一种假单胞菌及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种假单胞菌及其应用。


背景技术：

2.近年来，随着学界对盐碱地土壤的生态系统服务功能的深入研究发现，盐碱地土壤中储存着大量的土壤无机碳。由于盐碱地受盐碱胁迫，仅有少数耐盐植物可以生长，且由于环境限制，植被稀少，因此其固碳能力值得深入探讨。土壤微生物作为地球化学循环的引擎，在土壤碳转化过程中发挥着重要的作用。对土壤微生物的深入研究，对于合理评判盐碱地土壤碳过程，以及盐碱地土壤无机碳的形成机制，具有非常重要的意义。详细了解此类微生物形成含碳矿物质的功能，具有极为重要的潜在应用价值。


技术实现要素：

3.本发明提出一种假单胞菌及其应用，首次公开了从盐碱地土壤中分离的假单胞菌具有利用多种物质生成碳酸盐矿物的能力。
4.为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：提供一种假单胞菌，命名为yrd202202cf，分类命名为假单胞菌pseudomonas sp.，于2022年3月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码为100101，保藏编号为cgmcc no.24519。
5.进一步地，假单胞菌的16s rdna基因序列如seq id no.1所示。
6.进一步地，假单胞菌来源于盐碱地土壤。
7.进一步地，假单胞菌的筛选方法为：将盐碱地土壤稀释，取土壤稀释液接种至含草酸钙的无机盐msm培养基中，培养分离获得假单胞菌。
8.本发明还提供假单胞菌在代谢利用草酸钙形成含碳矿物质中的应用。
9.本发明还提供假单胞菌在诱导碳酸盐矿物生成中的应用。
10.本发明还提供假单胞菌在固定大气二氧化碳中的应用。
11.进一步地：含碳矿物质包括但不限于含碳无机化合物，如碳酸盐。
12.进一步地：碳酸盐包括但不限于碳酸钙以及碳酸钙的同质异形体，如球霰石、方解石。
13.本发明的有益效果为：本发明首次公开了从盐碱地土壤中分离的假单胞菌具有利用多种物质生成碳酸盐矿物的能力，对于深入认识土壤碳转化过程，提升土壤碳储量潜力，固定大气co2，减缓大气“温室效应”，缓解全球气候变暖，具有重要应有价值和科学意义。
附图说明
14.图1为本发明实施例2中实验组土壤薄层表面电镜扫描图；图2为本发明实施例2中对照组土壤薄层表面电镜扫描图；
图3为本发明实施例2中实验组土壤薄层表面矿物能量色散衍射分析图；图4为本发明实施例2中对照组土壤薄层表面矿物能量色散衍射分析图；图5为本发明实施例3中沉淀物电镜扫描图；图6为本发明实施例3中沉淀物能量色散衍射分析图。
具体实施方式
15.下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
16.若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册（sambrook j & russell dw，molecular cloning: a laboratory manual，2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
17.实施例1菌株yrd202202cf的分离鉴定：以山东黄河三角洲典型盐碱地的土壤为目标土壤，具体筛选步骤如下：1、采集0-10 cm深度的土壤，取采集的土壤1.0 g，加入到9 ml灭菌水中，震荡10 min，制成土壤溶液。取1 ml土壤悬浮液，置于 9 ml 灭菌水中，稀释土壤溶液。重复此操作，将土壤溶液稀释到10-3
倍。取100 μl土壤稀释液，接种至含草酸钙的无机盐msm培养基中，在25℃条件下培养7天。
18.具体地说，培养基成分为：na2hpo4·
2 h2o，3.5 g/l； kh2po4，1.0 g/l；(nh4) 2 so4，0.5 g/l；mgcl2·
6 h2o，0.1 g/l；ca(no3)2·
4 h2o，0.05 g/l；微量元素溶液，1 ml/l；cac2o4，2 g/l；1.5%琼脂，ph 7.25。
19.微量元素溶液的配方为：feso4·
7h2o，0.4 g/l；znso4·
7h2o，0.1 g/l；mncl2· 4h2o，0.3 g/l；h3bo3，0.3 g/l；cucl2·
2h2o，0.1 g/l；nicl2·
6h2o，0.2 g/l；namoo4，0.3 g/l；cocl2·
6h2o，0.1 g/l；na2seo4·
2h2o，0.05 g/l。
20.2、挑取培养基上生长出来的单菌落，涂布于lb培养基上，进一步分离纯化。获得菌株yrd202202cf。
21.3、对菌株yrd202202cf进行16s rdna测序：采用通用引物27f和1492r引物对菌株yrd202202cf的基因组dna进行pcr扩增，将扩增产物进行测序，测序结果如seq id no.1所示。
22.seq id no.1如下所示：tacaccgtggtaccgtcctcccgaaggttagactagctacttctggtgcaacccactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcgacattctgattcgcgattactagcgattccgacttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccggactacgatcggttttatgggattagctccacctcgcggcttggcaaccctttgtaccgaccattgtagcacgtgtgtagcccaggccgtaagggccatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctccttagagtgcccaccataacgtgctggtaactaaggacaagggttgcgctcgttacgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtctcaatgttcccgaaggcaccaatccatctctggaaagttcattggatgtcaaggcctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctc
caccgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgagttttaaccttgcggccgtactccccaggcggtcaacttaatgcgttagctgcgccactaagagctcaaggctcccaacggctagttgacatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcacctcagtgtcagtatcagtccaggtggtcgccttcgccactggtgttccttcctatatctacgcatttcaccgctacacaggaaattccaccaccctctaccatactctagctcgccagttttggatgcagttcccaggttgagcccggggatttcacatccaacttaacgaaccacctacgcgcgctttacgcccagtaattccgattaacgcttgcaccctctgtattaccgcggctgctggcacagagttagccggtgcttattctgtcggtaacgtcaaaattgcagagtattaatctacaacccttcctcccaacttaaagtgctttacaatccgaagaccttcttcacacacgcggcatggctggatcaggctttcgcccattgtccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctggaccgtgtctcagttccagtgtgactgatcatcctctcagaccagttacggatcgtcgccttggtgagccattacctcaccaactagctaatccgacctaggctcatctgatagcgcaaggcccgaaggtcccctgctttctcccgtaggacgtatgcggtattagcgttcctttcgaaacgttgtcccccactaccaggcagattcctaggcattactcacccgtccgccgctgaatccaggagcaagctcctttcatccgctcgacttgcatg利用ncbi数据库，根据菌株16s rdna基因序列进行blast分析，结果表明菌株16s rdna基因序列与假单胞菌属同源（与pseudomonas sp. bf1-3同源性99 %，genbank：kj849233.1），综合菌株yrd202202cf的形态、结构和生理生化方面的特性，最终确定菌株为假单胞菌，并命名为yrd202202cf。
23.实施例2菌株yrd202202cf利用难利用有机物（草酸钙）形成含碳矿物质：1、对盐碱地土壤进行酸化、中和、淋溶和烘干处理，获得不含无机碳的土壤。取10 g处理后的土壤样品，加入200 mg草酸钙粉末作为碳源物质，加入20 mg聚乙二醇作为土壤粘结剂，混匀，将混合样品置于50 ml去离子水中，在旋涡振荡器上振荡5 min，制成悬浊液。取200 μl悬浊液置于35 mm直径的培养皿中，并在无尘环境中晾干，此时培养皿内形成一个土壤薄层。该薄层为用于观测微生物转化草酸钙为含碳矿物的观测界面。
24.2、将含有土壤薄层的培养皿，在121℃条件下灭菌30 min，以去除杂菌的污染，加入2 ml灭菌去离子水使土壤薄层浸润至水中，将菌株yrd202202cf接种至培养皿中，对照组为接种灭活处理的菌株，其他条件都相同。将培养皿封盖处理，置于室内温度下培养3个月。
25.3、培养结束后，采用扫描电镜和能量色散衍射分析的方法，观测实验组和对照组的土壤薄层上含碳矿物的变化情况。结果如图1和图2所示，通过扫描电镜分析，发现实验组土壤薄层表面有形态多样的矿物质，而对照组表面光滑，组成较为均一。对图1和图2上典型点，进行能量色散衍射分析（图3 和图4），实验组和对照组表面矿物的组成中（表1），都含有碳、氧、钙、镁、铝、硅等元素，而实验组的含碳量明显高于对照组，即菌株yrd202202cf确实能够形成含碳矿物质。
26.表1 实验组和对照组表面矿物元素组成
实施例3菌株yrd202202cf利用易利用有机物（碳氮丰富的有机物）生成碳酸盐：配制液体培养基100 ml，置于250 ml三角瓶中，在121℃条件下灭菌30 min。具体地说，液体培养基成分为：胰蛋白胨10 g/l，酵母浸提物5 g/l，氯化钠10 g/l，氯化钙5 g/l。
27.用接种针将菌株yrd202202cf接种于培养基中，对照组为接种灭活处理的菌株，其余条件均一致，置于室温条件下培养。每隔一周观察是否有沉淀生成，第4周观察发现实验组有沉淀生成，为获取足量沉淀进行后续分析，该过程共培养60天。培养结束后，收集实验组生成的沉淀，并用过氧化氢溶液进行处理，去掉微生物残体等物质，共获得0.4271 g沉淀物质，而对照物无沉淀物产生。对沉淀物进行电镜扫描，能量色散衍射分析。
28.结果如图5所示，通过扫描电镜分析，发现实验生成的沉淀为半球状，且半球状结构层层叠在一起，其上有孔洞结构，是微生物作用的直接证据，孔洞为微生物在死亡或实验处理后，遗留的痕迹，这说明微生物在此类沉淀物的形成过程中，扮演着重要的角色；如图6及表2所示，根据能量色散衍射分析，沉淀的主要成分为碳、氧、钙，且通过原子百分比和重量百分比分析为碳酸钙，表明菌株yrd202202cf具有生成含碳矿物的能力。此外，基于x射线衍射分析发现，沉淀物为碳酸钙，其中球霰石的比例为100%。
29.表2 含碳矿物元素组成分析表（重量和原子数）实施例4菌株yrd202202cf通过形成含碳矿物固定大气二氧化碳：采用实施例3的操作方法配制培养基，接种菌株yrd202202cf。实验组为将培养基置于
13
co2环境中培养，以标记大气中co2的去向；对照组为置于无
13
co2标记的环境中培养。培养结束后，将沉淀物采用过氧化氢溶液处理，氧化去除有机物，测定含碳矿物的
13
c丰度值。
30.结果如表3所示，实验组在
13
co2环境下含碳矿物中
13
c丰度值为130.52
‰
，显著高于对照组的-12.67
‰
，说明实验组中含碳矿物中部分c来源于大气co2。结果还发现，对照组培养基ph为6.93，而实验组为8.51，实验组铵根离子浓度显著高于对照组。上述结果表明，菌
株yrd202202cf通过对含氮有机物的分解作用，产生铵根离子，铵根离子水解呈碱性，促使溶液ph升高，导致液体培养基呈碱性。大气中的co2溶解进入碱性液体介质中，形成hco
3-，该过程继续导致“co2—hco
3-—co
32
‑”平衡向右移动，继而导致碳酸盐矿物的形成。上述结果表明，菌株yrd202202cf可以将大气co2的碳转化为含碳矿物质中的碳，保存于含碳矿物中。这个过程，在一定程度上，解释了盐碱地土壤由于其碱性特质会吸收大气co2，进一步通过微生物的作用，转化为含碳矿物，提供了一个潜在的理论模型。
31.表3 含碳矿物中
13
c丰度值 13
c丰度值（
‰
）对照组-12.67
‰
实验组130.52
‰
本发明首次公开了从盐碱地土壤中分离的假单胞菌具有利用多种物质生成碳酸盐矿物的能力，对于深入认识土壤碳转化过程，提升土壤碳储量潜力，固定大气co2，减缓大气“温室效应”，缓解全球气候变暖具有重要科学意义。
32.于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
33.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。