分离人工合成的MpgS蛋白质多肽和MpgP蛋白质多肽及其应用

分离人工合成的mpgs蛋白质多肽和mpgp蛋白质多肽及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种分离人工合成的mpgs蛋白质多肽和mpgp蛋白质多肽及其应用，尤其涉及人工合成甘露糖基转移酶基因和甘露糖基磷酸酶基因提高细胞氧化与失水能力的方法。


背景技术：

2.微生物细胞中含有两种主要胞内有机溶质：海藻糖和甘露糖基甘油酸酯(mg)，它们可以在极端逆境条件下(高温、高盐)在细胞内进行累积。其中，甘露糖基甘油酸酯(mg)是深海微生物在适应高温环境可溶性溶质。该溶质具有保护细胞蛋白质免于热变性和免于细胞失水的能力。研究发现，甘露糖基甘油酸酯具有两种生物合成途径。其中，最有效的途径是gdp-甘露糖(gdp-mannose)通过甘露糖基转移酶(mpgs)合成为甘露糖基-3-磷酸甘油酸(mpg)，并通过甘露糖基磷酸酶(mpgp)脱磷酸化为甘露糖基甘油酸酯mg，如图1所示。植物、动物、人体细胞中并不存在甘露糖基甘油酸酯途径。
3.深海微生物中甘露糖基甘油酸酯的合成途径中由两个基因编码，它们是甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因。研究发现，直接表达来自深海微生物的甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因，合成甘露糖基甘油酸酯的能力非常有限，效率低。主要原因是：微生物中gdp-甘露糖的前体含量比较低，此外微生物的基因由于生物适配性的原因不适合在现有的工程菌中进行表达。
4.但是，目前没有有关植物如何产生甘露糖基甘油酸酯、以及利用甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因改善植物抗逆境胁迫的相关报道。
5.本发明拟在植物中表达甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因，在植物(例如拟南芥)中，通过基因工程方法来表达人工合成的甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因，合成甘露糖基甘油酸酯提高植物抗氧化、抗失水能力，从而增加植株对干旱能力、以及耐高温的水平。合成的甘露糖基甘油酸酯提高植株保水性，减少失水率，以及提高抗氧化能力，从而提高植株抵抗非生物胁迫(例如干旱、高温)的抗性。此外，可以利用基因工程植物提取甘露糖基甘油酸酯用于动物细胞的涂抹促进其抗失水能力。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供人工合成甘露糖基转移酶基因和甘露糖基磷酸酶基因提高细胞抗失水和抗氧化能力的应用。
7.本发明的目的可以通过以下方案来实现：
8.本发明提供了一种分离人工合成的蛋白质多肽，所述蛋白质多肽为mpgs蛋白质多肽或mpgp蛋白质多肽；
9.所述mpgs蛋白质多肽为具有seq id no:1所示氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、活性片段、活性衍生物中的一种；
10.所述mpgp蛋白质多肽包括为seq id no:2所示氨基酸序列的多肽，或其保守性变
异多肽、活性片段、活性衍生物中的一种。
11.作为本发明的一个实施方案，所述mpgs蛋白质多肽为seq id no:1序列被一个或多个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的多肽、活性片段、活性衍生物中的一种。
12.作为本发明的一个实施方案，所述mpgp蛋白质多肽为seq id no:2序列被一个或多个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的多肽、活性片段、活性衍生物中的一种。
13.本发明提供了一种蛋白质多肽在提高植物抗细胞氧化和抗失水能力方面的应用，所述mpgs蛋白质多肽和mpgp蛋白质多肽共同表达提高植物细胞抗氧化和抗失水能力。
14.本发明提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含：
15.(a)编码权利要求1所述的蛋白质多肽中mpgs蛋白质多肽或mpgp蛋白质多肽的多核苷酸；或，
16.(b)与(a)互补的多核苷酸。
17.本发明提供了一种多核苷酸真核生物细胞抗氧化和抗失水能力方面的应用。编码所述mpgs脱氧核糖核酸dna序列如seq id no:3所示；编码所述mpgp脱氧核糖核酸dan序列如seq id no:4所示。本发明同时表达这两个基因，可达到较好提高植株抵抗非生物胁迫的效果。
18.本发明提供了一种载体，所述载体含有所述的多核苷酸。所述载体含有上述多核苷酸，或该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
19.本发明提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的载体。
20.本发明提供了一种所述多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
21.(a)恒温培养箱条件下，培养所述的宿主细胞；
22.(b)从宿主细胞的培养物中分离出具有甘露糖基转移酶基因或甘露糖基磷酸酶基因及其编码的甘露糖基转移酶蛋白质活性的多肽或甘露糖基磷酸酶蛋白质活性的多肽。
23.所述恒温温度为28℃，转速200rpm。
24.本发明提供了一种植物对提高细胞氧化和失水能力的方法，所述方法包括如下步骤：
25.s1、提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有甘露糖基转移酶基因和甘露糖基磷酸酶基因的dna编码序列；所述甘露糖基转移酶为具有seq id no:1氨基酸序列的多肽，所述甘露糖基磷酸酶为具有seq id no:2氨基酸序列的多肽；
26.s2、利用步骤s1中的农杆菌侵染植物细胞、组织或器官，从而使甘露糖基转移酶基因和甘露糖基磷酸酶基因的编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
27.s3、筛选出含有甘露糖基转移酶基因和甘露糖基磷酸酶基因的dna编码序列的植物细胞或组织或器官；
28.s4、将步骤s3中的植物细胞或组织或器官再成植株。
29.将步骤s4中的植物进行细胞氧化和失水能力抗性鉴定，植株具有高抗水平。
30.本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
31.本发明人经过广泛而深入的研究，首次采用人工合成方法从构建甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因，并且通过实验证实了它具有提高细胞氧化和失
水能力，并且转入植物后可导致植物对抗旱能力的提高。在此基础上完成了本发明。
32.在本发明中，术语“甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)蛋白质”、“甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)多肽”可互换使用，都指具有提高细胞氧化和失水能力甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)氨基酸序列(seq id no:1和seq id no:2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)蛋白质。
33.如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
34.如本文所用，“分离的甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)蛋白或多肽”是指甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)蛋白质。
35.本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
36.在本发明中，术语“甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)多肽”指具有提高细胞氧化和失水能力的seq id no:1和seq id no.2序列的多肽。该术语还包括具有与甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)蛋白质相同功能的、seq id no:1和seq id no.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)蛋白的活性片段和活性衍生物。
37.该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨程度条件下能与甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因的dna所编码蛋白、以及利用抗甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)多肽的可溶性片段。通常，该片段具有甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
38.发明还提供甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)蛋白质或多肽的类似物。这些类似物与天然甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)多肽的差别可以
是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到。
39.在本发明中，“甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)蛋白质保守性变异多肽”指与seq id no:1和seq id no:2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
40.表1
41.最初的残基代表性的取代优选的取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu
42.本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与seq id no:3和seq id no:4所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有seq id no:1和seq id no:2的蛋白质，但与seq id no:3和seq id no:4所示的编码区序列有差别的核酸序列。
43.编码seq id no:1和seq id no:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
44.术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
45.本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多
肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
46.本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2
×
ssc,0.1％sds,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与seq id no:1和seq id no:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
47.本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如pcr)以确定和/或分离编码甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)蛋白质的多聚核苷酸。
48.本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
49.本发明的甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用人工合成、pcr扩增法、或重组法的方法获得。例如首先根据seq id no:3和seq id no:4的序列进行全序列合成。
50.对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用人工合成的甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因核苷酸全长序列或其片段作为模板，扩增而得有关序列。
51.一旦获得了有关的序列，就可用重组法大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
52.此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
53.目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段和衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
54.本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
55.通过常规的重组dna技术(science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的甘露糖基转移酶(mpgs)基因或者甘露糖基磷酸酶(mpgp)多肽。一般来说有以下步骤：
56.(1)用本发明的编码甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
57.(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；
58.(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
59.本发明中，甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以使用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
60.本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
61.此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
62.包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
63.宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞等。
64.本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是dna的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
65.本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
66.用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得抗枯黄萎病抗性提高的植物。
67.获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
68.在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
69.另一方面，本发明还包括对甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)
基因的dna或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。较佳地，指那些能与甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)蛋白质的分子，也包括那些并不影响甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)蛋白质功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)蛋白质基结合的抗体。
70.本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或dna芯片(又称为“基因芯片”)上，用于基因的表达分析。用特异的引物进行rna-聚合酶链反应(rt-pcr)体外扩增也可检测甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因的转录产物。
71.在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有seq id no:1和seq id no:2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从通过dna合成仪器人工进行合成的。其dna序列如seq id no:3和seq id no:4所示，序列全长分别为1191bp和753bp，分别编码397个氨基酸和245个氨基酸(seq id no:1和seq id no:2)。
72.经实验证明(见实施例4、5)，转基因植株分别具有明确的提高细胞氧化和失水能力功能。
73.本发明的甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)蛋白质的创造性在于：a)提高植物细胞氧化和失水能力功能性在植物上没有报道；b)结构新，在核酸水平上与已见报道的甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)蛋白质编码基因无任何同源性，同源性位点不含有现有专利保护序列和突变位点。
74.甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)蛋白质为提高植物细胞氧化和失水能力提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。通过将甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因导入植物(以拟南芥为例子)，改变现有农作物品种的细胞氧化与失水能力，可获得抗旱的作物品种和新材料，提高作物抗旱性，解决农业生产中存在的实际问题。同时，利用转基因的材料，通过一定的提取手段可以方便地提取甘露糖基甘油酸酯。
75.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
76.本发明拟在植物中表达甘露糖基转移酶(mpgs)和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因，合成甘露糖基甘油酸酯提高植株保水性，减少失水率，以及提高抗氧化能力，从而提高植株抵抗非生物胁迫(例如干旱、高温)的抗性。此外，可以利用基因工程植物提取甘露糖基甘油酸酯用于动物细胞的涂抹促进其抗失水能力。
附图说明
77.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
78.图1细菌中甘露糖基甘油酸酯途径。
79.图2是甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因遗传转化载体的构建示意图。
ter的片段连入pcambia2301，形成中间载体p35s-2301-gus；
94.b.用xbai和saci双切p35s-2301-gus和上述人工合成的甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因，用甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)置换p35s-2301-gus相应酶切位点的gus，从而获得甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因植物表达载体，如图1所示。再将其转入农杆菌系lba4404中，用于转化拟南芥。
95.实施例3
96.利用农杆菌介导转化构建获得抗旱基因的转基因拟南芥
97.把含有目的基因的农杆菌在含有50mg/l卡那霉素和100mg/l利福平的lb固态培养基上划线，28℃下培养2天，挑取单菌落接种于50ml(浓度为50mg/l卡那霉素和100mg/l利福平)的lb液体培养基中。培养基在200rpm，28度条件下摇床上培养42-48小时。当od
600
达到0.3-0.8之间时，3000g离心收集菌体。利用1/2ms液体培养基将收集的菌体稀释至od
600
＝0.2-0.4之间。
98.(1)将以上获得的camv35s::mpgs和camv35s::mpgp超表达载体，用于侵染拟南芥花，获得转基因株系。
99.(2)农杆菌预培养：拟南芥生长三周后，开始准备转化所用的农杆菌。通常挑单克隆，在液体培养基上培养一天后，获得侵染液。
100.(3)侵染：用配置好的侵染液，侵染拟南芥花絮，黑暗培养一天，取出，放在正常条件下生长。
101.(4)转基因的pcr鉴定：用小量抽提植物总dna的方法得到植物总dna，以1.5μl总dna为模板以引物(1000-1200bp，700-900bp)进行pcr扩增。5’上游引物序列如seq id no:9所示：atcggaatcctcctcgctaaggc；3’下游引物序列如seq id no:10所示：agggagatcgttctcaccatct。共检测了50棵无菌拟南芥，其中有5棵被检测到有特异性条带的阳性植株(t0)，部分植株pcr产物电泳结果如图2所示。
102.实施例4
103.利用pcr和测序的方法鉴定拟南芥转入甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因植株。如图3所示，m为dl2000分子量标记。标记的分子量分别为2000、1000、750、500、250和100bp；图中， 是阳性对照(甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)质粒)；左侧1-3为转基因拟南芥幼苗的甘露糖基转移酶(mpgs)基因pcr分析；右侧1-3为转基因拟南芥幼苗的甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因pcr验证(见实施例4)。
104.利用pcr扩增转基因植株基因组中整合的甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因。
105.甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因的dna序列设计引物，甘露糖基转移酶(mpgs)基因的引物对分别为seq id no:5、seq id no:6所示，为mg1s5:5-atcggaatcctcctcgctaaggc-3(450)，mg1s3:5-agtca tagcg tgctc accag cg-3(750)；甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因的引物对分别为seq id no:7、seq id no:8所示，为mg2s5:5-atcgc tcaag agtac ggact-3(300)，mg2s3:5-ag ggaga tcgtt ctcac catct-3(600)。
106.以转基因植株叶片的dna为模板进行pcr反应，具体的体系如下：
[0107][0108][0109]
pcr反应条件为：
[0110][0111]
上述反应完毕，加入6
×
loading buffer到反应产物中，混匀离心，配制1.0％-1.2％的琼脂糖凝胶，待凝固后吸取适量反应产物到插孔中进行电泳检测，根据电泳结果，结合预测dna片段长度，初步推断正确的克隆条带位置，切胶回收。
[0112]
扩增片断的回收：采用爱思进公司的植物dna胶回收试剂盒对扩增片断进行回收试验，将凝胶中的dna进行回收，用于dna测序分析。
[0113]
a.用1.0％-1.2％琼脂糖凝胶对pcr产物进行电泳检测。
[0114]
b.在切胶仪中选择与目的基因大小相同的条带切下，放入2ml ep管中。
[0115]
c.在放有回收胶的ep管中加入500μl buffer de-a，在金属水浴锅中加热75℃，10min。
[0116]
d.加入250μl buffer de-b溶液，混匀将液体加入吸附柱中。
[0117]
e.12000rpm，离心2min。弃去液体。
[0118]
f.在吸附柱中加入buffer w1 500μl，放置于离心机中12000rpm离心30sec，弃液体部分。
[0119]
g.继续加入700μl buffer w2，离心30sec，再次重复此操作。
[0120]
h.空管置于离心机上，12000rpm，离心1min。
[0121]
i.加入25-30μl ddh2o，静置2min。
[0122]
j.离心所得溶液放置在-20℃冰箱存储。
[0123]
将回收的dna进行测序，序列与转甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因完全相同。
[0124]
实施例5
[0125]
转基因植株的叶片抗细胞氧化和失水能力鉴定分析
[0126]
将拟南芥种子在4度冰箱储存7天进行春化。然后利用70％的酒精对种子进行表面
消毒。消毒后的种子播种于带孔的100μl 96孔pcr板上，对照和转基因种子分别播种三个pcr板。培养板固定在培养盒上，将培养盒放置于智能光照培养箱(宁波伯朗特公司)，培养箱温度设置为22℃，光照时间为16h(7am-11pm)，湿度为80％。前3天用纯水培养，待种子发芽3天采用1/2ms营养液进行培养，培养3周后分别用含有15％和18％的聚乙二醇(peg6000)(polyethylene glycol,peg)的营养液处理3天，同时用1/2ms营养液培养的材料为对照，取叶片样品进行后续分析。
[0127]
相对电导率的测定：将叶片置于干净的10ml离心管中，加入5ml纯水，同时准备一管纯水做对照。将离心管置于旋转摇床上室温下摇动(50r/min)1.5h，用电导仪(dss-307，spsic)测量样品和转基因材料的电导率值。之后将离心管置于沸水中煮沸10min，室温自然冷却后测此时的电导率值c2和ck2。相对电导率(％)的计算公式为：c(％)＝(c1-ck1)/(c2-ck2)
×
100％。
[0128]
丙二醛(mda)含量的测定：称取0.1-0.2g样品加入0.1m磷酸缓冲液(pbs，ph7.8)制成10％的组织匀浆。将匀浆转入离心管中，4℃，8000r/min离心10min，之后吸取上清于4℃备用。按照mda测试试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行含量分析。mda的含量以nmol/mg蛋白表示。利用考马斯亮蓝法测定叶片中蛋白含量。测试结果如表1所示。
[0129]
失水率的测定：将样品置于干净的滤纸上，并称其初始重量。于40℃条件下进行脱水分析，分别于1h、3h、6h、9h后再测其重量。则相对失水率的计算方法为：(脱水前的重量-脱水后的重量)/脱水前的重量
×
100％。测试结果如表2所示。
[0130]
表1是转甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因的拟南芥植株的抗氧化能力分析。1-3为转基因拟南芥幼苗(见实施例5)。
[0131]
表2转甘露糖基转移酶(mpgs)基因和甘露糖基磷酸酶(mpgp)基因的拟南芥植株表2不同处理时间段转基因材料与对照植株的相对失水率。1-3为转基因拟南芥幼苗(见实施例5)。
[0132]
表1转基因材料与对照植株抗氧化能力分析
[0133][0134][0135]
表2不同处理时间段转基因材料与对照植株的相对失水率
[0136]
基因型1h3h6h9h野生型(col-0)65％
±
3.873％
±
4.582％
±
2.499％
±
0.2转基因株系135％
±
1.545％
±
4.151％
±
0.755％
±
4.1转基因株系229％
±
2.437％
±
3.742％
±
3.248％
±
3.2转基因株系331％
±
3.239％
±
2.943％
±
1.849％
±
1.9
[0137]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。