靶向PD-1和TGFβ的重组蛋白的制作方法

靶向pd-1和tgf
β
的重组蛋白
技术领域
1.本公开涉及一种靶向pd-1和tgfβ的重组融合蛋白及其制备和用途。


背景技术：

2.根据世界卫生组织的数据，癌症是全球第二大致死病因。据估计，2018年有960万人死于癌症。
3.癌症实际上是一组涉及异常的细胞生长和分裂的疾病。癌细胞是相当“聪明的”，并且它们已经发展出若干种机制来逃避宿主的免疫监视。例如，它们表达高水平的膜蛋白pd-l1和pd-l2，这两种蛋白结合t细胞表面上的pd-1并诱导t细胞耗竭(oscar arrieta等，(2017)oncotarget 8(60):101994-102005)。癌细胞还提高转化生长因子β(tgfβ)的表达，最常提高tgfβ1的表达，以通过降低cd8

t细胞和nk细胞中激活免疫受体nkg2d的表达并抑制nkg2d配体mica的表达来抑制细胞毒性淋巴细胞和nk细胞的细胞杀伤(masato morikawa等，(2016)cold spring harb perspect biol 8:a021873；joan massague(2008)cell 134(2):215-230；paul spear等，(2013)cancer immun.13:8)。
4.人们已在癌症的早期诊断和适当治疗方面做出了努力，因此与癌症有关的总体死亡率正在下降。目前癌症治疗的选择包括手术、放射疗法、化疗、激素疗法、靶向疗法、免疫疗法等。其中，免疫疗法是一种通过增强免疫应答来帮助免疫系统对抗癌症的治疗。免疫疗法尚未像手术、化疗和放射疗法那样得到广泛应用，但近年来已取得相当大的成功。免疫疗法中使用了靶向免疫抑制途径的药物，例如抗体。
5.pd-1
6.pd-1也称为cd279，是一种细胞表面受体。它具有两个配体，即pd-l1和pd-l2。pd-l1的表达响应于lps和gm-csf处理在巨噬细胞和树突状细胞上上调，并在tcr和b细胞受体信号传导后在t细胞和b细胞上上调，并且在小鼠心脏、肺、胸腺、脾和肾中检测到了pd-l1 mrna(freeman gj等，(2000)journal of experimental medicine 192(7):1027；yamazaki t等，(2002)journal of immunology 169(10):5538-5545。pd-l1在肿瘤细胞上也有表达。pd-l2具有更局限的表达谱。
7.当与pd-l1或pd-l2结合时，pd-1通过抑制t细胞炎性活动下调免疫系统并促进自身耐受性。pd-1对免疫系统的抑制作用可预防自身免疫性疾病。而另一方面，癌细胞中局部pd-l1表达的增加可阻止免疫系统杀伤这些细胞。若干种抗pd-1抗体，诸如(bms)和(默克)已被证明可以单独或与其他抗肿瘤剂组合用于临床癌症治疗。
8.tgfβ
9.转化生长因子β(tgfβ)是一种双功能细胞因子，其具有三种哺乳动物同种型，即tgfβ1、tgfβ2和tgfβ3。tgfβ与其他因子复合形成丝氨酸/苏氨酸激酶复合物，该复合物结合tgfβ受体并激活下游底物和调节蛋白。在大多数细胞类型中，tgfβ信号传导主要传递强烈的生长抑制活性。例如，tgfβ抑制t淋巴细胞和胸腺细胞的增殖。tgfβ在某些条件下还刺激
一些细胞的增殖。例如，tgfβ与il-2组合诱导treg细胞分化。癌细胞表达高水平的tgfβ1以抑制免疫功能，同时通过核心途径组分的突变失活或失去信号传导途径的肿瘤抑制臂来使tgfβ的肿瘤抑制作用失效。
10.tgfβ受体tgfβr1和tgfβr2均对tgfβ1具有高亲和力。tgfβr2是由c末端蛋白激酶结构域和n末端胞外结构域组成的跨膜蛋白。该胞外结构域由含有九条β链的紧凑折叠和由六个链内二硫键的网络维持稳定的单螺旋组成。tgfβr2的t细胞特异性表达可阻止小鼠体内接种的黑色素瘤或胸腺瘤生长。
11.靶向多于一种分子的疗法
12.有时发现靶向单一肿瘤相关抗原或单一免疫抑制途径的药物其治疗效果有限。例如，抗vegf抗体被证明在一定程度上抑制癌细胞生长，但不能消除癌细胞。此外，获批的抗pd-l1抗体阿维鲁单抗(巴文西亚)的总缓解率仅为33％。
13.因此，在临床试验和临床治疗中，通常将药用制剂与另一种治疗剂组合施用，从而以多种方式攻击靶细胞(例如癌细胞)。另选地，可以开发具有两种或更多种靶点结合特异性的单分子药物，例如双特异性或多特异性抗体/蛋白质，以实现靶向多于一种分子的疗法。例如，emd serono已经开发出一种双特异性融合蛋白m7824，其含有与tgfβr2胞外结构域连接的抗pd-l1抗体，用于治疗多种实体癌，包括非小细胞肺癌和胆道癌。


技术实现要素：

14.本公开公开了一种重组融合蛋白，该重组融合蛋白包含：1)能够结合tgfβ的tgfβr2或其片段，和2)结合pd-1的抗体或其抗原结合片段。该重组融合蛋白捕获肿瘤微环境中的tgfβ以降低对免疫细胞增殖和功能的抑制作用，并且还阻断肿瘤细胞上的pd-l1与免疫细胞上的pd-1的相互作用以解除pd-1介导的抑制信号对免疫细胞的制约。通过靶向两种免疫抑制途径，本公开的重组融合蛋白增强了对肿瘤细胞的免疫应答。
15.本公开的tgfβr2可以是人tgfβr2。本公开的tgfβr2片段可以是tgfβr2胞外结构域。在一些实施方案中，本公开的重组融合蛋白包含tgfβr2胞外结构域，该tgfβr2胞外结构域包含与seq id no:1具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中该tgfβr2胞外结构域结合tgfβ。
16.本公开的结合pd-1的抗体可以是人或人源化抗pd-1抗体。在一些实施方案中，本公开的结合pd-1的抗体包含重链可变区和轻链可变区，任选地具有人igg1、igg4重链恒定区和人κ轻链恒定区，该重链可变区具有与seq id no:2具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，该轻链可变区具有与seq id no:3具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中该抗体结合pd-1并阻断pd-1-pd-l1相互作用。在一个实施方案中，结合pd-1的抗体包含重链和轻链，该重链具有与seq id no:4具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，该轻链具有与seq id no:5具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中该抗体结合pd-1并阻断pd-1-pd-l1相互作用。抗原结合片段可以是
scfv、fab、f(ab')2或fv片段。
17.tgfβr2或其片段可通过接头与抗体或其抗原结合片段连接。接头可以是约5个至30个氨基酸残基的肽。在一个实施方案中，接头是10个至30个氨基酸残基的肽。在另一个实施方案中，接头是10个至20个氨基酸残基的肽。接头可以是具有seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9所示的氨基酸序列的接头。
18.本公开的重组融合蛋白可包含在重链或轻链的n末端或c末端与抗pd-1抗体连接的tgfβr2片段。
19.本公开的重组融合蛋白可包含在重链恒定区c末端通过接头与抗pd-1抗体连接的tgfβr2胞外结构域。在一些实施方案中，tgfβr2胞外结构域包含seq id no:1的氨基酸序列。抗pd-1抗体包含seq id no:4的重链和seq id no:5的轻链可变区。接头包含seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8或seq id no:9所示的氨基酸序列。抗pd-1重链-接头-tgfβr2胞外结构域包含seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12或seq id no:13的氨基酸序列。
20.本公开的重组融合蛋白仍具有结合tgfβ和pd-1两者的能力，并且显示出与现有技术的双特异性融合蛋白m7824相比优异的pd-l1-pd-1阻断活性和其他药学性质。
21.在一个实施方案中，本技术提供了一种重组融合蛋白，该重组融合蛋白包含：
22.a)人tgfβr2片段，和
23.b)包含重链和轻链的抗体，
24.其中该人tgfβr2片段与该重链的c末端连接。
25.在一个实施方案中，本技术提供了一种重组融合蛋白，该重组融合蛋白包含：
26.a)人tgfβr2片段，和
27.b)包含重链可变区和轻链可变区的(fab')2，
28.其中该tgfβr2片段与该重链可变区的c末端连接。
29.在一个实施方案中，本技术提供了一种重组融合蛋白，该重组融合蛋白包含抗pd-1抗体或其抗原结合片段和人tgfβr2片段，其中该抗pd-1抗体或其抗原结合片段包含seq id no:2的重链可变区和seq id no:3的轻链可变区的6个cdr。
30.在一个实施方案中，本技术提供了一种重组融合蛋白，其中tgfβr2胞外结构域包含seq id no:1的氨基酸序列或与seq id no:1具有至少90％同一性的氨基酸序列。
31.在一个实施方案中，本技术提供了一种重组融合蛋白，其中抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含seq id no:2的氨基酸序列或与seq id no:2具有至少90％同一性的氨基酸序列，并同时具有seq id no:2的3个cdr；并且该轻链可变区包含seq id no:3的氨基酸序列或与seq id no:3具有至少90％同一性的氨基酸序列，并同时具有seq id no:3的3个cdr。
32.在一个实施方案中，本技术提供了一种重组融合蛋白，其中重链包含seq id no:4的氨基酸序列或与seq id no:4具有至少80％同一性的氨基酸序列，并同时具有seq id no:4的3个cdr；并且轻链包含seq id no:5的氨基酸序列或与seq id no:5具有至少80％同一性的氨基酸序列，并同时具有seq id no:5的3个cdr。
33.在一个实施方案中，本技术提供了一种重组融合蛋白，该重组融合蛋白包含两种肽，其中第一肽包含人抗pd-1抗体的重链、接头和tgfβrii胞外结构域，并且第二肽包含人
抗pd-1抗体的轻链。
34.在一个实施方案中，本技术提供了一种重组融合蛋白，该重组融合蛋白选自：
35.1)重组融合蛋白，该重组融合蛋白包含seq id no:10的氨基酸序列或与seq id no:10具有至少80％同一性的氨基酸序列，并同时具有seq id no:4的3个cdr；并且包含seq id no:5的氨基酸序列或与seq id no:5具有至少80％同一性的氨基酸序列，并同时具有seq id no:5的3个cdr；
36.2)重组融合蛋白，该重组融合蛋白包含seq id no:11的氨基酸序列或与seq id no:11具有至少80％同一性的氨基酸序列，并同时具有seq id no:4的3个cdr；并且包含seq id no:5的氨基酸序列或与seq id no:5具有至少80％同一性的氨基酸序列，并同时具有seq id no:5的3个cdr；
37.3)重组融合蛋白，该重组融合蛋白包含seq id no:12的氨基酸序列或与seq id no:12具有至少80％同一性的氨基酸序列，并同时具有seq id no:4的3个cdr；并且包含seq id no:5的氨基酸序列或与seq id no:5具有至少80％同一性的氨基酸序列，并同时具有seq id no:5的3个cdr；或
38.4)重组融合蛋白，该重组融合蛋白包含seq id no:13的氨基酸序列或与seq id no:13具有至少80％同一性的氨基酸序列，并同时具有seq id no:4的3个cdr；并且包含seq id no:5的氨基酸序列或与seq id no:5具有至少80％同一性的氨基酸序列，并同时具有seq id no:5的3个cdr。
39.在另一个实施方案中，本技术提供了一种包含两种肽的重组融合蛋白，其中第一肽包含seq id no:10所示的氨基酸序列，第二肽包含seq id no:5所示的氨基酸序列。优选地，第一肽由seq id no:10所示的氨基酸序列组成，第二肽由seq id no:5所示的氨基酸组成。
40.在另一个实施方案中，本技术提供了一种包含两种肽的重组融合蛋白，其中第一肽包含seq id no:11所示的氨基酸序列，第二肽包含seq id no:5所示的氨基酸序列。优选地，第一肽由seq id no:11所示的氨基酸序列组成，第二肽由seq id no:5所示的氨基酸组成。
41.在另一个实施方案中，本技术提供了一种包含两种肽的重组融合蛋白，其中第一肽包含seq id no:12所示的氨基酸序列，第二肽包含seq id no:5所示的氨基酸序列。优选地，第一肽由seq id no:12所示的氨基酸序列组成，第二肽由seq id no:5所示的氨基酸组成。
42.在另一个实施方案中，本技术提供了一种包含两种肽的重组融合蛋白，其中第一肽包含seq id no:13所示的氨基酸序列，第二肽包含seq id no:5所示的氨基酸序列。优选地，第一肽由seq id no:13所示的氨基酸序列组成，第二肽由seq id no:5所示的氨基酸组成。
43.在一个方面，还提供了一种编码本发明的重组融合蛋白的核酸分子，以及一种包含该核酸的表达载体和一种包含该表达载体的宿主细胞。
44.在另一方面，还提供了一种使用包含表达载体的宿主细胞制备重组融合蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(i)在该宿主细胞中表达该重组融合蛋白，以及(ii)从该宿主细胞回收该重组融合蛋白。
45.在另一方面，本发明提供了一种包含本发明的重组融合蛋白的药物组合物，以及至少一种药学上可接受的载体。药物组合物还可包含至少一种佐剂。
46.在另一方面，本发明提供了一种治疗由tgfβ和/或pd-l1过表达引起的疾病的方法，该方法包括向有此需要的患者或受试者施用治疗有效量的本发明的重组融合蛋白或本发明的药物组合物。
47.在另一方面，本发明提供了一种重组融合蛋白在制备用于治疗由tgfβ和/或pd-l1过表达引起的疾病的药物组合物中的用途。
48.在一个实施方案中，本发明的方法用于抑制癌症/肿瘤生长。癌症或肿瘤可选自结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、子宫颈癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、子宫内膜癌、子宫癌、膀胱癌、神经内分泌癌、头颈癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤和骨髓异常增生综合征。
49.从下文具体实施方式和实施例中可以清楚地了解本公开的其他特征和优点，这些具体实施方式和实施例不应理解为是限制性的。本技术全文中引用的所有参考文献、genbank条目、专利和公开的专利申请的内容明确通过引用方式并入本文。
附图说明
50.图1是本公开的示例性重组融合蛋白的结构的示意图。
51.图2示出了融合蛋白trap-13(左)、trap-14(左)和trap-15(右)与人pd-1的结合活性。
52.图3示出了融合蛋白trap-13(左)、trap-14(右)和trap-15(右)与人tgfβ1的结合活性。
53.图4示出了trap-15对tgfβ-tgfβr相互作用的阻断活性。
54.图5示出了trap-15对pd-l1-pd-1相互作用的阻断活性。
55.图6显示trap-15可刺激人pbmc释放ifnγ。
56.图7显示trap-15不诱导adcc效应。
57.图8显示trap-15不诱导cdc效应。
58.图9显示trap-15可显著抑制肿瘤生长。
具体实施方式
59.主要存在三种不同的方法来靶向两种或更多种肿瘤生长的药理学成分。最常见的方法是，可以给予患者两种或更多种不同药物的混合物。尽管这种选择在可能的药物组合和不同的剂量方面具有最大的灵活性，但它存在以下问题：(a)由于药物负担增加以及单个药物的给药方案不同，病人对治疗的依从性可能较差，(b)由于药物之间的相互作用，可能出现不相容性，以及(c)药物副作用的风险增加。这些问题会降低治疗的有效性，并阻碍治疗目标的实现，特别是在慢性疾病(例如，癌症)管理方面。
60.第二种方法依赖于使用单一剂型药物的固定剂量组合。这种方法减少了药物负担，从而提高了患者的依从性。固定剂量组合的缺点主要是活性成分之间可能的剂量比选择有限，那么想要适当地调整个体患者的剂量，使其以最小的不良反应获得最大疗效，就会
变得更加困难。此外，组合中组分的不同药代动力学性质可能导致单个靶点处的药效学效应出现复杂的时间不匹配，从而影响整体疗效。
61.第三种方法是使用在单一化合物中组合两种或更多种药理学成分的多功能药物。这种多功能分子的设计和验证比较复杂，并且需要对分子中靶点活性的最佳比例进行大量研究，但统一的药代动力学可在分子靶点上产生匹配的药效学活性。多功能分子也可与其他药物进行固定剂量组合，从而在单个药物中组合三种或甚至四种药理学成分，以进一步提高疗效。
62.本发明人发明了一种新型重组多功能融合蛋白，该融合蛋白包含结合tgfβ的tgfβrii或tgfβrii片段以及结合pd-1的抗体或其抗原结合部分。重组融合蛋白捕获肿瘤微环境中的tgfβ，从而降低tgfβ对免疫细胞增殖和功能的抑制作用，并且还阻断pd-l1-pd-1相互作用，以解除pd-1介导的抑制信号对免疫细胞的制约，从而增强免疫细胞对癌细胞的杀伤。
63.如本文所用，当在权利要求书和/或说明书中与术语“包含”一起使用时，词语“一”或“一个”可以指“一个”，但其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。
64.如本文所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“可”、“含有”及其变体旨在作为不排除附加动作或结构的可能性的开放式过渡短语、术语或词语。本公开还考虑了“包含”、“由”和“基本上由”本文提出的实施方案或要素“组成”的其他实施方案，无论是否有明确的阐述。
65.术语“约”或“大约”意指在由本领域的普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，其将部分地取决于如何测量或测定值，即测量系统的限制。另选地，“约”可指给定值的至多20％，优选至多10％，更优选至多5％，还更优选至多1％的范围。
66.术语“tgfβrii”或“tgfβ受体ii”是指具有野生型人tgfβii型受体同种型a序列的多肽(例如ncbi参考序列(refseq)登录号为np_001020018的氨基酸序列)，或具有野生型人tgfβii型受体同种型b序列的多肽(例如ncbi refseq登录号为np_003233的氨基酸序列)。tgfβrii可保留野生型序列的至少0.1％、0.5％、1％、5％、10％、25％、35％、50％、75％、90％、95％或99％的tgfβ结合活性。“能够结合tgfβ的tgfβrii片段”意指ncbi refseq登录号为np_001020018或ncbi refseq登录号为np_003233的保留tgfβ结合活性的任何部分。
67.如本文所提到的术语“抗体”包括完整抗体和其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。完整抗体是糖蛋白，其包含通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链。每一条重链包含重链可变区(在本文中缩写为vh)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，即c
h1
、c
h2
和c
h3
。每一条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为v
l
)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，即c
l
。vh区和v
l
区可以进一步细分成被称为互补决定区(cdr)的高变区，所述高变区与被称为框架区(fr)的更保守的区域交替。每一个vh和v
l
由三个cdr和四个fr构成，它们从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)。
68.术语抗体的“抗原结合部分”或抗体的“抗原结合片段”在本技术全文中可互换使用，并且可分别简称为“抗体部分”或“抗体片段”。如本文所用的术语抗体的“抗原结合部
分”指的是抗体的一个或多个片段，其保留与抗原(例如pd-1蛋白)特异性结合的能力。已经证实的是，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。术语抗体的“抗原结合部分”内所涵盖的结合片段的实例包括(i)fab片段，即由v
l
、vh、c
l
和c
h1
结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，即包含在铰链区通过二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh结构域和c
h1
结构域组成的fd片段；(iv)由单臂的v
l
结构域和vh结构域组成的fv片段；(v)由vh结构域组成的dab片段(ward等,(1989)nature 341:544-546)；(vi)分离的互补决定区(cdr)；和(vii)纳米抗体，含有单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管fv片段的两个结构域v
l
和vh由单独的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成接头连接，所述合成接头使得它们能够被制成单一蛋白质链，其中所述v
l
区和vh区配对以形成单价分子(被称为单链fv(scfv)；参见例如bird等(1988)science 242:423-426；和huston等(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85:5879-5883)。这些单链抗体也意图被涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用筛选片段。
69.术语“融合蛋白”在本文中以最广泛的含义使用，并且包含一个或多于一个肽。“融合蛋白”的示例是但不限于免疫缀合物。“免疫缀合物”是缀合至一种或多种异源分子(包括但不限于细胞因子)的抗体。在一个实施方案中，本公开的融合蛋白是包含抗pd-1抗体和tgfβrii的免疫缀合物。
70.本公开的融合蛋白中包含的两种主要组分是tgfβrii或tgfβrii片段，以及抗pd-1抗体或其抗原结合部分。本领域的普通技术人员将认识到，用于选择上述两种组分的设计选择有很多。优选地，来源于人的序列用于人的癌症治疗，原因是来自非人动物的蛋白质或肽的强烈免疫原性可能导致过敏和其他不良反应。然而，在适当情况下，其他人源化的动物蛋白或肽也可基于不同的应用目的用于本发明。
71.tgfβrii可以是人tgfβrii，并且可优选tgfβrii胞外结构域构建相对较小尺寸的融合蛋白。tgfβrii胞外结构域可具有seq id no:1的氨基酸序列。
72.本公开的融合蛋白中的抗pd-1抗体详细描述于pct/cn2019/087287中，其中重链恒定区被修饰以消除抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和补体依赖性细胞毒性(cdc)。
73.在本公开中，在一些实施方案中，tgfβrii胞外结构域与重链或重链恒定区的c末端连接，部分地用于消除adcc和cdc的目的。在其他实施方案中，tgfβrii胞外结构域可与重链或轻链(可变区)的n末端连接，或另选地与轻链或轻链恒定区的c末端连接。抗体重链恒定区可被去除或修饰以降低adcc和cdc，但去除重链恒定区可缩短融合蛋白在人体内的半衰期。
74.必要时可在tgfβrii胞外结构域和抗pd-1抗体之间使用接头。接头主要用作间隔区。接头可由通过肽键连接在一起的氨基酸组成，优选地由通过肽键连接的5个至30个氨基酸组成，其中这些氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。如本领域技术人员所理解的，这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可被糖基化。在一个实施方案中，5个至30个氨基酸可选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和赖氨酸。在一个实施方案中，接头由大多数空间上不受阻碍的氨基酸组成，诸如甘氨酸和丙氨酸。示例性的接头是聚甘氨酸(特别是glys、(gly)8)、聚(gly-ala)和聚丙氨酸。如下文实施例所示的一个示例性的合适接头是
(gly-ser)，例如-(gly-gly-gly-gly-ser)
3-。接头也可以是非肽接头。例如，可使用烷基接头，诸如-nh-、-(ch2)s-c(o)-，其中s＝2-20。这些烷基接头可进一步被任何非空间位阻基团取代，这些非空间位阻基团诸如低级烷基(例如c
1-4
)、低级酰基、卤素(例如cl、br)、cn、nh2、苯基等。
75.此外，本发明提供了一种编码重组融合蛋白的多核苷酸分子和一种表达重组双功能融合蛋白的表达载体。载体的示例包括但不限于质粒、病毒载体、酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)、可转化人工染色体(tac)、哺乳动物人工染色体(mac)和人类人工附加染色体(haec)。
76.本发明提供了包含上述表达载体的宿主细胞。这些宿主细胞可用表达载体进行转化或转染。合适的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母和其他真核生物。优选地，使用大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞系(如cos或cho)。
77.在另一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含与药学上可接受的载体一起配制的本发明的融合蛋白。所述组合物可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分，如另一种抗体或药物。本发明的药物组合物也可以在与例如另一种免疫刺激剂、抗癌剂、抗病毒剂或疫苗的组合疗法中施用。
78.所述药物组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、包衣剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂和其组合。合适的赋形剂的选择和使用在gennaro编著，remington:the science and practice of pharmacy(《雷明顿：药学科学与实践》)，第20版(lippincott williams&wilkins 2003)中教导，其公开内容以引用的方式并入本文。
79.药物组合物中的主要媒介物或载体可以是水性或非水性的。例如，合适的媒介物或载体可以是可能补充有注射中常见的其他材料的注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液。例如，该媒介物或载体可以是中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水。其他示例性的药物组合物包含tris缓冲液或醋酸盐缓冲液，这些缓冲液可进一步包括山梨糖醇或其合适的替代物。在本发明的一个实施方案中，可通过将具有所需纯度的所选组合物与任选的配制剂(《雷明顿药物科学》，同上)以冻干饼或水溶液的形式混合来制备用于储存的组合物。此外，可使用适当的赋形剂(例如，蔗糖)将治疗组合物配制成冻干物。
80.优选的是，所述药物组合物适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。根据施用途径，活性化合物可以被包被在材料中以保护它防止酸和可能使它失活的其它自然条件的作用。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。可选地，本发明的抗体可以经由非肠胃外途径，如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、经阴道、经直肠、舌下或局部施用。
81.药物组合物可以呈无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以被配制成微乳液、脂质体或适合于高药物浓度的其它有序结构。
82.可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的受试者和特定施用方式而变化，并且一般将是产生治疗作用的组合物的量。一般，在百分之一百中，
与药学上可接受的载体组合，该量将在约0.01％至约99％的活性成分，优选地约0.1％至约70％，最优选地约1％至约30％的活性成分的范围内。
83.调整给药方案以提供最佳的所期望的响应(例如治疗响应)。例如，可以随时间推移施用几次分次剂量或可以按比例减少或增加剂量，如由治疗情况的紧急程度所指示。特别有利的是，将肠胃外组合物配制成剂量单位形式以易于施用和保持剂量均匀。如本文所用的剂量单位形式指的是适合作为单位剂量用于待治疗的受试者的物理上离散的单位；每一个单位含有被计算以与所需的药物载体联合产生所期望的治疗作用的预定量的活性化合物。可选地，融合蛋白可以作为持续释放制剂施用，在这种情况下，需要不太频繁的施用。
84.对于融合蛋白的施用，剂量在每公斤宿主体重约0.0001mg至100mg，并且更通常每公斤宿主体重0.01mg至10mg的范围内。例如，剂量可以是每公斤体重0.3mg、每公斤体重1mg、每公斤体重3mg、每公斤体重5mg或每公斤体重10mg或在1mg/kg-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次、每四周施用一次、每月施用一次、每3个月施用一次或每3个月至6个月施用一次。本发明的融合蛋白的优选剂量方案包括每公斤体重3mg或每公斤体重6mg/kg，通过腹膜内施用，其中使用下列给药方案之一给予抗体：(i)每四周一次，持续六次剂量，然后每三个月一次；(ii)每三周一次；(iii)以每公斤体重3mg施用一次，继而以每公斤体重1mg每三周施用一次；(vi)以每公斤体重6mg每周施用一次。在一些方法中，调整剂量以达到约1μg/ml-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中，达到约25μg/ml-300μg/ml的血浆抗体浓度。
[0085]“治疗有效剂量”的本发明的融合蛋白优选地引起疾病症状的严重程度降低、无疾病症状期的频率和持续时间增加或预防由于疾病困扰引起的障碍或残疾。例如，对于治疗携带肿瘤的受试者，相对于未经治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选地相对于未接受治疗的受试者来说将肿瘤生长抑制至少约40％，更优选地至少约60％，甚至更优选地至少约80％，并且还更优选地至少约99％。治疗有效量的治疗性化合物可以在受试者中减小肿瘤尺寸或以其它方式改善症状，所述受试者通常是人类或可以是另外的哺乳动物。
[0086]
所述药物组合物可以是受控释放制剂，包括植入物、透皮贴剂和微封装的递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。参见例如sustained and controlled release drug delivery systems(《持续和受控释放药物递送系统》),j.r.robinson编著,纽约的marcel dekker公司(marcel dekker,inc.,new york),1978。
[0087]
治疗组合物可以经由医疗装置施用，如(1)无针皮下注射装置(例如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824和4,596,556)；(2)微型输注泵(美国专利号4,487,603)；(3)透皮装置(美国专利号4,486,194)；(4)输注设备(美国专利号4,447,233和4,447,224)；以及(5)渗透装置(美国专利号4,439,196和4,475,196)；这些文献的公开内容以引用的方式并入本文。
[0088]
在某些实施方案中，可以配制本发明的融合蛋白以确保在体内的适当分布。例如，为了确保本发明的治疗性融合蛋白穿过血脑屏障，可以将它们在脂质体中配制，所述脂质体可以另外包含靶向部分以增强向特定细胞或器官的选择性转运。参见例如美国专利号4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331。
[0089]
还设想了体内基因疗法，其中将编码本发明的重组融合蛋白或其衍生物的核酸分
子直接引入受试者。例如，通过局部注射含有或不含合适递送载体(例如，腺相关病毒载体)的核酸构建体，将编码本发明的重组融合蛋白的核酸序列引入靶细胞。任选的病毒载体包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒和乳头瘤病毒载体。病毒载体的物理转移可通过局部注射所需核酸构建体或其他含有所需核酸序列的合适递送载体、脂质体介导的转移、直接注射(裸dna)或微粒轰击(基因枪)在体内实现。
[0090]
本公开的组合物可以单独使用或与其他治疗剂组合使用，以增强其治疗效果或减少潜在的副作用。
[0091]
本发明的另一个目的是提供一种制备上述重组融合蛋白和包含上述重组融合蛋白的药物组合物的方法。在一个实施方案中，该方法包括：(1)提供编码蛋白质的多核苷酸分子；(2)构建包含(1)的多核苷酸分子的表达载体；(3)用(2)的表达载体转染或转化合适的宿主细胞，并培养这些宿主细胞以表达该蛋白质；以及(4)纯化该蛋白质。制备可以由普通技术人员通过公知的技术进行。
[0092]
本发明的另一个目的是提供一种使用本发明的重组融合蛋白或本发明的药物组合物治疗癌症的方法，该方法包括向有此需要的患者或受试者施用有效量的上述药物组合物。在一个实施方案中，该药物组合物用于治疗tgfβ和/或pd-l1过表达的肿瘤或癌症，包括但不限于结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、子宫颈癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、子宫内膜癌、子宫癌、膀胱癌、神经内分泌癌、头颈癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、梅克尔细胞癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、肉瘤、间皮瘤和骨髓异常增生综合征。
[0093]
现在通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。
[0094]
实施例
[0095]
在以下实施例中，制备并测试了本公开的四种示例性融合蛋白trap-12、trap-13、trap-14和trap-15。融合蛋白的示意图如图1所示，其包含一种通过接头与两个tgfβrii胞外结构域融合的抗pd-1抗体。
[0096]
trap-12由两个seq id no:10的多肽和两个seq id no:5的多肽形成。trap-13由两个seq id no:11的多肽和两个seq id no:5的多肽形成。trap-14含有两个seq id no:12的多肽和两个seq id no:5的多肽。trap-15含有两个seq id no:13的多肽和两个seq id no:5的多肽。
[0097]
实施例1：表达trap-12、trap-13、trap-14和trap-15的载体的构建
[0098]
编码重链-接头-tgfβrii胞外结构域(分别为seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12和seq id no:13所示的氨基酸)和轻链(seq id no:5所示的氨基酸)的核苷酸由金唯智公司合成，并分别克隆到表达载体pcdna3.1中。
[0099]
实施例2：蛋白质表达和纯化
[0100]
根据制造商的说明书，使用expicho表达系统(赛默飞世尔)将实施例1中构建的载体共转染到cho-s细胞中。在第12天收获培养物上清液，并用蛋白a亲和层析(ge healthcare)纯化。
[0101]
实施例3：结合pd-1的示例性融合蛋白
[0102]
进行elisa测定以确定融合蛋白与人pd-1的相对结合能力。
[0103]
通过在4℃以25ng/孔温育过夜，将人pd-1蛋白(百普赛斯，目录号：pd1-h5221)固定在96孔板的pbs(hyclone，目录号：sh30256.01)中。然后通过在37℃加入1％bsa的pbs溶液温育一小时来封闭培养板。封闭后，将培养板用pbst(含0.05％tween 20的pbs)洗涤三次。用结合缓冲液(含0.05％tween20和0.5％bsa的pbs)制备系列稀释的融合蛋白(trap-13、trap-14和trap-15)、作为阳性对照的抗pd-1抗体(pct/cn2019/087287中的抗体21f12-1f6，本文也称为抗人pd-1，其重链和轻链分别具有seq id no:14和seq id no:5的氨基酸序列)和作为阴性对照的自制抗tim3抗体(本文也称为人igg对照，pct/cn2019/082318中公开的抗体tim3-6.12)，并在37℃加入到培养板中与固定的pd-1蛋白一起温育一小时。结合后，将培养板用pbst洗涤三次，在37℃加入用结合缓冲液以1/20000稀释的过氧化物酶标记的山羊抗人f(ab')2抗体(杰克逊免疫研究，目录号：109-035-097)温育一小时，再次洗涤，用tmb(赛默飞世尔，目录号：34028)显色15分钟，然后用1m h2so4终止反应。各培养板孔在每个步骤中均含有50μl溶液。测定450nm-620nm处的吸光度，融合蛋白与人pd-1结合的ec
50
值和结合曲线示于图2。
[0104]
数据表明，本公开的融合蛋白维持了pd-1结合能力，具有与抗体21f12-1f6相当的ec
50
值。
[0105]
实施例4：结合tgfβ1的示例性融合蛋白
[0106]
进行elisa测定以确定融合蛋白与人tgfβ1的相对结合能力。
[0107]
通过在4℃以10ng/孔温育过夜，将人tgfβ1蛋白(近岸蛋白质公司，目录号：ca59)固定在96孔板的pbs(hyclone，目录号：sh30256.01)中。然后通过在37℃加入1％bsa的pbs溶液温育一小时来封闭培养板。封闭后，将培养板用pbst(含0.05％tween 20的pbs)洗涤三次。用结合缓冲液(含0.05％tween 20和0.5％bsa的pbs)制备系列稀释的融合蛋白(trap-13、trap-14和trap-15)、作为阳性对照的人tgfβr2-hfc(百普赛斯，目录号：tg2-h5252)和作为阴性对照的抗tim3抗体，并在37℃加入到培养板中与固定的人tgfβ1蛋白一起温育一小时。结合后，将培养板用pbst洗涤三次，在37℃加入用结合缓冲液以1/20000稀释的过氧化物酶标记的山羊抗人fc抗体(杰克逊免疫研究，目录号：109-035-098)温育一小时，再次洗涤，用tmb(赛默飞世尔，目录号：34028)显色15分钟，然后用1m h2so4终止反应。测定450nm-620nm处的吸光度。融合蛋白与人tgfβ1结合的ec
50
值和结合曲线示于图3。
[0108]
数据表明，本公开的结合人tgfβ1的融合蛋白与人tgfβr2-hfc具有相似的ec
50
值。
[0109]
实施例5：示例性融合蛋白与pd-1和tgfβ1的结合亲和力
[0110]
使用fortebio octet red96通过生物膜干涉技术(bli)测定trap-15与人pd-1、食蟹猴pd-1、人tgfβ1和大鼠tgfβ1的动力学结合活性。
[0111]
将ahc生物传感器(fortebio，目录号：18-5060)用运行缓冲液(1
×
pbs hyclone，目录号：sh30256.01，含0.02％tween 20，ph 7.0)预浸泡，浸入运行缓冲液中100秒以建立基线，然后浸没在含有5μg/mltrap-15的运行缓冲液溶液的孔中，直至生物传感器负载0.8nm trap-15。将生物传感器浸入运行缓冲液中100秒以平衡基线。然后将生物传感器浸入含有系列稀释的400nm、200nm、100nm、50nm、25nm、12.5nm和6.25nm的人pd-1(百普赛斯，目录号：pd1-h5221)或食蟹猴pd-1(百普赛斯，目录号：pd1-c5223)的运行缓冲液溶液的孔中200秒，然后浸没到运行缓冲液中600秒。
[0112]
将ahc生物传感器(fortebio，目录号：18-5060)用运行缓冲液(1
×
pbs hyclone，
目录号：sh30256.01，含0.02％tween 20，ph 7.0)预浸泡，浸入运行缓冲液中100秒以建立基线，然后浸没在含有20μg/mltrap-15的运行缓冲液溶液的孔中，直至生物传感器负载1.2nm trap-15。将生物传感器浸入运行缓冲液中100秒以平衡基线。然后将生物传感器浸入含有系列稀释的100nm、50nm、25nm、12.5nm、6.25nm、3.12nm和1.56nm的人tgfβ1(义翘神州，目录号：10804-hnac)和大鼠tgfβ1(近岸蛋白质，目录号：ck33)的运行缓冲液溶液的孔中60秒，然后浸没到运行缓冲液中600秒。
[0113]
使用octet评估软件将结合和解离曲线拟合为1:1的langmuir结合模型。测定ka、kd和kd值并汇总于下表1中。
[0114]
数据表明，trap-15以高亲和力结合四种蛋白质。
[0115]
表1.trap-15与pd-1和tgfβ1的结合亲和力
[0116][0117]
实施例6：示例性融合蛋白阻断tgfβ-tgfβr相互作用
[0118]
tgfβ蛋白结合细胞表面的tgfβ受体，引发信号级联，导致smad2和smad3的磷酸化和激活，继而与smad4形成复合物。然后smad复合物易位至细胞核，并与细胞核中的smad结合元件(sbe)结合，导致tgfβ/smad应答基因的转录和表达。基于此，测试了本公开的融合蛋白阻断tgfβ-tgfβr相互作用的活性。
[0119]
通过使用lipofectaminetm 2000试剂(invitrogen，目录号：11668027)将293t细胞用pgl4.48[luc2p/sbe/hygro](promega，目录号：e367a)转染，然后进行有限稀释，制备稳定的细胞系293t/sbe-luc2p。将所得的细胞培养在含有10％fbs(gibco，目录号：10099141)和85μg/ml潮霉素b(gibco，目录号：10687010)的dmem(gibco，目录号：11995065)中。
[0120]
将在含有10％fbs的dmem中的293t/sbe-luc2p细胞以50000个细胞/孔加入到96孔板(康宁，目录号：3917)中。分别将在含有10％fbs和1.2ng/ml tgfβ1蛋白(sino，10804-hnac)的dmem中的系列稀释的trap-15和对照抗体(m7824，描述于us 2015/0225483 a1中，具有seq id no:15的重链-接头-tgfβr片段和seq id no:16的轻链)在室温下温育约30分钟，然后以60μl/孔加入到含有293t/sbe-luc2p细胞的96孔板中。将培养板在37℃、5％co2的培养箱中温育16-18小时。然后，将上清液以60μl/孔弃去，并将one-glo
tm
试剂(promega，目录号：e6130)以60μl/孔加入到测定板中。使用发光酶标仪(帝肯，f200)测量发光。
[0121]
利用通过graphpad prism拟合的抑制剂剂量-响应变量斜率(四个参数)测定ic
50
值，剂量依赖性曲线示于图4。
[0122]
结果表明，trap-15的阻断活性与m7824相当。
[0123]
实施例7：示例性融合蛋白阻断pd-1-pd-l1相互作用
[0124]
当表达pd-1的jurkat-nfat-pd-1效应细胞与表达pd-l1的cho-okt3-pd-l1靶细胞共培养时，由于pd-1-pd-l1相互作用，几乎观察不到tcr-nfat介导的发光。当pd-1-pd-l1相
互作用被阻断时，则会看到发光。因此，在jurkat-nfat-pd-1报告基因测定中测试本公开的融合蛋白对阻断pd-1-pd-l1相互作用的活性。
[0125]
将中国仓鼠卵巢上皮cho-k1细胞系(atcc，目录号：ccl-61)维持在含有10％fbs的f-12k培养基中，并置于37℃、5％co2的加湿培养箱。使用聚乙烯亚胺(mw 25kda，polyscience，目录号：23966-2)将包含编码人pd-l1(seq id no:17所示的np_054862.1的氨基酸)的核酸分子的载体和包含编码okt3-scfv(seq id no:18所示的氨基酸序列)的核酸分子的载体共转染至cho-k1细胞，并通过有限稀释获得稳定表达人pd-l1和okt3-scfv的cho-okt3-pd-l1细胞系克隆。
[0126]
通过电穿孔用包含编码seq id no:19的人pd-1和pgl4.30[luc2p/nfat-re/hygro](promega，目录号：e848a)的核酸分子的载体共转染jurkat细胞系(中科院(中国上海)的细胞库，克隆e6-1)来制备jurkat-nfat-pd-1细胞系，并通过有限稀释获得稳定表达人pd-1和nfat的克隆。
[0127]
将在含有1％fbs的rpmi 1640培养基(gibco，目录号：22400089)中的系列稀释的trap-15和m7824以60μl/孔铺板在96孔板(康宁，目录号：3917)上。然后以60μl/孔向培养板中加入含有在含1％fbs的rpmi 1640培养基中的30000个jurkat-nfat-pd1细胞和20000个cho-okt3-pd-l1细胞的细胞悬浮液，并在37℃、5％co2的培养箱中温育16-18小时。然后将one-glo
tm
试剂(promega，目录号：e6130)以60μl/孔加入到测定板中，并使用发光酶标仪(帝肯，f200)测量发光。计算ec
50
值，剂量依赖性曲线示于图5。
[0128]
数据表明，trap-15对pd-1-pd-l1相互作用的阻断活性优于m7824。
[0129]
实施例8：trap-15拮抗人tgfβ1，重新激活pbmc功能
[0130]
进行基于细胞的测定以确定trap-15是否能在免疫抑制因子tgfβ1存在的情况下重新激活人pbmc功能。
[0131]
人pbmc从健康供体获得。在含有lymphoprep密度梯度试剂(stem cell tenchnologies)的sepmate-50管(stem cell technologies)中回收pbmc。在4℃用0.5μg/ml功能级抗cd3(ebioscience，目录号：16-0037-85)的pbs溶液包被96孔板(康宁，目录号：3799)过夜。第二天，将包被的培养板用dpbs缓冲液(hyclone，目录号：sh30256.01)洗涤两次。将pbmc以1
×
105/孔加入到培养板中。将系列稀释的trap-15、m7824、抗pd-1抗体(抗体21f12-1f6)和igg对照(阴性对照igg)(重链：seq id no:22；轻链：seq id no:23)分别与人tgfβ1(义翘神州，目录号：10804-hnac)混合，并加入到培养板中，培养板中tgfβ1的终浓度为5ng/ml。在37℃培养细胞72小时后，收集上清液，并用elisa试剂盒(r&d systems，目录号：dy285b)测试ifnγ水平。结果示于图6。
[0132]
结果表明，trap-15可以阻断pd-1和tgfβ1两者，重新激活pbmc，以剂量依赖性方式提高ifnγ水平。令人惊奇的是，m7824未在该测定系统中显示出任何作用。
[0133]
实施例9：trap-15不诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)
[0134]
使trap-15的fc区突变以消除adcc效应。对表达pd-1的cho-k1/pd-1细胞进行抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)测定，以考察trap-15是否具有adcc效应。通过将包含编码人pd-1(seq id no:19)的核酸序列的载体转染到cho-k1细胞系中，制备表达pd-1的cho-k1/pd-1细胞。通过有限稀释获得稳定表达人pd-1的克隆。
[0135]
将表达pd-1的cho-k1/pd-1细胞以每孔10000个细胞的密度接种，并加入100nm或
10nm trap-15或igg4对照(重链：seq id no:24；轻链：seq id no:25)的测定缓冲液(不含酚红的mem培养基(gibco，目录号：41061-029) 1％fbs)溶液预温育30分钟。加入来自健康供体的pbmc效应细胞，以10:1、25:1或50:1的e/t(效应细胞pbmc/靶细胞cho-k1/pd-1)比引发adcc效应。将raji细胞上的利妥昔单抗的adcc效应用作内部对照以确保测定质量。在37℃、5％co2的培养箱中温育24小时后，收集细胞上清液，并使用活力/细胞毒性多重测定试剂盒(dojindo，目录号：ck17)检测。在f50(帝肯)上读取od
490nm
处的吸光度。细胞裂解的百分比根据下式计算：
[0136]
％细胞裂解＝100
×
(od
样品-od
靶细胞加效应细胞
)/(od
最大释放-od
最小释放
)。
[0137]
通过graphpad prism分析数据。
[0138]
图7中所示的数据表明，trap-15不诱导对cho-k1/pd-1靶细胞的adcc效应。
[0139]
实施例10：trap-15不诱导补体依赖性细胞毒性(cdc)
[0140]
使trap-15的fc区突变以消除cdc效应。对表达pd-1的cho-k1/pd-1细胞进行补体依赖性细胞毒性(cdc)测定，以考察trap-15是否具有cdc效应。将表达pd-1的cho-k1/pd-1细胞以每孔5000个细胞的密度接种，加入系列稀释的trap-15和igg对照(重链：seq id no:22；轻链：seq id no:23)(起始浓度：50μg/ml，5倍稀释，7个浓度点)的测定缓冲液(不含酚红的mem培养基 1％fbs)溶液温育30分钟。然后向培养板中加入终浓度为20v/v％的来自健康供体的血浆，以引发cdc效应。在37℃、5％co2的培养箱中温育4小时后，向细胞中加入cell counting-lite 2.0发光细胞活力测定试剂(诺唯赞)，并在f200(帝肯)上读取rlu数据。细胞裂解的百分比根据下式计算：
[0141]
％细胞裂解＝100
×
(1-(rlu
样品-rlu
背景
)/(rlu
细胞 正常人血浆-rlu
背景
))。
[0142]
图8中所示的数据表明，trap-15不诱导表达pd-1的cho-k1/pd-1靶细胞的cdc效应。
[0143]
实施例11：mc38-ova模型上的trap-15的抗肿瘤作用
[0144]
在荷mc38-ova肿瘤的hpd-1敲入小鼠模型中研究trap-15的体内功效。对于本文的实验，使用人pd-1胞外部分敲入小鼠c57bl/6j-pdcd1
em1(pdcd1)smoc
(上海南方模式生物科技股份有限公司)。
[0145]
使用逆转录病毒转导，用编码卵清蛋白(aab59956)的核酸转导mc38细胞。随后通过有限稀释克隆细胞。选择高表达ova蛋白的克隆作为mc38-ova细胞系。
[0146]
将1
×
106个mc38-ova细胞分别皮下植入5-6周的c57bl/6j-pdcd1
em1(pdcd1)smoc
小鼠，并在第0天当平均肿瘤体积达到约80mm3(长度
×
宽度2/2)时随机分组。在第0天、3天、7天、10天、14天和17天，分别向小鼠腹膜内施用10mg/kg trap-15、纳武利尤单抗(重链：seq id no:20；轻链：seq id no:21)和pbs。在研究期间，每周用卡尺测量两次来监测肿瘤体积。数据示于下表2和图9。
[0147]
与pbs组相比，用trap-15作为单一疗法的治疗显著抑制了肿瘤生长。trap-15的抑制作用比纳武利尤单抗强。
[0148]
表2.mc38-ova肿瘤生长抑制
[0149][0150]a肿瘤体积数据表示为平均值
±
sem；
[0151]
b tgi＝(1-治疗组相对肿瘤体积/pbs组相对肿瘤体积)
×
100％
[0152]c与pbs组进行比较，进行双因素方差分析，然后进行tukey多重比较检验。
[0153]
实施例12：示例性融合蛋白的热稳定性
[0154]
本实施例测试了trap-13、trap-14和trap-15的热稳定性。简言之，将融合蛋白在40℃储存2周，并在第0天、第7天和第14天进行测试。通过尺寸排阻色谱法测量蛋白质纯度。特别地，使用100mm磷酸钠 100mm na2so
4 ph 7.0作为运行缓冲液，将20μg融合蛋白注入tsk g3000swxl柱中。所有测量均在agilent 1220hplc上进行。数据使用openlab软件分析并汇总于表3中。
[0155]
结果表明，trap-13、trap-14和trap-15在高温下储存2周期间相对稳定。
[0156]
表3.融合蛋白的热稳定性
[0157][0158][0159]
本公开中的序列将汇总如下。
[0160]
[0161]
[0162]
[0163][0164]
尽管上文已经结合一个或多个实施方案描述了本发明，但应当理解，本发明并不局限于这些实施方案，并且本描述旨在覆盖所有替代方案、变型和等效形式，如可以被包括在所附权利要求的精神和范围内的。本文引用的所有参考文献进一步通过引用方式整体并入。