调控ZmARP1基因表达的物质在调控植物抗旱中的应用

调控zmarp1基因表达的物质在调控植物抗旱中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及调控zmarp1基因表达的物质在调控植物抗旱中的应用。


背景技术：

2.玉米是世界三大粮食作物之一，其种植区域广泛，但在各地区的分布并不均匀，不同的地区，环境不同，气候条件不同，降水量也不同。干旱是影响玉米产量的重要因素，在苗期会抑制玉米生长速率，导致发育期严重缩短；还会抑制玉米株高，导致叶片萎蔫，从而使光合作用减少。在玉米灌浆期，干旱会导致籽粒不饱满，从而导致玉米产量减少。
3.arp1是受到生长素调控的蛋白质，具有一个未知功能域，目前植物中已有一些关于arp1蛋白的研究，拟南芥中的同源蛋白为soseki，之前的报道表明拟南芥同源蛋白可以参与细胞的极性生长，并且可以影响细胞分裂的方向。zmarp1在玉米中的相关研究还很少。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是确定zmarp1蛋白的功能及应用和/或如何调控植物的抗旱性。
5.为了解决上述技术问题，本发明首先提供了调控玉米zmarp1基因表达的物质的下述任一种应用：
6.f1、调控基因表达的物质在调控植物抗旱性中的应用，
7.f2、调控基因表达的物质在制备降低植物抗旱性的产品中的应用，
8.f3、调控基因表达的物质在植物育种中的应用；
9.f1-f3中，所述基因编码如下a1)、a2)或a3)的蛋白质(名称为zmarp1)：
10.a1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
11.a2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由a1)衍生的或与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
12.a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
13.上述植物可为玉米。
14.上述蛋白质中，序列表中序列1由421个氨基酸残基组成。
15.上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
16.上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
17.上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使
用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
18.上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
19.上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
20.上述应用中，所述调控植物的抗旱性为提高植物对干旱的敏感性。
21.上述应用中，所述调控基因表达可为增强或提高所述基因表达。
22.上述应用中，所述调控基因表达的物质可为增强或提高所述基因表达的试剂。
23.所述调控基因表达的物质具体可为下述任一种：
24.b1)编码上述蛋白质的核酸分子；
25.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
26.b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体。
27.上述蛋白质也属于本发明的保护范围。
28.为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述蛋白质的下述任一种应用：
29.p1、上述蛋白质在调控植物抗旱性中的应用，
30.p2、上述蛋白质在制备降低植物抗旱性的产品中的应用，
31.p3、上述蛋白质在植物育种中的应用。
32.为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述蛋白质相关的生物材料的下述任一种应用：
33.q1、所述生物材料在调控植物抗旱性中的应用，
34.q2、所述生物材料在制备降低植物抗旱性的产品中的应用，
35.q3、所述生物材料在植物育种中的应用。
36.所述生物材料为下述b1)至b11)中的任一种：
37.b1)编码上述蛋白质的核酸分子；
38.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
39.b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；
40.b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；
41.b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
42.b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织；
43.b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植
物器官；
44.b8)促进或提高上述蛋白质的基因表达的核酸分子；
45.b9)含有b8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系；
46.b10)抑制或降低上述蛋白质的基因表达的核酸分子；
47.b11)含有b10)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
48.上述生物材料中，b1)所述核酸分子为如下b1)、b2)或b3)所示的所述蛋白质的编码基因：
49.b1)编码链的编码序列是序列表中序列3的核苷酸的cdna分子或dna分子；
50.b2)核苷酸是序列表中序列3的cdna分子或dna分子；
51.b3)与b2)限定的cdna或dna分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的cdna分子或dna分子。
52.上述生物材料中，b2)所述的含有核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达上述应用中所述蛋白质的dna，该dna不但可包括启动蛋白编码基因转录的启动子，还可包括终止蛋白编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。可用现有的植物表达载体构建含有所述蛋白编码基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pahc25、pwmb123、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。
53.上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。
54.上述调控基因的物质和/或上述蛋白质和/或上述生物材料的下述任意一种产品也属于本发明的保护范围：
55.d1、调控植物抗旱性的产品；
56.d2、降低植物抗旱性的产品；
57.d3、提高植物干旱敏感性的产品。
58.上文中，所述降低植物抗旱性的产品可为植物抗逆调控剂。所述植物抗逆调控剂可含有上述蛋白质或/和所述生物材料。为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育干旱敏感植物的方法，包括提高目的植物中上述蛋白质生物表达量或/和上述核酸分子的表达量，得到干旱敏感的植物。所述干旱敏感植物对干旱的敏感性高于所述目的植物。所述目的植物可为玉米。
59.上述方法中，所述提高目的植物中所述zmarp1蛋白质的含量或/和上述核酸分子的表达量可通过将所述zmarp1蛋白的编码基因导入所述目的植物实现。
60.上述方法中，所述对逆境胁迫敏感植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。
61.上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
62.上文所述调控植物的抗旱性为提高植物对干旱的敏感性。
63.上文所述植物可为玉米。
64.上文所述核酸分子可产生不同转录本，翻译出不同蛋白质，所述核酸分子产生的不同转录本以及翻译出的不同蛋白质均在本专利保护范围内。
65.本发明将来自玉米1145的zmarp1基因导入玉米b73中得到zmarp1的转基因过表达株系；与未转化的b73对照植株相比，过表达zmarp1基因增加了转基因玉米对干旱胁迫的敏感性。说明zmarp1参与植物对干旱相关逆境胁迫的调控与适应。
附图说明
66.图1为对照和zmarp1过表达株系干旱处理表型。
具体实施方式
67.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
68.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
69.农杆菌菌株是eha105。主要试剂包括：neb、toyobo等生物公司的限制性内切酶、dna聚合酶、t4连接酶等；thermo公司的反转录试剂盒；magen公司的rna提取试剂盒；taraka公司的定量pcr试剂；质粒提取试剂盒以及dna回收试剂盒购自天根公司；ms培养基、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素、卡那霉素、硫酸庆大霉素、利福平等抗生素等试剂购自sigma；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂；引物合成和测序由英俊公司完成。
70.实施例1zmarp1基因过表达载体的构建
71.本技术的发明人在玉米生态型为1145中发现了一种植物耐旱相关基因，其基因组基因核苷酸序列如序列表中序列2所示，该基因由2879个碱基组成。该基因t01转录本的读码框为自5'端第1位到第2501位碱基。该转录本有3个外显子，其中编码外显子为2个,分别为读码框的第1位到第971位碱基和第2207位到第2501位碱基，其余为其内含子序列。
72.将该基因编码的蛋白质命名zmarp1，其氨基酸序列如序列表中序列1所示，zmarp1的cdna基因的cds如序列表中的序列3所示。
73.将核苷酸序列是序列表中的序列3的dna分子插入pbcxun载体中得到zmarp1基因表达重组载体，命名为pbcxun-zmarp1。pbcxun-zmarp1中，序列表中的序列3所示的dna分子由玉米泛素基因ubi的启动子启动并由nos终止子终止，能够表达zmarp1蛋白(氨基酸序列如序列表中序列1所示)。
74.pbcxun载体是将pcxun(genbank:fj905215.1，06-jul-2009)的hyg基因(hptii，潮霉素抗性基因)替换为bar基因(编码膦丝菌素乙酰转移酶)(genbank:mg719235.1中的第284-835位核苷酸，02-oct-2018)，保持pcxun的其它核苷酸不变得到的表达载体。
75.实施例2zmarp1基因过表达植株的获得
76.将实例1中构建的pbcxun-zmarp1通过热激法转化到感受态农杆菌eha105菌株中，菌落pcr鉴定出阳性克隆，挑选阳性克隆测序，菌落pcr和测序鉴定引物为ubip-seq(对应于ubi启动子中)和nosr-seq(对应于nos终止子中)。含有pbcxun-zmarp1的阳性克隆即为重组农杆菌，命名为pbcxun-zmarp1/eha105。
77.ubip-seq:5
′‑
ttttagccctgccttcatacgc-3
′
，
78.nosr-seq:5
′‑
agaccggcaacaggattcaatc-3
′
。
79.将pbcxun-zmarp1/eha105单菌落接种于2-3ml含有100μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的液体培养基中，28℃振荡培养过夜，第二天转接到含有卡那霉素和利福平抗生素的大量液体培养基中震荡培养，转接几次后收集菌体，将菌体重新悬浮至od
600
在0.8-1.0之间得到重组农杆菌菌悬液。采用获得的重组农杆菌菌悬液侵染无菌条件下扒出的b73玉米幼胚后，经除草剂草丁膦筛选诱导愈伤组织成苗，采用pcr鉴定法筛选得到zmarp1转基因植株(提取植株叶片的基因组dna，采用ubip-seq和nosr-seq组成的引物对进行pcr扩增，得到特异性扩增产物的植株为zmarp1转基因植株)。zmarp1转基因植株经自交繁种后获得t3代稳定遗传的zmarp1基因过表达植株进行后续实验。
80.实施例3zmarp1基因过表达玉米干旱处理表型检测
81.实验包含三个重复。每个重复中包含对照(b73)15个小盆和zmarp1基因过表达植株(t3代)15个小盆。在每个小盆中加入140g土，托盘里加上水，每小盆放4粒种子，覆盖50ml土，吸满水后将托盘中剩余的水倒掉后于培养间(温度25℃，湿度40％)正常培养，出苗后将长势不齐的一棵苗去掉，在托盘里加入1l水，吸满后将水倒掉，开始干旱处理不再浇水。在处理3周时出现干旱胁迫表型，结果如图1所示，zmarp1转基因过表达植株(图1中oe zmarp1所示)的生长状况差于对照b73(图1中wt所示)。两种材料植株在干旱胁迫下均出现叶片萎蔫表型，oe zmarp1植株叶片萎蔫程度高于wt，说明zmarp1转基因植株比对照b73植株对干旱更敏感，zmarp1蛋白在玉米抵御干旱逆境胁迫中起负调控作用。
82.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。