一种耐碱果胶裂解酶及应用

1.本发明属于生物工程领域，具体涉及一种耐碱果胶裂解酶及应用。


背景技术：

2.果胶是由半乳糖醛酸通过α-1，4糖苷键连接而成的多聚物，是一种杂多糖，呈弱酸性，耐热性强。目前，普遍认为果胶分子包括鼠李半乳糖醛酸聚糖-i(rgi)、鼠李半乳糖醛酸聚糖-ii(rgii)和多聚半乳糖醛酸聚糖(hg)3种类型。果胶酶是指能协同分解果胶质的一组酶的总称，按照酶的作用方式，果胶酶可分为原果胶酶(protopectinase)、果胶酯酶(pectinesterase)和解聚酶(depolymerizing enzymes)，解聚酶又包括水解酶和裂解酶，广泛存在于动、植物和微生物中。
3.果胶裂解酶是通过反式消去作用裂解果胶聚合体的一种果胶酶。果胶裂解酶通过切断果胶c-4位置，并从c-5处消去一个h原子，产生一个不饱和产物裂解果胶。根据其对酸碱环境的耐受度，果胶裂解酶分为碱性、中性和酸性。
4.中国专利文献cn113549608a(申请号：202110563930.8)公开了一种果胶裂解酶突变体δpelg403及其编码基因、制备方法和应用。该果胶裂解酶突变体δpelg403柔性区第129位的氨基酸由小分子量丙氨酸突变为大分子量缬氨酸；该发明提供的突变酶在碱性条件下，酶活力与耐热性能有明显的提高，解决了野生型果胶裂解酶在碱性条件下催化活性低和热稳定性不足的问题。该发明涉及的定点突变与本发明涉及的果胶裂解酶突变不同。
5.在现有技术的研究中，研究者们往往为了提高某一蛋白质的耐热性，就会在其基因结构中加入二硫键，以达到提高耐热性的效果。中国文献《二硫键对提高木聚糖aoxyn11a热稳定性的作用》(刘晓彤，邬敏辰等，食品与生物技术学报2014年第33卷第10期)中记载了利用定点突变技术在aoxyn11a的相应位置引入二硫键(cys108-cys152)，该研究表明二硫键对提高aoxyn11a的热稳定性有重要作用。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明提供了一种构建耐碱果胶裂解酶的方法。
7.发明人发现分别将果胶裂解酶基因pgla4的氨基酸突变为半胱氨酸，从而形成二硫键，并未提高果胶裂解酶的热稳定性，本发明改造后的果胶裂解酶pgla4-c209-289、果胶裂解酶pgla4-c10-182耐碱能力稳定性提高。
8.本发明技术方案如下：
9.一种突变果胶裂解酶pgla4-c209-289编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
10.一种突变果胶裂解酶pgla4-c209-289的氨基酸序列如seq id no.2所示。
11.一种重组载体，包含上述突变果胶裂解酶pgla4-c209-289编码基因的核苷酸序列，如seq id no.1所示。
12.一种重组菌，包含上述突变果胶裂解酶pgla4-c209-289编码基因的核苷酸序列，
如seq id no.1所示。
13.一种含突变果胶裂解酶pgla4-c209-289基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：
14.(1)将合成的pet-28a( )-pgla4质粒通过反向pcr扩增含有两个突变点的c209-289基因片段，其核苷酸序列如seq id no.3所示；
15.(2)通过反向pcr扩增pet-28a( )-pgla4基因片段，其核苷酸序列如seq id no.4所示；
16.(3)将步骤(1)中制得的c209-289基因片段与步骤(2)制得的pet-28a( )-pgla4基因片段进行无缝克隆连接，得到重组质粒pet-28a( )-pgla4-c209-289；
17.(4)制备大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，将步骤(3)制得的重组质粒pet-28a( )-pgla4-c209-289转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含突变果胶裂解酶pgla4-c209-289的大肠杆菌工程菌。
18.根据本发明优选的，所述步骤(1)中，反向pcr扩增以pet-28a( )-pgla4质粒为模板，扩增引物的核苷酸序列如下：
19.f1:cgctttggtgaggcacatattttctgcaattattacgca seq id no.5；
20.r1:gcattagcacgcacaacgtccttgcactgattgac seq id no.6；
21.根据本发明优选的，所述步骤(1)中，pcr扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
[0022][0023]
pcr扩增程序如下：
[0024]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸15sec，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
[0025]
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，反向pcr扩增模板为pet-28a( )-pgla4质粒；扩增引物的核苷酸序列如下：
[0026]
f2:gacgttgtgcgtgctaatgcaggtgtaggcgtcat seq id no.7；
[0027]
r2:atatgtgcctcaccaaagcgaacagacggaacacgg seq id no.8；
[0028]
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，pcr扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
[0029][0030]
所述的pcr扩增程序如下：
[0031]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃
延伸5min，4℃保存。
[0032]
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，无缝克隆pcr扩增体系如下，总体系为20μl：
[0033][0034]
所述的无缝克隆程序如下：
[0035]
37℃反应30min，4℃保存；
[0036]
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，筛选阳性克隆的方法为：将转化细胞涂布在含有含有50μg/ml卡纳霉素的lb固体培养基上，37℃过夜培养，挑取单菌落接种至含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中37℃培养过夜，然后通过pcr验证，得到目的基因条带的阳性克隆子，然后测序，保留测序结果正确的菌株作为目的表达菌株。
[0037]
一种突变果胶裂解酶pgla4-c10-182编码基因的核苷酸序列如seq id no.9所示。
[0038]
一种突变果胶裂解酶pgla4-c10-182的氨基酸序列如seq id no.10所示。
[0039]
一种重组载体，包含上述突变果胶裂解酶pgla4-c10-182编码基因的核苷酸序列，如seq id no.9所示。
[0040]
一种重组菌，包含上述突变果胶裂解酶pgla4-c10-182编码基因的核苷酸序列，如seq id no.9所示。
[0041]
一种含突变果胶裂解酶pgla4-c10-182基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：
[0042]
①
将合成的pet-28a( )-pgla4质粒通过反向pcr扩增含有两个突变点的c10-182基因片段，其核苷酸序列如seq id no.11所示；
[0043]
②
通过反向pcr扩增pet-28a( )-pgla4基因片段，其核苷酸序列如seq id no.12所示；
[0044]
③
将步骤
①
中制得的c10-182基因片段与步骤
②
制得的pet-28a( )-pgla4基因片段进行无缝克隆连接，得到重组质粒pet-28a( )-pgla4-c10-182；
[0045]
④
制备大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，将步骤
③
制得的重组质粒pet-28a( )-pgla4-c10-182转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含突变果胶裂解酶pgla4-c10-182的大肠杆菌工程菌。
[0046]
根据本发明优选的，所述步骤
①
中，反向pcr扩增以pet-28a( )-pgla4质粒为模板，扩增引物的核苷酸序列如下：
[0047]
f1-1:aacgtgaacttttccatgcaaggtugcgccact seq id no.13；
[0048]
r1-1:tcaggttctcgaaatagttattgtggaaagtgatgcaacgaccata seq id no.14；
[0049]
根据本发明优选的，所述步骤
①
中，pcr扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
[0050][0051]
pcr扩增程序如下：
[0052]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸20sec，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
[0053]
根据本发明优选的，所述步骤
②
中，反向pcr扩增模板为pet-28a( )-pgla4质粒；扩增引物的核苷酸序列如下：
[0054]
f1-2:actttccacaataactatttcgagaacctgaacagccg seq id no.15；
[0055]
r1-2:ttgcatggaaaagttcacgttcgccatggtatatctc seq id no.16；
[0056]
根据本发明优选的，所述步骤
②
中，pcr扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
[0057][0058][0059]
所述的pcr扩增程序如下：
[0060]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
[0061]
根据本发明优选的，所述步骤
③
中，无缝克隆pcr扩增体系如下，总体系为20μl：
[0062][0063]
所述的无缝克隆程序如下：
[0064]
37℃反应30min，4℃保存；
[0065]
根据本发明优选的，所述步骤
④
中，筛选阳性克隆的方法为：将转化细胞涂布在含有含有50μg/ml卡纳霉素的lb固体培养基上，37℃过夜培养，挑取单菌落接种至含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中37℃培养过夜，然后通过pcr验证，得到目的基因条带的阳性克隆子，然后测序，保留测序结果正确的菌株作为目的表达菌株。
[0066]
上述重组菌或上述构建方法制得的大肠杆菌工程菌在生产果胶裂解酶中的应用。
[0067]
有益效果
[0068]
本发明提供的突变果胶裂解酶pgla4-c209-289、突变果胶裂解酶pgla4-c10-182，
本发明改造后的果胶裂解酶耐碱能力提高，在制浆、造纸、纺织、饲料等领域具有广泛的应用前景。
附图说明
[0069]
图1为实施例4中不同ph值条件下酶活检测结果图。
[0070]
图2为实施例4中不同温度条件下酶活检测结果图。
[0071]
图3为实施例5中不同ph值条件下酶活检测结果图。
[0072]
图4为实施例5中不同温度条件下酶活检测结果图。
[0073]
图5为对比例1中不同ph值条件下酶活检测结果图。
[0074]
图6为对比例1中不同温度条件下酶活检测结果图。
具体实施方式
[0075]
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
[0076]
实施例中未详加说明的均按本领域现有技术。
[0077]
实施例1
[0078]
突变果胶裂解酶pgla4-c209-289基因构建
[0079]
(i)以pet-28a( )-pgla4的dna为模板，进行pcr扩增，得到突变基因片段，其核苷酸序列如seq id no.3所示；
[0080]
所述的pcr引物序列如下：
[0081]
f1:cgctttggtgaggcacatattttctgcaattattacgca seq id no.5；
[0082]
r1:gcattagcacgcacaacgtccttgcactgattgac seq id no.6；
[0083]
所述的pcr扩增体系见表1：
[0084]
表1
[0085][0086]
所述的pcr扩增程序如下：
[0087]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸15sec，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存；
[0088]
琼脂糖凝胶电泳检验pcr产物，长度为约250bp，使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用。
[0089]
(ii)以pet-28a( )-pgla4的dna为模板，进行pcr扩增，得到质粒上的剩余未突变片段，其核苷酸序列如seq id no.4所示；
[0090]
所述的pcr引物序列如下：
[0091]
f2:gacgttgtgcgtgctaatgcaggtgtaggcgtcat seq id no.7；
[0092]
r2:atatgtgcctcaccaaagcgaacagacggaacacgg seq id no.8；
[0093]
所述的pcr扩增体系见表2：
[0094]
表2
[0095][0096][0097]
所述的pcr扩增程序如下：
[0098]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存；
[0099]
琼脂糖凝胶电泳检验pcr产物，长度为约5900bp，使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用。
[0100]
(iii)将步骤(i)制得的c209-289片段与步骤(ii)制得的pet-28a( )-pgla4片段进行无缝克隆，制得pet-28a( )-pgla4-c209-289，果胶裂解酶pgla4-c209-289的基因序列如seq id no.1所示，其氨基酸序列如seq id no.2所示；
[0101]
所述的无缝克隆的扩增体系，见表3：
[0102]
表3
[0103][0104]
所述的无缝克隆程序如下：
[0105]
37℃反应30min，4℃保存；
[0106]
琼脂糖凝胶电泳检验pcr产物，长度为6148bp，使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用。
[0107]
实施例2
[0108]
制备大肠杆菌感受态
[0109]
(i)挑取大肠杆菌(escherichia coli)bl21(de3)单菌落接种至lb培养基中，220r/min、37℃培养过夜；
[0110]
(ii)吸取0.1ml菌液至10ml的lb培养基中，300r/min、37℃培养至od
600
达0.6～0.8；
[0111]
(iii)吸取1mlod
600
达0.6～0.8的菌液至1.5ml无菌离心管中，12000r/min离心2min，彻底去除上清；
[0112]
(iv)加入100μl冰预冷的sscs(一步法快速制备感受态细胞试剂盒，上海生工生物工程公司产品)，轻悬菌体即制成感受态细胞。
[0113]
(v)将制备好的感受态细胞分装100μl每管，-80℃保存，备用。
[0114]
实施例3
[0115]
pgla4-c209-289基因化学转化大肠杆菌(escherichia coli)bl21(de3)
[0116]
首先利用核酸超微量分光光度计测定pgla4-c209-289片段浓度，达到300μg/ml浓度后，进行化学转化，得到的细胞使用复苏培养基37℃复苏培养1h后，取100μl涂布在含50μg/ml卡纳霉素的lb固体培养基上，在37℃过夜培养，筛选具有卡那霉素抗性的阳性重组菌落。
[0117]
液体复苏培养基，每升组分如下：
[0118]
蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、山梨醇91g、甘露醇69.4g，余量水。
[0119]
阳性重组菌的培养及鉴定
[0120]
挑取上述阳性重组菌落，接种到含50μg/ml卡纳霉素抗性的液体lb培养基中37℃培养过夜，培养完成后，使用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取重组菌dna，并以获得的基因组为模板，f1和r2为引物进行pcr扩增，扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳进行验证；
[0121]
所述的pcr引物序列如下:
[0122]
f1:cgctttggtgaggcacatattttctgcaattattacgca seq id no.5；
[0123]
r2:atatgtgcctcaccaaagcgaacagacggaacacgg seq id no.8；
[0124]
所述的pcr扩增体系为20μl，见表4：
[0125]
表4
[0126][0127]
所述的pcr扩增程序如下：
[0128]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸3.5min，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存；
[0129]
琼脂糖凝胶电泳检验pcr产物，结果显示，使用引物f1和r2能够扩增出一条特异性基因条带，大小约为6100bp，与理论值6148bp接近，表明包含目的基因的载体已成功转入到大肠杆菌细胞内上，制得突变果胶裂解酶pgla4-c209-289基因的大肠杆菌工程菌。
[0130]
实施例4
[0131]
实施例3制备含果胶裂解酶pgla4-c209-289基因的大肠杆菌工程菌发酵测试
[0132]
将制备的含有果胶裂解酶pgla4-c209-289基因的大肠杆菌工程菌接种至100ml lb培养基(蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 10g/l，余量水)中220rpm 37℃下培养至发酵液od
600 0.8，再加入iptg诱导12h，取样。参考qb/t 4482-2013碱性果胶裂解酶酶活测定方法，样品处理后通过紫外分光光度(a235)法测定发酵液中果胶裂解酶最适酸碱度，在55℃，ph8.5-12.0的条件下分别处理10min后，加入3ml 0.03m磷酸终止反应，紫外分光光度计235nm处测定吸光度值，检测结果见图1。通过紫外分光光度法(a235法)测定发酵液中果胶裂解酶的最适温度，在最适ph11.5，温度55℃-85℃(梯度为5℃)的条件下分别处理10min后，加入3ml 0.03m磷酸终止反应，紫外分光光度计235nm处测定吸光度值，检测结果见图2。
[0133]
与原始酶pgla4(最适温度为70℃，最适ph为11)相比，重组后的含pgla4-c209-289基因大肠杆菌工程菌发酵液中果胶裂解酶的最适ph可以达到11.5。且重组后的果胶裂解酶pgla4-c209-289耐碱性质比原始酶pgla4要好很多，在温度为55℃、ph为12的高碱性条件下处理10min后，原始酶pgla4的酶活力的残留率为80.63％，而重组后的果胶裂解酶pgla4-c209-289的酶活力的残留率为93.26％。虽然最适温度降为65℃(降低了5℃)，但重组后的果胶裂解酶pgla4-c209-289的耐碱性质相比以往所报道的果胶裂解酶的性质好，且在同样耐碱的果胶裂解酶中耐热性质比较好。
[0134]
实施例5
[0135]
果胶裂解酶pgla4-c10-182基因的构建及发酵测试
[0136]
(i)提取大肠杆菌(escherichia coli)bl21(de3)的pet-28a( )-pgla4质粒dna，以该基因组dna为模板，进行pcr扩增，得到突变基因片段，其核苷酸序列如seq id no.11；
[0137]
所述的pcr引物序列如下：
[0138]
f1-1:aacgtgaacttttccatgcaaggttgcgccact seq id no.13；
[0139]
r1-1:tcaggttctcgaaatagttattgtggaaagtgatgcaacgaccataseq id no.14；
[0140]
所述的pcr扩增体系，见表5：
[0141]
表5
[0142][0143][0144]
所述的pcr扩增程序如下：
[0145]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸20sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
[0146]
琼脂糖凝胶电泳检验pcr产物，长度为约500bp，使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用。
[0147]
(ii)提取大肠杆菌(escherichia coli)bl21(de3)的pet-28a( )-pgla4质粒dna，
以该基因组dna为模板，进行pcr扩增，得到载体基因片段，其核苷酸序列如seq id no.12所示；
[0148]
所述的pcr引物序列如下：
[0149]
f2-1:actttccacaataactatttcgagaacctgaacagccg seq id no.15；
[0150]
r2-1:ttgcatggaaaagttcacgttcgccatggtatatctc seq id no.16；
[0151]
所述的pcr扩增体系，见表6：
[0152]
表6
[0153][0154]
所述的pcr扩增程序如下：
[0155]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存；
[0156]
琼脂糖凝胶电泳检验pcr产物，长度为约6000bp，使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用。
[0157]
(iii)将步骤(i)制得的c10-182片段与步骤(ii)制得的pet-28a( )-pgla4-1片段进行无缝克隆，制得pet-28a( )-pgla4-c10-182基因序列；果胶裂解酶pgla4-c10-182的核苷酸序列如seq id no.9所示，果胶裂解酶pgla4-c10-182的氨基酸序列如seq id no.10所示。
[0158]
所述的无缝克隆的扩增体系，见表7：
[0159]
表7
[0160][0161]
所述的无缝克隆程序如下：
[0162]
37℃反应30min，4℃保存；
[0163]
琼脂糖凝胶电泳检验pcr产物，长度为6148bp，使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用。
[0164]
参照实施例3的方法，制备含有耐碱果胶裂解酶pgla4-c10-182基因的大肠杆菌工
程菌，将制备的含有耐碱果胶裂解酶pgla4-c10-182基因的大肠杆菌工程菌接种至100ml lb培养基(蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 10g/l)中220rpm 37℃下培养至发酵液od
600 0.8之间，再加入iptg诱导12h，取样。参考qb/t 4482-2013碱性果胶裂解酶酶活测定方法，样品处理后通过紫外分光光度(a235)法测定发酵液中果胶裂解酶最适酸碱度，在55℃，ph8.0-12.0的条件下分别处理10min后，加入3ml 0.03m磷酸终止反应，紫外分光光度计235nm处测定吸光度值，检测结果见图3。通过紫外分光光度法(a235法)测定发酵液中果胶裂解酶的最适温度，在ph11.5，温度55℃-85℃(梯度为5℃)的条件下分别处理10min后，加入3ml 0.03m磷酸终止反应，紫外分光光度计235nm处测定吸光度值，检测结果见图4。
[0165]
与原始酶pgla4(最适温度为70℃，最适ph为11)相比，重组后的含pgla4-c10-182基因大肠杆菌工程菌发酵液中果胶裂解酶的最适ph可以达到11.5，最适温度为60℃，耐热性与原始酶pgla4相比降低了10℃。在55℃、ph12的高碱性条件下处理10min后，原始果胶裂解酶pgla4的酶活力残留率为80.63％，而重组后的果胶裂解酶pgla4-c10-182的酶活力的残留率为85.62％。
[0166]
对比例1
[0167]
重组pgla4-c259-286基因的构建及发酵测试
[0168]
(i)提取大肠杆菌(escherichia coli)bl21(de3)的pet-28a( )-pgla4质粒dna，以该基因组dna为模板，进行pcr扩增，得到突变基因片段；
[0169]
所述的pcr引物序列如下：
[0170]
f1-2:ttactggcacctggttaataactgctacgtttcct seq id no.17；
[0171]
r1-2:cgcacaacgtccttaacctgattgcacggg seq id no.18；
[0172]
所述的pcr扩增体系，见表8：
[0173]
表8
[0174][0175]
所述的pcr扩增程序如下：
[0176]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸10sec，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存；
[0177]
琼脂糖凝胶电泳检验pcr产物，长度为约100bp，使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用。
[0178]
(ii)提取大肠杆菌(escherichia coli)bl21(de3)的pet-28a( )-pgla4质粒dna，以该基因组dna为模板，进行pcr扩增，得到载体基因片段；
[0179]
所述的pcr引物序列如下：
[0180]
f2-2:aatcaggttaaggacgttgtgcgtgctaatgcaggtgt seq id no.19；
[0181]
r2-2:tattaaccaggtgccagtaaccaatttcttttgaatcgcgg seq id no.20；
[0182]
所述的pcr扩增体系，见表9：
[0183]
表9
[0184][0185]
所述的pcr扩增程序如下：
[0186]
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸3.3min，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存；
[0187]
琼脂糖凝胶电泳检验pcr产物，长度为约6000bp，使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用。
[0188]
(iii)将步骤(i)制得的c259-286片段与步骤(ii)制得的pet-28a( )-pgla4-2片段进行无缝克隆，制得pet-28a( )-pgla4-c259-286基因序列，其核苷酸序列如seq id no.21所示；
[0189]
所述的无缝克隆的扩增体系，见表10：
[0190]
表10
[0191][0192]
所述的无缝克隆程序如下：
[0193]
37℃反应30min，4℃保存；
[0194]
琼脂糖凝胶电泳检验pcr产物，长度为6148bp，使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用。
[0195]
参照实施例3的方法，制备含有耐碱果胶裂解酶pgla4-c259-286基因的大肠杆菌工程菌，将制备的含有耐碱果胶裂解酶pgla4-c259-286基因的大肠杆菌工程菌接种至100ml lb培养基(蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 10g/l)中220rpm 37℃下培养至发酵液od
600 0.8，再加入iptg诱导12h，取样，参考qb/t 4482-2013碱性果胶裂解酶酶活测定方法，样品处理后通过紫外分光光度(a235)法测定发酵液中果胶裂解酶最适酸碱度，在55℃，ph8.0-12.0的条件下分别处理10min后，加入3ml 0.03m磷酸终止反应，紫外分光光度计
235nm处测定吸光度值，检测结果见图5。通过紫外分光光度法(a235法)测定发酵液中果胶裂解酶的最适温度，在ph11.5，温度55℃-85℃(梯度为5℃)的条件下分别处理10min后，加入3ml 0.03m磷酸终止反应，紫外分光光度计235nm处测定吸光度值，检测结果见图6。
[0196]
与原始酶pgla4(最适温度为70℃，最适ph为11)相比，重组后的含pgla4-c10-182基因大肠杆菌工程菌发酵液中果胶裂解酶的最适ph仍为11.0，最适温度为65℃，耐热性与原始酶pgla4相比降低了5℃。且在55℃、ph12的高碱性条件下处理10min后，原始果胶裂解酶pgla4的酶活力的残留率为80.63％，而重组后的果胶裂解酶pgla4-c259-286的酶活力的残留率为84.81％。
[0197]
综上，实施例4中pgla4-c209-289是将果胶裂解酶pgla4的第209和第286号位的丝氨酸和缬氨酸均突变为半胱氨酸，从而形成二硫键。
[0198]
实施例5中pgla4-c10-182选取了果胶裂解酶pgla4的第10、182号位的苯丙氨酸、赖氨酸均突变为半胱氨酸，从而形成二硫键。
[0199]
对比例1中pgla4-c259-286选取了果胶裂解酶pgla4的第259、286号位的精氨酸、缬氨酸均突变为半胱氨酸；从而形成二硫键。
[0200]
原始酶以及三种突变酶对应的酶学特性见表11：
[0201]
表11
[0202][0203]
通过本发明涉及的突变酶与对比例1涉及的突变酶的比较，显示耐热性与耐碱性的提升与替换二硫键的位置没有直接关系。本发明改造后的果胶裂解酶pgla4-c209-289、果胶裂解酶pgla4-c10-182耐碱能力稳定性提高，在制浆、造纸、纺织、饲料等领域具有广泛的应用前景。