线。实时结合信号由数据分析模块(美国华盛顿州西雅图plexera bioscience的dam)记录和分析。使用biacore 4.1软件(biacore公司)进行动力学分析。
[0454]
结果：spr结合结果显示cd43细胞外部分和h-umg1之间的kd值为99.4nm(图19)。结果表明与靶标有很强的结合亲和力。
[0455]
此外，与cd43的无糖基化细胞外部分(在大肠杆菌中产生，没有哺乳动物糖基化)的结合将umg1与仅与糖基化或神经氨酸酶敏感表位结合的其他抗cd43抗体(例如un1和mem-59)区分开来(de laurentiis a等，mol cellproteomics.2011年5月；10(5))。
[0456]
6.17.16.实施例15b：umg1结合特异性——umg1结合特征与un1历史数据的比较
[0457]
如上述实施例所示，与其他抗cd43抗体相比，umg1及其嵌合和人源化衍生物ch umg1和h-umg1分别具有几种不同的结合特性，包括un1的历史报告数据。表5将umg1的属性与un1上历史报告的数据进行了比较。
[0458]
[0459]
[0460][0461]
6.17.17.实施例16：ch-umg1-具有umg1结合特异性的嵌合抗体的构建
[0462]
通过使用标准技术将鼠umg1 vh(seq id no：34)融合到人类vh恒定区，并将鼠umg1 vl(seq id no：35)融合到人类轻链恒定区，构建了具有umg1结合特异性的嵌合抗体(ch-umg1)。
[0463]
6.17.18.实施例17：ch-umg1-ch-umg1诱导t细胞急性淋巴母细胞白血病/淋巴母细胞淋巴瘤的抗体依赖性细胞介导细胞毒性(adcc)
[0464]
为了确定作为免疫治疗工具的单克隆抗体ch-umg1的潜在活性，针对两种细胞系测试了其诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)的能力，这两种细胞系已在实施例3中显示表达umg1表位。
[0465]
来自健康供体(效应细胞)的pbmc与t-all细胞系hpb all或t淋巴瘤细胞系h9(靶细胞)在不同浓度的ch-umg1存在下共同培养，如下所示。
[0466]
方法：将4
×
104个靶细胞接种于96孔圆底板中，在37℃5％co2条件下，在不同浓度的单克隆抗体ch-umg1(0、10、50、100、200μg/m1)或最高剂量(200μg/ml)的嵌合阴性或阳性
对照(nc和pc分别为200μg/ml)igg1存在下培养30分钟。随后，将来自同一供体的0.4
×
106个pbmc(固定e：t＝10：1)与20μl/ml pe偶联的抗cd107a单克隆抗体(becton dickinson)一起添加到每个孔中，然后将细胞在37℃5％co2下孵育3h。1小时后，将6μg/ml莫能菌素添加到每个孔中(golgistop，bd)。在孵育期结束时，用apc偶联的抗cd56和percp偶联的抗cd3对细胞进行染色，并使用attune nxt流式细胞仪(thermo scientific)通过facs进行分析。
[0467]
结果：发现cd3-/cd56 /cd107a 细胞随着ch-umg1抗体的浓度显著增加，证实了ch-umg1抗体作为adcc诱导剂的潜力(图6a-6b)。
[0468]
嵌合单抗ch-umg1是治疗t细胞急性淋巴母细胞白血病/淋巴母细胞淋巴瘤的有效免疫治疗工具。这些数据有助于设计免疫靶向方法，这是t细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴母细胞淋巴瘤的紧迫且未得到满足的临床需求。
[0469]
6.17.19.实施例18：ch-umg1-ch-umg1诱导瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症细胞的抗体依赖性细胞介导细胞毒性(adcc)
[0470]
为了进一步研究ch-umg1抗体的免疫治疗潜力，评估了其诱导瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症细胞的抗体依赖性细胞介导细胞毒性(adcc)的能力。
[0471]
方法：我们通过将来自健康供体(效应细胞)和bcwm.1细胞系(靶细胞)的纯化nk细胞在不同浓度的ch-umg1抗体或阴性/阳性对照存在下共同培养来进行脱颗粒试验。我们选择mab西妥昔单抗作为阴性对照，mab利妥昔单抗作为阳性对照。
[0472]
具体而言，将105个靶细胞接种在96孔圆底板中，并在37℃5％co2条件下，在不同浓度的ch-umg1抗体(0、10、50、100、200μg/ml)、200μg/ml西妥昔单抗或200μg/ml利妥昔单抗存在下培养30分钟。随后，将来自同一供体的105个nk细胞(固定e∶t＝1∶1)与20μl/ml pe偶联的抗cd107a单克隆抗体(bd)一起添加到每个孔中，然后将细胞在37℃5％co2下孵育2小时。1小时后，将6μg/ml莫能菌素添加到每个孔中(golgistop，bd)。在孵育期结束时，用apc偶联的抗cd56和percp偶联的抗cd3对细胞进行染色，并在attune nxt流式细胞仪(thermo scientific)上进行分析。
[0473]
结果：发现cd3-/cd56 /cd107a 细胞随ch-umg1抗体浓度显著增加，达到与利妥昔单抗完全相同的效果。这些结果证实了ch-umg1抗体作为adcc诱导剂的潜力(图7)。嵌合单克隆抗体ch-umg1是治疗瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症的有效免疫治疗工具。
[0474]
6.17.20.实施例19：h-umg1-人源化umg1单克隆抗体的构建
[0475]
人源化umg1抗体是使用本文提供的人类重链seq id no：8至seq id no：11和人类轻链seq id no：13至seq id no：16的组合构建的。
[0476]
抗体的表达和纯化如下：使用常规(非基于pcr的)克隆技术将抗体的相应cdna克隆到载体系统中。基因合成载体质粒。基于阴离子交换色谱法，在低内毒素条件下制备质粒dna。通过在260nm波长下测量吸收来确定dna浓度。sanger测序验证了序列的正确性(根据cdna的大小，每个质粒最多有两个测序反应)。
[0477]
悬浮适应的cho k1细胞(最初从atcc获得，并适应悬浮培养中的无血清生长)用于生产。对于无糖基化抗体(a-h-umg1)，使用glymaxx技术(probiogen)，并在cho细胞(evitria)中瞬时表达。种子生长在一种化学明确的、无动物成分、无血清的培养基中。用定制的专有转染试剂转染细胞，转染后在无动物成分、无血清培养基中培养细胞。
[0478]
通过离心和后续过滤(0.2μm过滤器)收集上清液。抗体用mabselect
tm sure
tm
纯
化
tm
。使用安捷伦advancebio sec柱(300a 2.7um 7.8x300mm)和dpbs作为流动缓冲液以0.8ml/分钟通过分析尺寸排除色谱法测定纯度。
[0479]
内毒素含量用charles river endosafe pts系统测量。使用fortebio蛋白a生物传感器(动力学分析)测量效价，并根据人类igg1标准计算效价。
[0480]
测试了推定的h-umg1抗体(如实施例19所述构建)在已知对umg1表位呈阳性的hpb-all和h9细胞系上的亲和力。
[0481]
方法：通过鉴定鼠互补决定区(cdr)并通过替换框架区域中最近人类生殖系序列中的选定残基将cdr移接到人类抗体框架中，产生四个人源化重链(h 1-4)和四个人源化轻链(l 1-4)变体，目的是保护鼠对应物的潜在结构重要残基。通过将四条人源化重链(seq id no：8-11)中的每一条与四条人源化轻链(seq id no：13-16)中的每一条结合，构建了16种人源化抗体。所有重链变体均采用igg1同种型。
[0482]
此外，还产生了8个杂交chl(1-4)和h(1-4)cl变体。这8个杂交变种包括4个带小鼠重链和人类轻链，选择范围为l1-4(序列号：13-16)，4个带小鼠轻链和人类重链，选择范围为h1-4(seq id no：8-11)。
[0483]
将重组基因放入evitria载体质粒中，并(使用evifect，evitria)转染到cho k1细胞中。细胞在无动物成分、无血清培养基(evimake2，evitria)中转染后生长。通过离心收集上清液，随后进行无菌过滤(0.2μm过滤器)。
[0484]
6.17.21.实施例20：h-umg1-筛选与hpb-all和h9细胞系结合的h-umg1抗体
[0485]
选择：在2个不同的细胞系(hpb-all和h9)上筛选每个人源化抗体对靶细胞的亲和力(通过平均荧光强度，mfi进行估计)，并通过流式细胞术(attune nxt，thermo scientific)将其与嵌合(ch-umg1)和杂交单克隆抗体的结合进行比较。每次筛选进行两次，共4次重复。所有试验均在相同条件下进行：所有单克隆抗体的最终浓度均为1μg/ml；利妥昔单抗(罗氏)已被用作igg1阴性对照；fitc小鼠抗人igg(bd biosciences)被用作单克隆二抗。
[0486]
结果：所有评价的抗体都能以至少与嵌合单克隆抗体(ch-umg1)相同的亲和力结合靶标。参见图16。一种人源化抗体(h3-l4)在筛选中获得了最高的mfi，并被选择用于进一步开发，命名为umg1。参见图16。
[0487]
6.17.22.实施例21：h-umg1-通过使用人源化umg1(h-umg1)和无糖基化h-umg1(a-h-umg1)，nsg小鼠模型中的hpb-all肿瘤减少
[0488]
本实施例报告了一项体内实验的肿瘤体积曲线，该实验比较了对照igg1与人源化形式的umg1单克隆抗体(h-umg1)和无糖基化形式的umg1单克隆抗体(a-h-umg1)。
[0489]
方法：将15只nod-scid-g-链-空(nsg)小鼠皮下移植5x106个hpb-all细胞。然后将小鼠随机分组，从第1天开始，每周腹腔内注射15mg/kg对照igg1、h-umg1或h-umg1，直至死亡、肿瘤体积》2000mm3或出现不可接受的毒性。每隔一天评估一次肿瘤体积，每个治疗组在每个时间点的平均肿瘤体积如图11所示。
[0490]
结果：从第29天开始，与igg1对照组(带圆圈的线)相比，h-umg1(带正方形的线)和a-h-umg1(带三角形的线)抗体治疗组的疾病负担显著降低。参见图11。这些结果表明，这两种抗体都具有很强的抗肿瘤活性。
[0491]
6.17.23.实施例22：car-umg1-umg1靶向嵌合抗原受体t细胞(car-umg1)在h9细胞
pbs ph 7.4(gibco，10010-015)洗涤(5分钟，rt，1300rpm)后，使用af647抗人igg(pe)对t-all细胞染色20分钟。在两次1x pbs ph7.4(gibco，10010-015)洗涤(5分钟，rt，1300rpm)后，通过流式细胞术评估结合活性，作为与阴性对照相比，处理细胞中pe阳性细胞的百分比。
[0508]
结果：如图32所示，当浓度为0.001μg/ml时，umg1-cd3双特异性结合在ke37上达到最大水平，而在浓度为10μg/ml时，在ccrf-cem细胞上观察到更逐渐的结合，达到90％的结合。相反，在我们的实验条件下，在所有浓度的jurkat细胞上观察到非常低的umg1-cd3双特异性结合。结果表明，umg1-cd3双特异性抗体可与umg1 或cd3 阳性细胞结合。结果还表明，umg1-cd3对umg1的双特异性亲和力高于对cd3的亲和力。
[0509]
6.17.26.实施例25：umg1-cd3双特异性抗体介导的对t-all细胞的t细胞细胞毒性
[0510]
本实施例测试umg1-cd3双特异性抗体对t-all细胞系和患者来源的原代t-all细胞的功效。
[0511]
方法：使用包含seq id no：40的umg1-cd3构建体来产生umg1-cd3双特异性抗体。使用人外周血单核细胞(pbmc)和一组t-all细胞系和t-all原代母细胞，通过流式细胞术检测重定向t细胞的细胞毒性。
[0512]
以1∶1、5∶1、10∶1或20∶1的不同pbmc e∶t细胞比率，将浓度增加的umg1-cd3双特异性抗体与远红色(体外)标记的靶细胞以及效应细胞孵育。孵育48小时后，通过流式细胞术评估细胞混合物为靶细胞膜完整性丧失，这反映为7aad(bd pharmingen)的核摄取。
[0513]
结果：与未经处理的细胞相比，经umg1-cd3双特异性抗体处理后，主要在umg1阳性细胞中观察到增加的杀伤作用(图21a-21b；图22a-22c)。此外，表达umg1抗原的ccrf-cem(见图21a和图22a)、ke37细胞系(见图22b)和egiliii t-all母细胞(见图21b)在所检测的细胞群中显示出较高的细胞死亡率(80％至95％)，而不表达umg1抗原的all-sil细胞系在所检测的细胞群中，细胞死亡率较低(10％)(见图22c)。
[0514]
6.17.27.实施例26：umg1-cd3双特异性-确认umg1-cd3双特异性抗体介导的t细胞对t-all细胞的细胞毒性
[0515]
t-all细胞系通过免疫磁珠与总人类pbmc或去除cd8 t细胞或cd4 t细胞的pbmc共培养。
[0516]
方法：用流式细胞术检测总人外周血单核细胞或cd8 t细胞或cd4 t细胞免疫磁性消耗的(美天旎磁珠法)外周血单核细胞和ccrf-cem细胞系的重定向t细胞毒性。
[0517]
umg1-cd3双特异性抗体(1μg/ml)与远红色(体外)标记的靶细胞以及效应细胞以10∶1的pbmc e∶t细胞比率孵育。孵育48小时后，通过流式细胞术评估细胞混合物为靶细胞膜完整性丧失，这反映为7aad(bd pharmingen)的核摄取。
[0518]
结果：与总pbmc相比，在去淋巴细胞样品中观察到靶细胞毒性降低，从而证实了t细胞介导的umg1-cd3双特异性细胞毒性对t-all细胞的活性(见图24)。
[0519]
6.17.28.实施例27：umg1-cd3双特异性抗体诱导t-all细胞系凋亡
[0520]
本实施例显示了umg1-cd3双特异性在t-all细胞系中诱导凋亡的能力。
[0521]
方法：通过流式细胞术使用人外周血单核细胞(pbmc)和ccrf-cem细胞评估凋亡。
[0522]
将浓度增加的umg1-cd3双特异性抗体与远红色(体外)标记的靶细胞以及效应细胞以10∶1的pbmc e∶t细胞比率孵育。通过流式细胞术检测治疗24小时后靶细胞膜联蛋白阳
性百分比来评估细胞凋亡。
[0523]
结果：在以剂量依赖性方式用umg1-cd3双特异性抗体治疗后，观察到细胞凋亡率增加(见图23)。
[0524]
6.17.29.实施例28：umg1-cd3双特异性抗体诱导pbmc活化
[0525]
在本实施例中，测试了umg1-cd3双特异性通过接合cd3阳性t细胞诱导pbmc活化的能力。
[0526]
方法：通过流式细胞术使用来自不同健康供体的人外周血单核细胞(pbmc)来评估重定向t细胞毒性。
[0527]
将浓度增加的umg1-cd3双特异性抗体与cfse(invitrogen)标记的pbmc孵育。通过cell-titer glo(promega)和流式细胞术评估96小时处理后的细胞增殖。在用umg1-cd3双特异性抗体或阴性对照处理24小时后，通过流式细胞术分析cd4和cd8细胞上的cd69和cd25阳性来评估pbmc活化。在单用pbmc或ccrf-cem进行umg1-cd3双特异性抗体处理96小时后，通过western印迹分析评估磷酸-nfκb-p65(a-8，santacruz)的蛋白表达。在pbmc与brefeldin a(santacruz)孵育4小时后评估细胞因子释放，作为umg1-cd3双特异性抗体处理后24小时cd4和cd8细胞内ifnγ和tnfα(bdpharmingen)阳性。
[0528]
结果：umg1-cd3双特异性治疗增加了pbmc增殖(图25和图26a-26b)。与阴性对照(nc)相比，在umg1-cd3-双特异性的存在下，观察到t细胞上早期和晚期t细胞活化标志物cd25和cd69的上调(图27a-27b)。umg1-cd3双特异性诱导的激活导致ifnγ和tnfα释放增加，t细胞增殖增加(图28a-28d)。nfκb通路仅在pbmc中被umg1-cd3双特异性处理激活，而在ccrf-cem细胞系中未被激活(图29)。众所周知，在ccrf-cem细胞系中，nfκb通路被组成性激活。
[0529]
6.17.30.实施例29：umg1-cd3双特异性-umg1-cd3双特异性对多发性骨髓瘤细胞系的体外效力
[0530]
在三种不同的骨髓瘤细胞系上评估umg1-cd3双特异性的效力。
[0531]
方法：使用人外周血单核细胞(pbmc)和多发性骨髓瘤(mm)细胞系，通过流式细胞术检测重定向t细胞的细胞毒性。检测了两株umg1阳性mm细胞系(h929，kms26)和一株umg1靶抗原表位阴性(delta 47)。
[0532]
umg1-cd3双特异性抗体(1μg/ml)与远红色(体外)标记的靶细胞以及效应细胞以10∶1的pbmc e∶t细胞比率孵育。处理48小时后，通过流式细胞术评估细胞混合物是否失去靶细胞膜完整性，这反映为7aad(bdpharmingen)的核摄取。
[0533]
结果：与未经处理的细胞(nc，阴性对照)相比，经umg1-cd3双特异性抗体处理后，主要在umg1阳性细胞中观察到杀伤率增加。此外，h929和kms26 umg1阳性细胞显示80％至95％的细胞死亡(图30a-30d)，而不表达umg1抗原的delta47细胞系显示10％的细胞死亡(图30e-30f)。
[0534]
6.17.31.实施例30：umg1-cd3双特异性-umg1-cd3双特异性对睾丸癌(精原细胞瘤)细胞系的体外效力
[0535]
在睾丸癌(精原细胞瘤)细胞系上评估umg1-cd3双特异性的效力。
[0536]
方法：使用人外周血单核细胞(pbmc)和精原细胞瘤细胞系，通过流式细胞术检测重定向t细胞的细胞毒性。特别是对tcam2精原细胞瘤umg1表位阳性细胞系进行了检测。
[0537]
umg1-cd3双特异性抗体(1μg/ml)与远红(体外)标记的靶细胞以及效应细胞以10∶1的pbmc e∶t细胞比率孵育。处理48小时后，通过流式细胞术评估细胞混合物的靶细胞膜完整性丧失，这反映为7aad(bd pharmingen)的核摄取。第二个实验是在类似条件下进行的，但加入一组经a-h-umg1单抗(15mg/kg)处理的细胞，并通过流式细胞术评估24小时处理后的细胞混合物的靶细胞膜完整性丧失，这反映为7aad(bd pharmingen)的核摄取。
[0538]
结果：与未经处理的细胞相比，经umg1-cd3双特异性抗体处理48小时后，观察到tcam2细胞被显著杀伤(图31a-31b)。与a-h-umg1单抗相比，umg1-cd3双特异性抗体在处理24小时后显示出更强的杀伤作用(图31c)。
[0539]
6.18.序列
[0540]
umg1重链cdr1[seq id no：1]：
[0541]
gly phe thr phe ser ser phe gly met his
[0542]
umg1重链cdr2[seq id no：2]：
[0543]
tyr ile ser ser gly ser gly asn phe tyr tyr val asp thrval lvs
[0544]
umg1重链cdr3[seq id no：3]：
[0545]
ser thr tyr tyr his gly ser arg gly ala met asp tyrumg1轻链cdr1[seq id no：4]：
[0546]
ser ala ser ser ser va1 ser ser met tyr trp tyr
[0547]
umg1轻链cdr2[seq id no：5]：
[0548]
asp thr ser lys met ala ser
[0549]
umg1轻链cdr3[seq id no：6]：
[0550]
gln g1n trp ser ser tyr pro pro ile thr
[0551]
umg1 vh(鼠)(克隆ighv5-17*02)[seq id no：7]：
[0552]
●●
[0553]
○
cdr带下划线和斜体
[0554]
○
种系突变加粗
[0555]
■
种系中v是a
[0556]
人源化vh1(克隆ighv3-48*01)[seq id no：8]：
[0557]
●●
[0558]
○
cdr带下划线和斜体
[0559]
○
对于原小鼠序列的突变加粗
[0560]
人源化vh2(克隆ighv3-48*01，带种系逆转)[seq id no：9]：
[0561][0562]
○
cdr带下划线和斜体
[0563]
○
对于原小鼠序列的突变加粗
[0564]
人源化vh3(克隆ighv1-48*01，带种系逆转和侧接cdr的保守残基)[seqid no：10]：
[0565][0566]
○
cdr带下划线和斜体
[0567]
○
对于原小鼠序列的突变加粗
[0568]
人源化vh4(克隆ighv3-30*02，带种系逆转)[seq id no：11]：
[0569][0570]
○
cdr带下划线和斜体
[0571]
○
对于原小鼠序列的突变加粗umg1 vl(鼠，κ)(克隆ig igkv4-55*01)[seq id no：12]：
[0572][0573]
○
cdr带下划线和斜体
[0574]
○
种系突变加粗
[0575]
■
种系中a为v
[0576]
■
种系中l为q
[0577]
■
种系中i为v
[0578]
■
种系中f为y
[0579]
■
种系中v为i
[0580]
■
种系中v为m
[0581]
人源化vl1(克隆igkv3d-20*01)[seq id no：13]：
[0582][0583]
○
cdr带下划线和斜体
[0584]
○
对于原小鼠序列的突变加粗人源化vl2(igkv3d-20*01，带种系逆转)[seq id no：14]：
[0585][0586]
○
cdr带下划线和斜体
[0587]
○
对于原小鼠序列的突变加粗
[0588]
人源化vl3(克隆igkv6d-41*01)[seq id no:15]:
[0589][0590]
○
cdr带下划线和斜体
[0591]
○
对于原小鼠序列的突变加粗
[0592]
人源化vl4(克隆igkv6d-41*01，部分种系逆转)[seq id no:16]:
[0593][0594]
○
cdr带下划线和斜体
[0595]
○
对于原小鼠序列的突变加粗
[0596]
cd43克隆#1(野生型cd43带400 aa)[seq id no:17]:
[0597]
●
matlllllgvlvvspdalgsttavqtptsgeplvstseplsskmyttsitsdpkadstgdqtsalppstsinegsplwtsigastgsplpepttyqevsikmssvpqetphatshpavpitanslgshtvtggtittnspetssrtsgapvttaassletsrgtsgppltmatvsletskgtsgppvtmatdsletstgttgppvtmttgslepssgasgpqvssvklstmmspttstnastvpfrnpdensrgmlpvavlvallavivlvallllwrrrqkrrtgalvlsrggkrngvvdawagpaqvpeegavtvtvggsggdkgsgfpdgegssrrptlttffgrrksrqgslameelksgsgpslkgeeeplvasedgavdapapdepeggdgaap
[0598]
cd43克隆#2(截短的cd43)(aa 31至400)[seq id no:18]:
[0599]
●
eplvstseplsskmyttsitsdpkadstgdqtsalppstsinegsplwtsigastgsplpepttyqevsikmssvpqetphatshpavpitanslgshtvtggtittnspetssrtsgapvttaassletsrgtsgppltmatvsletskgtsgppvtmatdsletstgttgppvtmttgslepssgasgpqvssvklstmmspttstnastvpfrnpdensrgmlpvavlvallavivlvallllwrrrqkrrtgalvlsrggkrngvvdawagpaqvpeegavtvtvggsggdkg
sgfpdgegssrrptlttffgrrksrqgslameelksgsgpslkgeeeplvasedgavdapapdepeggdgaap
[0600]
cd43克隆#3截短的cd43(aa 41至400)[seq id no:19]:
[0601]
●
qtsalppstsinegsplwtsigastgsplpepttyqevsikmssvpqetphatshpavpitanslgshtvtggtittnspetssrtsgapvttaassletsrgtsgppltmatvsletskgtsgppvtmatdsletstgttgppvtmttgslepssgasgpqvssvklstmmspttstnastvpfrnpdensrgmlpvavlvallavivlvallllwrrrqkrrtgalvlsrggkrngvvdawagpaqvpeegavtvtvggsggdkgsgfpdgegssrrptlttffgrrksrqgslameelksgsgpslkgeeeplvasedgavdapapdepeggdgaap
[0602]
cd43克隆#4载短的cd43(aa 61至400)[seq id no:20]:
[0603]
●
qtsalppstsinegsplwtsigastgsplpepttyqevsikmssvpqetphatshpavpitanslgshtvtggtittnspetssrtsgapvttaassletsrgtsgppltmatvsletskgtsgppvtmatdsletstgttgppvtmttgslepssgasgpqvssvklstmmspttstnastvpfrnpdensrgmlpvavlvallavivlvallllwrrrqkrrtgalvlsrggkrngvvdawagpaqvpeegavtvtvggsggdkgsgfpdgegssrrptlttffgrrksrqgslameelksgsgpslkgeeeplvasedgavdapapdepeggdgaap
[0604]
cd43克隆#5截短的cd43(aa 91至400)[seq id no:21]:
[0605]
epttyqevsikmssvpqetphatshpavpitanslgshtvtggtittnspetssrtsgapvttaassletsrgtsgppltmatvsletskgtsgppvtmatdsletstgttgppvtmttgslepssgasgpqvssvklstmmspttstnastvpfrnpdensrgmlpvavlvallavivlvallllwrrrqkrrtgalvlsrggkrngvvdawagpaqvpeegavtvtvggsggdkgsgfpdgegssrrptlttffgrrksrqgslameelksgsgpslkgeeeplvasedgavdapapdepeggdgaap
[0606]
cd43克隆#6，从aa 64至78删除[seq id no:22]:
[0607]
●
matlllllgvlvvspdalgsttavqtptsgeplvstseplsskmyttsitsdpkadstgdqtstsigastgsplpepttyqevsikmssvpqetphatshpavpitanslgshtvtggtittnspetssrtsgapvttaassletsrgtsgppltmatvsletskgtsgppvtmatdsletstgttgppvtmttgslepssgasgpqvssvklstmmspttstnastvpfrnpdensrgmlpvavlvallavivlvallllwrrrqkrrtgalvlsrggkrngvvdawagpaqvpeegavtvtvggsggdkgsgfpdgegssrrptlttffgrrksrqgslameelksgsgpslkgeeeplvasedgavdapapdepeggdgaap
[0608]
cd43克隆#7，删除aa 69(galnac的o-糖基化位点)[seq id no:23]:
[0609]
●
matlllllgvlvvspdalgsttavqtptsgeplvstseplsskmyttsitsdpkadstgdqtsalppssinegsplwtsigastgsplpepttyqevsikmssvpqetphatshpavpitanslgshtvtggtittnspetssrtsgapvttaassletsrgtsgppltmatvsletskgtsgppvtmatdsletstgttgppvtmttgslepssgasgpqvssvklstmmspttstnastvpfrnpdensrgmlpvavlvallavivlvallllwrrrqkrrtgalvlsrggkrngvvdawagpaqvpeegavtvtvggsggdkgsgfpdgegssrrptlttffgrrksrqgslameelksgsgpslkgeeeplvasedgavdapapdepeggdgaap
[0610]
cd43克隆#8氨基酸取代t69n[seq id no:24]:
[0611]
●
matlllllgvlvvspdalgsttavqtptsgeplvstseplsskmyttsitsdpkadstgdqtsalppsnsinegsplwtsigastgsplpepttyqevsikmssvpqetphatshpavpitanslgshtvtggtittnspetssrtsgapvttaassletsrgtsgppltmatvsletskgtsgppvtmatdsletstgttgppvtmttgslepssgasgpqvssvklstmmspttstnastvpfrnpdensrgmlpvavlvallavivlvallllwrrrqkrrtgalvlsrggkrngvvdawagpaqvpeegavtvtvggsggdkgsgfpdgegssrrptlttffgrrksrqgslameelksgsgpslkgeee
plvasedgavdapapdepeggdgaap
[0612]
人核苷酸cd43全长[seq id no:25]:
[0613]
atggccacgc ttctccttct ccttggggtg ctggtggtaa gcccagacgc tctggggagc acaacagcag tgcagacacc cacctccgga gagcctttgg tctctactag cgagcccctg
[0614]
agctcaaaga tgtacaccac ttcaataaca agtgacccta aggccgacag cactggggac cagacctcag ccctacctcc ctcaacttcc atcaatgagg gatcccctct ttggacttcc
[0615]
attggtgcca gcactggttc ccctttacct gagccaacaa cctaccagga agtttccatc aagatgtcat cagtgcccca ggaaacccct catgcaacca gtcatcctgc tgttcccata
[0616]
acagcaaact ctctaggatc ccacaccgtg acaggtggaa ccataacaac gaactctcca gaaacctcca gtaggaccag tggagcccct gttaccacgg cagctagctc tctggagacc
[0617]
tccagaggca cctctggacc ccctcttacc atggcaactg tctctctgga gacttccaaa ggcacctctg gaccccctgt taccatggca actgactctc tggagacctc cactgggacc
[0618]
actggacccc ctgttaccat gacaactggc tctctggagc cctccagcgg ggccagtgga ccccaggtct ctagcgtaaa actatctaca atgatgtctc caacgacctc caccaacgca
[0619]
agcactgtgc ccttccggaa cccagatgag aactcacgag gcatgctgcc agtggctgtg cttgtggccc tgctggcggt catagtcctc gtggctctgc tcctgctgtg gcgccggcgg
[0620]
cagaagcggc ggactggggc cctcgtgctg agcagaggcg gcaagcgtaa cggggtggtg gacgcctggg ctgggccagc ccaggtccct gaggaggggg ccgtgacagt gaccgtggga
[0621]
gggtccgggg gcgacaaggg ctctgggttc cccgatgggg aggggtctag ccgtcggccc acgctcacca ctttctttgg cagacggaag tctcgccagg gctccctggc gatggaggag
[0622]
ctgaagtctg ggtcaggccc cagcctcaaa ggggaggagg agccactggt ggccagtgag gatggggctg tggacgcccc agctcctgat gagcccgaag ggggagacgg ggctgcccct
[0623]
taa
[0624]
人蛋白质cd43全长[seq id no:26]:
[0625]
●
matlllllgvlvvspdalgsttavqtptsgeplvstseplsskmyttsitsdpkadstgdqtsalppstsinegsplwtsigastgsplpepttyqevsikmssvpqetphatshpavpitanslgshtvtggtittnspetssrtsgapvttaassletsrgtsgppltmatvsletskgtsgppvtmatdsletstgttgppvtmttgslepssgasgpqvssvklstmmspttstnastvpfrnpdensrgmlpvavlvallavivlvallllwrrrqkrrtgalvlsrggkrngvvdawagpaqvpeegavtvtvggsggdkgsgfpdgegssrrptlttffgrrksrqgslameelksgsgpslkgeeeplvasedgavdapapdepeggdgaap
[0626]
umg1嵌合重链，核酸(克隆nuc 7200_evi-5 umg.1.ch-h1.hc)[seq id no:27]:
[0627]
gcggccgccatgaattttggactgaggctgattttcctggtgctgaccctgaaaggcgtccagtgtgacgtgcagctggtcgagagtggcggagggctggtgcagcccggtggcagccgaaagctgtcttgcgtcgctagtggtttcaccttttccagcttcggcatgcactgggtgaggcaggcacctgagaaaggactggaatgggtcgcctacatctctagtggaagcgggaacttctactatgtggacactgtcaaggggaggtttaccatttctcgggataacccaaaaaatacactgtttctgcaaatgacttcactgagatccgaagacaccgccatgtactattgtgctagatcaacatactaccacggctccaggggcgctatggactattggggtcagggcacctctgtgacagtctcgagcgctagcacaaagggccctagtgtgtttcctctggctccctcttccaaatccacttctggtggcactgctgctctgggatgcctggtgaaggattactttcctgaacctgtgactgtctcatggaactctggtgctctgacttctggtgtccacactttccctgctgtgctgca
gtctagtggactgtactctctgtcatctgtggtcactgtgccctcttcatctctgggaacccagacctacatttgtaatgtgaaccacaaaccatccaacactaaagtggacaaaaaagtggaacccaaatcctgtgacaaaacccacacctgcccaccttgtcctgcccctgaactgctgggaggaccttctgtgtttctgttcccccccaaaccaaaggataccctgatgatctctagaacccctgaggtgacatgtgtggtggtggatgtgtctcatgaggaccctgaggtcaaattcaactggtacgtggatggagtggaagtccacaatgccaaaaccaagcctagagaggaacagtacaattcaacctacagagtggtcagtgtgctgactgtgctgcatcaggattggctgaatggcaaggaatacaagtgtaaagtctcaaacaaggccctgcctgctccaattgagaaaacaatctcaaaggccaagggacagcctagggaaccccaggtctacaccctgccaccttcaagagaggaaatgaccaaaaaccaggtgtccctgacatgcctggtcaaaggcttctacccttctgacattgctgtggagtgggagtcaaatggacagcctgagaacaactacaaaacaaccccccctgtgctggattctgatggctctttctttctgtactccaaactgactgtggacaagtctagatggcagcaggggaatgtcttttcttgctctgtcatgcatgaggctctgcataaccactacactcagaaatccctgtctctgtctcccgggaaatgatagtaaaagctt
[0628]
umg1嵌合轻链，核酸(克隆nuc 7201_evi-5 umg.1.ch-hk.lc)[seq id no:28]
[0629]
●
gcggccgccatgaattttggactgaggctgattttcctggtgctgaccctgaaaggcgtccagtgtcagatcgccctgacccagagtcctgcaattatgtcagcctccccgggcgagaaggtgaccatgacatgctccgcttccagctctgtcagttcaatgtactggtatcagctgaagcccggctcctcccccaggctgctgatctacgacacaagcaaaatggcatctggcgtgcccattcggttcagcggctctggaagtgggacttcattttccctgaccgtgtccagagtcgaggctgaagatgccgctacatactattgtcagcagtggtctagttatccccctatcactttcggtgcaggcagcaagctcgagctgaaacgtacggtcgcggcgccttctgtgttcattttccccccatctgatgaacagctgaaatctggcactgcttctgtggtctgtctgctgaacaacttctaccctagagaggccaaagtccagtggaaagtggacaatgctctgcagagtgggaattcccaggaatctgtcactgagcaggactctaaggatagcacatactccctgtcctctactctgacactgagcaaggctgattacgagaaacacaaagtgtacgcctgtgaagtcacacatcaggggctgtctagtcctgtgaccaaatccttcaataggggagagtgctgatagtaaaagctt人源化重链(vh3)，核酸(克隆nuc 7683_evi-5 umg.hum3-h1.hc)，核酸[seq id no:29]
[0630]
gcggccgccatgaattttggactgaggctgattttcctggtgctgaccctgaaaggcgtccagtgtgaggtgcagctggtggaatctggcggagggctggtgcagcccggtggcagcctgagactgtcttgcgtcgccagtggattcaccttttccagcttcgggatgcactgggtcaggcaggcacctggaaaggggctggagtgggtggcctacatctctagtggttccggcaacttctactatgtggacactgtcaagggcaggtttaccattagccgggataacgctaaaaattctctgtatctgcaaatgaatagtctgagagccgaagacacagccgtgtactattgtgctagatcaacttactatcatggttcccgcggcgcaatggattactggggacaggggaccctggtgacagtctcgagcgctagcacaaagggccctagtgtgtttcctctggctccctcttccaaatccacttctggtggcactgctgctctgggatgcctggtgaaggattactttcctgaacctgtgactgtctcatggaactctggtgctctgacttctggtgtccacactttccctgctgtgctgcagtctagtggactgtactctctgtcatctgtggtcactgtgccctcttcatctctgggaacccagacctacatttgtaatgtgaaccacaaaccatccaacactaaagtggacaaaaaagtggaacccaaatcctgtgacaaaacccacacctgcccaccttgtcctgcccctgaactgctgggaggaccttctgtgtttctgttcccccccaaaccaaaggataccctgatgatctctagaacccctgaggtgacatgtgtggtggtggatgtgtctcatgaggaccctgaggtcaaattcaactggtacgtggatggagtggaagtccacaatgccaaaaccaagcctagagaggaacagtacaattcaacctacagagtggtcagtgtgctgactgtgctgcatcaggattggctgaatggcaaggaatacaagtgtaaagtctcaaacaaggccctgcctgctccaattgagaaaacaatctcaaaggccaagggacagcctagggaaccccaggtctacaccctgccaccttcaagagaggaaatgaccaaaaaccaggtgtccctgacatgcctggtcaaaggcttctacccttctgacattgctgtggag
tgggagtcaaatggacagcctgagaacaactacaaaacaaccccccctgtgctggattctgatggctctttctttctgtactccaaactgactgtggacaagtctagatggcagcaggggaatgtcttttcttgctctgtcatgcatgaggctctgcataaccactacactcagaaatccctgtctctgtctcccgggaaatgatagtaaaagctt
[0631]
人源化轻链(vl4)，核酸(克隆nuc 7700_evi-5 umg.hum4-hk.lc)[seq id no:30]
[0632]
●
gcggccgccatgaattttggactgaggctgattttcctggtgctgaccctgaaaggcgtccagtgtcaggtggtcatgacccagtctcctgctttcctgtccgtgacaccgggcgagaaggtcaccatcacatgctccgcatccagctctgtcagttcaatgtactggtatcagctgaagccagaccaggcacccaaactgctgatctacgatacatctaaaatggccagtggcgtccccattaggttctcgggatcggggagcggaactgacttcacttttaccgtgtcgagcgtcgaggccgaagatgccgctacctactattgtcagcagtggtctagttatccccctatcacatttggcggagggactaaggtggagattaagcgtacggtcgcggcgccttctgtgttcattttccccccatctgatgaacagctgaaatctggcactgcttctgtggtctgtctgctgaacaacttctaccctagagaggccaaagtccagtggaaagtggacaatgctctgcagagtgggaattcccaggaatctgtcactgagcaggactctaaggatagcacatactccctgtcctctactctgacactgagcaaggctgattacgagaaacacaaagtgtacgcctgtgaagtcacacatcaggggctgtctagtcctgtgaccaaatccttcaataggggagagtgctgatagtaaaagctt小鼠重链，核酸(克隆nuc 29709_evi-5 umg.vh-m1.hc)[seq id no:31]
[0633]
●
gcggccgccatgaattttggactgaggctgattttcctggtgctgaccctgaaaggcgtccagtgtgacgtgcagctggtcgagagtggcggagggctggtgcagcccggtggcagccgaaagctgtcttgcgtcgctagtggtttcaccttttccagcttcggcatgcactgggtgaggcaggcacctgagaaaggactggaatgggtcgcctacatctctagtggaagcgggaacttctactatgtggacactgtcaaggggaggtttaccatttctcgggataacccaaaaaatacactgtttctgcaaatgacttcactgagatccgaagacaccgccatgtactattgtgctagatcaacatactaccacggctccaggggcgctatggactattggggtcagggcacctctgtgacagtctcgagcgcaaaaacaacccctccaagcgtctaccccctggcgcctgggagcgcggcgcagacgaactcgatggtcacgttggggtgcctcgtcaagggatatttcccggagccagtcacggtcacgtggaactcggggagcctgtcgagcggcgtccacacgttcccggcagtcctgcaaagcgacctgtacacgctgagctcgtcagtcacggtcccgagctcgacgtggccgtcggagacggtcacgtgcaacgtggcgcacccggcgagctcgacgaaagtggacaagaagatcgtgccgcgggactgcgggtgcaagccatgcatatgcacggtcccggaagtgtcgagcgtgttcatcttcccgccgaagccgaaggacgtgctgacgatcacgctgacgccgaaagtcacgtgcgtcgtcgtagacatctcgaaggacgacccggaagtccagttctcgtggttcgtcgacgacgtggaagtccacacggcgcagacgcagccgcgggaggagcagttcaactcgacgttcaggagcgtgtcggagctgccgatcatgcaccaggactggctgaacgggaaggagttcaagtgccgcgtcaactcggcggcgttcccagcgccaattgagaagacgatctcgaagacgaaggggcggccgaaagcgccgcaagtctacacgatcccgccgccgaaggagcagatggcgaaggacaaagtctcgctgacgtgcatgatcacggacttcttcccggaggacatcacggtcgagtggcagtggaacgggcagcctgcagagaactacaagaacacgcagccgatcatggacacggacgggagctacttcgtgtactcgaagctgaacgtgcagaagtcgaactgggaggcggggaacacgttcacgtgctcagtcctgcacgaggggctgcacaaccaccacacggagaagagcctgtcgcactcgcccgggaaatgataagctt
[0634]
小鼠轻链，核酸(克隆nuc 29710_evi-5 umg.vl-mk.lc)[seq id no:32]
[0635]
●
gcggccgccatgaattttggactgaggctgattttcctggtgctgaccctgaaaggcgtccagtgtcagatcgccctgacccagagtcctgcaattatgtcagcctccccgggcgagaaggtgaccatgacatgctccgcttccagctctgtcagttcaatgtactggtatcagctgaagcccggctcctcccccaggctgctgatctacgacacaagca
aaatggcatctggcgtgcccattcggttcagcggctctggaagtgggacttcattttccctgaccgtgtccagagtcgaggctgaagatgccgctacatactattgtcagcagtggtctagttatccccctatcactttcggtgcaggcagcaagctcgagctgaaacgggctgacgcggcgcctacagtctccatttttccacctagtagcgaacagctgacatccgggggggcttccgtcgtctgctttctgaacaacttttaccccaaggacatcaacgtgaagtggaaaattgatggctccgagaggcagaacggagtcctgaattcttggaccgaccaggattctaaggacagtacatattcaatgtccagcaccctgacactgactaaagatgagtacgaacggcacaatagctatacctgcgaggcaacccataaaacaagcacaagcccaatcgtcaaatccttcaaccgtaatgagtgttgataagctt
[0636]
双特异性人重链，核酸(nuc 32827_evi-5 umg.vh3-h1.hc-cd3.scfv)[seq id no:33]
[0637]
●
gcggccgccatgaattttggactgaggctgattttcctggtgctgaccctgaaaggcgtccagtgtgaggtgcagctggtggaatctggcggagggctggtgcagcccggtggcagcctgagactgtcttgcgtcgccagtggattcaccttttccagcttcgggatgcactgggtcaggcaggcacctggaaaggggctggagtgggtggcctacatctctagtggttccggcaacttctactatgtggacactgtcaagggcaggtttaccattagccgggataacgctaaaaattctctgtatctgcaaatgaatagtctgagagccgaagacacagccgtgtactattgtgctagatcaacttactatcatggttcccgcggcgcaatggattactggggacaggggaccctggtgacagtctcgagcgctagcacaaagggccctagtgtgtttcctctggctccctcttccaaatccacttctggtggcactgctgctctgggatgcctggtgaaggattactttcctgaacctgtgactgtctcatggaactctggtgctctgacttctggtgtccacactttccctgctgtgctgcagtctagtggactgtactctctgtcatctgtggtcactgtgccctcttcatctctgggaacccagacctacatttgtaatgtgaaccacaaaccatccaacactaaagtggacaaaaaagtggaacccaaatcctgtgacaaaacccacacctgcccaccttgtcctgcccctgaactgctgggaggaccttctgtgtttctgttcccaccaaaaccaaaagataccctgatgatctctagaacccctgaggtgacatgtgtggtggtggatgtgtctcatgaggaccctgaggtcaaattcaactggtacgtggatggagtggaagtccacaatgccaaaaccaagcctagagaggaacagtacaattcaacctacagagtggtcagtgtgctgactgtgctgcatcaggattggctgaatggcaaggaatacaagtgtaaagtctcaaacaaggccctgcctgctccaattgagaaaacaatctcaaaggccaagggacagcctagggaaccccaggtctacaccctgccaccttcaagagaggaaatgaccaaaaaccaggtgtccctgacatgcctggtcaaaggcttctacccttctgacattgctgtggagtgggagtcaaatggacagcctgagaacaactacaaaacaaccccccctgtgctggattctgatggctctttctttctgtactccaaactgactgtggacaagtctagatggcagcaggggaatgtcttttcttgctctgtcatgcatgaggctctgcataaccactacactcagaaatccctgtctctgtctcctggcaaaggcggcggaggatccgggggtgggggaagcggcggaggaggtagcgacatcaaactgcagcagagtggagccgaactggctagacctggtgcttctgtgaaaatgtcctgtaaaacctccggttacacctttacccggtacacaatgcattgggtgaaacagaggcctggacaggggctggaatggatcggatacatcaaccctagtcggggatacacaaactacaaccagaaattcaaagacaaggccaccctgacaaccgacaaatcttcttctactgcctacatgcagctgtcatctctgacttccgaggatagtgccgtctactactgtgctcggtactacgatgatcattactgtctggactactggggccagggaacaacacttaccgtttctagcgtcgagggcggatctggcggtagcggtggatctggaggctctggaggagtggatgatatccagctgacccagtctcctgctatcatgtccgcttcacctggcgaaaaagtgaccatgacctgccgtgcttcatcttccgtgtcatacatgaattggtaccagcagaaatctggcacatctcccaaacgatggatctacgacacctcaaaagtcgctagtggcgtgccttaccgtttctccggttccggatctggaacatcatactccctgaccatctcttctatggaggctgaggatgctgccacatactactgtcagcagtggagtagcaatcctctgacctttggtgctgggacaaaactggagctgaaatgataagctttga
[0638]
嵌合重链，(克隆pro 7200_evi-5 umg.1.ch-h1.hc)[seq id no:34]
[0639]
●
dvqlvesggglvqpggsrklscvasgftfssfgmhwvrqapekglewvayissgsgnfyyvdtvkgrftisrdnpkntlflqmtslrsedtamyycarstyyhgsrgamdywgqgtsvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0640]
嵌合轻链(克隆pro 7201_evi-5 umg.1.ch-hk.lc)[seq id no:35]
[0641]
●
qialtqspaimsaspgekvtmtcsasssvssmywyqlkpgssprlliydtskmasgvpirfsgsgsgtsfsltvsrveaedaatyycqqwssyppitfgagsklelkrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0642]
人重链(vh3)(克隆pro 7683_evi-5 umg.hum3-h1.hc)[seq id no:36]
[0643]
●
evqlvesggglvqpggslrlscvasgftfssfgmhwvrqapgkglewvayissgsgnfyyvdtvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycarstyyhgsrgamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0644]
人轻链(vl4)(克隆pro 7700_evi-5 umg.vl4-hk.lc)[seq id no:37]
[0645]
●
qvvmtqspaflsvtpgekvtitcsasssvssmywyqlkpdqapklliydtskmasgvpirfsgsgsgtdftftvssveaedaatyycqqwssyppitfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0646]
小鼠重链(克隆pro 29709_evi-5 umg.vh-m1.hc)[seq id no:38]
[0647]
●
dvqlvesggglvqpggsrklscvasgftfssfgmhwvrqapekglewvayissgsgnfyyvdtvkgrftisrdnpkntlflqmtslrsedtamyycarstyyhgsrgamdywgqgtsvtvssakttppsvyplapgsaaqtnsmvtlgclvkgyfpepvtvtwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvpsstwpsetvtcnvahpasstkvdkkivprdcgckpcictvpevssvfifppkpkdvltitltpkvtcvvvdiskddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenykntqpimdtdgsyfvysklnvqksnweagntftcsvlheglhnhhtekslshspgk
[0648]
小鼠轻链(克隆pro 29710_evi-5 umg.vl-mk.lc)[seq id no:39]
[0649]
●
`qialtqspaimsaspgekvtmtcsasssvssmywyqlkpgssprlliydtskmasgvpirfsgsgsgtsfsltvsrveaedaatyycqqwssyppitfgagsklelkradaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtdqdskdstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec
[0650]
双特异性人重链-cd3(克隆pro 32827_evi-5 umg.vh3-h1.hc-cd3.scfv)[seq id no:40]
[0651]
●
evqlvesggglvqpggslrlscvasgftfssfgmhwvrqapgkglewvayissgsgnfyyvdtvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycarstyyhgsrgamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkv
epkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkggggsggggsggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssveggsggsggsggsggvddiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelk
[0652]
car-t的质粒序列，核酸[seq id no:41]:
[0653]
●
acgcgtgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacctgaaagcgaaagggaaaccagagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcctcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaattcaaaattttatcgatactagtattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtttatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagattctagagccgccaccatggccctcccagtaaccgccctcctgctcccccttgctttgctgctgcacgccgcacggcccgctagcgaagttcagcttgtc
gaatctgggggagggttggttcagccgggagggagtctgcgcctttcttgcgtggcttcaggctttaccttttccagttttgggatgcattgggtacgacaagcacctgggaaaggactggagtgggtggcatatatatcaagcggcagcggaaacttctactacgttgacactgtaaaagggagattcaccatctcccgagacaacgctaaaaactcactctatcttcaaatgaatagcctgcgagctgaggatacggcggtttactactgcgcgcgatcaacatattaccacgggtccagaggcgcgatggactactgggggcaagggactttggttactgtgggtggcggaggcagcggcggtggtggttccggaggcggcggttctcaagtcgttatgacccaaagccccgcatttctttctgtgactccaggcgagaaggtgacgataacctgttcagccagttccagtgtctccagtatgtattggtatcaactgaaaccagatcaggcaccgaagcttttgatatatgacacatctaaaatggcatcaggggtacccataaggtttagcgggtccggctcagggaccgattttacgtttactgtctcatccgtcgaggcggaagatgcagcgacctattactgccagcagtggagtagttatccccccatcacgtttggcggcggtacgaaagtggagataaaggactacaaagacgatgacgacaagctcgagaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaataggaattcgtcgacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaaaataagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggctctagctatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctagacttttgcagagacggcccaaattcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgc
cagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgccaagctg
[0654]
●
[0655]
重组人蛋白cd43(aa 20至253)[seq id no:42]:
[0656]
●
sttavqtptsgeplvstseplsskmyttsitsdpkadstgdqtsalppstsinegsplwtsigastgsplpepttyqevsikmssvpqetphatshpavpitanslgshtvtggtittnspetssrtsgapvttaassletsrgtsgppltmatvsletskgtsgppvtmatdsletstgttgppvtmttgslepssgasgpqvssvklstmmspttstnastvpfrnpdensr
[0657]
umg1重链cdr2
–
长[seq id no:43]
[0658]
●
yissgsgnfyyvdtvkg
[0659]
umg1 vh(鼠)
–
替代序列[seq id no:44]
[0660]
●
dvqvesggglvqpggsrklscvasgftfssfgmhwvrqapekglewvayissgsgnfyyvdtvkgrftisrdnpkntlflqmtslrsedtamyycarstyyhgsrgamdywgqgtsvtvss
[0661]
人源化vh1
–
替代序列[seq id no:45]
[0662]
●
evqvesggglvqpggslrlscaasgftfssfgmhwvrqapgkglewvsyissgsgnfyyvdtvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycarstyyhgsrgamdywgqgtlvtvss
[0663]
中性肽接头[seq id no:46]
[0664]
●
gsgsgsg
[0665]
来自流感血凝素(ha)表位的合成肽[seq id no:47]
[0666]
●
ypydvpdyag
[0667]
人cd43的线性表位
–
aa 71-78[seq id no:48]
[0668]
●
inegsplw
[0669]
人cd43的线性表位
–
高度碱性序列1[seq id no:49]
[0670]
●
rrrqkr
[0671]
人cd43的线性表位
–
高度碱性序列2[seq id no:50]
[0672]
●
rrptlttffgrrk
[0673]
人cd43的线性表位，用于取代筛选[seq id no:51]
[0674]
●
ppstsinegsplwts
[0675]
非人cd43的线性表位[seq id no:52]
[0676]
●
ppstsvnegsplgts
[0677]
人cd43的线性表位
–
aa 73-78[seq id no:53]
[0678]
●
egsplw
[0679]
人cd43的线性肽序列-aa 66-72[seq id no:54]
[0680]
●
ppstsin
[0681]
人cd43的线性肽序列
–
aa 79-80[seq id no:55]
[0682]
●
ts
[0683]
表8:umg1 cdr序列
[0684]
[0685][0686]
7.通过引用纳入本文
[0687]
本技术中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文件在此以引用的方式全部纳入，用于所有目的，其程度与每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文件被单独指示以引用的方式纳入用于所有目的的程度相同。
[0688]
8.等价形式
[0689]
虽然已经示出并描述了各种具体实施方式，但上述说明书并不具有限制性。应当理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种改变。本领域技术人员在阅读本说明书后将清楚地想到许多改变。