可作为益生元的金耳多糖ATP-L1及其制备方法和应用与流程

可作为益生元的金耳多糖atp-l1及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及源自金耳的益生元物质及其制备和应用技术领域。


背景技术：

2.金耳俗称脑耳、黄耳和黄木耳等，是一种珍稀食用和药用真菌。金耳作为“三耳”之首，较木耳和银耳的子实体大，口感更佳细腻柔和，色泽更加鲜艳（参见李曦,邓兰,周娅,仲伶俐,赵珊,雷欣宇,郑幸果.金耳、银耳与木耳的营养成分比较[j].食品研究与开发,2021,42(16):77-82.）。益生元是不被宿主消化吸收却能够选择性地促进体内有益菌的代谢和增殖，从而改善宿主健康的有机物质。肠道微生物是人体微生态系统的重要组成部分，参与机体对营养物质的吸收和消化，对人体代谢非常重要。食用菌多糖是一种极性大分子物质，能够促进肠道内有益微生物的增殖，促进短链脂肪酸等次生代谢物的产生，调节机体免疫平衡，增强抵抗力。金耳多糖作为一种生物活性物质能够通过增强患者的免疫防御系统，达到抑病抗病的效果（参见杨林雷,李荣春,曹瑶,李梦杰,罗祥英,沈真辉,陆青青.金耳及金耳多糖的药用保健功效及其机理研究进展[j].食药用菌,2021,29(03):176-182.）。然而与其它真菌多糖相比，目前对金耳子实体多糖作为益生元在改善肠道微生物促进人体健康方面还鲜有报道。


技术实现要素：

[0003]
本发明的目的是提供一种可作为益生元的金耳子实体多糖atp-l1，并提供这种金耳子实体多糖atp-l1的制备方法及其在制备益生元食品、保健品和饲料中的应用。
[0004]
本发明采取的技术方案如下：一种可作为益生元的金耳多糖atp-l1，其分子量为7.6
×
105da，其单糖组成按摩尔比为甘露糖：木糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：半乳糖＝5：4.1：1.1：0.1：0.1。
[0005]
所述可作为益生元的金耳多糖atp-l1的益生元来源于保藏号为cgmcc no.20271的金耳菌菌株和保藏号为cgmcc no.19659的毛韧革菌菌株。
[0006]
所述可作为益生元的金耳多糖atp-l1的制备方法如下：（1）将金耳子实体采用水提醇沉，制备得到纯度大于90%的金耳子实体粗多糖；（2）用蒸馏水溶解步骤（1）得到的金耳子实体粗多糖，用氯仿与正戊醇按质量比5：1混合后对金耳子实体粗多糖溶液进行去蛋白处理；（3）用deae-sepharose tm fast flow阴离子柱对经步骤（2）去蛋白处理过的金耳子实体粗多糖进行层析，上样条件为50mg金耳子实体粗多糖溶于10ml蒸馏水，流速1ml/min，收集洗脱液；（4）用akta explorer层析系统进行sephacryl s-400凝胶层析，凝胶柱规格100cmx26mm；上样条件为，将步骤（3）收集的水洗脱多糖溶液进行浓缩和冷冻干燥，将100mg水洗脱多糖样品溶于10ml蒸馏水，流速为1ml/min，收集溶液进行浓缩和冷冻干燥后得到金耳子实体多糖atp-l1。
[0007]
本发明所述的金耳子实体多糖atp-l1在肠道益生元制品制备中的应用。
[0008]
所述肠道益生元制品为食品、保健品和饲料中的一种。
[0009]
将本发明的金耳子实体多糖atp-l1对小鼠进行灌胃处理后，一方面能够增加小鼠抗炎因子白细胞介素-10（il-10）表达量，降低小鼠炎性因子白细胞介素-6（il-6）和白细胞介素-1β（il-1β）表达量，提高机体免疫力；另一方面可促进肠道益生菌类群乳酸杆菌属和拟杆菌属的增殖，降低厚壁菌门在小鼠肠道内的丰度，增加拟杆菌门在小鼠肠道内的丰度，改善肠道微生物群落结构，促进肠道益生菌的增殖，促进机体健康。
[0010]
将本发明的金耳子实体多糖atp-l1应用于益生元食品、保健品和饲料中，具有较好的抗炎作用，并且能够促进肠道益生菌的生长，为益生元食品及制剂提供了新的添加成分选择。
附图说明
[0011]
图1为金耳子实体多糖atp-l1调节小鼠细胞因子表达含量变化图；图2为金耳子实体多糖atp-l1调节小鼠肠道微生物类群在属水平相对丰度比较图；图3为金耳子实体多糖atp-l1调节小鼠肠道微生物类群在门水平相对丰度比较图。
具体实施方式
[0012]
下面结合具体实施例对本发明的内容进行进一步的阐述。
[0013]
实施例1可作为益生元使用的金耳多糖atp-l1，其分子量为7.6
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105da，其单糖组成按摩尔比为甘露糖：木糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：半乳糖＝5：4.1：1.1：0.1：0.1。益生元来源于保藏号为cgmcc no.19659的毛韧革菌菌株和保藏号为cgmcc no.20271的金耳菌菌株，在公开号为cn112592835a的中国专利申请中已经公开，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏日期为分别为2020年6月11日和2020年9月18日。
[0014]
所述金耳多糖atp-l1的制备方法如下：（1）将金耳子实体采用水提醇沉，制备得到纯度大于90%的金耳子实体粗多糖；（2）用蒸馏水溶解步骤（1）得到的金耳子实体粗多糖，用氯仿与正戊醇按质量比5：1混合后对金耳子实体粗多糖溶液进行去蛋白处理；（3）用deae-sepharose tm fast flow阴离子柱对经步骤（2）去蛋白处理过的金耳子实体粗多糖进行层析，上样条件为50mg金耳子实体粗多糖溶于10ml蒸馏水，流速1ml/min，收集洗脱液；（4）用akta explorer层析系统进行sephacryl s-400凝胶层析，凝胶柱规格100cmx26mm；上样条件为，将步骤（3）收集的水洗脱多糖溶液进行浓缩和冷冻干燥，将100mg水洗脱多糖样品溶于10ml蒸馏水，流速为1ml/min，收集溶液进行浓缩和冷冻干燥后得到金耳子实体多糖atp-l1。
[0015]
将小鼠随机分为实验组（金耳子实体多糖组）和对照组（bc），每组各5只小鼠。对照
组小鼠给予0.2ml生理盐水灌胃，每天一次。金耳子实体多糖组按150mg/kg.bw的剂量用0.2ml生理盐水将实施例1的金耳子实体多糖atp-l1溶解后进行灌胃，每天一次。所有小鼠自由进食和饮水，每天灌胃给药后称量每只小鼠重量，调整给药量，以备第二天灌胃给药。21天后采用脱臼法处死小鼠，摘眼球取血并采用酶联免疫法（elisa）进行细胞因子检测，根据标准品的浓度和od值做标准曲线，最后根据标准曲线方程计算小鼠血清中白细胞介素
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6（il-6）、白细胞介素-1β（il-1β）和白细胞介素-10（il-10）的浓度。
[0016]
结果如图1所示：金耳子实体多糖处理组il-1β表达水平在对照组的基础上降低了94.69%， il-6在在对照组的基础上降低了50.91%，il-10在对照组的基础上上升了了218.7%。说明小鼠腹腔注射金耳子实体多糖溶液能够上调机体抗炎因子表达水平，下调炎性因子表达水平，具有免疫调节作用。
[0017]
将小鼠随机分为实验组（金耳子实体多糖组）和对照组（bc）实验组，每组各5只小鼠。对照组小鼠给予0.2ml生理盐水灌胃，每天一次。金耳子实体多糖组按150mg/kg.bw的剂量用0.2ml生理盐水将实施例2的金耳子实体多糖atp-l1溶解后灌胃，每天一次。所有小鼠自由进食和饮水，每天灌胃给药后称量每只小鼠重量，调整给药量，以备第二天灌胃给药。最后一次灌胃24小时后脱臼法处死小鼠，将小鼠固定于解剖板，剖开腹腔，无菌收集回盲部末端10cm以内的盲肠内容物，将样品送至测序公司进行16s扩增子测序，进行肠道微生物区系分析。
[0018]
结果如图2所示:金耳子实体多糖组与对照组相比，在属水平上乳酸杆菌属lactobacillus丰度增加了46.7%、拟杆菌属bacteroides丰度增加了10.8%、阿克曼氏菌属akkermansia丰度增加了19.4%。说明在肠道中乳酸杆菌能够分解糖类产生乳酸，维持肠道酸度，抑制病原菌的繁殖，而拟杆菌在肠道内能够代谢膳食纤维和多糖，产生有益于宿主和其它肠道益生菌的物质。
[0019]
研究表明小鼠体内的厚壁菌门与拟杆菌门的比例与肥胖密切相关，厚壁菌门升高或拟杆菌门降低都会促进肥胖的发生。根据如图3所示的实验结果，金耳子实体多糖组与对照组相比，在门水平上厚壁菌门firmicutes丰度降低了12.5%，拟杆菌门bacteroidetes丰度升高了22.7%。说明金耳子实体多糖能够改善肠道微生物群落结构，促进肠道益生菌的增殖，有益于机体健康。
[0020]
实施例2将本发明的金耳子实体多糖atp-l1应用于食品，应用方法如下：将金耳子实体多糖atp-l1添加于奶粉、饼干、面包等食品中，添加量为2%。
[0021]
实施例3将本发明的金耳子实体多糖atp-l1应用于保健品，应用方法如下：将金耳子实体多糖atp-l1添加于阿胶、蜂胶、蛋白质粉等保健品中，添加量为26.15 %。
[0022]
实施例4将本发明的金耳子实体多糖atp-l1应用于犬饲料，应用方法如下：将金耳子实体多糖atp-l1添加于干型犬粮中，添加量为3.74%。
[0023]
除非另有说明，本发明涉及的百分数均为质量百分数。