抑制LECT2基因表达的组合物和方法与流程

抑制lect2基因表达的组合物和方法
1.相关申请
2.本技术要求2019年09月03日提交的美国临时申请号62/895,217的优先权。前述申请中每一个的全部内容在此通过引用并入本文。
3.序列表
4.本技术包含已以ascii格式电子提交的序列表，并在此通过引用整体并入。所述ascii副本创建于2020年08月27日，名为a2038-7232wo_sl.txt，大小为221,086字节。
5.公开领域
6.本公开涉及对lect2基因表达的特异性抑制。


背景技术：

7.淀粉样变性是一组以不溶性纤维蛋白聚集体(称为淀粉样蛋白)在器官或组织中沉积为特征的疾病。淀粉样蛋白可以由突变型或野生型蛋白形成。淀粉样蛋白疾病的一种命名系统使用形成淀粉样蛋白沉积物的蛋白的缩写，前面加上字母“a”。因此，例如，alect2是淀粉样变性的缩写，其涉及由白细胞衍生的趋化因子2(alect2)形成的淀粉样蛋白沉积物。
8.lect2淀粉样变性(alect2)是最近发现的淀粉样变性类型之一。在患有肾或肝淀粉样变性的个体中观察到lect2淀粉样变性。这种形式的淀粉样变性可以表现为肾病综合征或肝脏受累(例如，肝炎，例如，慢性肝炎)。其可能在墨西哥裔美国人和/或在成熟lect2蛋白的第40位(或在未加工蛋白中的第58位)为编码缬氨酸的g等位基因纯合的个体中特别普遍。lect2淀粉样变性的治疗方法有限，需要新的治疗方法。


技术实现要素：

9.本公开描述了用于调控lect2基因表达的方法和irna组合物。在某些实施方式中，使用lect2特异性irna可降低或抑制lect2基因表达。此类抑制在治疗与lect2表达相关的病症(如淀粉样变性，例如，lect2淀粉样变性(alect2))中可能是有用的。
10.因此，本文描述的是影响rna诱导的沉默复合物(risc)介导的lect2基因的rna转录物切割的组合物和方法，如在细胞中或在受试者中(例如，在哺乳动物中，如人类受试者)。还描述了用于治疗与lect2基因表达相关的病症的组合物和方法，如lect2淀粉样变性。
11.在一些实施方式中，lect2淀粉样变性是肾淀粉样变性。在一些实施方式中，lect2淀粉样变性涉及肾脏中的淀粉样蛋白沉积。在一些实施方式中，lect2淀粉样变性与肾脏疾病(例如，肾病综合征)相关。在一些实施方式中，淀粉样变性与蛋白尿相关。在一些实施方式中，没有蛋白尿。在一些实施方式中，lect2淀粉样变性是肝淀粉样变性。在一些实施方式中，lect2淀粉样变性涉及肝脏中的淀粉样蛋白沉积。在一些实施方式中，lect2淀粉样变性与肝脏炎症(例如，肝炎，例如，慢性肝炎)相关。在一些实施方式中，本文所述的方法有效抑制淀粉样蛋白沉积(例如，通过防止淀粉样蛋白沉积或减少淀粉样蛋白沉积，例如，通过减
少淀粉样蛋白沉积物的尺寸、数量或程度)或者与淀粉样蛋白沉积相关的症状。
12.如本文所用，术语“irna”、“rnai”、“irna药剂”、“rnai药剂”或“irna分子”指包含如本文定义的术语的rna，并且其介导rna转录物的靶向切割，例如，通过rna诱导的沉默复合物(risc)途径。在一个实施方式中，如本文所述的irna抑制细胞或哺乳动物中lect2表达。
13.包含在本文特征的组合物中的irna(例如，dsrna)包含rna链(反义链)，其具有与lect2基因(例如，小鼠或人lect2基因)的mrna转录物的至少一部分基本上互补的区域，例如30个核苷酸或更少，通常长度为19-24个核苷酸的区域(在本文中也称为“lect2特异性irna”)。在一些实施方式中，lect2 mrna转录物是人lect2 mrna转录物，例如，seq id no:1。在一些实施方式中，lect2 mrna转录物在seq id no:1的核苷酸位置373处具有a至g置换。在一些实施方式中，mrna转录物编码在成熟lect2蛋白的位置40处(或在未加工蛋白的氨基酸58)的缬氨酸。在一些实施方式中，mrna转录物编码在成熟lect2蛋白的位置40处(或在未加工蛋白的氨基酸58)的异亮氨酸。
14.在一些实施方式中，本文所述的irna(例如，dsrna)包含反义链，所述反义链具有与人lect2 mrna的区域基本上互补的区域。在一些实施方式中，人lect2 mrna具有nm_002302.2(seq id no:1)的序列。在一些实施方式中，人lect2 mrna在seq id no:1的核苷酸位置373处具有a至g置换。
15.在其他实施方式中，irna包含具有rna链(反义链)的dsrna，所述rna链具有与lect2 mrna的一部分基本上互补的区域。在一个实施方式中，irna包含具有rna链(反义链)的dsrna，所述rna链具有与lect2 mrna的一部分基本上互补的区域，例如，人lect2 mrna(例如，如在nm_002302.2(seq id no:1)中提供的人lect2 mrna或者在seq id no:1的核苷酸位置373处具有a至g置换)。
16.在一个实施方式中，用于抑制lect2基因表达的irna包含至少两个彼此互补的序列。irna包含具有第一序列的有义链和具有第二序列的反义链。反义链包含与编码lect2转录物的mrna的至少一部分基本上互补的核苷酸序列，并且互补区域的长度为30个核苷酸或更少，或者至少15个核苷酸。通常，irna长度为19至24个核苷酸。
17.在一些实施方式中，irna长度为19-21个核苷酸。在一些实施方式中，irna长度为19-21个核苷酸，并且其在脂质制剂中，例如，脂质纳米颗粒(lnp)制剂(例如，lnp11制剂)中。在一个实施方式中，靶向lect2的irna在稳定的核酸脂质颗粒(snalp)中配制。
18.在一些实施方式中，irna长度为21-23个核苷酸。在一些实施方式中，irna长度为21-23个核苷酸，并且其是缀合物形式，例如，缀合至如本文所述的一种或多种galnac衍生物。
19.在一些实施方式中，irna长度为从约15至约25个核苷酸，以及在其他实施方式中，irna长度为从约25至约30个核苷酸。当通过本领域公知的方法或如本文所述的方法测定时，靶向lect2的irna在与表达lect2的细胞接触后，抑制lect2基因表达(例如，至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％)。
20.在一个实施方式中，本文特征的irna(例如，dsrna)包含或由dsrna的第一序列和第二序列，或其药学上可接受的盐组成，所述dsrna的第一序列选自以下：表2a-2b、3a-3b、6
或7的有义序列，以及第二序列选自以下：表2a-2b、3a-3b、6或7的反义序列。
21.在一些实施方式中，本文特征的irna(例如，dsrna)包含或由选自表2a-2b、3a-3b、6或7中提供的拿下有义和/或反义序列，或其药学上可接受的盐组成。在一些实施方式中，本文特征的irna(例如，dsrna)包含或由有义和/或反义序列组成，所述有义和/或反义序列选自如本文实施例中所公开的ad-454781、ad-133461、ad-454746、ad-86459或ad-86460的那些。在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)具有选自ad-454781、ad-133461或ad-454746的拿下有义和/或反义序列。在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)具有有义和/或反义序列ad-454781。
22.本文特征的irna分子可以包括天然存在的核苷酸或者可以包括至少一个修饰的核苷酸，包括但不限于2
’‑
o-甲基修饰的核苷酸、具有5’硫代磷酸酯基团的核苷酸和与胆固醇衍生物连接的末端核苷酸。或者，所述修饰的核苷酸可以选自以下：2
’‑
脱氧-2
’‑
氟修饰的核苷酸、2
’‑
脱氧修饰的核苷酸、锁定核酸、无环核苷酸、脱碱基核苷酸、乙二醇核苷酸、2
’‑
氨基修饰的核苷酸、2
’‑
烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然碱基的核苷酸。此类修饰的序列可以基于，例如，在所述irna的第一序列和第二序列上，所述第一序列选自表2a、3a或6的有义序列，所述第二序列选自表2a、3a或6的相应反义序列。
23.在一个实施方式中，本文特征的irna(例如，dsrna)包含有义链，其包含选自seq id no:143、seq id no:29或seq id no:23的序列。在一个实施方式中，本文特征的irna(例如，dsrna)包含反义链，其包含选自seq id no:144、seq id no:30或seq id no:24的序列。在一个实施方式中，irna(例如，dsrna)包含有义链，其包含seq id no:143的序列。在一个实施方式中，irna(例如，dsrna)包含反义链，其包含seq id no:144的序列。
24.在一个实施方式中，本文特征的irna(例如，dsrna)包含有义链，其包含选自seq id no:370,seq id no:294,or seq id no:290的序列。在一个实施方式中，本文特征的irna(例如，dsrna)包含反义链，其包含选自seq id no:371、seq id no:295或seq id no:291的序列。在一个实施方式中，irna(例如，dsrna)包含有义链，其包含seq id no:370的序列。在一个实施方式中，irna(例如，dsrna)包含反义序列，其包含seq id no:371的序列。
25.在一个实施方式中，如本文所述的irna靶向野生型lect2 rna转录物变体，和在另一个实施方式中，irna靶向突变转录物变体(例如，携带等位基因变体的lect2 rna)。例如，在本公开中的irna可以靶向lect2多态性变体，如单核苷酸多态性(snp)。
26.在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)靶向(例如，减少)编码在成熟lect2蛋白的位置40处(或在未加工蛋白的氨基酸58)的缬氨酸的mrna。在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)靶向(例如，减少)编码在成熟lect2蛋白的位置40处(或在未加工蛋白的氨基酸58)的异亮氨酸的mrna。在另一个实施方式中，irna(例如，dsrna)靶向(例如，减少)在成熟lect2蛋白的位置40处(或在未加工蛋白的氨基酸58)编码缬氨酸的mrna和编码异亮氨酸的mrna。
27.在另一个实施方式中，irna靶向野生型和突变lect2转录物。在又一个实施方式中，irna靶向lect2的特定转录物变体。在又一个实施方式中，irna药剂靶向多个转录物变体。
28.在一个实施方式中，在公开内容中的irna靶向lect2 rna转录物的非编码区，如转录物的5’或3’非翻译区。
29.在一些实施方式中，如本文所述的irna是缀合物形式，例如，碳水化合物缀合物，其可用如作本文所述的靶向部分和/或配体。在一个实施方式中，缀合物附接至dsrna的有义链的3’末端。在一些实施方式中，缀合物通过接头附接，例如，通过二价或三价支链接头。
30.在一些实施方式中，缀合物包含一个或多个n-乙酰半乳糖胺(galnac)衍生物。此类缀合物在本文中也称为galnac缀合物。在一些实施方式中，缀合物将rnai药剂(例如，dsrna)靶向至特定细胞，例如，肝脏细胞，例如，肝细胞。galnac衍生物可以通过接头附接，例如，二价或三价支链接头。在特定实施方式中，缀合物是
[0031][0032]
在一些实施方式中，rnai药剂通过接头附接至碳水化合物缀合物，例如，如下图所示的接头，其中x是o或s
[0033][0034]
在一些实施方式中，x是o。在一些实施方式中，x是s。
[0035]
在一些实施方式中，rnai药剂缀合物至如表1中所定义的和下文所示的l96。
[0036][0037]
在一些实施方式中，rnai药剂与将rnai(例如，dsrna)靶向至所需器官(例如，肝脏)或特定细胞类型(例如，肝细胞)的配体缀合。在一些实施方式中，rnai药剂缀合物将rnai药剂(例如，dsrna)靶向至肝脏的配体(例如，galnac配体，例如，l96)。
[0038]
在一个方面中，本文提供了一种用于抑制lect2基因在生物体(一般是人受试者)中表达的药物组合物。所述组合物通常包含一种或多种本文所述的irna和药学上可接受的载体或递送载剂。在一个实施方式中，所述组合物用于治疗与lect2表达相关的病症，例如，淀粉样变性，例如，lect2淀粉样变性。
[0039]
在一个方面中，本文提供的irna是一种用于抑制lect2表达的双链核糖核酸(dsrna)，其中所述dsrna包含长度为15-30个碱基对的有义链和反义链，并且所述反义链与表2a-2b、3a-3b、4a-4b或5-7中公开的双链体的靶序列的至少15个核苷酸互补，或其药学上可接受的盐。
[0040]
在一些实施方式中，反义链与表2a-2b、3a-3b、4a-4b或5-7中公开的双链体的靶序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸互补。在一些实施方式中，反义链与表2a-2b、3a-3b、4a-4b或5-7中公开的双链体的靶序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸互补。
[0041]
在一些实施方式中，反义链与表2a-2b、3a-3b、6或7中公开的双链体的靶序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸互补。在一些实施方式中，反义链与表2a-2b、3a-3b、6或7中公开的双链体的靶序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸互补。
[0042]
在一些实施方式中，反义链与双链体ad-454781、ad-133461、ad-454746、ad-86459或ad-86460的靶序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸互补。在一些实施方式中，反义链与双链体ad-454781、ad-133461、ad-454746、ad-86459或ad-86460的靶序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸互补。
[0043]
在一些实施方式中，反义链与双链体ad-454781、ad-133461或ad-454746的靶序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸互补。在一些实施方式中，反义链与双链体ad-454781、ad-133461或ad-454746的靶序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸互补。
[0044]
在一些实施方式中，反义链与双链体ad-454781的靶序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸互补。在一些实施方式中，反义链与双链体ad-454781的靶序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸互补。在一些实施方式中，反义链与双链体ad-454781的靶序列的全部核苷酸互补。
[0045]
在一些实施方式中，反义链与在表2a、3a或6中提供的靶序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸互补。在一些实施方式中，反义链与在表2a、3a或7中提供的靶序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸互补。
[0046]
在一些实施方式中，反义链与seq id no:145、31或25的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸互补。在一些实施方式中，反义链与seq id no:145的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸互补。在一些实施方式中，反义链与seq id no:145的全部核苷酸互补。
[0047]
在一个进一步的方面中，本文提供的irna是包含与反义链互补的有义链的双链rnai(dsrna)，其中所述反义链包含对于lect2 rna转录物的互补区，其中每条链具有约14至约30个核苷酸，其中所述双链rnai药剂由式(iii)表示：
[0048]
有义：5’n
p-n
a-(xxx)
i-n
b-yyy-n
b-(zzz)
j-n
a-n
q3’
[0049]
反义：3’n
p
’‑
na’‑
(x’x’x’)
k-nb’‑
y’y’y
’‑
nb’‑
(z’z’z’)
l-na’‑
nq’5’ꢀꢀ
(iii)
[0050]
其中：
[0051]
i、j、k和l分别独立地为0或1；
[0052]
p、p’、q和q’分别独立地为0-6；
[0053]
每个na和n
a’独立地表示包含0-25个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每条序列包含至少两个不同的修饰的核苷酸；
[0054]
每个nb和n
b’独立地表示包含0-10个修饰的或未修饰的或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
[0055]
每个n
p
、n
p’、nq和n
q’独立地表示突出核苷酸；
[0056]
xxx、yyy、zzz、x’x’x’、y’y’y’和z’z’z’分别独立地表示三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序；
[0057]
在nb上的修饰不同于在y上的修饰和在n
b’上的修饰不同于在y’上的修饰。
[0058]
在一些实施方式中，有义链与至少一个配体缀合。
[0059]
在一些实施方式中，i是1；j是1；或者i和j两者是1。
[0060]
在一些实施方式中，k是1；l是1；或者k和l两者是1。
[0061]
在一些实施方式中，xxx与x’x’x’互补，yyy与y’y’y’互补，以及zzz与z’z’z’互补。
[0062]
在一些实施方式中，y’y’y’基序出现在反义链5’末端的11、12和13位处。
[0063]
在一些实施方式中，y’是2
’‑
o-甲基。
[0064]
在一些实施方式中，双链体区的长度为15-30个核苷酸对。在一些实施方式中，双链体区的长度为17-23个核苷酸对。在一些实施方式中，双链体区的长度为19-21个核苷酸对。在一些实施方式中，双链体区的长度为21-23个核苷酸对。
[0065]
在一些实施方式中，在核苷酸上的修饰选自以下：锁定核酸(lna)、无环核苷酸、己糖醇或己糖核酸(hna)、环己烯核酸(cena)、乙二醇核酸(gna)、2
’‑
甲氧基乙基、2
’‑
o-烷基、2
’‑
o-烯丙基、2
’‑
c-烯丙基、2
’‑
氟、2
’‑
脱氧、2
’‑
羟基及其任意组合。
[0066]
在一些实施方式中，在核苷酸上的修饰是2
’‑
o-甲基、2
’‑
氟或者这两者，以及任选地乙二醇核酸(gna)。
[0067]
在一些实施方式中，配体包含碳水化合物。
[0068]
在一些实施方式中，配体通过接头附接。
[0069]
在一些实施方式中，接头是二价或三价支链接头。
[0070]
在一些实施方式中，接头是
[0071]
[0072]
在一些实施方式中，配体和接头如式xxiv中所示：
[0073][0074]
在一些实施方式中，配体附接至有义链的3’末端。
[0075]
在一些实施方式中，dsrna具有(例如，包含)核苷酸序列(例如，有义和/或反义序列)，其选自表2a-2b、3a-3b、6或7中提供的序列。
[0076]
在一个进一步的方面中，本文提供的irna是用于抑制lect2表达的双链核糖核酸(dsrna)，其中所述dsrna包含有义链和反义链，所述反义链包含对于lect2 rna转录物的互补区，其中反义链包含与表2a-2b、3a-3b、6或7的任一个中列出的反义序列之一相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，或其药学上可接受的盐。
[0077]
在一些实施方式中，反义链包含与表2a-2b、3a-3b、6或7的任一个中列出的反义序列之一相差不超过3个核苷酸的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。在一些实施方式中，反义链包含与表2a-2b、3a-3b、6或7的任一个中列出的反义序列之一相差不超过2个核苷酸的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。在一些实施方式中，反义链包含与表2a-2b、3a-3b、6或7的任一个中列出的反义序列之一相差不超过1个核苷酸的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。
[0078]
在一些实施方式中，有义链包含与表2a-2b、3a-3b、6或7的任一个中列出的反义序列之一相差不超过3个核苷酸的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。在一些实施方式中，有义链包含与表2a-2b、3a-3b、6或7的任一个中列出的反义序列之一相差不超过2个核苷酸的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。在一些实施方式中，有义链包含与表2a-2b、3a-3b、6或7的任一个中列出的反义序列之一相差不超过1个核苷酸的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。
[0079]
在一些实施方式中，有义和反义序列选自如在实施例中公开的双链体ad-454781、ad-133461、ad-454746、ad-86459或ad-86460的那些。在一些实施方式中，有义和反义序列选自双链体ad-454781、ad-133461或ad-454746的那些。在一些实施方式中，有义和反义序列选自双链体ad-454781的那些。在一些实施方式中，有义和反义序列是本文公开的双链体的拿下，其使lect2 mrna表达抑制至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，例如，如使用本文提供的实施例中公开的测定评估的。
[0080]
在一些实施方式中，dsrna包含至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方式中，dsrna的不超过五个有义链核苷酸和不超过五个反义链核苷酸是未修饰的核苷酸。在一些实施方式中，dsrna的有义链的全部核苷酸和反义链的全部核苷酸包含修饰。
[0081]
在一些实施方式中，至少一个修饰的核苷酸选自以下：2
’‑
o-甲基修饰的核苷酸、包含5’硫代磷酸酯基团的核苷酸，以及与胆固醇衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸。
[0082]
在一些实施方式中，修饰的核苷酸选自以下：2
’‑
脱氧-2
’‑
氟修饰的核苷酸、2
’‑
脱氧修饰的核苷酸、锁定核酸、无环核苷酸、脱碱基核苷酸、乙二醇核苷酸、2
’‑
氨基修饰的核苷酸、2
’‑
烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然碱基的核苷酸。
[0083]
在一些实施方式中，dsrna包含2
’‑
o-甲基修饰的核苷酸、2
’‑
氟修饰的核苷酸或者这两者，以及任选地乙二醇核苷酸。
[0084]
在一些实施方式中，dsrna在有义链中包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17个或更多个2
’‑
o-甲基修饰的核苷酸。在一些实施方式中，dsrna在反义链中包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个2
’‑
o-甲基修饰的核苷酸。
[0085]
在一些实施方式中，dsrna在有义链中包含至少1、2、3、4个或更多个2
’‑
氟修饰的核苷酸。在一些实施方式中，dsrna在有义链的位置7、位置9、位置10、位置11或其组合包含2
’‑
氟修饰的核苷酸。在一些实施方式中，dsrna在有义链的位置7、位置9、位置10和位置11包含2
’‑
氟修饰的核苷酸。在一些实施方式中，dsrna在反义链包含至少1、2、3、4、5、6、7个或更多个2
’‑
氟修饰的核苷酸。在一些实施方式中，dsrna在反义链的位置2、位置4、位置6、位置8、位置9、位置14、位置16或其组合包含2
’‑
氟修饰的核苷酸。在一些实施方式中，dsrna在反义链的位置2、位置14和位置16包含2
’‑
氟修饰的核苷酸。在一些实施方式中，dsrna在反义链的位置2、位置6、位置8、位置9、位置14和位置16包含2
’‑
氟修饰的核苷酸。在一些实施方式中，dsrna在反义链的位置2、位置4、位置8、位置9、位置12、位置14和位置16包含2
’‑
氟修饰的核苷酸。
[0086]
在一些实施方式中，dsrna还包含乙二醇核苷酸。在一些实施方式中，乙二醇核苷酸存在于反义链中。在一些实施方式中，乙二醇核苷酸存在于反义链的7位。
[0087]
在一些实施方式中，dsrna在有义链的位置1和位置2之间，位置2和位置3之间或者这两者包含硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，dsrna在有义链的位置1和位置2之间以及位置2和位置3之间包含硫代磷酸酯键。
[0088]
在一些实施方式中，dsrna在反义链的位置1和位置2之间，位置2和位置3之间，位置21和位置22之间，位置22和位置23之间或其组合包含硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，dsrna在反义链的位置1和位置2之间，位置2和位置3之间，位置21和位置22之间以及位置22和位置23之间包含硫代磷酸酯键。
[0089]
在一些实施方式中，互补区的长度为至少17个核苷酸。在一些实施方式中，互补区的长度为19至23个核苷酸之间。在一些实施方式中，互补区的长度为21个核苷酸。
[0090]
在一些实施方式中，每条链长度不超过30个核苷酸。在一些实施方式中，每条链长度为21个核苷酸至23个核苷酸之间。在一些实施方式中，有义链长度为21个核苷酸。在一些实施方式中，反义链长度为23个核苷酸。在一些实施方式中，有义链长度为21个核苷酸和反义链长度为23个核苷酸。
[0091]
在一些实施方式中，至少一条链包含至少1个核苷酸的3’突出端。在一些实施方式中，至少一条链包含至少2个核苷酸的3’突出端。在一些实施方式中，dsrna包含平末端。在一些实施方式中，dsrna包含3’突出端和平末端。
[0092]
在一些实施方式中，本文所述的irna(例如，dsrna)还包含配体。在一些实施方式中，配体是galnac配体。在一些实施方式中，配体将irna(例如，dsrna)靶向至肝脏(例如，肝
细胞)。在一些实施方式中，配体与dsrna有义链的3’末端缀合。
[0093]
在一些实施方式中，互补区由选自表2a-2b、3a-3b、6或7中提供的反义序列的反义序列组成。在一些实施方式中，互补区由选自如在实施例中公开的ad-454781、ad-133461、ad-454746、ad-86459或ad-86460的反义序列组成。在一些实施方式中，互补区由选自ad-454781、ad-133461或ad-454746的反义序列组成。在一些实施方式中，互补区由双链体ad-454781的反义序列组成。在一些实施方式中，互补区由选自本文公开的双链体的反义序列组成，其中所述双链体抑制lect2 mrna或蛋白表达至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％或90％。
[0094]
在一些实施方式中，dsrna包含有义链和反义链，所述有义链包含或由选自表2a-2b、3a-3b、6或7的有义链序列组成，所述反义链包含或由选自表2a-2b、3a-3b、6或7的反义序列组成。在一些实施方式中，dsrna包含或由一堆对应的有义和反义序列组成，所述有义和反义序列选自表2a-2b、3a-3b、4a-4b或5-7中公开的双链体的那些。在某些实施方式中，dsrna包含或由一堆对应的有义和反义序列组成，所述有义和反义序列选自表2a、3a或6中公开的双链体的那些。在某些实施方式中，dsrna包含或由一堆对应的有义和反义序列组成，所述有义和反义序列选自表2b、3b或7中公开的双链体的那些。在某些实施方式中，dsrna包含或由一堆对应的有义和反义序列组成，所述有义和反义序列选自表4a或4b中公开的双链体的那些。在某些实施方式中，dsrna包含或由一堆对应的有义和反义序列组成，所述有义和反义序列选自表5中公开的双链体的那些。
[0095]
在一个方面中，本公开提供了用于抑制lect2表达的双链核糖核酸(dsrna)，其中所述dsrna包含有义链和反义链，所述反义链包含对于lect2 rna转录物的互补区，其中所述有义链包含csasugugcfacfafufugaaaacugul96(seq id no:23)的序列和全部修饰，和所述反义链包含ascfsagfuu(tgn)ufcfaaufgufgcfacaugscsg(seq id no:24)的序列和全部修饰。
[0096]
在一个方面中，本公开提供了用于抑制lect2表达的双链核糖核酸(dsrna)，其中所述dsrna包含有义链和反义链，所述反义链包含对于lect2 rna转录物的互补区，其中所述有义链包含asusggucafgafufcfuucaaaauaal96(seq id no:29)的序列和全部修饰，和所述反义链包含usufsauuu(tgn)gaagaucfugfaccaususg(seq id no:30)的序列和全部修饰。
[0097]
在一个方面中，本公开提供了用于抑制lect2表达的双链核糖核酸(dsrna)，其中所述dsrna包含有义链和反义链，所述反义链包含对于lect2 rna转录物的互补区，其中所述有义链包含gsgsucagafucfufufcaaaauaaaul96(seq id no:143)的序列和全部修饰，和所述反义链包含asufsuuaufuufufgaagafucfugaccsgsg(seq id no:144)的序列和全部修饰。
[0098]
在一个方面中，本公开提供了一种细胞，其包含至少一种本文公开的irna(例如，dsrna)。所述细胞通常是哺乳动物细胞，如人细胞。在一些实施方式中，所述细胞是肝脏细胞(例如，肝细胞)。
[0099]
在一个方面中，本公开提供了一种人细胞(例如，本文所述的人细胞)，与其他相似的未处理细胞相比，其包含降低的lect2 mrna水平或lect2蛋白水平，其中任选地所述水平降低至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
[0100]
在一些实施方式中，所述人细胞通过包含将人细胞(例如，本文所述的人细胞)与dsrna(例如，本文所述的dsrna)接触的方法生产。
[0101]
在一个方面中，本文提供了一种用于抑制lect2基因表达的药物组合物，所述组合物包含本文所述的irna(例如，dsrna)。
[0102]
在本文所述药物组合物的一些实施方式中，在非缓冲溶液中施用irna(例如，dsrna)。在一些实施方式中，所述非缓冲溶液是盐水或水。
[0103]
在本文所述药物组合物的一些实施方式中，使用缓冲溶液施用irna(例如，dsrna)。在一些实施方式中，所述缓冲溶液包含醋酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐、磷酸盐或其任何组合。在一些实施方式中，所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(pbs)。
[0104]
在本文所述药物组合物的一些实施方式中，将irna(例如，dsrna)靶向至肝脏(例如，肝细胞)。
[0105]
在本文所述药物组合物的一些实施方式中，所述组合物是静脉内施用的。在本文所述药物组合物的一些实施方式中，所述组合物是皮下施用的。
[0106]
在一些实施方式中，一种药物组合物包含本文所述的irna(例如，dsrna)，其包含配体(例如，galnac配体)，所述配体将irna(例如，dsrna)靶向至肝脏细胞，例如，肝细胞。
[0107]
在一些实施方式中，一种药物组合物包含本文所述的irna(例如，dsrna)，其包含配体(例如，galnac配体)，以及所述药物组合物是通过皮下施用的。在一些实施方式中，所述配体将irna(例如，dsrna)靶向至肝脏细胞，例如，肝细胞。
[0108]
在某些实施方式中，一种药物组合物，例如，本文所述的组合物，包含脂质制剂。在一些实施方式中，rnai药剂是在lnp制剂中，例如，mc3制剂。在一些实施方式中，lnp制剂将rnai药剂靶向特定细胞，例如，肝脏细胞(例如，肝细胞)。在一些实施方式中，脂质制剂是lnp11制剂。在一些实施方式中，所述组合物是静脉内施用的。
[0109]
在另一个实施方式中，将药物组合物配制用于根据本文所述的剂量方案施用，例如，每四周不超过一次、每三周不超过一次、每两周不超过一次或每周不超过一次。在另一个实施方式中，药物组合物的施用可以维持一个月或更长时间，例如，一个月、两个月、三个月或六个月，或者一年或更长时间。
[0110]
在另一个实施方式中，包含本公开中特征的irna，例如，靶向lect2的dsrna的组合物与针对与lect2表达相关的病症(例如，lect2淀粉样变性)的第二疗法联合施用。irna或包含本文提供的irna的组合物可以在第二疗法之前、之后或同时施用。在一些实施方式中，irna在第二疗法之间施用。在一些实施方式中，irna在第二疗法之后施用。在一些实施方式中，irna与第二疗法同时施用。
[0111]
在一些实施方式中，第二疗法是有效治疗病症或病症的症状的非irna治疗剂。
[0112]
在一些实施方式中，待通过本文公开的组合物或方法治疗的病症是影响肾功能的lect2淀粉样变性，例如，通过淀粉样蛋白沉积在肾脏中。在一些此类实施方式中，irna施用与支持肾功能的疗法(例如，透析)一起使用。在一些实施方式中，irna施用与利尿剂、ace(血管紧张素转化酶)抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂和/或透析一起使用，例如，以支持或控制肾功能。
[0113]
在一些实施方式中，待通过本文公开的组合物或方法治疗的病症是涉及肝脏中淀粉样蛋白沉积的lect2淀粉样变性病。在一些此类实施方式中，irna施用与支持肝功能的疗
法一起使用。
[0114]
在一些实施方式中，待通过本文公开的组合物或方法治疗的病症是lect2淀粉样变性，并且irna施用与切除受淀粉样变性影响的一个或多个器官的全部或部分(例如，切除受淀粉样变性影响的肾脏或肝脏组织的全部或部分)一起使用。移除任选地与替换全部或部分移除的器官一起进行(例如，与肾脏或肝脏器官移植一起)。
[0115]
在一个方面中，本文提供了一种在细胞中抑制lect2表达的方法，所述方法包括：(a)将本文所述的irna(例如，dsrna)引入所述细胞和(b)将步骤(a)的所述细胞维持足够长的时间以获得lect2基因的mrna转录物的降解，从而抑制细胞中lect2基因表达。
[0116]
在一个方面中，本文提供了一种在细胞(例如，本文所述的细胞)中抑制lect2表达的方法，所述方法包括：(a)接触，例如，将本文所述的irna(例如，dsrna)引入所述细胞中，和(b)将步骤(a)的所述细胞维持足够长的时间以获得降低的lect2 mrna、lect2蛋白或者lect2 mrna或lect2蛋白两者的水平，从而抑制细胞中lect2基因表达。
[0117]
在一个方面中，本文提供了一种用于降低或抑制细胞(例如，肝脏细胞，例如，肝细胞)中lect2基因表达的方法。所述方法包括将细胞与如本文所述的dsrna接触，从而抑制lect2基因表达。如本文所用，“接触”包括直接接触细胞，以及间接接触细胞。例如，当向受试者施用(例如，静脉内或皮下)包含rnai的组合物时，可以接触受试者内的细胞(例如，肝细胞)。
[0118]
在一些实施方式中，所述方法包括：
[0119]
(a)将双链核糖核酸(dsrna)进入细胞，其中dsrna包含至少两个彼此互补的序列。dsrna具有具有第一序列的有义链和具有第二序列的反义链；所述反义链具有与编码lect2的mrna的至少一部分基本上互补的互补区，和其中互补区的长度为30个核苷酸或更少，例如，15-30个核苷酸，并且通常长度为19-24个核苷酸，并且当与表达lect2的细胞接触后，dsrna抑制lect2基因表达至少10％，例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或很多；和
[0120]
(b)将步骤(a)的所述细胞维持足够长的时间以获得lect2基因的mrna转录物的降解，从而减少或抑制细胞中lect2基因表达。
[0121]
在前述抑制细胞中lect2表达的方法的一些实施方式中，离体、在体外或在体内处理细胞。在一些实施方式中，细胞是肝细胞。
[0122]
在一些实施方式中，细胞存在于需要治疗、预防和/或控制与lect2表达相关的病症的受试者中。
[0123]
在一些实施方式中，病症是lect2淀粉样变性，如本文所述的。
[0124]
在一些实施方式中，lect2表达被抑制至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％，例如，如通过本文所述的方法确定的。
[0125]
在一些实施方式中，lect2 mrna表达被抑制至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一些实施方式中，lect2蛋白表达被抑制至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
[0126]
在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)具有范围0.0005-1nm的ic
50
，例如，0.001和0.2nm之间、0.002和0.1nm之间、0.005和0.075nm之间或0.01和0.05nm之间。在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)的ic
50
等于或小于0.02nm，例如，0.0005和0.02nm之间、0.001和0.02nm之间、0.005和0.02nm之间或0.01和0.02nm之间。在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)具有0.01-1nm的ic
50
。
[0127]
在一些实施方式中，细胞(例如，肝细胞)是哺乳动物细胞(例如，人、非人灵长类或啮齿类细胞)。在一个实施方式中，所述受试者是具有lect2淀粉样变性的哺乳动物(例如，人)。在一个实施方式中，引入dsrna降低或抑制细胞中lect2基因表达。
[0128]
在一个实施方式中，dsrna抑制lect2基因表达，或抑制淀粉样蛋白沉积(例如，通过防止淀粉样蛋白沉积或减少淀粉样蛋白沉积，例如，通过减少淀粉样蛋白沉积物的尺寸、数量或程度)。抑制任选地涉及与参照物(例如，未处理或使用非靶向dsrna(例如，不是靶向lect2的dsrna)处理的对照)相比抑制至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。
[0129]
在一些实施方式中，抑制lect2基因表达使来自受试者的生物样品(例如，血清样品)的lect2蛋白水平减少至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
[0130]
在其他方面中，本公开提供了用于治疗与lect2表达相关的病理过程(例如，淀粉样蛋白沉积)的方法。在一个实施方式中，所述方法包括向受试者(例如，需要此类治疗的患者)施用有效(例如，治疗或预防有效)量的本文提供的dsrna。
[0131]
在一个方面中，本文提供了治疗和/或预防与lect2表达相关的病症(例如，lect2淀粉样变性)的方法，其包括向需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的本文所述的irna(例如，dsrna)或本文所述的包含irna(例如，dsrna)的组合物。
[0132]
在一个方面中，本文提供了一种治疗与lect2表达相关的病症(例如，lect2淀粉样变性)的方法，其包括向需要此类治疗的受试者施用双链核糖核酸(dsrna)，其中所述dsrna包含长度为15-30个碱基对的有义链和反义链，并且反义链与lect2 mrna转录物的至少15个连续核苷酸互补，例如，人lect2 mrna转录物，例如，seq id no:1或在seq id no:1的核苷酸位置373处具有a到g置换的核苷酸序列。在一个实施方式中，irna(例如，dsrna)靶向编码在成熟lect2蛋白(或在未加工蛋白的氨基酸58)中的位置40处的缬氨酸的mrna。
[0133]
在一个实施方式中，本文提供了一种治疗具有lect2淀粉样变性的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用双链核糖核酸(dsrna)，其中所述dsrna包含长度为15-30个碱基对的有义链和反义链，并且反义链与lect2 mrna转录物的至少15个连续核苷酸互补，例如，人lect2 mrna转录物，例如，seq id no:1或在seq id no:1的核苷酸位置373处具有a到g置换的核苷酸序列。在一个实施方式中，irna(例如，dsrna)靶向编码在成熟lect2蛋白(或在未加工蛋白的氨基酸58)中的位置40处的缬氨酸的mrna。
[0134]
在一些实施方式中，施用靶向lect2的irna缓解或减轻患者中与lect2表达相关的病症的至少一种症状的严重程度。在一些实施方式中，与lect2表达相关的病症(例如，淀粉样变性，例如，lect2淀粉样变性)的至少一种体征或症状包括淀粉样蛋白沉积物或者lect2存在或水平(例如，lect2基因、lect2 mrna或lect2蛋白)的指标。
[0135]
在一个实施方式中，所述受试者具有lect2淀粉样变性。在另一个实施方式中，所述受试者有发展lect2淀粉样变性的风险。
[0136]
在一些实施方式中，所述受试者是人。
[0137]
在一些实施方式中，dsrna或药物组合物(例如，如本文所述的dsrna或药物组合物)皮下或静脉内向受试者施用。
[0138]
在一些实施方式中，治疗包括预防病症的进展。
[0139]
在一些实施方式中，治疗包括抑制或降低细胞(例如，肝细胞)中lect2表达或活性。在一些实施方式中，治疗导致细胞中lect2 mrna与基线相比平均减少至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
[0140]
在一些实施方式中，本文所述的方法还包括测量受试者中lect2(例如，lect2基因、lect2 mrna或lect2蛋白)的水平。在一些实施方式中，测量受试者中的lect2水平包括测量来自受试者的生物样品(例如，组织、血液或血清样品)中lect2基因、lect2蛋白或lect2 mrna的水平。在一些实施方式中，本文所述的方法还包括进行血液测试、成像测试或者肝脏或肾脏组织活检。在一些实施方式中，在使用dsrna药剂或药物组合物治疗之前，在受试者中进行lect2(例如，lect2基因、lect2 mrna或lect2蛋白)水平的测量。在一些实施方式中，在确定受试者具有大于参照水平的lect2(例如，lect2基因、lect2 mrna或lect2蛋白)水平之后，向受试者施用dsrna药剂或药物组合物。在一些实施方式中，在使用dsrna药剂或药物组合物治疗之后，在受试者中进行lect2(例如，lect2基因、lect2 mrna或lect2蛋白)水平的测量。
[0141]
在一些实施方式中，将irna(例如，dsrna)配制为lnp制剂。
[0142]
在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)是galnac缀合物形式。
[0143]
在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)以0.05-50mg/kg的剂量施用。
[0144]
在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)以0.01mg/kg-5mg/kg受试者体重的浓度施用。
[0145]
在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)配制为lnp制剂，并以0.05-5mg/kg的剂量施用。在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)配制为lnp制剂，并以0.1至0.5mg/kg的剂量施用。
[0146]
在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)是galnac缀合物的形式，并以0.5-50mg/kg的剂量施用。在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)是galnac缀合物的形式，并以1-10mg/kg的剂量施用。
[0147]
在一些实施方式中，所述方法抑制lect2基因表达，或抑制淀粉样蛋白沉积(例如，通过防止淀粉样蛋白沉积或减少淀粉样蛋白沉积，例如，通过减少淀粉样蛋白沉积物的尺寸、数量或程度)。抑制任选地涉及与参照(例如，对照是未处理或使用非靶向dsrna(例如，不是靶向lect2的dsrna)处理的)相比抑制至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
[0148]
在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)具有范围0.0005-1nm的ic
50
，例如，0.001和0.2nm之间、0.002和0.1nm之间、0.005和0.075nm之间或0.01和0.05nm之间。在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)的ic
50
等于或小于0.02nm，例如，0.0005和0.02nm之间、0.001和0.02nm之间、0.005和0.02nm之间或0.01和0.02nm之间。在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)具有0.01-1nm的ic
50
。
[0149]
在一些实施方式中，本文所述的方法改善与lect2相关病症(例如，lect2淀粉样变
性)相关的症状。在一些实施方式中，本文所述的方法抑制受试者中lect2基因表达。在一些实施方式中，本文所述的方法抑制淀粉样蛋白沉积(例如，通过防止淀粉样蛋白沉积或减少淀粉样蛋白沉积，例如，通过减少淀粉样蛋白沉积物的尺寸、数量或程度)。
[0150]
在一些实施方式中，根据给药方案施用irna(例如，dsrna)或包含irna的组合物。在一些实施方式中，重复施用irna(例如，dsrna)或包含irna的组合物，例如，根据给药方案。
[0151]
在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)或包含irna的组合物是皮下施用的。在一些实施方式中，irna是galnac缀合物形式。在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)以0.5-50mg/kg的剂量施用。在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)是galnac缀合物形式，并以1至10mg/kg的剂量施用。
[0152]
在一个方面中，本文提供了一种载体，其编码如本文所述的irna(例如，dsrna)的至少一条链。
[0153]
在一个方面中，本文提供了一种编码dsrna的至少一条链的载体，其中所述dsrna包含编码lect2的mrna的至少一部分的互补区，其中所述dsrna长度为30个碱基对或更少，和其中所述dsrna靶向所述mrna进行切割。
[0154]
在一些实施方式中，互补区的长度为至少15个核苷酸。在一些实施方式中，互补区的长度为19至23个核苷酸。在一些实施方式中，互补区的长度为21至23个核苷酸。
[0155]
在一个方面中，提供了一种用于抑制细胞中lect2基因表达的载体。在一个实施方式中，所述载体包含如本文所述的irna。在一个实施方式中，载体包含至少一个调控序列，所述调控序列可操作地连接至核苷酸序列，所述核苷酸序列编码如本文所述的irna的至少一条链。在一个实施方式中，载体包含lect2 irna的至少一条链。
[0156]
在一个方面中，本文提供了一种细胞，其包含如本文所述的载体。
[0157]
在一个方面中，本文提供了一种包含载体的细胞，所述载体用于抑制细胞中lect2基因表达。载体包含调控序列，所述调控序列可操作地连接至核苷酸序列，所述核苷酸序列编码本文所述的irna的至少一条链。
[0158]
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入。
[0159]
本公开的各种实施方式的细节在下面的描述中阐述。本公开的其他特征、目的和优点将从说明书和附图以及从权利要求中显而易见。
附图说明
[0160]
专利或申请文件包含至少一幅彩色绘图。专利局将根据请求以及支付必要的费用提供本专利或专利申请公开文本的彩色附图副本。
[0161]
图1描述了人lect2 mrna转录物序列(ref.seq.nm_002302.2gi：59806344，记录日期为2013年04月17日；seq id no：1)。
[0162]
图2描述了三个示例性lect2 sirna的序列和化学性质：ad-454781、ad-133461和ad-454746，将其设计为靶向人和食蟹猴两者中的lect2 mrna区域。对于每个sirna，显示为绿色的“f”是“2’氟”修饰，显示为黑色的ome是甲氧基，显示为紫色的gna是乙二醇核酸，以及ps指硫代磷酸酯键。图2按照出现顺序分别公开了seq id nos 897-902。
[0163]
图3描述了在啮齿动物aav模型中三个示例性lect2 sirna的药效学。在实验组
(lect2 sirna)和对照组(pbs)治疗后第14天，对肝脏中lect2 mrna和血浆中循环lect2蛋白的相对水平(剩余百分比)进行量化。
[0164]
图4a-4c显示了三个示例性lect2 sirna在抑制食蟹猴中相对于pbs对照的lect2的剂量应答。血浆lect2的相对水平(血浆lect2蛋白敲低)通过归一化为每只猴子的预处理蛋白水平来量化。
[0165]
图5a-5b描述了在实验组(lect2 sirna)或对照(pbs)组中治疗开始后3、6或12个月时肝脏中大鼠(图5a)或小鼠(图5b)lect2 mrna的相对水平(表达倍数差异)。
[0166]
图6a-6b评估了在食蟹猴中的长期lect-2敲低。在图6a中，在实验组(sirna ad-81725)和对照(pbs)组中对初始治疗后六个月时猴肝脏中lect2 mrna的相对水平(表达倍数差异)进行量化。在图6b中，在实验组(sirna ad-81725)和对照组(pbs)首次给药后的六个月内，每个月测量lect2血浆蛋白的相对循环水平(剩余蛋白百分比)。
具体实施方式
[0167]
irna通过称为rna干扰(rnai)的过程涉及mrna的序列特异性降解。本文描述了使用其调控(例如，抑制)lect2基因表达的irna和方法。还提供了用于治疗与lect2表达相关病症的组合物和方法，如淀粉样变性(例如，lect2淀粉样变性)。
[0168]
本文特征的组合物的irna包含具有某一区域的rna链(反义链)，所述区域长度为30个核苷酸或更短，即，长度为15-30个核苷酸，通常长度为19-24个核苷酸，其中该区域与lect2基因的mrna转录物的至少一部分基本上互补(本文中还称为“lect2特异性irna”)。如本文所述，使用此类irna能够靶向降解与lect2表达相关的病症相关的基因的mrna。极低剂量的lect2特异性irna能够特异性和有效介导rnai，从而显著抑制lect2基因表达。靶向lect2的irna能够特异性和有效介导rnai，从而显著抑制lect2基因表达，可以对其进行评估，例如，在基于细胞的测定中。
[0169]
以下说明书公开了如何制备和使用含有irna来调控(例如，抑制)lect2基因表达的组合物，以及用于治疗与lect2基因表达相关的病症的组合物和方法。
[0170]
本文特征的药物组合物的实施方式包含具有反义链的irna，所述反义链包含某一区域，所述区域长度为30个核苷酸或更短，长度通常为19-24个核苷酸，其中该区域与lect2基因的mrna转录物的至少一部分基本上互补。
[0171]
在一些方面中，本文的特征为包含lect2 irna和药学上可接受的载体的药物组合物，使用所述组合物抑制lect2基因表达的方法，以及使用所述药物组合物以治疗与lect2基因表达相关的病症(例如，lect2淀粉样变性)的方法。
[0172]
i.定义
[0173]
为方便起见，说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语和短语的含义如下提供。如果本说明书其他部分的术语使用与本章节提供的定义存在明显差异，则以本章节的定义为准。
[0174]
如本文所用，“lect2”指白细胞趋化因子2(也称为白细胞来源的趋化因子2、软骨调节素-ii、chm-ii或chm2)。参见，例如，yamagoe s等，genomics,1998mar 15；48(3):324-9。lect2首次被鉴定为一种新型中性粒细胞趋化蛋白，与软骨调节素ii相同，软骨调节素ii是软骨细胞和成骨细胞的生长刺激剂。人lect2基因定位到染色体5q31.1-q32。同上。
[0175]
人lect2 mrna转录物的序列可以参见nm_002302.2(seq id no:1)。小鼠lect2 mrna的序列可以参见nm_010702.1和nm_010702.2，以及大鼠lect2 mrna的序列可以参见nm_001108405.1。
[0176]
人lect2蛋白是分泌的16kda蛋白。lect2蛋白是由肝脏分泌的。它与鸡myb诱导的髓样1蛋白的软骨调节素重复区具有高度序列相似性(www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝lect2；访问时间2013年08月29日)。lect2基因的多态性与类风湿性关节炎有关。同上。
[0177]
lect2在各种组织中表达，包括脑和胃以及肝脏。koshimizu,y&ohtomi,m.(2010)brain res.1311:1-11。在一项使用间接免疫过氧化物酶染色研究lect2在肝脏以外的正常和患病人体器官和组织中的表达的研究中，发现lect2普遍表达于血管、内皮和平滑肌细胞、脂肪细胞、脑神经细胞、顶端鳞状上皮、甲状旁腺细胞、汗腺和皮脂腺上皮、哈氏小体和免疫造血组织中的一些单核细胞中。这种蛋白通常呈阴性，但偶尔在成骨细胞、软骨细胞、心肌和骨骼肌细胞、胃肠道平滑肌细胞和一些组织的上皮细胞中呈阳性染色。nagai等，(1998)pathol int.48(11):882-6。
[0178]
人lect2基因编码151个氨基酸，包括一个18个氨基酸的信号肽。分泌的蛋白有133个残基。已鉴定出基因外显子3中第172位核苷酸的g/a多态性(密码子从gtc变为atc)，这说明未加工蛋白的第58位(或成熟蛋白的第40位)存在缬氨酸或异亮氨酸。g等位基因在欧洲血统的个体中的总频率为0.477，频率范围为0.6-0.7。参见benson,m.d.等，(2008)kidney international,74:218-222；murphy,c.l.等，(2010)am j kidney dis,56(6):1100-1107。lect2淀粉样变性患者通常是g等位基因纯合子。不希望受到理论的束缚，有人提出，用缬氨酸(g等位基因)替换埋藏的异亮氨酸(a等位基因)侧链可能会破坏蛋白的稳定性，并可能解释这种lect2变体的淀粉样蛋白形成倾向。murphy,c.l.等，(2010)am j kidney dis,56(6):1100-1107。
[0179]
如本文所用，“lect2淀粉样变性”或“alect2”包括淀粉样变性，其涉及含有lect2蛋白(例如，lect2蛋白的任何多态性变体)或lect2蛋白的一部分的淀粉样蛋白或淀粉样蛋白原纤维的沉积。lect2蛋白可以是变体(例如，突变的)lect2蛋白。淀粉样变性可以是全身性的或局部的。在一些实施方式中，lect2淀粉样变性涉及肾脏和/或肝脏中的淀粉样蛋白沉积物。
[0180]“g”、“c”、“a”、“t”和“u”通常分别代表以鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶为碱基的核苷酸。然而，应当理解，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可以指修饰的核苷酸，如下文进一步详述，或替代物替代部分。本领域技术人员非常清楚，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其他部分替代，而不会显着改变包含带有这种替代部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对性质。t例如，不限于，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，包含尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本公开中的特征的dsrna的核苷酸序列中被包含例如肌苷的核苷酸替换。在另一个实例中，寡核苷酸中任何位置的腺嘌呤和胞嘧啶都可以分别被鸟嘌呤和尿嘧啶取代，从而与靶mrna形成g-u wobble碱基配对。包含此类替换部分的序列适用于本公开中的组合物和方法。
[0181]
如本文所用，术语“irna”、“rnai”、“irna药剂”或“rnai药剂”指包含如本文定义的术语的rna并且介导rna转录物的靶向切割的药剂，例如，通过rna诱导的沉默复合物(risc)
途径。在一个实施方式中，如本文所述的irna影响lect2表达的抑制。可以基于alect2mrna水平的降低或alect2蛋白水平的降低来评估alect2表达的抑制。如本文所用，“靶序列”指在alect2基因转录过程中形成的mrna分子的核苷酸序列的连续部分，包括作为初级转录产物的rna加工产物的mrna。序列的靶部分将至少足够长，以用作在该部分处或附近进行irna定向切割的底物。例如，靶序列将通常是9-36个核苷酸的长度，例如，15-30个核苷酸的长度，包括其间的所有子范围。作为非限制性实例，靶序列可以是15-30个核苷酸、15-26个核苷酸、15-23个核苷酸、15-22个核苷酸、15-21个核苷酸、15-20个核苷酸、15-19个核苷酸、15-18个核苷酸、15-17个核苷酸、18-30个核苷酸、18-26个核苷酸、18-23个核苷酸、18-22个核苷酸、18-21个核苷酸、18-20个核苷酸、19-30个核苷酸、19-26个核苷酸、19-23个核苷酸、19-22个核苷酸、19-21个核苷酸、19-20个核苷酸、20-30个核苷酸、20-26个核苷酸、20-25个核苷酸、20-24个核苷酸、20-23个核苷酸、20-22个核苷酸、20-21个核苷酸、21-30个核苷酸、21-26个核苷酸、21-25个核苷酸、21-24个核苷酸、21-23个核苷酸或21-22个核苷酸。
[0182]
如本文所用，术语“包含序列的链”指包含核苷酸链的寡核苷酸，所述核苷酸链由使用标准核苷酸命名法提及的序列描述。
[0183]
如本文所用，并且除非另有说明，术语“互补的”，当用于描述与第二核苷酸序列相关的第一核苷酸序列时，指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链体结构的能力，如本领域技术人员将理解的。例如，此类条件可以是严格条件，其中严格条件可以包括：400mm nacl、40mm pipes ph 6.4、1mm edta、50℃或70℃持续12-16小时，然后洗涤。可以应用其他条件，如可能在生物体内遇到的生理相关条件。技术人员将能够根据杂交核苷酸的最终应用确定最适合测试两个序列的互补性的一组条件。
[0184]
irna内(例如，如本文所述的dsrna内)的互补序列，包括在一个或两个核苷酸序列的全长上包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸的碱基配对。可以将这样的序列在本文中称为彼此“完全互补”。然而，当第一序列在本文中被称为相对于第二序列“基本上互补”时，这两个序列可以是完全互补的，或者其可以形成一个或多个，但通常不超过5、4、3或2个错配碱基对，最多30个碱基对的双链体杂交，同时保留在与其最终应用最相关的条件下杂交的能力，例如，通过risc通路抑制基因表达。然而，如果两个寡核苷酸被设计成在杂交时形成一个或多个单链突出端，在确定互补性方面，此类突出端不应被视为不匹配。例如，dsrna包含一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸和另一个长度为23个核苷酸的寡核苷酸，其中较长的寡核苷酸包含与较短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，出于本文所述的目的，仍可称为“完全互补的”。
[0185]
如本文所用，“互补”序列还可以包括或完全由非watson-crick碱基对和/或由非天然和修饰的核苷酸形成的碱基对形成，只要满足上述关于其杂交能力的要求即可。此类非watson-crick碱基对包括但不限于g:u wobble或hoogstein碱基配对。
[0186]
本文中的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可用于关于dsrna的有义链与反义链之间或irna药剂的反义链与靶序列之间的碱基匹配，从其的使用上下文中可以理解。
[0187]
如本文所用，与信使rna(mrna)的“至少部分基本上互补”的多核苷酸是指与目标mrna(例如，编码alect2蛋白的mrna)的连续部分基本上互补的多核苷酸。例如，如果该序列
与编码lect2的mrna的非间断部分基本上互补，则该多核苷酸与lect2 mrna的至少一部分互补。作为另一个实例，如果该序列与编码lect2的mrna的非间断部分基本上互补，则该多核苷酸与lect2 mrna的至少一部分互补。
[0188]
如本文所用，术语“双链rna”或“dsrna”是指包含rna分子或分子复合物的irna，其具有包含两条反平行且基本上互补的核酸链的杂交双链体区，这将被称为相对于靶rna具有“有义”和“反义”放心。双链体区可以是允许所需的靶rna特异性降解的任何长度，例如，通过risc途径，但通常长度范围为9-36个碱基对，例如，长度15-30个碱基对。考虑到9到36个碱基对之间的双链体，双链体可以是该范围内的任何长度，例如，9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36以及之间的任何子范围，包括但不限于15-30个碱基对、15-26个碱基对、15-23个碱基对、15-22个碱基对、15-21个碱基对、15-20个碱基对、15-19个碱基对、15-18个碱基对、15-17个碱基对、18-30个碱基对、18-26个碱基对、18-23个碱基对、18-22个碱基对、18-21个碱基对、18-20个碱基对、19-30个碱基对、19-26个碱基对、19-23个碱基对、19-22个碱基对、19-21个碱基对、19-20个碱基对、20-30个碱基对、20-26个碱基对、20-25个碱基对、20-24个碱基对、20-23个碱基对、20-22个碱基对、20-21个碱基对、21-30个碱基对、21-26个碱基对、21-25个碱基对、21-24个碱基对、21-23个碱基对或21-22个碱基对。通过用dicer和类似酶处理在细胞中产生的dsrna通常长度在19-22个碱基对的范围内。dsdna的双链体区域的一条链包含与靶rna的区域基本上互补的序列。形成双链体结构的两条链可以来自具有至少一个自身互补区的单个rna分子，或者可以由两个或更多个单独的rna分子形成。当双链体区由单个分子的两条链形成时，该分子可以在一条链的3
’‑
末端和形成双链体结构的相应另一链的5
’‑
末端之间具有由单链核苷酸链(本文称为“发夹环”)隔开的双链体区。发夹环可以包含至少一个未配对的核苷酸；在一些实施方式中，发夹环可以包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少23个或更多个不配对的核苷酸。当dsrna的两条基本上互补的链由单独的rna分子组成时，这些分子不需要但可以共价连接。当两条链通过发夹环以外的方式共价连接时，连接结构被称为“接头”。术语“sirna”在本文中也用于指代如上所述的dsrna。
[0189]
在另一个实施方式中，irna药剂可以是“单链sirna”，将其引入细胞或生物体以抑制靶mrna。单链rnai药剂与risc核酸内切酶argonaute 2结合，然后切割靶mrna。单链sirna通常15-30个核苷酸并且是化学修饰的。单链sirna的设计和测试在美国专利号8,101,348和lima等，(2012)cell 150:883-894中描述，其每一个的全部内容在此通过引用并入本文。本文所述的任何反义核苷酸序列(例如，表2a-2b、3a-3b、6或7中提供的序列)可用作本文所述的单链sirna或通过lima等，(2012)cell 150:883-894中所述的方法进行化学修饰。
[0190]
本领域技术人员将认识到，术语“rna分子”或“核糖核酸分子”不仅包括如在自然界中表达或发现的rna分子，而且包括rna的类似物和衍生物，包括如本文所述或本领域公知的一种或多种核糖核苷酸/核糖核苷类似物或衍生物。严格来说，“核糖核苷”包括核苷碱基和核糖，“核糖核苷酸”是具有一个、两个或三个磷酸部分的核糖核苷。然而，术语“核糖核苷”和“核糖核苷酸”可以认为与本文使用的相同。rna可以在核碱基结构、核糖结构或核糖-磷酸骨架结构中被修饰，例如，如下文所述。然而，包含核糖核苷类似物或衍生物的分子必须保留形成双链体的能力。作为非限制性实例，rna分子还可以包含至少一种修饰的核糖核
苷，包括但不限于2
’‑
o-甲基修饰的核苷、包含5’硫代磷酸酯基团的核苷、与胆固醇衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷、锁定核苷、无碱基核苷、无环核苷、乙二醇核苷酸、2
’‑
脱氧-2
’‑
氟修饰的核苷、2
’‑
氨基修饰的核苷、2
’‑
烷基修饰的核苷、吗啉代核苷、氨基磷酸酯或包含非天然碱基的核苷酸或其任意组合。或者，rna分子可以包含至少两个修饰的核糖核苷、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或更多，直至dsrna分子的整个长度。对于rna分子中这样的多个修饰核糖核苷中的每一个，修饰不必相同。在一个实施方式中，预期用于本文所述的方法和组合物的修饰的rna是肽核酸(pna)，其具有形成所需双链体结构的能力并且允许或介导靶rna的特异性降解，例如，通过risc途径。
[0191]
在一个方面中，修饰的核糖核苷包括脱氧核糖核苷。在这种情况下，irna药剂包含一种或多种脱氧核苷，包括例如，一个或多个脱氧核苷突出端，或dsrna双链体部分内的一种或多种脱氧核苷。在某些实施方式中，rna分子包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95％或更高百分比(但不是100％)的脱氧核糖核苷，例如，在一条或两条链中。在其他实施方式中，术语“irna”不包含双链dna分子(例如，天然存在的双链dna分子或100％含脱氧核苷的dna分子)。
[0192]
在一个方面中，rna干扰剂包括与靶rna序列相互作用以指导靶rna切割的单链rna。不希望受到理论的束缚，引入细胞的长双链rna被称为dicer的iii型核酸内切酶分解成sirna(sharp等，genes dev.2001,15:485)。dicer是一种核糖核酸酶iii样酶，将dsrna加工成19-23个碱基对的短干扰rna，具有特征性的两个碱基3’突出端(bernstein,等，(2001)nature 409:363)。然后将sirna掺入rna诱导的沉默复合体(risc)中，其中一个或多个解旋酶解开sirna双链体，使互补反义链能够指导靶识别(nykanen,等，(2001)cell 107:309)。在与适当的靶mrna结合后，risc内的一种或多种核酸内切酶会切割靶点以诱导沉默(elbashir,等，(2001)genes dev.15:188)。因此，在一个方面中，本公开涉及促进risc复合物形成以实现靶基因沉默的单链rna。
[0193]
如本文所用，术语“核苷酸突出端”是指至少一个从irna(例如，dsrna)的双链体结构突出的未配对核苷酸。例如，当dsrna一条链的3’端延伸到另一条链的5’端之外时，或反之亦然，则存在核苷酸突出端。dsrna可以包含至少一个核苷酸的突出端；或者，突出端可以包含至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多。核苷酸突出端可以包含或由核苷酸/核苷类似物组成，包括脱氧核苷酸/核苷。突出端可以在有义链、反义链或者其任何组合上。此外，突出端的核苷酸可以存在于dsrna反义链或有义链的5’端、3’端或者两端。
[0194]
在一个实施方式中，dsrna的反义链在3’末端和/或5’末端具有1-10个核苷酸突出端。在一个实施方式中，dsrna的有义链在3’末端和/或5’末端具有1-10个核苷酸突出端。在另一个实施方式中，突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代。
[0195]
如本文所用，关于dsrna的术语“平端”或“平末端”是指在dsrna的给定末端不存在未配对的核苷酸或核苷酸类似物，即，没有核苷酸突出端。dsrna的一个或两个末端可以是平端。dsrna的两个末端是平端，可以说dsrna是平末端的。需要明确的是，“平末端”dsrna是两个末端平端的dsrna，即，分子的任一端都没有核苷酸突出端。大多数情况下，这种分子在其整个长度上都是双链的。
[0196]
术语“反义链”或“指导链”指irna的链，例如，dsrna，其包括与靶序列基本上互补的区域。如本文所用，术语“互补区”指反义链上与本文定义的序列例如靶序列基本上互补的区域。当互补区与靶序列不完全互补时，错配可能在分子的内部或末端区域。在一些实施方式中，互补区包含0、1或2个错配。
[0197]
如本文所用，术语“有义链”或“随从链”指包含对于本文定义的反义链区域的基本上互补区域的irna链。
[0198]
如本文所用，术语“snalp”指稳定的核酸脂质颗粒。snalp代表包被减少的水性内部的脂质囊泡，所述水性内部包含核酸，如irna或从中转录irna的质粒。在例如美国专利申请公开号2006/0240093、2007/0135372和国际申请号wo 2009/082817中对snalp进行了描述。这些申请通过引用整体并入本文。
[0199]
如本领域技术人员所理解的，当提及irna时，“引入细胞中”指促进或影响细胞的摄取或吸收。irna的吸收或摄取可以通过独立的扩散或活性细胞过程，或通过助剂或装置发生。该术语的含义不仅限于体外细胞；irna也可以“引入细胞”，其中细胞是活生物体的一部分。在这种情况下，引入细胞将包括递送至生物体。例如，对于体内递送，irna可以注射到组织部分或全身施用。体内递送也可以通过β-葡聚糖递送系统，例如在美国专利号5,032,401和5,607,677以及美国公开号2005/0281781中描述的那些，这些专利在此通过引用整体并入。体外引入细胞包括本领域公知的方法，如电穿孔和脂质转染。进一步的方法在下文中描述或是本领域公知的。
[0200]
如本文所用，术语“调控表达”指与对照细胞中lect2表达相比，用本文所述的irna组合物处理的细胞中lect2基因表达至少部分“抑制”或部分“激活”。对照细胞包括未处理的细胞，或者使用非靶向对照irna处理的细胞。
[0201]
术语“激活”、“增强”、“上调表达”、“增加表达”等，只要其指的是lect2基因，在本文中指lect2基因表达的至少部分激活，如lect2mrna量的增加所证明的，与第二细胞或细胞组相比，该第二细胞或细胞组与第一细胞或细胞组基本相同，但未进行如此处理(对照细胞)，其可以从其中转录lect2基因并且已经被处理使得lect2基因表达增加的第一细胞或细胞组中分离或检测到。
[0202]
在一个实施方式中，通过施用如本文所述的irna，lect2基因表达激活至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在一些实施方式中，通过施用本公开的irna，lect2基因激活至少约60％、70％或80％。在一些实施方式中，通过施用如本文所述的irna，lect2基因表达激活至少约85％、90％或95％或更多。在一些实施方式中，与在未处理细胞中的表达相比，在使用如本文所述的irna处理的细胞中lect2基因表达增加至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更高。例如，在li等，2006proc.natl.acad.sci.u.s.a.103:17337-42，以及us2007/0111963和us2005/226848中描述了小dsrna激活表达，其每一个都通过引用并入本文。
[0203]
术语“沉默”、“抑制表达”、“下调表达”、“抑制表达”等，只要其指的是lect2基因，在本文中指lect2基因的至少部分抑制，如评估的，例如，基于lect2 mrna表达、lect2蛋白表达或与lect2基因表达功能相关的另一个参数。例如，lect2表达的抑制可以通过lect2 mrna量的减少来证明，与对照相比，其可以从其中转录lect2基因并且已经被处理使得lect2基因表达被抑制的第一细胞或细胞组中分离或检测到。对照可以是与第一细胞或细
胞组基本相同的第二细胞或细胞组，除了第二细胞或细胞组未经过如此处理以外(对照细胞)。抑制程度通常以对照水平的百分比表示，例如，
[0204][0205]
或者，抑制程度可以根据与lect2基因表达功能相关的参数的减少来给出，例如，由lect2基因编码的蛋白的量。与lect2基因表达功能相关的参数的减少可以类似地表示为对照水平的百分比。原则上，lect2基因沉默可以在任何表达lect2的细胞中确定，无论是组成型还是通过基因组工程，以及通过任何适当的测定。
[0206]
例如，在某些情况下，通过施用本文公开的irna，抑制lect2基因表达至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在一些实施方式中，通过施用本文公开的irna，抑制lect2基因至少约60％、65％、70％、75％或80％。在一些实施方式中，通过施用如本文所述的irna，抑制lect2基因至少约85％、90％、95％、98％、99％或更多。
[0207]
在本公开背景下，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”等指预防、缓解或减轻与lect2表达相关的病症相关的至少一种症状，或者减缓或逆转此类病症的进展或预期进展。例如，本文所述的方法，当用于治疗lect2淀粉样变性时，可用于抑制淀粉样蛋白沉积，减少或预防淀粉样变性的一种或多种症状，或降低相关病况(例如，肾病综合征或肝炎)的风险或严重程度。因此，除非上下文另有明确说明，否则术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”等旨在涵盖预防，例如，预防与lect2表达相关的病症和/或病症的症状。
[0208]
在疾病标志物或症状的上下文中，“降低”是指任何降低，例如，这种水平的统计学或临床显着降低。降低可以是，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。对于没有这种病症的个体，降低可以降至可接受的正常范围内的水平。
[0209]
如本文所用，短语“治疗有效量”和“预防有效量”等指在治疗、预防或控制与lect2表达相关的任何病症或病理过程中提供治疗获益的量。治疗有效的具体量可以根据本领域公知的因素而变化，例如，疾病或病理过程的类型、患者的病史和年龄、疾病或病理过程的阶段以及其他疗法的施用。
[0210]
如本文所用，“药物组合物”包含药理学有效量的irna和药学上可接受的载体。如本文所用，“药理学有效量”、“治疗有效量”或简称“有效量”是指有效产生预期药理学、治疗或预防结果的irna的量。例如，在治疗与lect2表达相关病症(例如，lect2淀粉样变性)的方法中，有效量包括有效减少与lect2淀粉样变性相关的一种或多种症状的量、有效抑制淀粉样蛋白沉积(例如，lect2淀粉样蛋白沉积)的量，或有效降低发生与lect2淀粉样变性相关病况的风险的量。例如，如果当与疾病或病症相关的可测量参数降低至少10％时，给定的临床治疗被认为是有效的，则用于治疗该疾病或病症的药物的治疗有效量是使该参数至少降低10％所必需的量。例如，治疗有效量的靶向lect2的irna可以将lect2 mrna水平或lect2蛋白水平降低任何可测量的量，例如，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
[0211]
术语“药学上可接受的载体”指用于施用治疗剂的载体。此类载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。术语特别地排除细胞培养基。对于口服施用的药物，药学上可接受的载体包括但不限于药学上可接受的赋形剂，如惰性稀释剂、崩解
剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。适宜的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙以及乳糖，而玉米淀粉和海藻酸是适宜的崩解剂。粘合剂可以包括淀粉和明胶，而如果存在的话，润滑剂通常是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。如果需要，片剂可以用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的材料包衣，以延迟在胃肠道中的吸收。药物制剂中包含的佐剂在下文中进一步描述。
[0212]
当提及数字或数值范围时，术语“约”是指所指的数字或数值范围是实验可变性(或统计实验误差)内的近似值，因此，数字或数值范围可能会在所述数字或数值范围的例如1％到15％之间变化。
[0213]
ii.irna药剂
[0214]
本文描述了调控(例如，抑制)letc2基因表达的irna药剂。
[0215]
在一些实施方式中，irna药剂激活细胞或哺乳动物中lect2基因表达。
[0216]
在一些实施方式中，irna药剂包括双链核糖核酸(dsrna)分子，用于抑制lect2基因在细胞或受试者中(例如，在哺乳动物中，例如，在人中)的表达，其中dsrna包括具有互补区的反义链，该区域与在lect2基因表达中形成的mrna的至少一部分互补，并且其中互补区的长度为30个核苷酸或更短，长度通常为19-24个核苷酸，并且其中dsrna在与表达lect2基因的细胞接触后抑制lect2基因表达，例如，至少10％、20％、30％、40％或50％。
[0217]
lect2基因表达的调控(例如，抑制)可以通过例如基于pcr或分支dna(bdna)的方法或通过基于蛋白的方法(如通过蛋白印迹)来测定。lect2基因在细胞培养物中的表达，如在cos细胞、hela细胞、原代肝细胞、hepg2细胞、原代培养细胞中或者来自受试者的生物样品中的表达可以通过测量lect2 mrna水平来测定，如bdna或taqman测定，或通过测量蛋白水平，如通过免疫荧光分析，使用例如western印迹或流式细胞术技术。
[0218]
dsrna包括两条足够互补的rna链，可在使用dsrna的条件下杂交形成双链体结构。dsrna的一条链(反义链)包含与靶序列基本上互补且通常完全互补的互补区，该靶序列来源于在lect2基因表达期间形成的mrna序列。另一条链(有义链)包含与反义链互补的区域，使得两条链在适宜条件下结合时杂交并形成双链体结构。在通常情况下，双链体结构的长度在15和30之间(含)，更通常在18和25之间(含)，更通常在19和24之间(含)，最通常在19和21之间个碱基对(含)。类似地，与靶序列的互补区的长度在15和30之间(含)，更通常在18和25之间(含)，更通常在19和24之间(含)，最通常在19和21之间个核苷酸(含)。
[0219]
在一些实施方式中，dsrna长度为15至20个核苷酸之间(含)，和在其他实施方式中，dsrna长度为25至30个核苷酸之间(含)。正如普通技术人员将认识到的，靶向切割的rna的靶向区域通常是较大rna分子的一部分，通常是mrna分子。在相关的情况下，mrna靶点的“部分”是mrna靶点的连续序列，其长度足以成为rnai定向切割(即，通过risc途径的切割)的底物。具有短至9个碱基对的双链体的dsrna在某些情况下可以介导rnai指导的rna切割。大多数情况下，靶点长度至少为15个核苷酸，例如，长度为15-30个核苷酸。
[0220]
本领域技术人员还将意识到的是，双链体区是dsrna的主要功能部分，例如9至36个，例如15-30个碱基对的双链体区。因此，在一个实施方式中，就其被加工成例如15-30个碱基对的功能性双链体而言，该双链体靶向所需的rna进行切割，具有大于30个碱基对的双链体区的rna分子或rna分子复合物是dsrna。因此，普通技术人员将意识到的是，在一个实施方式中，然而，mirna是dsrna。在另一个实施方式中，dsrna不是天然存在的mirna。在另一
个实施方式中，用于靶向lect2表达的irna药剂不会通过切割较大的dsrna在靶细胞中产生。
[0221]
本文所述的dsrna可以进一步包含一个或多个单链核苷酸突出端。dsrna可以通过本领域公知的标准方法合成，如下文进一步讨论，例如，通过使用自动化dna合成仪，如可以从例如biosearch,applied biosystems,inc商购获得。
[0222]
在一个实施方式中，lect2基因是人lect2基因。在另一个实施方式中，lect2基因是小鼠或大鼠lect2基因。
[0223]
在特定实施方式中，dsrna包含有义链和反义链，所述有义链包含或由选自表2a-2b、3a-3b、6或7中提供的有义序列的有义序列组成，和所述反义链包含或由选自表2a-2b、3a-3b、6或7中提供的反义序列的反义序列组成。
[0224]
在一个方面中，dsrna将至少包含有义和反义核苷酸序列，从而有义链选自表2a-2b、3a-3b、6或7中提供的序列，以及相应的反义链选自表2a-2b、3a-3b、6或7中提供的序列。
[0225]
在这些方面中，两个序列之一与两个序列中的另一个互补，其中一个序列与由lect2基因表达产生的mrna序列基本上互补。因此，dsrna将包含两个寡核苷酸，其中将一个寡核苷酸描述为有义链，而将第二个寡核苷酸描述为相应的反义链。如本文其他部分所述和本领域公知的，dsrna的互补序列也可以作为单个核酸分子的自我互补区包含，而不是在单独的寡核苷酸上。
[0226]
本领域技术人员非常清楚具有20至23个，特别是21个碱基对的双链体结构的dsrna在诱导rna干扰方面被认为是特别有效的(elbashir等，embo 2001,20:6877-6888)。然而，其他人发现更短或更长的rna双链体结构也可能有效。
[0227]
在上文所述的实施方式中，凭借在表2a-2b、3a-3b、6或7中提供的寡核苷酸序列的性质，本文所述的dsrna可以包括至少一条长度至少为19个核苷酸的链。可以合理地预期，与上述dsrna相比，具有表2a-2b、3a-3b、6或7的序列之一在一端或两端仅减去几个核苷酸的更短双链体将同样有效。
[0228]
在一些实施方式中，dsrna具有来自表2a-2b、3a-3b、6或7的序列之一的至少15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸的部分序列。
[0229]
在一些实施方式中，dsrna具有反义序列和有义序列，所述反义序列包含在表2a-2b、3a-3b、6或7中提供的反义序列的至少15、16、17、18或19个连续的核苷酸，所述有义序列包含在表2a-2b、3a-3b、6或7中提供的相应有义序列的至少15、16、17、18或19个连续的核苷酸。
[0230]
在一些实施方式中，dsrna具有反义序列和有义序列，所述反义序列包含在表2a-2b或3a-3b中提供的反义序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续的核苷酸，所述有义序列包含在表2a-2b、3a-3b、6或7中提供的相应有义序列的至少15、16、17、18、19、20或21个连续的核苷酸。
[0231]
在一些实施方式中，dsrna具有反义序列和有义序列，所述反义序列包含在表2a或2b中提供的反义序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续的核苷酸，所述有义序列包含在表2a或2b中提供的相应有义序列的至少15、16、17、18、19、20或21个连续的核苷酸。
[0232]
在一些实施方式中，dsrna具有反义序列和有义序列，所述反义序列包含在表3a或
3b中提供的反义序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续的核苷酸，所述有义序列包含在表3a或3b中提供的相应有义序列的至少15、16、17、18、19、20或21个连续的核苷酸。
[0233]
在一些实施方式中，dsrna具有反义序列和有义序列，所述反义序列包含在表6或7中提供的反义序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续的核苷酸，所述有义序列包含在表6或7中提供的相应有义序列的至少15、16、17、18、19、20或21个连续的核苷酸。
[0234]
在一些此类实施方式中，尽管dsrna仅包含表2a-2b、3a-3b、6或7中提供的序列的一部分，但在抑制lect2表达水平方面与包含表2a-2b、3a-3b、6或7中提供的全长序列的dsrna一样有效。在一些实施方式中，与包含公开的完整序列的dsrna相比，dsrna对lect2基因表达水平的抑制差异不超过5、10、15、20、25、30、35、40、45或50％的抑制。
[0235]
表2a-2b、3a-3b、4a-4b或5-7中提供的irna鉴定了lect2转录物中易受risc介导的切割的位点。这样，本公开进一步表征了靶向此类序列之一内的irna。如本文所用，如果irna促进转录物在特定位点内任何位置的切割，则称irna靶向rna转录物的特定位点。这样的irna通常将包括来自表2a-2b、3a-3b、4a-4b或5-7中提供的序列之一的至少15个连续核苷酸，与取自与lect2基因中所选序列邻接的区域的附加核苷酸序列偶联。
[0236]
尽管靶序列的长度通常为15-30个核苷酸，但该范围内的特定序列对于指导任何给定靶rna的切割的适用性存在很大差异。此处列出的各种软件包和指南为识别任何给定基因靶点的最佳靶标序列提供了指导，但是也可以采用经验方法，其中给定尺寸(作为非限制性实例，21个核苷酸)的“窗口”或“掩码”在字面上或形象上(包括，例如，在计算机上)放置在靶rna序列上，以鉴定尺寸范围内可作为靶序列的序列。通过将序列“窗口”逐渐移动到初始靶序列位置的上游或下游一个核苷酸，可以鉴定下一个潜在的靶序列，直到针对所选的任何给定靶尺寸鉴定出完整的可能序列集。该过程与所鉴定序列的系统合成和测试(使用本文所述或本领域公知的测定法)相结合，以鉴定那些表现最佳的序列，可以鉴定那些当用irna试剂靶向时，介导对靶基因表达的最佳抑制的rna序列。因此，尽管鉴定的序列，例如，在表2a-2b、3a-3b、6或7中，代表有效的靶序列，预期抑制效率的进一步优化可以通过在给定序列的上游或下游逐步“走窗”一个核苷酸来鉴定具有相同或更好抑制特性的序列来实现。
[0237]
此外，预期对于例如在表2a-2b、3a-3b、6或7中鉴定的任何序列，进一步优化可以通过系统地添加或去除核苷酸以产生更长或更短的序列并测试这些和通过从该点向上或向下移动靶rna上或下靶rna的窗口所产生的序列来实现。同样，在本领域公知的或如本文所述的抑制测定中，将该方法与产生新候选靶点的方法与基于那些靶点序列的irna有效性测试相结合可以导致抑制效率的进一步提高。此外，可以通过例如引入本文所述或本领域公知的修饰核苷酸、突出端的添加或改变或本领域公知和/或本文讨论的其他修饰来调整此类优化的序列以进一步优化作为表达抑制剂的分子(例如，增加血清稳定性或循环半衰期，增加热稳定性，增强跨膜递送，靶向特定位置或细胞类型，增加与沉默途径酶的相互作用，增加内体释放等)。
[0238]
如本文所述的irna可以包含与靶序列的一个或多个错配。在一个实施方式中，如本文所述的irna包含不超过3个错配。如果irna的反义链包含与靶序列的错配，则错配区域最好不要位于互补区的中心。如果irna的反义链包含与靶序列的错配，最好将错配限制在
互补区5’或3’末端的最后5个核苷酸内。例如，对于与lect2基因区域互补的23个核苷酸的irna药剂的rna链，该rna链通常在中央13个核苷酸内不包含任何错配。本文所述的方法或本领域公知的方法可用于确定含有与靶序列错配的irna是否有效抑制lect2基因表达。考虑具有错配的irna在抑制lect2基因表达方面的有效性很重要，特别是如果已知lect2基因中的特定互补区在群体中具有多态性序列变异。
[0239]
在一个实施方式中，dsrna的至少一个末端具有1至4个单链核苷酸突出端，通常1至2个核苷酸。与平末端对应物相比，具有至少一个核苷酸突出端的dsrna具有出人意料的优越抑制性质。在又一个实施方式中，irna(例如，dsrna)的rna是化学修饰的以增强稳定性或其他有益特征。本公开中的核酸可以通过本领域良好建立的方法合成和/或修饰，如在“current protocols in nucleic acid chemistry,”beaucage,s.l.等(编著)，john wiley&sons,inc.,new york,ny,usa中描述的那些，其通过引用并入本文。修饰包括，例如，(a)末端修饰，例如，5’末端修饰(磷酸化、缀合、反向连接等)，3’末端修饰(缀合、dna核苷酸、反向连接等)，(b)碱基修饰，例如，用稳定碱基、去稳定碱基或与扩展的伴侣库碱基配对的碱基、除去碱基(无碱基核苷酸)或缀合的碱基替代，(c)糖修饰(例如，在2’位置或4’位置处，或具有无环糖)或糖的替代，以及(d)骨架修饰，包括磷酸二酯键的修饰或替代。在该公开内容中使用的rna化合物的特定实例包括但不限于含有修饰骨架或不含天然核苷间键的rna。具有修饰骨架的rna尤其包括那些在骨架中没有磷原子的rna。出于本说明书的目的，并且如本领域中有时提到的，也可以将在其核苷间骨架中不具有磷原子的修饰的rna认为是寡核苷。在特定实施方式中，修饰的rna在其核苷间骨架中将有一个磷原子。
[0240]
修饰的rna骨架包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯，包括3
’‑
亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯，包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯和硼酸磷酸酯，其具有正常3
’‑5’
键、2
’‑5’
连接的这些类似物，以及具有反向极性的那些，其中相邻的核苷单元对以3
’‑5’
至5
’‑3’
或2
’‑5’
至5
’‑2’
连接。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。
[0241]
教导制备上述含磷键的代表性美国专利包括但不限于美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；以及美国专利re39464，其每一个通过引用并入本文。
[0242]
其中不包含磷原子的修饰的rna骨架具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的骨架。这些包括具有吗啉代键(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲乙酰和硫甲乙酰骨架；亚甲基甲乙酰和硫甲乙酰骨架；含有烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺胺骨架；酰胺骨架；以及混合了n、o、s和ch2组分部分的其他的那些。
[0243]
教导制备上述寡核苷的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439，其每一个通过引用并入本文。
[0244]
在适合或考虑用于irna的其他rna模拟物中，核苷酸单元的糖和核苷间键(即，骨架)都被新基团取代。保持碱基单位用于与适合的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物，其已被证明具有优异杂交性质的rna模拟物，将其称为肽核酸(pna)。在pna化合物中，pna的糖骨架被含有酰胺的骨架取代，特别是氨乙基甘氨酸骨架。核碱基被保留并直接或间接结合到骨架酰胺部分的氮杂氮原子上。教导制备pna化合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262，其每一个通过引用并入本文。pna化合物的其他教导可以参见例如nielsen等，science,1991,254,1497-1500。
[0245]
本公开中的一些实施方式包括具有硫代磷酸酯骨架的pna和具有杂原子骨架的寡核苷，并且特别是上文提及的美国专利号5,489,677的
‑‑
ch2‑‑
nh
‑‑
ch2‑‑
、
‑‑
ch2‑‑
n(ch3)
‑‑o‑‑
ch2‑‑
[称为亚甲基(甲基亚氨基)或mmi骨架]、
‑‑
ch2‑‑o‑‑
n(ch3)
‑‑
ch2‑‑
、
‑‑
ch2‑‑
n(ch3)
‑‑
n(ch3)
‑‑
ch2—和
‑‑
n(ch3)
‑‑
ch2‑‑
ch2‑‑
[其中天然磷酸二酯骨架表示为
‑‑o‑‑
p
‑‑o‑‑
ch2‑‑
]，以及上文提及的美国专利号5,602,240的酰胺骨架。在一些实施方式中，本文所述的rna具有上文提及的美国专利号5,034,506的吗啉代骨架结构。
[0246]
修饰的rna还可以包含一个或多个取代的糖部分。本文所述的irna(例如，dsrna)在2’位置处可以包含以下之一：oh；f；o-、s-或n-烷基；o-、s-或n-烯基；o-、s-或n-炔基；或o-烷基-o-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的c1至c
10
烷基或c2至c
10
烯基和炔基。示例性适宜修饰包括o[(ch2)no]mch3、o(ch2).noch3、o(ch2)nnh2、o(ch2)nch3、o(ch2)nonh2和o(ch2)non[(ch2)nch3)]2，其中n和m是从1到约10。在其他实施方式中，dsrna在2’位置处可以包含以下之一：c1至c
10
低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、o-烷芳基或o-芳烷基、sh、sch3、ocn、cl、br、cn、cf3、ocf3、soch3、so2ch3、ono2、no2、n3、nh2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、rna切割基团、报告基团、嵌入剂、用于改善irna药代动力学性质的基团或用于改善irna药效学性质的基团以及具有类似性质的其他取代基。在一些实施方式中，修饰包括2
’‑
甲氧基乙氧基(2
’‑o‑‑
ch2ch2och3，也称为2
’‑
o-(2-甲氧基乙基)或2
’‑
moe)(martin等，helv.chim.acta,1995,78:486-504)，即，烷氧基-烷氧基基团。另一种示例性修饰是2
’‑
二甲基氨基氧乙氧基，即，o(ch2)2on(ch3)2基团，也称为2
’‑
dmaoe、2
’‑
二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称为2
’‑
o-二甲基氨基乙氧基乙基或2
’‑
dmaeoe)，即，2
’‑o‑‑
ch2‑‑o‑‑
ch2‑‑
n(ch2)2。
[0247]
在其他实施方式中，irna药剂包含一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)无环核苷酸(或核苷)。在某些实施方式中，有义链或反义链或者有义链和反义链两者每条链包含少于五个无环核苷酸(例如，每条链四个、三个、两个或一个无环核苷酸)。一个或多个无环核苷酸可以存在于例如irna药剂有义链或反义链或者这两者的双链区；在有义链或反义链或者这两者的5’末端、3’末端、5’末端和3’末端两者。在一个实施方式中，一个或多个无环核苷酸存在于有义链或反义链或者这两者的位置1至8。在一个实施方式中，一个或多个无环核苷酸存在于反义链中，在反义链5’末端的位置4至10(例如，位置6-8)
处。在另一个实施方式中，一个或多个无环核苷酸存在于irna药剂的一个或两个3’末端突出端。
[0248]
如本文所用，术语“无环核苷酸”或“无环核苷”指具有无环糖(例如，无环核糖)的任何核苷酸或核苷。示例性无环核苷酸或核苷可以包括核碱基，例如，天然存在的或修饰的核碱基(例如，如本文所述的核碱基)。在某些实施方式中，任何核糖碳(c1、c2、c3、c4或c5)之间的键独立地或组合地不存在于核苷酸中。在一个实施方式中，核糖环的c2-c3碳之间的键不存在，例如，无环2
’‑3’‑
断裂核苷酸单体。在其他实施方式中，c1-c2、c3-c4或c4-c5之间的键不存在(例如，1
’‑2’
、3
’‑4’
或4
’‑5’‑
断裂核苷酸单体)。在us 8,314,227中公开了示例性无环核苷酸，其全部内容通过引用并入本文。例如，无环核苷酸可以包括us 8,314,227的附图1-2中单体d-j的任何一个。在一个实施方式中，无环核苷酸包含以下单体：
[0249][0250]
其中“碱基”是核碱基，例如，天然存在的或修饰的核碱基(例如，如本文所述的核碱基)。
[0251]
在某些实施方式中，可以对无环核苷酸进行修饰或衍生化，例如，通过将无环核苷酸与另一部分缀合，例如，配体(例如，galnac、胆固醇配体)、烷基、多胺、糖、多肽等。
[0252]
在其他实施方式中，irna药剂包含一个或多个无环核苷酸和一个或多个lna(例如，本文所述的lna)。例如，一个或多个无环核苷酸和/或一个或多个lna可以存在于有义链、反义链或者这两者中。在一条链中无环核苷酸的数量可以与相反链中lna数量相同或不同。在某些实施方式中，有义链和/或反义链包含少于五个位于双链区或3
’‑
突出端的lna(例如，四个、三个、两个或一个lna)。在其他实施方式中，一个或两个lna位于双链区或有义链的3
’‑
突出端。或者，或组合地，有义链和/或反义链在双链区或3
’‑
突出端包含少于五个无环核苷酸(例如，四个、三个、两个或一个无环核苷酸)。在一个实施方式中，irna药剂的有义链在有义链的3’突出端包含一个或两个lan，在irna药剂的反义链(例如，反义链5’末端的位置4至10处(例如，位置6-8))的双链区包含一个或两个无环核苷酸。
[0253]
在其他实施方式中，在irna药剂中包含一个或多个无环核苷酸(单独或还有一个或多个lna)导致irna分子以下一种或多种(或全部)：(i)降低脱靶效应；(ii)在rnai中减少随从链的参与；(iii)增加指导链对其靶mrna的特异性；(iv)降低微rna的脱靶效应；(v)增加稳定性；或(vi)增加对降解的抗性。
[0254]
其他修饰包括2
’‑
甲氧基(2
’‑
och3)、2
’‑
5氨基丙氧基(2
’‑
och2ch2ch2nh2)和2
’‑
氟(2
’‑
f)。类似的修饰也可以在irna的rna上的其他位置进行，特别是在3’末端核苷酸上或在2
’‑5’
连接的dsrna中糖的3’位置和5’末端核苷酸的5’位置。irna还可以具有糖模拟物，如环丁基部分来代替呋喃戊糖。教导制备此类修饰糖结构的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,
627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633和5,700,920，其中某些是本技术所共同拥有的，并且其每一个通过引用并入本文。
[0255]
irna还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未修饰的”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。修饰的核碱基包括其他合成和天然核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-c)、5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-氮杂尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代，特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
[0256]
其他核碱基包括在美国专利号3,687,808中公开的那些，在modified nucleosides in biochemistry,biotechnology and medicine,herdewijn,p.编著，wiley-vch,2008中公开的那些；在the concise encyclopedia of polymer science and engineering,pages 858-859,kroschwitz,j.l编著，john wiley&sons,1990中公开的那些，englisch等，angewandte chemie,国际版，1991,30,613中公开的那些，以及sanghvi,y s.，第15章，dsrna research and applications,第289-302页，crooke,s.t.和lebleu,b.，编著，crc press,1993中公开的那些。这些核碱基中的某些碱基对于增加本公开中的寡聚化合物的结合亲和性特别有用5。这些包括5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶和n-2、n-6和0-6取代嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示可将核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃(sanghvi,y.s.,crooke,s.t.和lebleu,b.编著，dsrna research and applications,crc press,boca raton,1993,pp.276-278)以及是示例性碱基取代，甚至更特别地当与2
’‑
o-甲氧基乙基糖修饰组合时。
[0257]
教导制备某些上述修饰核碱基以及其他修饰核碱基的代表性美国专利包括但不限于上述美国专利号3,687,808，以及美国专利号4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,681,941；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；和7,495,088，其每一个通过引用并入本文，以及美国专利号5,750,692，也通过引用并入本文。
[0258]
也可以对irna的rna进行修饰以包含一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)锁定核酸(lna)(在本文中也称为“锁定核苷酸”)。在一个实施方式中，锁定核酸是具有修饰的核糖部分的核苷酸，其中核糖部分包含连接例如2’和4’碳的额外桥。该结构将核糖有效“锁定”在3
’‑
内结构构象中。已显示向sirna添加锁定核酸可提高血清中sirna的稳定性、提高热稳定性并减少脱靶效应(elmen,j.等，(2005)nucleic acids research 33(1):439-447；mook,or.等，(2007)mol canc ther 6(3):833-843；grunweller,a.等，(2003)nucleic acids research 31(12):3185-3193)。
[0259]
教导制备锁定核酸的代表性美国专利包括但不限于以下：美国专利号6,268,490；
6,670,461；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,084,125；7,399,845和8,314,227，其每一个的全部内容通过引用并入本文。示例性lna包括但不限于2’,4
’‑
c亚甲基双环核苷酸(参见例如，wengel等，国际pct 5公开号wo 00/66604和wo 99/14226)。
[0260]
在其他实施方式中，irna药剂包含一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)g-夹钳核苷酸。g-夹钳核苷酸是修饰的胞嘧啶类似物，其中修饰赋予双链体内互补鸟嘌呤的watson-crick和hoogsteen面氢键合的能力，参见例如，lin和matteucci,1998,j.am.chem.soc.,120,8531-8532。当与互补寡核苷酸杂交时，寡核苷酸内的单个g-夹钳类似物取代可导致显着增强的螺旋热稳定性和错配辨别。在irna分子中包含此类核苷酸可导致对核酸靶点、互补序列或模板链的亲和性和特异性增强。
[0261]
对rna分子末端的潜在稳定修饰可以包括n-(乙酰氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(hyp-c6-nhac)、n-(己酰基-4-羟基脯氨醇(hyp-c6)、n-(乙酰基-4-羟基脯氨醇(hyp-nhac)、胸腺嘧啶-2
’‑
o-脱氧胸腺嘧啶(醚)、n-(氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(hyp-c6-氨基)、2-二十二烷酰基-尿嘧啶-3
’‑
磷酸酯、反向碱基dt(idt)等。这种修饰的公开内容可以参见pct公开号wo 2011/005861。
[0262]
irna基序
[0263]
在一个实施方式中，有义链序列可以以式(i)表示：
[0264]5’np-n
a-(xxx)
i-n
b-yyy-n
b-(zzz)
j-n
a-n
q3’ꢀꢀ(i)[0265]
其中：
[0266]
i和j分别独立地为0或1；
[0267]
p和q分别独立地为0-6；
[0268]
每个na独立地表示包含0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每条序列包含至少两个不同的修饰的核苷酸；
[0269]
每个nb独立地表示包含0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
[0270]
每个n
p
和nq独立地表示突出端核苷酸；
[0271]
其中nb和y不具有相同修饰；和
[0272]
xxx、yyy和zzz分别独立地表示三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序。优选地yyy均是2
’‑
f修饰的核苷酸。
[0273]
在一个实施方式中，na和/或nb包含交替模式的修饰。
[0274]
在一个实施方式中，yyy基序出现在有义链的切割位点处或附近。例如，当rnai药剂具有长度为17-23个核苷酸的双链体区时，yyy基序可以出现在有义链的切割位点或其附近(例如，可以出现在位置6、7、8；7、8、9；8、9、10；9、10、11；10、11、12或11、12、13)，从第一个核苷酸开始计数，从5’端开始；或者可选地，从双链体区内的第一对核苷酸开始计数，从5’端开始。
[0275]
在一个实施方式中，i是1和j是0，或i是0和j是1，或者i和j两者是1。因此，有义链可以由下式表示：
[0276]5’np-n
a-yyy-n
b-zzz-n
a-n
q3’ꢀꢀ
(ib)；
[0277]5’np-n
a-xxx-n
b-yyy-n
a-n
q3’ꢀꢀ
(ic)；或
[0278]5’np-n
a-xxx-n
b-yyy-n
b-zzz-n
a-n
q3’ꢀꢀ
(id)。
[0279]
当有义链由式(ib)表示时，nb表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核苷
酸的寡核苷酸序列。每个na可以独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0280]
当有义链由式(ic)表示时，nb表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个na可以独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0281]
当有义链由式(id)表示时，每个nb独立地表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。优选地，nb是0、1、2、3、4、5或6。每个na可以独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0282]
每个x、y和z可以是相同的或彼此之间不同的。
[0283]
在其他实施方式中，i是0和j是0，和有义链可以由下式表示：
[0284]5’np-n
a-yyy-n
a-n
q3’ꢀꢀ
(ia)。
[0285]
当有义链由式(ia)表示时，每个na可以独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0286]
在一个实施方式中，rnai的反义链序列可以由式(ii)表示：
[0287]5’
nq’‑
na’‑
(z’z’z’)
k-nb’‑
y’y’y
’‑
nb’‑
(x’x’x’)
l-n’a-np
’3’ꢀꢀ
(ii)
[0288]
其中：
[0289]
k和l分别独立地为0或1；
[0290]
p’和q’分别独立地为0-6；
[0291]
每个n
a’独立地表示包含0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每条序列包含至少两个不同的修饰核苷酸；
[0292]
每个n
b’独立地表示包含0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
[0293]
每个n
p’和n
q’独立地表示突出端核苷酸；
[0294]
其中n
b’和y’不具有相同修饰；
[0295]
和
[0296]
x’x’x’、y’y’y’和z’z’z’分别独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰之一。
[0297]
在一个实施方式中，n
a’和/或n
b’包含交替类型的修饰。
[0298]
y’y’y’基序出现在有反义链的切割位点处或附近。例如，当rnai药剂具有长度为17-23个核苷酸的双链体区时，y’y’y’基序可以出现在有反义链的切割位点或其附近(例如，可以出现在位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15)，从第一个核苷酸开始计数，从5’端开始；或者可选地，从双链体区内的第一对核苷酸开始计数，从5’端开始。优选地，y’y’y’基序出现在位置11、12、13。
[0299]
在一个实施方式中，y’y’y’基序全部是2
’‑
ome修饰的核苷酸。
[0300]
在一个实施方式中，k是1和l是0，或者k是0和l是1，或者5k和l两者是1。
[0301]
因此，反义链可以由下式表示：
[0302]5’
nq’‑
na’‑
z’z’z
’‑
nb’‑
y’y’y
’‑
na’‑np
’3’ꢀꢀ
(iib)；
[0303]5’
nq’‑
na’‑
y’y’y
’‑
nb’‑
x’x’x
’‑np
’3’ꢀꢀ
(iic)；或者
[0304]5’
nq’‑
na’‑
z’z’z
’‑
nb’‑
y’y’y
’‑
nb’‑
x’x’x
’‑
na’‑np
’3’ꢀꢀ
(iid)。
[0305]
当反义链由式(iib)表示时，n
b’表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核
苷酸的寡核苷酸序列。每个n
a’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0306]
当反义链由式(iid)表示时，每个n
b’独立地表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个n
a’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。优选地，nb是0、1、2、3、4、5或6。
[0307]
在其他实施方式中，k是0和l是0，且反义链可以由下式表示：
[0308]5’np
’‑
na’‑
y’y’y
’‑
na’‑
nq’3’ꢀꢀ
(ia)。
[0309]
当反义链由式(iia)表示时，每个n
a’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0310]
每个x’、y’和z’可以是相同的或彼此之间不同的。
[0311]
有义链和反义链的每个核苷酸可以独立地被lna、hna、cena、gna、2
’‑
甲氧基乙基、2
’‑
o-甲基、2
’‑
o-烯丙基、2
’‑
c-烯丙基、2
’‑
羟基或2
’‑
氟修饰。例如，有义链和反义链的每个核酸独立地被2
’‑
o-甲基或2
’‑
氟修饰。每个x、y、z、x’、y’和z’，特别地，可以表示2
’‑
o-甲基修饰或2
’‑
氟修饰。
[0312]
在一个实施方式中，当双链体区为21nt时，rnai药剂的有义链可以包含出现在链的9、10和11位的yyy基序，从第一个核苷酸开始计数，从5’端开始，或者可选地，从双链体区内的第一对核苷酸开始计数，从5’端开始；和y表示2
’‑
f修饰。有义链可以另外包含xxx基序或zzz基序作为双链体区另一端的翼修饰；以及xxx和zzz分别独立地表示2
’‑
ome修饰或2
’‑
f修饰。
[0313]
在一个实施方式中，反义链可以具有出现在链的11、12、13位的y’y’y’基序，从第一个核苷酸开始计数，从5’端开始，或者可选地，从双链体区内的第一对核苷酸开始计数，从5’端开始；以及y’表示2
’‑
o-甲基修饰。反义链可以另外包含x’x’x’基序或z’z’z’基序作为双链体区另一端的翼修饰；以及x’x’x’和z’z’z’分别独立地表示2
’‑
ome修饰或2
’‑
f修饰。
[0314]
由上述式(ia)、(ib)、(ic)和(id)中任一项表示的有义链分别与由式(iia)、(iib)、(iic)和(iid)中任一项表示的反义链形成双链体。
[0315]
因此，在本公开的方法中使用的rnai药剂可以包含有义链和反义链，每条链具有14至30个核苷酸，rnai双链体由式(iii)表示：
[0316]
有义链：5’n
p-n
a-(xxx)
i-n
b-yyy-n
b-(zzz)
j-n
a-n
q3’
[0317]
反义链：3’n
p
’‑
na’‑
(x’x’x’)
k-nb’‑
y’y’y
’‑
nb’‑
(z’z’z’)
l-na’‑
nq’5’ꢀꢀ
(iii)
[0318]
其中，
[0319]
i、j、k和l分别独立地为0或1；
[0320]
p、p’、q和q’分别独立地为0-6；
[0321]
每个na和n
a’独立地表示包含0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每条序列包含至少两个不同的修饰的核苷酸；
[0322]
nb和n
b’独立地表示包含0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
[0323]
其中
[0324]
每个n
p’、n
p
、n
q’和nq，其每一个可以独立地存在或不存在，表示一个突出端核苷酸；和
[0325]
xxx、yyy、zzz、x’x’x’、y’y’y’和z’z’z’分别独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。
[0326]
在一个实施方式中，i是0和j是0；或者i是1和j是0；或者i是0和j是1；或者i和j这两者是0；或者i和j这两者是1。在另一个实施方式中，k是0和l是0；或者k是1和l是0；k是0和l是1；或者k和l两者是0；或者k和l两者是1。
[0327]
有义链和反义链形成rnai双链体的示例性组合包括下式：
[0328]5’np-n
a-yyy-n
a-n
q3’
[0329]3’np
’‑
na’‑
y’y’y
’‑na’nq’5’ꢀꢀ
(iiia)
[0330]5’np-n
a-yyy-n
b-zzz-n
a-n
q3’
[0331]3’np-na’‑
y’y’y
’‑
nb’‑
z’z’z
’‑
na’‑
nq’5’ꢀꢀ
(iiib)
[0332]5’np-n
a-xxx-n
b-yyy-n
a-n
q3’
[0333]3’np-na’‑
x’x’x
’‑
nb’‑
y’y’y
’‑
na’‑
nq’5’ꢀꢀ
(iiic)
[0334]5’np-n
a-xxx-n
b-yyy-n
b-zzz-n
a-n
q3’
[0335]3’np-na’‑
x’x’x
’‑
nb’‑
y’y’y
’‑
nb’‑
z’z’z
’‑
na’‑
nq’5’ꢀꢀ
(iiid)
[0336]
当rnai药剂由式(iiia)表示时，每个na独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0337]
当rnai药剂由式(iiib)表示时，每个nb独立地表示包含1-10、1-7、1-5或1-4个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个na独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0338]
当rnai药剂由式(iiic)表示时，每个nb、n
b’独立地表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个na独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0339]
当rnai药剂由式(iiid)表示时，每个nb、n
b’独立地表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个na、n
a’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个na、na’、nb和nb’独立地包含交替模式的修饰。
[0340]
在式(iii)、(iiia)、(iiib)、(iiic)和(iiid)中每个x、y和z可以是相同的或彼此之间不同的。
[0341]
当rnai药剂由式(iii)、(iiia)、(iiib)、(iiic)和(iiid)表示时，至少一个y核苷酸可以与一个y’核苷酸形成碱基对。或者，至少两个y核苷酸与相应y’核苷酸形成碱基对；或者全部三个y核苷酸全部与相应y’核苷酸形成碱基对。
[0342]
当rnai药剂由式(iiib)或(iiid)表示时，至少一个z核苷酸可以与一个z’核苷酸形成碱基对。或者，至少两个z核苷酸与相应z’核苷酸形成碱基对；或者全部三个z核苷酸全部与相应z’核苷酸形成碱基对。
[0343]
当rnai药剂由式(iiic)或(iiid)表示时，至少一个x核苷酸可以与一个x’核苷酸形成碱基对。或者，至少两个x核苷酸与相应x’核苷酸形成碱基对；或者全部三个x核苷酸全部与相应x’核苷酸形成碱基对。
[0344]
在一个实施方式中，y核苷酸上的修饰不同于y’核苷酸上的修饰，z核苷酸上的修饰不同于z’核苷酸上的修饰，和/或x核苷酸上的修饰不同于x’核苷酸上的修饰。
[0345]
在一个实施方式中，当rnai药剂由式(iiid)表示时，na修饰是2
’‑
o-甲基或2
’‑
氟
羰氧基胆固醇部分(crooke等，j.pharmacol.exp.ther.,1996,277:923-937)。
[0353]
在一个实施方式中，配体改变其所掺入的irna药剂的分布、靶向或寿命。在一些实施方式中，例如，如与不存在这种配体的物种相比，配体为选定的靶点提供了增强的亲和性，例如，分子、细胞或细胞类型、隔室，例如，细胞或器官隔室、组织、器官或身体区域。典型的配体不会参与双链核酸中的双链配对。
[0354]
配体可以包括天然存在的物质，如蛋白(例如，人血清白蛋白(hsa)、低密度脂蛋白(ldl)或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、支链淀粉、甲壳质、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组或合成分子，如合成聚合物，例如，合成聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括聚氨基酸是聚赖氨酸(pll)、聚l天冬氨酸、聚l-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(l-丙交酯-共-乙醇酸)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、n-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(hmpa)、聚乙二醇(peg)、聚乙烯醇(pva)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、n-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(pll)、精胺、亚精胺、多胺、假肽-多胺、拟肽多胺、树枝状多胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、多胺的季盐或α螺旋肽。
[0355]
脂质还可以包含与特定细胞类型(如肾细胞)结合的靶向基团，例如，细胞或组织靶向剂，例如，凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白，例如，抗体。靶向基团可以是促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白a、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、n-乙酰基-半乳糖胺、n-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸酯、聚谷氨酸酯、聚天冬氨酸酯、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素b12、生物素或rgd肽或rgd肽模拟物。
[0356]
在一些实施方式中，配体是galnac配体，其包含一个或多个n-乙酰半乳糖胺(galnac)衍生物。在一些实施方式中，galnac配体用于将irna靶向肝脏(例如，肝细胞)。在标题为碳水化合物缀合物的章节中提供了对galnac配体的其他描述。
[0357]
配体的其他实例包括染料、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂素、丝裂霉素c)、卟啉(tppc4、texaphyrin、sapphyrin)、多环芳烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如，edta)、亲脂性分子，例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-o(十六烷基)甘油、香叶氧基己基基团、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、o3-(油酰基)石胆酸、o3-(油酰基)胆酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪和肽缀合物(例如，触角肽、tat肽)、烷化剂、磷酸酯、氨基、巯基、peg(例如，peg-40k)、mpeg、[mpeg]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记物、酶、半抗原(例如，生物素)、转运/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素e、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的eu3 复合物)、二硝基苯基、hrp或ap。
[0358]
配体可以是蛋白，例如，糖蛋白或肽，例如，对共配体具有特定亲和性的分子，或抗体，例如，结合特定细胞类型(如癌细胞、内皮细胞或骨细胞)的抗体。配体还可以包括激素和激素受体。其还可以包括非肽类物质，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、n-乙酰基-半乳糖胺、n-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖或多价岩藻糖。配体可以是，例如，脂多糖、p38 map激酶的激活剂或nf-κb的激活剂。
[0359]
配体可以是物质，例如，药物，其可以通过破坏细胞的细胞骨架，例如，通过破坏细胞的微管、微丝和/或中间丝来增加irna药剂摄取进入细胞。药物可以是，例如，紫杉醇、长
春新碱、长春碱、细胞松弛素、诺考达唑、茉莉花内酯(japlakinolide)、拉春库磷a、鬼笔环肽、swinholide a、indanocine或myoservin。
[0360]
在一些实施方式中，如本文所述，附接至irna的配体作为药代动力学调节剂(pk调节剂)。pk调节剂包括亲脂性物质、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白结合剂、peg、维生素等。示例性pk调节剂包括但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、甘油二酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、维生素e、生物素等。还已知包含多个硫代磷酸酯键的寡核苷酸与血清蛋白结合，因此在骨架中包含多个硫代磷酸酯键的短寡核苷酸(例如，约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸)也适用于本公开作为配体(例如，pk调节配体)。此外，结合血清组分(例如，血清蛋白)的适体也适合用作本文所述实施方式中的pk调节配体。
[0361]
本公开的配体缀合的寡核苷酸可以通过使用具有悬垂反应性官能团的寡核苷酸来合成，如源自连接分子连接到寡核苷酸上的那些(如下所述)。这种反应性寡核苷酸可以直接与市售配体、合成的带有多种保护基团的配体或具有与其连接的连接部分的配体反应。
[0362]
在本公开的缀合物中使用的寡核苷酸可以通过众所周知的固相合成技术方便且常规地制备。用于这种合成的设备由多家供应商销售，包括，例如，applied biosystems(foster city,calif.)。可以附加地或替代地使用本领域公知的用于此类合成的任何其他方法。还已知使用类似技术制备其他寡核苷酸，如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。
[0363]
在本公开的配体缀合的寡核苷酸和带有序列特异性连接的核苷的配体分子中，寡核苷酸和寡核苷可以利用标准核苷酸或核苷前体，或已经带有连接部分的核苷酸或核苷缀合物前体，或已经带有配体分子的配体-核苷酸或核苷-缀合物前体，或带有非核苷配体的构建块。
[0364]
当使用已经带有连接部分的核苷酸-缀合物前体时，序列特异性连接的核苷的合成通常完成，然后配体分子与连接部分反应以形成配体-缀合的寡核苷酸。在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸或连接的核苷通过自动合成仪使用衍生自配体-核苷缀合物的亚磷酰胺以及可商购和常规用于寡核苷酸合成的标准亚磷酰胺和非标准亚磷酰胺合成。
[0365]
脂质缀合物
[0366]
在一个实施方式中，配体是脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子通常可以结合血清蛋白，如人血清白蛋白(hsa)。hsa结合配体允许缀合物分布到靶组织。例如，靶组织可以是肝脏，包括肝脏的实质细胞。其他可以结合has的分子也可以用作配体。例如，可以使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加对缀合物降解的抗性，(b)增加靶向或转运到靶细胞或细胞膜中，和/或(c)可以用于调节与血清蛋白的结合，例如，hsa。
[0367]
基于脂质的配体可用于调节例如控制(例如，抑制)缀合物与靶组织的结合。例如，与hsa结合更强的脂质或基于脂质的配体将不太可能靶向肾脏，因此不太可能从体内清除。与hsa结合较弱的脂质或基于脂质的配体可用于将缀合物靶向肾脏。
[0368]
在一个实施方式中，基于脂质的配体结合hsa。例如，配体可以以足够的亲和性结合hsa，从而增强缀合物向非肾组织的分布。然而，亲和性通常不会强到无法逆转hsa配体结合。
[0369]
在另一个实施方式中，基于脂质的配体弱结合或根本不结合hsa，从而增强了缀合物在肾脏的分布。靶向肾细胞的其他部分也可用于替代或补充基于脂质的配体。
[0370]
在另一个方面中，配体是被靶细胞(例如，增殖细胞)摄取的部分(例如，维生素)。这些特别适于治疗以不希望的细胞增殖为特征的疾病，例如，恶性或非恶性类型的细胞增殖，例如，癌细胞。示例性维生素包括维生素a、e和k。其他示例性维生素包括b族维生素，例如，叶酸、b12、核黄素、生物素、吡哆醛或者被癌细胞摄取的其他维生素或营养素。还包括hsa和低密度脂蛋白(ldl)。
[0371]
细胞渗透剂
[0372]
在另一个方面中，配体是细胞渗透剂，如螺旋细胞渗透剂。在一个实施方式中，所述药剂是两亲性的。示例性药剂是肽，如tat或触角蛋白。如果药剂是肽，则可以对其进行修饰，包括肽模拟物、转化体、非肽或假肽键，以及使用d-氨基酸。螺旋剂通常是α-螺旋剂，并且可以具有亲脂相和疏脂相。
[0373]
配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也称为寡肽模拟物)是能够折叠成类似于天然肽的确定的三维结构的分子。肽和肽模拟物与irna试剂的连接可以影响irna的药代动力学分布，如通过增强细胞识别和吸收。肽或肽模拟物部分可以是约5-50个氨基酸长，例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
[0374]
肽或肽模拟物可以是例如细胞渗透肽、阳离子肽、两亲性肽或疏水性肽(例如，主要由tyr、trp或phe组成)。肽部分可以是树枝状肽、约束肽或交联肽。在另一个替代方案中，肽部分可以包括疏水性膜易位序列(mts)。示例性的含有mts的疏水肽是具有氨基酸序列aavallpavllallap(seq id no:903)的rfgf。含有疏水性mts的rfgf类似物(例如，氨基酸序列aallpvllaap(seq id no:904))也可以是靶向部分。肽部分可以是“递送”肽，其可以携带包括肽、寡核苷酸和蛋白在内的大极性分子穿过细胞膜。例如，已发现来自hiv tat蛋白(grkkrrqrrrppq(seq id no:905))和果蝇触角蛋白(rqikiwfqnrrmkwkk(seq id no:906))的序列可以用作递送肽。肽或肽模拟物可由dna的随机序列编码，如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(oboc)组合文库中鉴定的肽(lam等，nature,354:82-84,1991)。通常，通过掺入的单体单元连接到dsrna药剂的肽或肽模拟物是细胞靶向肽，如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)-肽或rgd模拟物。肽部分长度范围可以是从约5个氨基酸到约40个氨基酸。肽部分可以具有结构修饰，如以增加稳定性或直接构象特征。可以使用下文所述的任何结构修饰。
[0375]
用于本公开的组合物和方法的rgd肽可以是线形或环状的，并且可以被修饰，例如，糖基化或甲基化，以促进靶向一个或多个特定组织。含有rgd的肽和肽模拟物可以包含d-氨基酸，以及合成的rgd模拟物。除了rgd以外，可以使用靶向整合素配体的其他部分。该配体优选的缀合物靶向pecam-1或vegf。
[0376]
rgd肽部分可以用于靶向特定细胞类型，例如，肿瘤细胞，如内皮肿瘤细胞或乳腺癌肿瘤细胞(zitzmann等，cancer res.,62:5139-43,2002)。rgd肽可以促进dsrna药剂靶向多种其他组织的肿瘤，包括肺、肾脏、脾脏或肝脏(aoki等，cancer gene therapy 8:783-787,2001)。通常，rgd肽将促进irna药剂靶向肾脏。rgd肽可以是线形或环状的，并且可以被修饰，例如，糖基化或甲基化，以促进靶向特定组织。例如，糖基话的rgd肽可以将irna药剂递送到表达αvβ3的肿瘤细胞(haubner等，jour.nucl.med.,42:326-336,2001)。
[0377]“细胞渗透肽”能够渗透细胞，例如，微生物细胞，如细菌或真菌细胞或哺乳动物细
胞，如人细胞。微生物细胞渗透肽可以是例如α-螺旋线性肽(例如，ll-37或ceropinp1)、含二硫键的肽(例如，α-防御素、β-防御素或细菌素)或仅含一个或两个主要氨基酸的肽(例如，pr-39或indolicidin)。细胞渗透肽还可以包含核定位信号(nls)。例如，细胞渗透肽可以是二分两亲性肽，如mpg，其衍生自hiv-1gp41和sv40大t抗原的nls的融合肽结构域(simeoni等，nucl.acids res.31:2717-2724,2003)。
[0378]
碳水化合物缀合物
[0379]
在本公开的组合物和方法的一些实施方式中，irna寡核苷酸还包含碳水化合物。碳水化合物缀合的irna有利于核酸的体内递送，以及适用于体内治疗用途的组合物，如本文所述。如本文所用，“碳水化合物”是指一种化合物，其本身是由一个或多个具有至少6个碳原子(可以是直链、支链或环状)的单糖单元组成的碳水化合物，其中每个碳原子上都有一个氧、氮或硫原子；或者具有作为其一部分的碳水化合物部分的化合物，所述碳水哈虎我部分由一个或多个单糖单元组成，每个单糖单元具有至少六个碳原子(其可以是直链的、支链的或环状的)，其中氧、氮或硫原子与每个碳原子键合。代表性碳水化合物包括糖类(含有约4、5、6、7、8或9个单糖单元的单糖、二糖、三糖和寡糖)和多糖，如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。特定的单糖包括c5及以上(例如，c5、c6、c7或c8)的糖；二糖和三糖包括具有两个或三个单糖单元(例如，c5、c6、c7或c8)的糖。
[0380]
在一个实施方式中，碳水化合物缀合物包含单糖。在一个实施方式中，单糖是n-乙酰半乳糖胺(galnac)。galnac缀合物，其包含一个或多个n-乙酰半乳糖胺(galnac)衍生物，描述在例如美国专利号8,106,022中，其全部内容通过引用并入本技术。在一些实施方式中，galnac缀合物作为将irna靶向特定细胞的配体。在一些实施方式中，galnac缀合物将irna靶向肝细胞，例如，通过充当肝脏细胞(例如，肝细胞)的去唾液酸糖蛋白受体的配体。
[0381]
在一些实施方式中，碳水化合物缀合物包含一个或多个galnac衍生物。galnac衍生物可以通过接头附接，例如，二价或三价支链接头。在一些实施方式中，galnac缀合物缀合至有义链的3’末端。在一些实施方式中，galnac缀合物通过接头(例如，如本文所述的接头)缀合至irna药剂(例如，有义链的3’末端)。
[0382]
在一些实施方式中，galnac缀合物是
[0383][0384]
在一些实施方式中，如下述路线图所示，rnai药剂通过接头附接至碳水化合物缀合物，其中x是o或s
[0385][0386]
在一些实施方式中，rnai药剂缀合至如表1中定义的l96，如下所示
[0387][0388]
在一些实施方式中，l96如下所示：
[0389][0390]
在一些实施方式中，在本公开的组合物和方法中使用的碳水化合物缀合物选自以下：
[0391]
[0392]
[0393]
[0394]
[0395][0396]
在本文所述的实施方式中使用的另一个代表性碳水化合物缀合物包括但不限于，
[0397][0398]
(式xxiii)，当x或y之一是寡核苷酸时，另外一个是氢。
[0399]
在一些实施方式中，碳水化合物缀合物还包含一个或多个如上文所述的其他配体，比如但不限于pk调节剂和/或细胞渗透肽。
[0400]
在一个实施方式中，本公开的irna通过接头缀合至碳水化合物。本公开的组合物和方法的具有接头的irna碳水化合物缀合物的非限制性实例包括但不限于，
[0401]
[0402][0403]
(式xxx)，当x或y之一是寡核苷酸时，另外一个是氢。
[0404]
接头
[0405]
在一些实施方式中，本文所述的缀合物或配体可通过各种可切割或不可切割的接头连接至irna寡核苷酸。
[0406]
术语“接头”或“连接基团”指连接化合物的两个部分的有机部分，例如，共价连接化合物的两个部分。接头通常包含直接键或原子(如氧或硫)、单元(如nr8、c(o)、c(o)nh、so、so2、so2nh)或原子的链，比如但不限于，取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳烷基、杂芳烯基、杂芳炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳烷基、烷基芳烯基、烷基芳炔基、烯基芳烷基、烯基芳烯基、烯基芳炔基、炔基芳烷基、炔基杂烯基、炔基杂炔基、烷基杂芳烷基、烷基杂芳烯基、烷基杂芳炔基、烯基杂芳烷基、烯基杂芳烯基、烯基杂芳炔基、炔基杂芳烷基、炔基杂芳烯基、炔基杂芳炔基、烷基杂环烷基、烷基杂环烯基、烷基杂环炔基、烯基杂环烷基、烯基杂环烯基、烯基杂环炔基、炔基杂环烷基、炔基杂环烯基、炔基杂环炔基、
烷芳基、烯芳基、炔芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可以被o、s、s(o)、so2、n(r8)、c(o)、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环基中断或终止；其中r8是氢、酰基、脂肪族或取代的脂肪族。在一个实施方式中，接头是约1-24个原子、2-24、3-24、4-24、5-24、6-24、6-18、7-18、8-18个原子、7-17、8-17、6-16、7-16或8-16个原子之间。
[0407]
在一个实施方式中，本公开的dsrna缀合物至二价或三价支链接头，所述接头选自式(xxxi)-(xxxiv)的任何一个所示的结构的组：
[0408][0409]
其中：
[0410]
q2a、q2b、q3a、q3b、q4a、q4b、q5a、q5b和q5c每次出现时独立地表示0-20，其中重复单元可以相同或不同；
[0411]
p
2a
、p
2b
、p
3a
、p
3b
、p
4a
、p
4b
、p
5a
、p
5b
、p
5c
、t
2a
、t
2b
、t
3a
、t
3b
、t
4a
、t
4b
、t
4a
、t
5b
、t
5c
每次出现时分别独立地为不存在、co、nh、o、s、oc(o)、nhc(o)、ch2、ch2nh或ch2o；
[0412]q2a
、q
2b
、q
3a
、q
3b
、q
4a
、q
4b
、q
5a
、q
5b
、q
5c
每次出现时分别独立地为不存在、亚烷基、取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可以被一个或多个o、s、s(o)、so2、n(rn)、c(r’)＝c(r”)、c≡c或c(o)中断或终止；
[0413]r2a
、r
2b
、r
3a
、r
3b
、r
4a
、r
4b
、r
5a
、r
5b
、r
5c
每次出现时分别独立地为不存在、nh、o、s、ch2、c(o)o、c(o)nh、nhch(ra)c(o)、-c(o)-ch(ra)-nh-、co、ch＝n-o、
[0414][0414]
或杂环基；
[0415]
l
2a
、l
2b
、l
3a
、l
3b
、l
4a
、l
4b
、l
5a
、l
5b
和l
5c
表示配体；即，每次出现时分别独立地为单糖(如galnac)、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖；和ra式h或氨基酸侧链。三价缀合的galnac衍生
物特别适用于与rnai药剂一起使用以抑制靶基因表达，如式(xxxv)的那些：
[0416]
式xxxv
[0417][0418]
其中l
5a
、l
5b
和l
5c
表示单糖，如galnac衍生物。
[0419]
缀合galnac衍生物的适宜的二价和三价支链接头基团的实例包括但不限于以上如式ii、vii、xi、x和xiii所述的结构。
[0420]
可切割的连接基团是在细胞外足够稳定的连接基团，但在进入靶细胞时被切割以释放接头保持在一起的两个部分。在优选实施方式中，在靶细胞中或在第一参考条件下(例如，可以对其进行选择以模拟或表示细胞内条件)比在受试者的血液中或在第二参考条件下(例如，可以对其进行选择以模拟或代表血液或血清中存在的条件)，可切割的连接基团切割快至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多或者至少约100倍。
[0421]
可切割的连接基团对切割剂敏感，例如，ph、氧化还原电位或存在降解分子。在通常情况下，切割剂在细胞内比在血清或血液中更普遍或以更高水平或活性存在。此类降解剂的实例包括：针对特定底物选择的或不具有底物特异性的氧化还原剂，包括例如存在于细胞中的氧化还原酶或还原酶或诸如硫醇的还原剂，其可以通过还原降解氧化还原可切割的连接基团；酯酶；可产生酸性环境的内体或药剂，例如，导致ph值为5或更低的那些；可以通过作为一般酸、肽酶(其可以是底物特异性的)和磷酸酶水解或降解酸可切割连接基团的酶。
[0422]
可切割的连接基团(如二硫键)可能对ph敏感。人血清的ph是7.4，而细胞内的平均ph略低，范围为约7.1-7.3。内体具有更酸的ph，在5.5-6.0范围内，溶酶体具有甚至更高的酸性ph，在5.0左右。一些接头将具有可切割的连接基团，该连接基团在优选的ph下倍切割，从而从细胞内的配体释放阳离子脂质，或释放到所需的细胞隔室中。
[0423]
接头可以包含被特定酶切割的可切割连接基团。掺入接头中的可切割连接基团的类型可能取决于待靶向的细胞。例如，肝脏靶向配体可以通过包含酯基团的接头与阳离子脂质连接。肝细胞富含酯酶，因此与不富含酯酶的细胞类型相比，肝细胞中的接头将被更有效地切割。其他富含酯酶的细胞类型包括肺细胞、肾皮质细胞和睾丸细胞。
[0424]
当靶向富含肽酶的细胞类型(如肝细胞和滑膜细胞)时，可以使用包含肽键的接头。
[0425]
在通常情况下，可通过测试降解剂(或条件)切割候选连接基团的能力来评价候选可切割连接基团的适用性。还需要测试候选可切割连接基团在血液中或在与其他非靶组织接触时抵抗切割的能力。因此，可以确定第一个和第二个条件之间对切割的相对敏感性，其中选择第一个以指示靶细胞中的切割，选择第二个以指示在其他组织或生物流体(例如，血
液或血清)中的切割。评价可以在无细胞系统、细胞、细胞培养物、器官或组织培养物或整个动物中进行。在无细胞或培养物条件下进行初步评价并通过在整个动物中进行进一步评价来确证可能是有用的。在优选实施方式中，与血液或血清(或在选择以模拟胞外条件的体外条件下)相比，在细胞中(或在选择以模拟胞内条件的体外条件下)有用的候选化合物的切割速度至少快约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100倍。
[0426]
氧化还原可切割连接基团
[0427]
在一个实施方式中，可切割连接基团式在还原或氧化时切割的氧化还原可切割连接基团。可还原切割的连接基团的一个实例是二硫键连接基团(-s-s-)。为确定候选可切割连接基团是否是适宜的“可还原切割连接基团”，或者例如是否适合与特定irna部分和特定靶向剂一起使用，可以参考本文所述的方法。例如，候选物可以通过与二硫苏糖醇(dtt)或使用本领域公知试剂的其他还原剂一起孵育来评价，这模拟了在细胞例如靶细胞中将观察到的切割速率。还可以在选择模拟血液或血清条件的条件下评价候选物。在一个条件下，候选化合物在血液中最多切割约10％。在其他实施方式中，与血液(或在选择以模拟胞外条件的体外条件下)中相比，在细胞(或在选择以模拟胞内条件的体外条件下)中有用的候选化合物的降解速度至少快约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100倍。候选化合物的切割速率可以在选择模拟细胞内介质的条件下使用标准酶动力学测定来确定，并与选择模拟细胞外介质的条件进行比较。
[0428]
基于磷酸酯的可切割连接基团
[0429]
在另一个实施方式中，可切割接头包括基于磷酸酯的可切割连接基团。基于磷酸酯的可切割连接基团被降解或水解磷酸酯基团的试剂切割。切割细胞中磷酸酯基团的试剂的一个实例式酶，如细胞中的磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例是-o-p(o)(ork)-o-、-o-p(s)(ork)-o-、-o-p(s)(srk)-o-、-s-p(o)(ork)-o-、-o-p(o)(ork)-s-、-s-p(o)(ork)-s-、-o-p(s)(ork)-s-、-s-p(s)(ork)-o-、-o-p(o)(rk)-o-、-o-p(s)(rk)-o-、-s-p(o)(rk)-o-、-s-p(s)(rk)-o-、-s-p(o)(rk)-s-、-o-p(s)(rk)-s-。优选的实施方式是-o-p(o)(oh)-o-、-o-p(s)(oh)-o-、-o-p(s)(sh)-o-、-s-p(o)(oh)-o-、-o-p(o)(oh)-s-、-s-p(o)(oh)-s-、-o-p(s)(oh)-s-、-s-p(s)(oh)-o-、-o-p(o)(h)-o-、-o-p(s)(h)-o-、-s-p(o)(h)-o、-s-p(s)(h)-o-、-s-p(o)(h)-s-、-o-p(s)(h)-s-。优选的实施方式是-o-p(o)(oh)-o-。可以使用与上述方法类似的方法对这些候选物进行评价。
[0430]
酸可切割连接基团
[0431]
在另一个实施方式中，可切割接头是酸可切割连接基团。酸可切割连接基团式在酸性条件下切割的连接基团。在优选实施方式中，在ph约6.5或更低(例如，约6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)的酸性环境中或通过可作为一般酸的酶等试剂来切割酸可切割连接基团。在细胞中，特定的低ph细胞器，如内体和溶酶体，可以为酸可切割连接基团提供切割环境。酸可切割连接基团的实例包括但不限于腙、酯和氨基酸的酯。酸可切割基团可以具有通式-c＝nn-、c(o)o或-oc(o)。优选的实施方式是当与酯的氧(烷氧基)附接的碳是芳基、取代的烷基或叔烷基如二甲基戊基或叔丁基时。这些候选物可以使用与上述方法类似的方法进行评价。
[0432]
基于酯的可切割连接基团
[0433]
在另一个实施方式中，可切割接头包含基于酯的可切割连接基团。基于酯的可切
割连接基团被细胞中的酶如酯酶和酰胺酶切割。基于酯的可切割连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可切割连接基团具有通式-c(o)o-或-oc(o)-。这些候选物可以使用与上述方法类似的方法进行评价。
[0434]
基于肽的可切割连接基团
[0435]
在又一个实施方式中，可切割接头包含基于肽的可切割连接基团。基于肽的可切割连接基团被细胞中的酶如肽酶和蛋白酶切割。基于肽的可切割连接基团是在氨基酸之间形成的肽键，以产生寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽。基于肽的可切割基团不包括酰胺基团(-c(o)nh-)。酰胺基团可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是氨基酸之间形成的一种特殊类型的酰胺键，可以产生肽和蛋白。基于肽的可切割基团通常限于在产生肽和蛋白的氨基酸之间形成的肽键(即酰胺键)，并且不包括整个酰胺官能团。基于肽的可切割连接基团具有通式-nhchrac(o)nhchrbc(o)-，其中ra和rb是两个相邻氨基酸的r基团。这些候选物可以使用与上述方法类似的方法进行评价。教导制备rna缀合物的代表性美国专利报告但不限于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；8,106,022,其每一个的全部内容通过引用并入本文。
[0436]
没有必要对给定化合物中的所有位置进行统一修饰，实际上可以将不止一种上述修饰引入单个化合物中，甚至可以引入irna内的单个核苷中。本公开还包括作为嵌合化合物的irna化合物。
[0437]
在本公开背景下，“嵌合”irna化合物，或“签合体”是irna化合物，例如，dsrna，其包含两个或更多个化学上不同的区域，每个区域由至少一个单体单元组成，即在dsrna化合物的情况下为核苷酸。这些irna通常包含至少一个区域，其中irna被修饰以赋予irna增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄取和/或增加的对靶核酸的结合亲和性。可以将irna的其他区域作为能够切割rna:dna或rna:rna杂合体的酶的底物。例如，rnase h是一种细胞核酸内切酶，其切割rna:dna双链体的rna链。因此，rnase h的激活导致rna靶点的切割，从而大大提高了irna抑制基因表达的效率。因此，与同相同靶区域杂交的硫代磷酸酯脱氧dsrna相比，当使用嵌合dsrna时，通常可以使用更短的irna获得可比的结果。rna靶点的切割可以通过凝胶电泳进行常规检测，如果需要，可以通过本领域公知的相关核酸杂交技术进行检测。
[0438]
在某些情况下，irna的rna可以被非配体基团修饰。很多非配体分子已与irna缀合以增强irna的活性、细胞分布或细胞摄取，并且进行此类缀合的程序可在科学文献中获得。此类非配体部分包括脂质部分，如胆固醇(kubo,t.等，biochem.biophys.res.comm.,2007,365(1):54-61；letsinger等，proc.natl.acad.sci.usa,1989,86:6553)、胆酸(manoharan
等，bioorg.med.chem.lett.,1994,4:1053)、；硫醚，例如，己基-s-三苯甲基硫醇(manoharan等，ann.n.y.acad.sci.,1992,660:306；manoharan等，bioorg.med.chem.let.,1993,3:2765)、硫代胆固醇(oberhauser等，nucl.acids res.,1992,20:533)、脂肪链，例如，十二烷基二醇或十一烷基残基(saison-behmoaras等，embo j.,1991,10:111；kabanov等，febs lett.,1990,259:327；svinarchuk等，biochimie,1993,75:49)、磷脂，例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵、1,2-二-o-十六烷基-外消旋-甘油-3-h-膦酸酯(manoharan等，tetrahedron lett.,1995,36:3651；shea等，nucl.acids res.,1990,18:3777)、多胺或聚乙二醇链(manoharan等，nucleosides&nucleotides,1995,14:969)或金刚烷乙酸(manoharan等，tetrahedron lett.,1995,36:3651)、棕榈基部分(mishra等，biochim.biophys.acta,1995,1264:229)或十八胺或己氨基-羰基-氧基胆固醇部分(crooke等，j.pharmacol.exp.ther.,1996,277:923)。上面列出了教导制备此类rna缀合物的代表性美国专利。典型的缀合物方案包括合成在序列的一个或多个位置带有氨基接头的rna。然而，使用合适的偶联剂或活化剂使氨基与被缀合的分子反应。缀合反应可以在rna仍与固相支持物结合的情况下进行，也可以在rna切割后在溶液相中进行。通过hplc纯化rna缀合物通常会得到纯的缀合物。
[0439]
irna的递送
[0440]
可以以多种不同方式实现向有需要的受试者递送irna。可以通过向受试者施用包含irna(例如，dsrna)的组合物直接进行体内递送。或者，递送可以通过施用一种或多种编码和指导irna表达的载体来间接进行。这些替代方案将在下面进一步讨论。
[0441]
直接递送
[0442]
在通常情况下，任何递送核酸分子的方法都可以适用于irna(参见例如，akhtar s.和julian rl.(1992)trends cell.biol.2(5):139-144和wo94/02595，其全部内容通过引用并入本文)。然而，为了在体内成功递送irna分子，需要考虑三个重要因素：(a)所递送分子的生物稳定性，(2)防止非特异性作用，和(3)所递送分子在靶组织中的累积。irna的非特异性作用可以通过局部施用最小化，例如，通过直接注射或植入组织(作为非限制性实例，肿瘤)或局部施用制剂。对治疗部位的局部施用使药剂的局部浓度最大化，限制药剂暴露于可能受到药剂伤害或可能降解药剂的全身组织，并允许施用较低总剂量的irna分子。几项研究表明，当局部施用irna时，基因产物成功敲低。例如，在年龄相关的黄斑变性实验模型中，通过在食蟹猴中的玻璃体内注射(tolentino,mj.等，(2004)retina 24:132-138)和在小鼠中的视网膜下注射(reich,sj.等，(2003)mol.vis.9:210-216)来眼内递送vegf dsrna都证明可以防止新生血管形成。此外，在小鼠中直接瘤内注射dsrna可减小肿瘤体积(pille,j.等，(2005)mol.ther.11:267-274)并能够延长荷瘤小鼠的生存期(kim,wj.等，(2006)mol.ther.14:343-350；li,s.等，(2007)mol.ther.15:515-523)。rna干扰还显示成功通过直接注射局部递送至cns(dorn,g.等，(2004)nucleic acids 32:e49；tan,ph.等，(2005)gene ther.12:59-66；makimura,h.等，(2002)bmc neurosci.3:18；shishkina,gt.等，(2004)neuroscience 129:521-528；thakker,er.等，(2004)proc.natl.acad.sci.u.s.a.101:17270-17275；akaneya,y.等，(2005)j.neurophysiol.93:594-602)和通过鼻内施用递送至肺(howard,ka.等，(2006)mol.ther.14:476-484；zhang,x.等，(2004)j.biol.chem.279:10677-10684；bitko,v.等，
(2005)nat.med.11:50-55)。为了全身性施用irna以治疗疾病，可以修饰rna或者替代地使用药物递送系统递送；这两种方法都可以防止体内核酸内切酶和核酸外切酶快速降解dsrna。
[0443]
rna或药物载体的修饰还可以使irna组合物靶向组织并避免不希望的脱靶效应。irna分子可以通过与其他基团的化学缀合来修饰，例如，如本文所述的脂质或碳水化合物基团。此类缀合物可用于将irna靶向特定细胞，例如，肝脏细胞，例如，肝细胞。例如，galnac缀合物或脂质(例如，lnp)制剂可用于将irna靶向特定细胞，例如，肝脏细胞，例如，肝细胞。
[0444]
亲脂性基团(如胆固醇)可增强细胞摄取并防止降解。例如，将与亲脂性胆固醇部分缀合的针对apob的irna全身注射至小鼠体内导致肝脏和空肠中的apob mrna敲低(soutschek,j.等，(2004)nature 432:173-178)。在前列腺癌小鼠模型中，irna与适体的结合已证明可抑制肿瘤生长并介导肿瘤消退(mcnamara,jo.等，(2006)nat.biotechnol.24:1005-1015)。在一个替代实施方式中，irna可以使用药物递送系统递送，如纳米颗粒、树枝状大分子、聚合物、脂质体或阳离子递送系统。带正电荷的阳离子递送系统促进irna分子(带负电荷)的结合，并且还增强带负电荷的细胞膜上的相互作用，以允许细胞有效摄取irna。阳离子脂质、树枝状大分子或聚合物可以与irna结合，或诱导以形成包封irna的囊泡或胶束(参见例如，kim sh.等，(2008)journal of controlled release 129(2):107-116)。当全身施用时，囊泡或胶束的形成进一步防止irna的降解。用于制备和施用阳离子-irna复合物的方法完全在本领域技术人员的能力范围内(参见例如，sorensen,dr.等，(2003)j.mol.biol 327:761-766；verma,un.等，(2003)clin.cancer res.9:1291-1300；arnold,as等，(2007)j.hypertens.25:197-205，其全部内容通过引用并入本文)。用于全身递送irna的药物递送系统的一些非限制性实例包括dotap(sorensen,dr.等，(2003)，同上；verma,un.等，(2003),同上)、oligofectamine，“固体核酸脂质颗粒”(zimmermann,ts.等，(2006)nature 441:111-114)、心磷脂(chien,py.等，(2005)cancer gene ther.12:321-328；pal,a.等，(2005)int j.oncol.26:1087-1091)、聚乙烯亚胺(bonnet me.等，(2008)pharm.res.aug 16网络公开发表；aigner,a.(2006)j.biomed.biotechnol.71659)、arg-gly-asp(rgd)肽(liu,s.(2006)mol.pharm.3:472-487)和聚氨基胺(tomalia,da.等，(2007)biochem.soc.trans.35:61-67；yoo,h.等，(1999)pharm.res.16:1799-1804)。在一些实施方式中，irna与环糊精形成复合物用于全身施用。irna和环糊精的施用方法和药物组合物可以参见美国专利号7,427,605，其全部内容通过引用并入本文。
[0445]
载体编码的irna
[0446]
在另一个方面中，靶向lect2基因的irna可以从插入dna或rna载体的转录单位表达(参见，例如，couture,a等，tig.(1996),12:5-10；skillern,a.,等，国际pct公开号wo 00/22113,conrad,国际pct公开号wo 00/22114以及conrad，美国专利号6,054,299)。表达可以是瞬时的(数小时至数周)或持续的(数周至数月或者更长时间)，这取决于所使用的特定构建体和靶组织或细胞类型。这些转基因可以作为线性构建体、环状质粒或病毒载体引入，其可以是整合的或非整合的载体。还可以构建转基因以使其作为染色体外质粒遗传(gassmann,等，proc.natl.acad.sci.usa(1995)92:1292)。
[0447]
irna的一条或多条链可以从表达载体上的启动子转录。在要表达两条单独的链以产生例如dsrna的情况下，可以将两个单独的表达载体共同引入(例如，通过转染或感染)到
therapy 4:129-141(1993)；以及grossman和wilson,curr.opin.in genetics and devel.3:110-114(1993)。考虑使用的慢病毒载体包括，例如，在美国专利号6,143,520；5,665,557；and 5,981,276中描述的基于hiv的载体，其通过引用并入本文。
[0454]
还考虑将腺病毒用于irna的递送。腺病毒是特别有吸引力的载体，例如，用于将基因递送到呼吸道上皮细胞。腺病毒自然感染呼吸道商品，引起轻微疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶点是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优势。kozarsky和wilson,current opinion in genetics and development 3:499-503(1993)综述了基于腺病毒的基因疗法。bout等，human gene therapy 5:3-10(1994)证明了使用腺病毒载体将基因转移到恒河猴的呼吸道上皮细胞中。在基因疗法中使用腺病毒的其他实例可以参见rosenfeld等，science 252:431-434(1991)；rosenfeld等，cell 68:143-155(1992)；mastrangeli等，j.clin.invest.91:225-234(1993)；pct公开wo94/12649；和wang,等，gene therapy 2:775-783(1995)。用于表达本公开的irna的适宜av载体，构建重组av载体的方法以及将载体递送到靶细胞中的方法描述在xia h等，(2002),nat.biotech.20:1006-1010中。
[0455]
还考虑使用腺相关病毒(aav)载体(walsh等，proc.soc.exp.biol.med.204:289-300(1993)；美国专利号5,436,146)。在一个实施方式中，irna可以表达为来自重组aav载体的两个独立的互补单链rna分子，该载体具有例如u6或h1 rna启动子，或巨细胞病毒(cmv)启动子。用于表达本公开的dsrna的适宜aav载体，构建重复av载体的方法以及将载体递送到靶细胞中的方法描述在samulski r等，(1987),j.virol.61:3096-3101；fisher k j等，(1996),j.virol.,70:520-532；samulski r等，(1989),j.virol.63:3822-3826；美国专利号5,252,479；美国专利号5,139,941；国际专利申请号wo 94/13788；和国际专利申请号wo 93/24641中，其全部公开内容通过引用并入本文。
[0456]
另一种典型的病毒载体是痘病毒，如牛痘病毒，例如减毒牛痘，如修饰的安卡拉病毒(mva)或nyvac，一种禽痘，如鸡痘或金丝雀痘。
[0457]
病毒载体的趋向性可以通过用包膜蛋白或来自其他病毒的其他表面抗原对载体进行假型化，或酌情替换不同的病毒衣壳蛋白来修饰。例如，慢病毒载体可以用来自水疱性口炎病毒(vsv)、狂犬病、埃博拉病毒、莫科拉病毒等的表面蛋白进行假型化。通过改造载体以表达不同的衣壳蛋白血清型，可以使aav载体靶向不同的细胞；参见，例如，rabinowitz j e等，(2002),j virol 76:791-801，其全部公开内容通过引用并入本文。
[0458]
载体的药物制剂可以包括在可接受的稀释剂中的载体，或者可以包括其中嵌入了基因递送载剂的缓释基质。或者，当完整的基因递送载体可以由重组细胞完整地产生时，例如，逆转录病毒载体，药物制剂可以包含一种或多种产生基因递送系统的细胞。
[0459]
iii.包含irna的药物组合物
[0460]
在一个实施方式中，本公开提供了药物组合物，其包含如本文所述的irna和药学上可接受的载体。含有irna的药物组合物可用于治疗与lect2基因表达或活性相关的疾病或病症(例如，lect2淀粉样变性)。此类药物组合物式基于递送模式配制的。例如，组合物可以配制用于通过胃肠外递送(例如，通过静脉内(iv)递送)全身施用。在一些实施方式中，将本文提供的组合物(例如，lnp制剂)配制用于静脉内递送。在一些实施方式中，本文提供的组合物(例如，包含galnac缀合物的组合物)配制用于皮下递送。
[0461]
本文所述的药物组合物以足以抑制lect2基因表达的剂量施用。在通常情况下，irna的适宜剂量将在每天每公斤受体体重0.01至200.0毫克范围内，通常在每天每公斤体重1至50mg范围内。例如，可以以单剂量0.05mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg或50mg/kg施用dsrna。药物组合物可以每天施用一次，或者irna可以在全天以适当的间隔作为两个、三个或更多个亚剂量施用，或者甚至使用连续输注或通过控释制剂递送。在这种情况下，每个亚剂量中所含的irna必须相应地更小，才能达到每日总剂量。剂量单位也可以复合以在几天内递送，例如，使用在几天内提供irna持续释放的常规持续释放制剂。缓释制剂在本领域中是众所周知的并且对于在特定部位递送药剂特别有用，如可以与本公开的药剂一起使用。在该实施方式中，剂量单位包含相应的多个每日剂量。
[0462]
单剂量对lect2水平的影响可能是持久的，因此后续剂量的施用间隔不超过3、4或5天，或者不超过1、2、3或4周间隔。
[0463]
本领域技术人员将意识到的是，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时机，包括但不限于疾病或病症的严重程度、此前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的组合物治疗受试者可以包括单一治疗或一系列治疗。可以使用常规方法或基于使用合适动物模型的体内测试来估计本公开所涵盖的个体irna的有效剂量和体内半衰期。
[0464]
适宜的动物模型(例如，包含表达人lect2的转基因的小鼠)，可用于确定lect2 sirna施用的治疗有效剂量和/或有效剂量方案。
[0465]
本公开还包括包含本文所述的irna化合物的药物组合物和制剂。本公开的药物组合物可以多种方式施用，这取决于是否需要局部或全身治疗以及取决于待治疗的面积。施用可以是局部的(例如，通过透皮贴片)、肺部的，例如，通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过雾化器；气管内、鼻内、表皮和透皮、口服或胃肠外。胃肠外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；真皮下，例如，通过植入装置；或颅内，例如，通过实质内、鞘内或心室内施用。
[0466]
irna可以以靶向特定组织的方式递送，如产生红细胞的组织。例如，可以将irna递送至骨髓、肝脏(例如，肝脏的肝细胞)、淋巴腺、脾脏、肺(例如，肺的胸膜)或脊柱。在一个实施方式中，irna递送至骨髓。
[0467]
用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末剂。传统的药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必要的或需要的。涂层避孕套、手套等也是有用的。适当的局部制剂包括本发明irna与局部递送剂混合的那些制剂，所述局部递送剂例如是脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂。适当的脂质和脂质体包括中性的(例如，二油酰基磷脂酰dope乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱dmpc、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性的(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油dmpg)和阳离子的(例如，二油酰基四甲基氨基丙基甘油dotap和二油酰基磷脂酰乙醇胺dotma)。本发明的irna可以包封于脂质体内，或可以形成与脂质体、特别是与阳离子脂质体的复合物。或者，irna可以和脂质特别是阳离子脂质复合。适当的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油二月桂酸酯、甘油基1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、
酰基肉碱、酰基胆碱或c
1-20
烷基酯(例如，肉豆蔻酸异丙酯ipm)、甘油一酯、甘油二酯或其药学可接受盐。局部制剂详细描述在美国专利号6,747,014中，其通过引用并入本文。
[0468]
脂质体制剂
[0469]
除了已被研究并用于药物制剂中的微乳剂外，还存在许多组织化的表面活性剂结构。其中包括单层、胶束、双层和囊泡。囊泡例如脂质体因为其特异性和其在药物递送方面提供的持久作用，因而吸引了巨大兴趣。如本公开所使用，术语“脂质体”指的是由以一个或多个球状双层排列的两性脂质组成的囊泡。
[0470]
脂质体是单层或多层囊泡，其具有由亲脂性的材料形成的膜和水性内部。水性部分包含要递送的组合物。阳离子脂质体具有能够融合至细胞壁的优点。尽管不能与细胞壁有效融合，但非阳离子脂质体在体内被巨噬细胞吞噬。
[0471]
为了透过完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必须在适当的透皮梯度的影响下透过一连串细孔，每个孔的直径小于50nm。因此，需要使用高度可变形并能透过这种细孔的脂质体。
[0472]
脂质体的其他优点包括：由天然磷脂获得的脂质体是可生物相容且可生物降解的；脂质体可以结合大量水和脂质可溶解的药物；脂质体可以保护其内在小室中包封的药物免受代谢和降解(rosoff,pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger和banker(编著)，1988,marcel dekker,inc.,new york,n.y.,第1卷,p.245)。制备脂质体制剂的重要考虑因素是脂质表面电荷、囊泡大小和脂质体的含水量。
[0473]
脂质体可用于转移和递送活性成分到作用部位。因为脂质体膜的结构类似于生物膜，当脂质体应用于组织时，脂质体开始与细胞膜融合，随着脂质体和细胞融合的进行，脂质体内容物注入细胞中，其中活化剂可以起作用。
[0474]
脂质体制剂作为许多药物的递送方式已经成为广泛研究的焦点。越来越多的证据表明，对于局部施用，脂质体存在着优于其他制剂的优点。这些优点包括与施用药物的高度全身吸收有关的副作用减少、施用药物在所需靶点上的积聚增加、以及能够将多种药物包括亲水性和疏水性药物施用于皮肤。
[0475]
若干报告详述了脂质体将包括高分子量dna的试剂递送入皮肤的能力。包括止痛剂、抗体、激素和高分子量dna的化合物已经施用于皮肤。大多数应用导致靶向上表层。
[0476]
脂质体分成两个主要类别。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其和带负电荷的dna分子相互作用以形成稳定络合物。带正电荷的dna/脂质体络合物结合至带负电荷的细胞表面并内化于内体中。由于内体中的酸性ph，脂质体破裂，释放其内容物到细胞质中(wang等，biochem.biophys.res.commun.,1987,147,980-985)。
[0477]
对ph敏感的或带负电荷的脂质体诱捕dna而不是含有其的络合物。因为dna和脂质两者所带的电荷相似，因此发生排斥而不是络合物形成。然而，一些dna在这些脂质体的含水内部被诱捕。ph敏感的脂质体用于递送编码胸苷激酶基因的dna到培养中的细胞单层。在靶细胞中检测到外源基因表达(zhou等，journal of controlled release,1992,19,269-274)。
[0478]
脂质体组合物的一种主要类型包括天然衍生的磷脂酰胆碱以外的磷脂。例如，中性脂质体组合物可以由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)组成。阴离子脂质体组合物通常由二肉豆蔻酰磷脂酰甘油组成，而阴离子融合脂质体主要由二油
酰磷酯酰乙醇胺(dope)形成。另一种类型的脂质体组合物由磷脂酰胆碱(pc)例如大豆pc和蛋pc组成。另一种类型由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。
[0479]
若干研究评价了脂质体药物制剂向皮肤的局部递送。将包含干扰素的脂质体应用到豚鼠皮肤，导致皮肤疱疹得分的减少，而经由其他手段(例如，作为溶液或作为乳剂)递送干扰素则无效(weiner等，journal of drug targeting,1992,2,405-410)。此外，另一研究测试了作为脂质体制剂部分施用的干扰素和使用含水体系施用干扰素的效果，并断定脂质体制剂优于含水施用(du plessis等，antiviral research,1992,18,259-265)。
[0480]
还检测了非离子脂质体系统(特别是含有非离子型表面活性剂和胆固醇的系统)以测定其在将药物递送至皮肤中的用途。含有novasome
tm i(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂酰醚)和novasome
tm ii(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子脂质体制剂用于递送环孢菌素-a到小鼠皮肤的真皮。结果显示这种离子脂质体系统能有效促进环孢菌素-a沉淀到不同皮肤层中(hu等，s.t.p.pharma.sci.,1994,4,6,466)。
[0481]
脂质体也包括“空间稳定的”脂质体，本文使用的该术语指的是当脂质结合入脂质体时，含有一种或多种特定脂质的脂质体相对于缺乏这种特定脂质的脂质体具有提高的循环有效期。空间稳定脂质体的例子是这样的脂质体：其中脂质体的囊泡形成脂质部分的一部分(a)包含一种或多种糖脂，例如单唾液酰神经节苷脂g
m1
，或(b)由一种或多种亲水性聚合物衍生化，例如聚乙二醇(peg)部分。不愿被任何特定理论束缚，本领域认为，至少对于包含神经节苷脂、鞘磷脂、或peg-衍生化脂质的空间稳定脂质体来说，这些空间稳定脂质体的提高的循环半衰期是由于向网状内皮系统(res)细胞内的摄入减少(allen等，febs letters,1987,223,42；wu等，cancer research,1993,53,3765)。
[0482]
含有一种或多种糖脂的各种脂质体是本领域已知的。papahadjopoulos等(ann.n.y.acad.sci.,1987,507,64)报导了单唾液酰神经节苷脂g
m1
、硫酸半乳糖脑苷脂和磷酯酰肌醇提高脂质体的血液半衰期的能力。这些发现也由gabizon等详细说明(proc.natl.acad.sci.u.s.a.,1988,85,6949)。美国专利号4,837,028和wo 88/04924(均属于allen等)公开了含有(1)鞘磷脂和(2)神经节苷脂g
m1
或硫酸半乳糖脑苷酯的脂质体。美国专利号5,543,152(webb等)公开了含有鞘磷脂的脂质体。wo 97/13499(lim等)公开了含有1,2-sn-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的脂质体。
[0483]
含有由一种或多种亲水性聚合物衍生化的脂质的许多脂质体及其制备方法是本领域已知的。sunamoto等(bull.chem.soc.jpn.,1980,53,2778)描述了含有非离子型去污剂2c
1215g
的脂质体，该去污剂含有peg部分。illum等(febs lett.,1984,167,79)注意到聚苯乙烯颗粒和聚乙二醇的亲水性包衣导致血半衰期的显著提高。sears描述了通过结合聚亚烷基二醇(例如，peg)的羧基而修饰的合成磷脂(美国专利号4,426,330和4,534,899)。klibanov等(febs lett.,1990,268,235)描述的实验证实了含有用peg或peg硬脂酸酯衍生的磷酯酰乙醇胺(pe)的脂质体具有显著提高的血循环半衰期。blume等(biochimica et biophysica acta,1990,1029,91)将这一发现扩展到其他peg-衍生磷脂，例如由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)和peg形成的dspe-peg。在其外表面具有共价结合的peg部分的脂质体在欧洲专利号ep 0 445 131 b1和fisher的wo 90/04384中描述。含有1-20摩尔百分比的用peg衍生的pe的脂质体组合物及其使用方法由woodle等(美国专利号5,013,556和5,356,
633)和martin等(美国专利号5,213,804和欧洲专利号ep 0 496 813 b1)描述。含有若干其他脂质-聚合物偶联物的脂质体在wo 91/05545和美国专利号5,225,212(两者均属于martin等)以及wo94/20073(zalipsky等)中描述。含有peg修饰的神经酰胺脂质的脂质体在wo 96/10391(choi等)中描述。美国专利号5,540,935(miyazaki等)和美国专利号5,556,948(tagawa等)描述了含有peg的脂质体，其表面可进一步用官能部分衍生化。
[0484]
含有核酸的若干脂质体是本领域已知的。thierry等的wo 96/40062公开了用于在脂质体中包封高分子量核酸的方法。tagawa等的美国专利号5,264,221公开了蛋白键合的脂质体，并声称这种脂质体的内容物可以包含dsrna。rahman等的美国专利号5,665,710描述了在脂质体中包封寡脱氧核糖核苷酸的某种方法。love等的wo 97/04787公开了含有靶向raf基因的dsrna的脂质体。
[0485]
传递体是另一种类型的脂质体，其是高度可变形的脂质集合体，是药物递送载体的重要候选者。传递体可以描述为脂质小滴，其是如此高度可变形因此其能够容易地穿透小于所述小滴的小孔。传递体适合于使用其的环境，例如，其是自优化(适应皮肤小孔的形状)、自修复、不间断地频繁到达其靶标以及通常自装载。为制备传递体，可以将表面边缘活化剂，通常是表面活性剂添加到标准的脂质体组合物中。传递体用于递送血清清蛋白到皮肤。传递体介导的血清清蛋白的递送显示和含有血清清蛋白的溶液的皮下注射一样有效。
[0486]
表面活性剂在制剂例如乳剂(包括微乳剂)和脂质体中具有广泛应用。分类和排序许多不同种类的表面活性剂(天然和合成的)的性质的最常用的方法是使用亲水/亲油平衡(hlb)。亲水基(又名“头”)的性质提供用于分类制剂中使用的不同表面活性剂的最有用的方法(rieger,pharmaceutical dosage forms,marcel dekker,inc.,new york,n.y.,1988,p.285)。
[0487]
如果表面活性剂分子未离子化，其被归类为非离子型表面活性剂。非离子型表面活性剂在药物和化妆品产品中有着广泛应用，且可在很宽的ph值范围内使用。通常，取决于其结构，其hlb值为2到约18。非离子型表面活性剂包括非离子酯例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、失水山梨醇酯、蔗糖酯和乙氧基化酯。非离子的烷醇酰胺和醚例如乙氧基化脂肪醇、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段共聚物也包括在这种类型中。聚氧化乙烯表面活性剂是非离子型表面活性剂中最常用的成员。
[0488]
如果表面活性剂分子溶解或分散在水中时，其携带负电荷，该表面活性剂归类为阴离子型。阴离子型表面活性剂包括羧酸酯，例如肥皂、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸酯例如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯、磺酸酯例如烷基苯磺酸酯、酰基羟乙基磺酸酯、酰基牛磺酸酯和磺基丁二酸酯，以及磷酸酯。阴离子型表面活性剂的最重要成员是烷基硫酸酯和肥皂。
[0489]
如果表面活性剂分子溶解或分散在水中时，其携带正电荷，该表面活性剂被归类为阳离子型。阳离子型表面活性剂包括季铵盐和乙氧化胺。季铵盐是这种类型的最常用的成员。
[0490]
如果表面活性剂分子能够携带正或负电荷，该表面活性剂被归类为两性的。两性表面活性剂包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、n-烷基甜菜碱和磷脂。
[0491]
药物、制剂以及乳剂中表面活性剂的使用已有综述(rieger,pharmaceutical dosage forms,marcel dekker,inc.,new york,n.y.,1988,p.285)。
[0492]
核酸脂质颗粒
[0493]
在一个实施方式中，本公开的lect2 dsrna完全包封于脂质制剂中，例如，以形成splp、psplp、snalp或其他的核酸-脂质颗粒。如本文所使用，“snalp”指的是稳定的核酸-脂质颗粒，包括splp。如本文所使用，“splp”指的是含有包封于脂质囊泡内的质粒dna的核酸-脂质颗粒。snalp和splp通常包含阳离子脂质、非阳离子脂质和阻止颗粒聚集的脂质(例如，peg-脂质偶联物)。snalp和splp对于全身应用极其有用，因为其在静脉(i.v.)注射后显示延长的循环有效期并聚集在远端部位(例如，在物理上与施用部位分离的部位)。splp包括“psplp”，其含有pct公开号wo 00/03683中所列的包封的缩合剂-核酸络合物。通常本发明颗粒的平均直径为约50nm到约150nm，更通常为约60nm到约130nm，更通常为约70nm到约110nm，最通常为约70nm到约90nm，且基本上无毒。另外，当存在于本发明的核酸-脂质颗粒中时，水溶液中的核酸抵抗核酸酶的降解。核酸-脂质颗粒及其制备方法描述在例如美国专利号5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；6,815,432；和pct公开号wo 96/40964中。
[0494]
在一个实施方式中，脂质与药物的比例(质量/质量比)(例如，脂质与dsrna的比例)将为约1∶1到约50∶1、约1∶1到约25∶1、约3∶1到约15∶1、约4∶1到约10∶1、约5∶1到约9∶1或约6∶1到约9∶1。
[0495]
阳离子脂质例如可以是，n,n-二油烯基-n,n-二甲基氯化铵(dodac)、n,n-二硬脂基-n,n-二甲基溴化铵(ddab)、n-(i-(2,3-二油氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotap)、n-(i-(2,3-二油酰氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)、n,n-二甲基-2,3-二油酰氧基)丙胺(dodma)、1,2-二亚油基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、1,2-二亚麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlendma)、1,2-二亚油基氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlin-c-dap)、1,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(dlin-dac)、1,2-二亚油基氧基-3-吗啉代丙烷(dlin-ma)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(dlindap)、1,2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(dlin-s-dma)、1-亚油酰基-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlin-2-dmap)、1,2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化盐(dlin-tma.cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化盐(dlin-tap.cl)、1,2-二亚油基氧基-3-(n-甲基哌嗪)丙烷(dlin-mpz)或3-(n,n-二亚油基氨基)-1，2-丙二醇(dlinap)、3-(n,n-二油基氨基)-1,2-丙二醇(doap)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-n,n-二甲基氨基)乙氧基丙烷(dlin-eg-dma)、1,2-二亚麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(dlin-k-dma)或其类似物、(3ar,5s,6as)-n,n-二甲基-2,2-二((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯)四氢-3ah-环戊[d][1,3]二氧戊环-5-胺(aln100)、4-(二甲基氨基)丁酸(6z,9z,28z,31z)-庚三十碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(mc3)、1,1
’‑
(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基亚氨基)双十二烷-2-醇(tech g1)或其混合物。阳离子脂质可以占存在于颗粒中的总脂质的约20mol％到约50mol％或约40mol％。
[0496]
在另一个实施方式中，化合物2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环可用于制备脂质-sirna纳米颗粒。2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环的合成描述在2008年10月23日提交的美国临时专利申请号61/107,998中，其以引用方式合并于此。
[0497]
在一个实施方式中，脂质-sirna颗粒包含40％的2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环∶10％dspc∶40％胆固醇∶10％peg-c-domg(摩尔百分比)，粒径为63.0
±
20nm，且sirna/脂质比例为0.027。
[0498]
非阳离子脂质可以是阴离子脂质或中性脂质，包括但不限于：二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰磷脂酰胆碱(dopc)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二油酰磷脂酰甘油(dopg)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)、二油酰-磷酯酰乙醇胺(dope)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(popc)、棕榈酰油酰磷酯酰乙醇胺(pope)、二油酰-磷酯酰乙醇胺4-(n-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(dope-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰磷酯酰乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰-磷脂酰基-乙醇胺(dspe)、16-o-一甲基pe、16-o-二甲基pe、18-1-反pe、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(sope)、胆固醇或其混合物。非阳离子脂质可以占存在于颗粒中的总脂质的约5mol％到约90mol％、约10mol％、或约58mol％(如果包括胆固醇的话)。
[0499]
抑制颗粒聚集的偶联脂质例如可以是聚乙二醇(peg)脂质，包括但不限于：peg-二酰甘油(dag)、peg-二烷氧基丙基(daa)、peg-磷脂、peg-神经酰胺(cer)或其混合物。peg-daa偶联物例如可以是peg-二月桂基氧基丙基(ci2)、peg-二肉豆蔻基氧基丙基(ci4)、peg-二棕榈基氧基丙基(ci6)或peg-二硬脂基氧基丙基(ci8)。抑制颗粒聚集的偶联脂质可以占存在于颗粒中的总脂质的0mol％到约20mol％或约2mol％。
[0500]
在一些实施方式中，核酸-脂质颗粒还包含胆固醇，例如是存在于颗粒中的总脂质的约10mol％到约60mol％或约48mol％。
[0501]
在一些实施方式中，在脂质纳米颗粒(lnp)中配制irna。
[0502]
lnp01
[0503]
在一个实施方式中，可用类脂质(lipidoid)nd98
·
4hcl(mw 1487)(参见于3/26/2008提交的美国专利申请号12/056,230，其通过引用并入本文)、胆固醇(sigma-aldrich)和peg-神经酰胺c16(avanti polar lipids)制备脂质-sirna纳米颗粒(例如，lnp01颗粒)。各自在乙醇中的原液可以如下制备：nd98，133mg/ml；胆固醇，25mg/ml，peg-神经酰胺c16，100mg/ml。然后例如以42∶48∶10的摩尔比混合nd98、胆固醇和peg-神经酰胺c16原液。混合的脂质溶液可以与水性dsrna(例如，在ph5的醋酸钠中)混合，这样乙醇的最终浓度约为35-45％且醋酸钠的最终浓度约为100-300mm。一旦混合，脂质-dsrna纳米颗粒通常自发形成。取决于所需的粒径分布，生成的纳米颗粒混合物可以使用例如热熔挤出机例如lipex挤出机(northern lipids,inc)挤压通过聚碳酸酯膜(例如，100nm截值)。在一些情况下，挤出步骤可以省略。除去乙醇和同时的缓冲液更换可以伴随着例如透析或切向流过滤。缓冲液可以例如用ph约7、例如，ph约6.9、ph约7.0、ph约7.1、ph约7.2、ph约7.3或ph约7.4的磷酸盐缓冲液(pbs)更换。
[0504][0505]
lnp01制剂例如描述在国际申请公开号wo 2008/042973中，其通过引用并入本文。
[0506]
在下表中提供了其他示例性脂质-dsrna制剂。
[0507]
表8：示例性脂质制剂
[0508]
[0509][0510]
dspc：双硬脂酰磷脂酰胆碱
[0511]
dppc：二棕榈酰磷脂酰胆碱
[0512]
peg-dmg：peg-二肉豆蔻酰基甘油(c14-peg或peg-c14)(peg平均分子量2000)
[0513]
peg-dsg：peg-二苯乙烯基甘油(c18-peg或peg-c18)(peg平均分子量2000)
[0514]
peg-cdma：peg-氨基甲酰基-1,2-二肉豆蔻氧基丙胺(peg平均分子量2000)
[0515]
在2009年04月15日提交的国际公开号wo2009/127060中描述了包含snalp(l,2-二亚麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma))的制剂，其通过引用并入本文。
[0516]
例如，在以下中描述了包含xtc的制剂：2009年01月29日提交的美国临时申请系列号61/148,366；2009年03月02日提交的美国临时申请系列号61/156,851；2009年06月10日提交的美国临时申请系列号61/185,712；2009年07月24日提交的美国临时申请系列号61/228,373；2009年09月03日提交的美国临时申请系列号61/239,686，以及2010年01月29日提交的国际申请号pct/us2010/022614，其通过引用并入本文。
[0517]
例如，在以下中描述了包含mc3的制剂：2009年09月22日提交的美国临时申请系列号61/244,834，2009年06月10日提交的美国临时申请系列号61/185,800，以及2010年06月10日提交的国际申请号pct/us10/28224，其通过引用并入本文。
[0518]
例如，在2009年11月10日提交的国际专利申请号pct/us09/63933中描述了包含alny-100的制剂，其通过引用并入本文。
[0519]
在2009年05月05日提交的美国临时申请系列号61/175,770和2010年05月05日提交的国际申请号pct/us10/33777中描述了包含c12-200的制剂，其通过引用并入本文。
[0520]
阳离子脂质的合成
[0521]
可通过已知的有机合成技术制备用于本公开的核酸-脂质颗粒中的任何化合物，例如，阳离子脂质等。除非另有说明，否则所有取代基的定义如下。
[0522]“烷基”指含有1-24个碳原子的直链或支链、非环状或环状饱和脂肪烃。代表性的饱和直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等；而饱和支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。代表性饱和环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；而不饱和的环烷基包括环戊烯基和环己烯基等。
[0523]“烯基”指在相邻碳原子之间含有至少一个双键的如上文所定义的烷基。烯基包括顺式和反式异构体。代表性的直链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基等。
[0524]“炔基”是指如上文定义的任何烷基或烯基，其在相邻碳之间另外包含至少一个三键。代表性的直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1丁炔基等。
[0525]“酰基”是指任何烷基、烯基或炔基，其中连接点的碳被如下定义的氧代基团取代。例如，-c(＝o)烷基、-c(＝o)烯基和-c(＝o)炔基是酰基基团。
[0526]“杂环”是指饱和、不饱和或芳族的5至7元单环或7至10元双环杂环，其包含1或2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子，并且其中氮和硫杂原子可以任选地被氧化，并且氮杂原子可以任选地被季铵化，包括其中任何上述杂环稠合至苯环的双环。杂环可以通过任何杂原子或碳原子连接。杂环包括如下定义的杂芳基。杂环包括吗啉基、吡咯烷基壬基、吡咯烷基、哌啶基、哌啶基、乙内酰脲基、戊内酰胺基、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢亚氨基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基等。
[0527]
术语“任选取代的烷基”、“任选取代的烯基”、“任选取代的炔基”、“任选取代的酰基”和“任选取代的杂环”是指，当被取代时，至少一个氢原子被取代基取代。在氧代取代基(＝o)的情况下，两个氢原子被取代。在这方面，取代基包括氧代、卤素、杂环、-cn、-or
x
、nr
xry
、nr
x
c(＝o)ry、nr
x
so2ry、c(＝o)r
x
、c(＝o)or
x
、c(＝o)nr
xry
、
–
so
nrx
和sonnr
xry
，其中n是0、1或2，r
x
和ry是相同或不同的且独立地为氢、烷基或杂环，并且每个所述烷基和杂环取代基可以进一步被一个或多个以下取代：氧代、卤素、-oh、-cn、烷基、-or
x
、杂环、nr
xry
、nr
x
c(＝o)ry、nr
x
so2ry、c(＝o)r
x
、c(＝o)or
x
、c(＝o)nr
xry
、so
nrx
和sonnr
xry
。
[0528]“卤素”指氟、氯、溴和碘。
[0529]
在一些实施方式中，本公开的方法可能需要使用保护基团。保护基方法学是本领域技术人员熟知的。(参见例如，protective groups in organic synthesis,green,t.w.等，wiley-interscience,new york city,1999)。简言之，本公开中的保护基团是降低或消除官能团不希望的反应性的任何基团。可以将保护基团添加到官能团以掩盖其在某些反应
期间的反应性，然后将其移除以显示原始官能团。在一些实施方式中，使用“醇保护基团”。“醇保护基团”是降低或消除醇官能团不希望的反应性的任何基团。可以使用本领域熟知的技术添加和除去保护基团。
[0530]
式a的合成
[0531]
在一个实施方式中，使用式a的阳离子脂质配制本公开中的核酸-脂质颗粒：
[0532][0533]
其中r1和r2独立地是烷基、烯基或炔基，每个可以任选地被取代，以及r3和r4独立地是低级烷基或r3和r4可以在一起形成任选取代的杂环的环。在一些实施方式中，阳离子脂质是xtc(2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环)。在通常情况下，上述式a的脂质可以通过以下反应路线1或2制备，其中所有取代基如上文所定义，除非另有说明。
[0534]
路线1
[0535][0536]
脂质a，其中r1和r2独立地是烷基、烯基或炔基，每个可以任选地被取代，以及r3和r4可以独立地是低级烷基或r3和r4可以在一起形成任选取代的杂环的环，可以根据路线1制备。酮1和溴化物2可以购买或根据本领域普通技术人员公知的方法制备。1和2的反应产生缩酮3。用胺4处理缩酮3产生式a的脂质。式a的脂质可以用式5的有机盐转化为相应的铵盐，其中x是卤素、氢氧化物、磷酸盐、硫酸盐等阴离子抗衡离子。
[0537]
路线2
[0538][0539]
或者，酮1初始原料可以根据路线2制备。格氏试剂6和氰化物7可以根据本领域普通技术人员公知的方法购买或制备。6和7的反应产生酮1。酮1向相应的式a的脂质的转化如路线1中所述。
[0540]
mc3的合成
[0541]
按照如下所示制备dlin-m-c3-dma(即，(6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯)。将(6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-醇(0.53g)、4-n,n-二甲基氨基丁酸盐酸盐(0.51g)、4-n,n-二甲基氨基吡啶(0.61g)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.53g)在二氯甲烷(5ml)的溶液中在室温下搅拌过夜。溶液用稀盐酸洗涤，然后用稀碳酸氢钠水溶液洗涤。有机部分用无水硫酸镁干燥，过滤并在旋转蒸发仪上除去溶剂。使用1-5％甲醇/二氯甲烷洗脱梯度将残留物通过硅胶柱(20g)。合并含有纯化产物的级分并除去溶剂，得到无色油状物(0.54g)。
[0542]
alny-100的合成
[0543]
使用下述路线3进行酮519[alny-100]的合成：
[0544][0545]
515的合成：
[0546]
在双颈rbf(1l)中搅拌的lialh4(3.74g，0.09852mol)在200ml无水thf中的悬浮液中，在0℃氮气氛下缓慢加入514(10g，0.04926mol)在70ml thf的溶液。完全加入后，将反应混合物升温至室温，然后加热回流4h。通过tlc监测反应进展。反应完成后(通过tlc)，将混合物冷却至0℃，并小心加入饱和na2so4溶液淬灭。将反应混合物在室温下搅拌4h并滤出。残留物用thf充分洗涤。将滤液和洗涤液混合，并用400ml二噁烷和26ml浓盐酸稀释，在室温下搅拌20分钟。在真空下汽提挥发物以提供作为白色固体的515的盐酸盐。收率：7.12g。1h-nmr(dmso,400mhz):δ＝9.34(宽峰,2h),5.68(s,2h),3.74(m,1h),2.66-2.60(m,2h),2.50-2.45(m,5h)。
[0547]
516的合成：
[0548]
向化合物515在250ml双颈rbf中的100ml干燥dcm中的搅拌溶液中加入net3(37.2ml，0.2669mol)并在氮气氛下冷却至0℃。在50ml干燥dcm中缓慢加入n-(苄氧基-羰基氧基)-琥珀酰亚胺(20g，0.08007mol)后，使反应混合物升温至室温。反应完成后(通过tlc分析2-3小时)，混合物依次用1n hcl溶液(1x100ml)和饱和nahco3溶液(1x50ml)洗涤。然后将有机层用无水na2so4干燥，并蒸发溶剂得到粗物质，将其通过硅胶柱色谱纯化得到516，为粘性物质。收率：11g(89％)。1h-nmr(cdcl3,400mhz):δ＝7.36-7.27(m,5h),5.69(s,2h),5.12(s,2h),4.96(br.,1h)2.74(s,3h),2.60(m,2h),2.30-2.25(m,2h)。lc-ms[m h]-232.3(96.94％)。
[0549]
517a和517b的合成：
[0550]
将环戊烯516(5g,0.02164mol)溶于单颈500ml rbf中的220ml丙酮和水(10:1)溶液中，并向其中加入n-甲基吗啉-n-氧化物(7.6g,0.06492mol)，然后在室温下加入4.2ml 7.6％oso4(0.275g，0.00108mol)的叔丁醇溶液。反应完成后(～3h)，混合物通过加入固体na2so3淬灭，所得混合物在室温下搅拌1.5h。将反应混合物用dcm(300ml)稀释并用水(2x100ml)洗涤，然后用饱和nahco3(1x50ml)溶液、水(1x30ml)和最后用盐水(1x50ml)洗涤。有机相用na2so4干燥并真空除去溶剂。粗物质的硅胶柱色谱纯化得到非对映异构体的混合物，其通过制备型hplc分离收率：-6g粗品。
[0551]
517a
–
峰1(白色固体)，5.13g(96％)。1h-nmr(dmso,400mhz):δ＝7.39-7.31(m,5h),5.04(s,2h),4.78-4.73(m,1h),4.48-4.47(d,2h),3.94-3.93(m,2h),2.71(s,3h),1.72-1.67(m,4h)。lc-ms
–
存在[m h]-266.3,[m nh4 ]-283.5，hplc-97.86％。通过x-射线证实立体化学。
[0552]
518的合成：
[0553]
使用与合成化合物505所描述的相似程序，得到化合物518(1.2g，41％)，为无色油状物。1h-nmr(cdcl3,400mhz):δ＝7.35-7.33(m,4h),7.30-7.27(m,1h),5.37-5.27(m,8h),5.12(s,2h),4.75(m,1h),4.58-4.57(m,2h),2.78-2.74(m,7h),2.06-2.00(m,8h),1.96-1.91(m,2h),1.62(m,4h),1.48(m,2h),1.37-1.25(br m,36h),0.87(m,6h)。hplc-98.65％。
[0554]
合成化合物519的一般程序：
[0555]
将化合物518(1eq)在己烷(15ml)中的溶液以逐滴方式添加到lah在thf(1m，2eq)中的冰冷溶液中。添加完成后，将混合物在40℃加热0.5小时，然后再次在冰浴上冷却。混合物用饱和na2so4水溶液小心水解，然后通过硅藻土过滤并还原成油状物。柱层析得到纯的519(1.3g，68％)，其为无色油状物。13c nmr＝130.2,130.1(x2),127.9(x3),112.3,79.3,64.4,44.7,38.3,35.4,31.5,29.9(x2),29.7,29.6(x2),29.5(x3),29.3(x2),27.2(x3),25.6,24.5,23.3,226,14.1；电喷雾ms( ve)：c44h80no2的分子量(m h) 计算值654.6，实测值654.6。
[0556]
通过标准或非挤出方法制备的制剂可以类似方式表征。例如，制剂通常以肉眼观察进行表征。其应该是发白透明的溶液，没有聚集或沉淀。脂质-纳米颗粒的粒径和粒径分布可以例如使用malvern zetasizer nano zs(malvern，usa)通过光散射测量。颗粒大小应该约为20-300nm，如40-100nm。粒径分布应该是单峰。制剂中dsrna总浓度以及诱捕的部分使用染料排除试验来评估。配制的dsrna样品可以与结合rna的染料例如ribogreen
(molecular probes)在存在或不存在干扰制剂的表面活性剂例如0.5％triton-x100的情况下温育。制剂中的总dsrna可根据从包含表面活性剂的样品发出的信号相对于标准曲线进行确定。诱捕的部分通过从总dsrna含量中减去“游离”dsrna含量(根据当不存在表面活性剂时的信号测定)来确定。诱捕dsrna的百分比通常＞85％。对于snalp制剂，粒径至少为30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm、以及至少120nm。适当的范围通常为约至少50nm到约至少110nm、约至少60nm到约至少100nm、或约至少80nm到约至少90nm。
[0557]
用于口服的组合物和制剂包含粉末或颗粒、微颗粒、纳米颗粒、悬浮液或水溶液或非水介质、胶囊、凝胶胶囊、袋剂、片剂或小片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是需要的。在一些实施方式中，口服制剂是本发明dsrna和一种或多种渗透促进剂表面活性剂和螯合剂一起施用的制剂。适当的表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。适当的胆汁酸/盐包含鹅脱氧胆酸(cdca)和猪脱氧鹅脱氧胆酸(udca)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、葡萄糖胆酸、甘油胆酸、甘油脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺-24,25-二氢-夫西地酸钠和甘油二氢夫西地酸钠。适当的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、甘油一油酸酯、甘油二月桂酸酯、甘油基1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或甘油一酯、甘油二酯或其药学可接受盐(例如，钠盐)。在一些实施方式中，使用渗透促进剂组合，例如，脂肪酸/盐和胆汁酸/盐组合。一种示范性的组合是月桂酸、癸酸和udca的钠盐。另外的渗透促进剂包括聚氧化乙烯-9-月桂基醚、聚氧化乙烯-20-十六烷基醚。本发明的dsrna可以以颗粒形式口服施用，所述颗粒形式包括喷雾干燥的颗粒，或复合以形成微米或纳米颗粒。dsrna络合剂包括聚氨基酸；聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚丙烯酸烷基酯、聚环氧乙烷、聚烷基腈基丙烯酸酯；阳离子化凝胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(peg)和淀粉；聚烷基腈基丙烯酸酯；deae-衍生化聚亚胺、支链淀粉、纤维素和淀粉。适当的络合剂包括壳聚糖、n-三甲基壳聚糖、聚-l-赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚精胺、鱼精蛋白、聚乙烯基吡啶、聚硫代二乙基氨甲基乙烯p(tdae)、聚氨基苯乙烯(例如，对-氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异己基氰基丙烯酸酯)、deae-甲基丙烯酸酯、deae-丙烯酸己酯、deae-丙烯酰胺、deae-白蛋白和deae-葡聚糖、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸己酯、聚(d,l-乳酸)、聚(dl-乳-共聚-羟基乙酸(plga)、藻酸盐和聚乙二醇(peg)。用于dsrna的口服制剂及其制备详细描述在美国专利6,887,906、美国申请公开号20030027780和美国专利号6,747,014中，其每一个通过引用并入本文。
[0558]
用于非肠道、实质内(进入脑)、鞘内、室内或肝内施用的组合物和制剂可以包含无菌水溶液，其也可以包含缓冲液、稀释剂及其他适当的添加剂，例如但不限于：渗透促进剂、载体化合物及其他药学可接受的载体或赋形剂。
[0559]
本发明药物组合物包括但不限于溶液、乳剂和含脂质体的制剂。这些组合物可由多种组分产生，所述组分包括但不限于预形成液体、自乳化固体和自乳化半固体。
[0560]
可以方便地以单元剂型存在的本发明药物制剂可以根据制药工业中众所周知的常规方法制备。这些技术包括使活性成分和药物载体或赋形剂结合的步骤。通常，通过均匀和紧密地使活性成分和液体载体或精细粉碎的固体载体或两者结合，然后如有必要，使产
物成形来制备制剂。
[0561]
本发明组合物可以配制成任何可能的剂型，例如但不限于：片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明组合物也可以在水、非水或混合介质中配制成悬浮液。水悬浮液还可以包含增加该悬浮液粘性的物质，例如包括羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该悬浮液也可以包含稳定剂。
[0562]
其他制剂
[0563]
乳剂
[0564]
本发明组合物可以制备和配制成乳剂。乳剂通常是一种液体以直径通常超过0.1μm的小滴形式分散在另一种液体中的非均匀体系(参见例如，ansel’s pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems,allen,lv.,popovich ng.和ansel hc.,2004,lippincott williams&wilkins(第8版)，new york,ny；idson,pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger和banker(编著),1988,marcel dekker,inc.,new york,n.y.，第1卷，p.199；rosoff,pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger和banker(编著),1988,marcel dekker,inc.,new york,n.y.，第1卷，p.245；block,pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger和banker(编著),1988,marcel dekker,inc.,new york,n.y.，第2卷，p.335；higuchi等，remington’s pharmaceutical sciences,mack publishing co.,easton,pa.,1985,p.301)。乳剂通常是含有紧密混合并互相分散的两种不混溶液相的两相系统。通常，乳剂可以是油包水(w/o)或水包油(o/w)类。当水相作为极细小滴精细分离并分散在大量油相中，所得组合物称为油包水(w/o)乳剂。或者，当油相作为极细小滴精细分离并分散在大量水相中，所得组合物称为水包油(o/w)乳剂。乳剂可以包含除分散相之外的其他组分，活性药物可以在水相、油相或它本身作为游离相中以溶液存在。药物赋形剂例如乳化剂、稳定剂、着色剂和抗氧化剂也可以根据需要存在于乳剂中。药物乳剂也可以是由超过两相组成的多重乳剂，例如，油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳剂。这种复杂制剂通常提供简单二元乳剂没有的某种优点。o/w乳剂的单个油滴围绕小的水滴的多重乳剂组成w/o/w乳剂。同样地，油连续相中稳定的水滴围绕油滴的体系提供o/w/o乳剂。
[0565]
乳剂的特征在于几乎没有或没有热力学稳定性。通常，乳剂的分散相或非连续相很好分散在外相或连续相中并通过乳化剂手段或制剂的粘性维持其形式。任何一个乳剂相可以是半固体或固体，乳剂类型的软膏基质和霜剂就是这样。稳定乳剂的其他手段需要使用可以结合入乳剂的任何一相的乳化剂。乳化剂可以大体分为四个种类：合成的表面活性剂、天然存在的乳化剂、吸收基质和精细分散的固体(参见例如，ansel’s pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems,allen,lv.,popovich ng.和ansel hc.,2004,lippincott williams&wilkins(第8版)，new york,ny；idson,pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger和banker(编著)，1988,marcel dekker,inc.,new york,n.y.，第1卷，p.199)。
[0566]
合成的表面活性剂，又名表面活性剂，在乳剂制剂中具有广泛的适用性并在文献中综述(参见例如，ansel’s pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems,allen,lv.,popovich ng.和ansel hc.,2004,lippincott williams&wilkins(第8版)，new york,ny；rieger,pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger和banker
(编著)，1988,marcel dekker,inc.,new york,n.y.，第1卷，p.285；idson,pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger和banker(编著)，marcel dekker,inc.,new york,n.y.,1988，第1卷，p.199)。表面活性剂通常是两性的并包含亲水性和疏水性部分。表面活性剂的亲水性与疏水性的比例称为亲水/亲油平衡值(hlb)，其是分类以及在制备制剂时选择表面活性剂的重要工具。表面活性剂可以基于亲水基团的性质分为不同的种类：非离子、阴离子、阳离子和两性的(参见例如，ansel’s pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems,allen,lv.,popovich ng.和ansel hc.,2004,lippincott williams&wilkins(第8版)，new york,ny rieger,pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger和banker(编著)，1988,marcel dekker,inc.,new york,n.y.，第1卷，p.285)。
[0567]
用于乳剂制剂的天然存在的乳化剂包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和阿拉伯树胶。吸收基质具有亲水性，因此其可以吸收水以形成w/o乳剂，同时保持其半固体稠度，例如无水羊毛脂和亲水性矿脂。精细分散的固体也可用作良好的乳化剂，特别是与表面活性剂结合和在粘性制剂中。其包括极性无机固体，如重金属氢氧化物、不溶胀的粘土如皂土、坡缕石、锂蒙脱石、高岭土、蒙脱土、胶质硅酸铝和胶质镁铝硅酸盐、颜料和非极性固体如碳或三硬脂酸甘油酯。
[0568]
多种非乳化材料也包括在乳剂制剂中，并有助于乳剂的性质。其包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、湿润剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(block,pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger和banker(编著)，1988,marcel dekker,inc.,new york,n.y.，第1卷，p.335；idson,pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger和banker(编著)，1988,marcel dekker,inc.,new york,n.y.，第1卷，p.199)。
[0569]
亲水胶体或水状胶体包括天然存在的胶和合成聚合物，例如多糖(例如，阿拉伯树胶、琼脂、藻酸、角叉菜胶、胍尔豆胶、刺梧桐树胶和黄蓍胶)、纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)、和合成聚合物(例如，卡波姆、纤维素醚和羧乙烯聚合物)。其分散或溶胀在水中以形成胶体溶液，其通过形成围绕分散相小滴的坚固界面膜和通过增加外相粘性来使乳剂稳定。
[0570]
因为乳剂通常包含若干容易支持微生物生长的组分例如碳水化合物、蛋白质、甾醇和磷脂，这些制剂通常加入防腐剂。乳剂制剂中包含的常用防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、季铵盐、杀藻铵、对羟基苯甲酸酯和硼酸。通常也加入抗氧化剂到乳剂制剂中以阻止制剂降解。所用抗氧化剂可以是自由基清除剂例如生育酚、没食子酸烷基酯、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯，或还原剂例如抗坏血酸和焦亚硫酸钠，以及抗氧化剂协同剂例如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂。
[0571]
乳剂制剂经由皮肤、口和非肠道途径的应用及其制备方法在以下文献中综述(参见例如，ansel’s pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems,allen,lv.,popovich ng.和ansel hc.,2004,lippincott williams&wilkins(第8版)，new york,ny；idson,pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger和banker(编著)，1988,marcel dekker,inc.,new york,n.y.，第1卷，p.199)。口服递送的乳剂制剂广泛使用，因为其易于制备、以及从吸收和生物利用率观点具有有效性(参见例如，ansel’s pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems,allen,lv.,popovich ng.和ansel hc.,2004,lippincott williams&wilkins(第8版)，new york,ny；rosoff,
pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger和banker(编著)，1988,marcel dekker,inc.,new york,n.y.，第1卷，p.245；idson,pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger和banker(编著)，1988,marcel dekker,inc.,new york,n.y.，第1卷，p.199)。矿物油基轻泻剂、油可溶解的维生素和高脂肪营养制剂是通常作为o/w乳剂口服施用的材料。
[0572]
在本公开的一个实施方式中，irna和核酸的组合物配制成微乳剂。微乳剂可定义为水、油和两性分子的系统，其是单光学各向同性和热力学稳定的液体溶液(参见例如，ansel’s pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems,allen,lv.,popovich ng.和ansel hc.,2004,lippincott williams&wilkins(第8版)，new york,ny；rosoff,pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger和banker(编著)，1988,marcel dekker,inc.,new york,n.y.，第1卷，p.245)。通常微乳剂是如下制备的体系：通过首先将油分散在表面活性剂水溶液中，然后添加足够量的第四组分，通常是中等链长度的醇，以形成透明系统。因此，微乳剂也被称为通过表面活性分子的界面膜稳定的两种不溶混液体的热力学稳定的、各向同性的澄清分散体(leung和shah,controlled release of drugs:polymers and aggregate systems,rosoff,m.编辑，1989,vch publishers,new york,第185-215页)。通常微乳剂通过结合包含油、水、表面活性剂、助表面活性剂和电解质的三到五个组分来制备。该微乳剂是油包水(w/o)类型还是水包油(o/w)类型取决于所用的油和表面活性剂的性质以及表面活性剂分子的极性头部和碳氢化合物尾部的结构和几何组装(schott,remington’s pharmaceutical sciences,mack publishing co.,easton,pa.,1985,p.271)。
[0573]
利用相位图的现象学方法已被广泛研究并对本领域技术人员提供如何配制微乳剂的全面知识(参见例如，ansel’s pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems,allen,lv.,popovich ng.和ansel hc.,2004,lippincott williams&wilkins(第8版)，new york,ny；rosoff,pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger和banker(编著)，1988,marcel dekker,inc.,new york,n.y.，第1卷，p.245；block,pharmaceutical dosage forms,lieberman,rieger和banker(编著)，1988,marcel dekker,inc.,new york,n.y.，第1卷，p.335)。与传统乳剂相比，微乳剂具有在自发形成的热力学稳定的小滴制剂中增溶水不溶解药物的优点。
[0574]
用于制备微乳剂的表面活性剂包括但不限于：离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、brij96、聚氧化乙烯油烯基醚、脂肪酸聚甘油酯、单月桂酸四甘油酯(ml310)、单油酸四甘油酯(mo310)、单油酸六甘油酯(po310)、五油酸六甘油酯(po500)、单癸酸十甘油酯(mca750)、单油酸十甘油酯(mo750)、倍半油酸十甘油酯(so750)、十油酸十甘油酯(dao750)，单独或结合助表面活性剂使用。助表面活性剂，通常是短链醇例如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，用于通过渗透入表面活性剂膜来增加界面流动性，并由于在表面活性剂分子间产生空隙体积而生成无序膜。然而，微乳剂可以在不使用助表面活性剂的情况下制备，且无醇自乳化微乳剂体系是本领域已知的。通常水相可以是但不限于：水、药物水溶液、甘油、peg300、peg400、聚丙三醇、丙二醇和乙二醇衍生物。油相可以包括但不限于：例如captex 300、captex 355、capmul mcm、脂肪酸酯、中链(c8-c12)单、二和三甘油酯、聚氧乙烯甘油基脂肪酸酯、脂肪醇、聚乙二醇化甘油酯、饱和的聚乙二醇化c8-c10甘油酯、植物油和硅油的
材料。
[0575]
从药物增溶作用和提高药物吸收观点而言，微乳剂是特别感兴趣的。已经提出脂质基微乳剂(o/w和w/o两者)来提高药物包括肽的口服生物利用率(参见例如，美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；constantinides等，pharmaceutical research,1994,11,1385-1390；ritschel,meth.find.exp.clin.pharmacol.,1993,13,205)。微乳剂提供以下优点：改善的药物增溶作用、保护药物不受酶水解、由于表面活性剂诱导的膜流体性和渗透性的变化而可能提高药物吸收、易于制备、比固体剂型易于口服、改善的临床药效和降低的毒性(参见例如，美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；constantinides等，pharmaceutical research,1994,11,1385；ho等，j.pharm.sci.,1996,85,138-143)。通常当其组分在环境温度下聚集时，微乳剂可以自发形成。当配制热不稳定的药物、肽或irna时，这可能是特别有利的。微乳剂在化妆品和药物应用两者的有效成分透皮递送中也是有效的。预期本发明微乳剂组合物和制剂将促进提高irna和核酸从胃肠道的全身吸收，以及提高局部细胞摄入irna和核酸。
[0576]
本发明微乳剂也可以包含其他组分和添加剂例如失水山梨醇单硬脂酸酯(grill 3)、labrasol和渗透促进剂以提高制剂的性能并提高本发明dsrna和核酸的吸收。用于本发明微乳剂的渗透促进剂可以分类为属于五大类
‑‑
表面活性剂、脂肪酸、胆盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(lee等，critical reviews in therapeutic drug carrier systems,1991,p.92)中的一类。这些分类的每一种已经在上文论述。
[0577]
渗透促进剂
[0578]
在一个实施方式中，本发明使用多种渗透促进剂来实现核酸特别是irna有效递送至动物皮肤。大多数药物以离子化和非离子化形式存在于溶液中。然而，通常仅脂溶性或亲脂性药物容易穿透细胞膜。已经发现，如果用渗透促进剂处理需要穿透的细胞膜，则甚至非亲脂性药物也可以穿透细胞膜。除帮助非亲脂性药物扩散穿透细胞膜之外，渗透促进剂也提高亲脂性药物的渗透性。
[0579]
渗透促进剂可以分类为属于五大类
‑‑
表面活性剂、脂肪酸、胆盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(参见例如，malmsten,m.surfactants and polymers in drug delivery,informa health care,new york,ny,2002；lee等，critical reviews in therapeutic drug carrier systems,1991,p.92)中的一类。上述的每一类渗透促进剂详细描述如下。
[0580]
表面活性剂：关于本发明，表面活性剂(或“表面-活性剂”)是当溶解在水溶液中时减少溶液的表面张力或水溶液与另一种液体之间的界面张力，从而提高irna通过黏膜吸收的化学实体。除胆盐和脂肪酸之外，这些渗透促进剂包括例如，月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚(参见例如，malmsten,m.surfactants and polymers in drug delivery,informa health care,new york,ny,2002；lee等，critical reviews in therapeutic drug carrier systems,1991,p.92)；和全氟化学乳剂，如fc-43(takahashi等，j.pharm.pharmacol.,1988,40,252)。
[0581]
脂肪酸：作为渗透促进剂的多种脂肪酸及其衍生物例如包括，油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油一油酸酯(1-一油酰-rac-甘油)、甘油二月桂酸酯、辛酸、花生四烯酸、甘油1-一癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或其c
1-20
烷基酯(例如，甲基、异丙基和叔丁基酯)、
及其单-和二-甘油酯(即，油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯等)(参见例如，touitou,e.,等，enhancement in drug delivery,crc press,danvers,ma,2006；lee等，critical reviews in therapeutic drug carrier systems,1991,p.92；muranishi,critical reviews in therapeutic drug carrier systems,1990,7,1-33；el hariri等，j.pharm.pharmacol.,1992,44,651-654)。
[0582]
胆盐：胆汁的生理学作用包括促进脂质和脂溶性维生素的扩散和吸收(参见例如，malmsten,m.surfactants and polymers in drug delivery,informa health care,new york,ny,2002；brunton，第38章，goodman&gilman’s the pharmacological basis of therapeutics，第8版，hardman等编著，mcgraw-hill,new york,1996,pp.934-935)。多种天然胆盐及其合成衍生物可作为渗透促进剂。因此术语“胆盐”包括任何天然存在的胆汁组分及其合成衍生物。适当的胆盐例如包括，胆酸(其药学可接受的钠盐，胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、葡萄糖胆酸(葡萄糖胆酸钠)、甘油胆酸(甘油胆酸钠)、甘油脱氧胆酸(甘油脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸钠)、熊脱氧胆酸(udca)、牛磺-24,25-二氢-夫西地酸钠(stdhf)、甘油二氢夫西地酸钠和聚氧乙烯-9-月桂基醚(poe)(参见例如，malmsten,m.surfactants and polymers in drug delivery,informa health care,new york,ny,2002；lee等，critical reviews in therapeutic drug carrier systems,1991，第92页；swinyard，第39章，remington’s pharmaceutical sciences，第18版，gennaro编辑，mack publishing co.,easton,pa.,1990，第782-783页；muranishi,critical reviews in therapeutic drug carrier systems,1990,7,1-33；yamamoto等，j.pharm.exp.ther.,1992,263,25；yamashita等，j.pharm.sci.,1990,79,579-583)。
[0583]
螯合剂：本发明使用的螯合剂可以定义为通过形成络合物将金属离子从溶液中除去，从而提高irna通过黏膜的吸收的化合物。当用作本发明的渗透促进剂时，螯合剂具有同时作为dnase抑制剂的额外优点，因为大多数表征的dna核酸酶需要二价金属离子作为催化剂，因此可被螯合剂抑制(jarrett,j.chromatogr.,1993,618,315-339)。适当的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(edta)、柠檬酸、水杨酸盐(例如，水杨酸钠、5-甲氧基水杨酸盐和高香草酸盐)、胶原的n-酰基衍生物、聚乙二醇单十二醚-9和β-双酮的n-氨基酰基衍生物(烯胺)(参见例如，katdare,a.等，excipient development for pharmaceutical,biotechnology,and drug delivery,crc press,danvers,ma,2006；lee等，critical reviews in therapeutic drug carrier systems,1991，第92页；muranishi,critical reviews in therapeutic drug carrier systems,1990,7,1-33；buur等，j.control rel.,1990,14,43-51)。
[0584]
非螯合非表面活性剂：如本文所使用，非螯合非表面活性剂渗透促进化合物可以定义为显示可忽略的螯合剂活性或表面活性剂活性，但仍然能提高irna通过营养黏膜吸收的化合物(参见例如，muranishi,critical reviews in therapeutic drug carrier systems,1990,7,1-33)。这类渗透促进剂例如包括不饱和环脲、1-烷基-和1-烯基氮杂环-烷酮衍生物(lee等，critical reviews in therapeutic drug carrier systems,1991，第92页)；和非甾体抗炎药例如双氯灭痛、吲哚美辛和苯基丁氮酮(yamashita等，j.pharm.pharmacol.,1987,39,621-626)。
[0585]
在细胞水平上增强irna摄取的药剂也可以添加到本公开的药物和其他组合物中。例如，还已知阳离子脂质，如lipofectin(junichi等，美国专利号5,705,188)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子，如聚赖氨酸(lollo等，pct申请wo 97/30731)可增强细胞摄取dsrna。可商购的转染试剂的实例包括例如lipofectamine
tm
(invitrogen；carlsbad,ca)、lipofectamine 2000
tm
(invitrogen；carlsbad,ca)、293fectin
tm
(invitrogen；carlsbad,ca)、cellfectin
tm
(invitrogen；carlsbad,ca)、dmrie-c
tm
(invitrogen；carlsbad,ca)、freestyle
tm
max(invitrogen；carlsbad,ca)、lipofectamine
tm
2000cd(invitrogen；carlsbad,ca)、lipofectamine
tm
(invitrogen；carlsbad,ca)、rnaimax(invitrogen；carlsbad,ca)、oligofectamine
tm
(invitrogen；carlsbad,ca)、optifect
tm
(invitrogen；carlsbad,ca)、x-tremegene q2转染试剂(roche；grenzacherstrasse,switzerland)、dotap脂质体转染试剂(grenzacherstrasse,switzerland)、dosper脂质体转染试剂(grenzacherstrasse,switzerland)或fugene(grenzacherstrasse,switzerland)、试剂(promega；madison,wi)、transfast
tm
转染试剂(promega；madison,wi)、tfx
tm-20试剂(promega；madison,wi)、tfx
tm-50试剂(promega；madison,wi)、dreamfect
tm
(oz biosciences；marseille,france)、ecotransfect(oz biosciences；marseille,france)、transpassa d1转染试剂(new england biolabs；ipswich,ma,usa)、lyovec
tm
/lipogen
tm
(invivogen；san diego,ca,usa)、perfectin转染试剂(genlantis；san diego,ca,usa)、neuroporter转染试剂(genlantis；san diego,ca,usa)、geneporter转染试剂(genlantis；san diego,ca,usa)、geneporter 2转染试剂(genlantis；san diego,ca,usa)、cytofectin转染试剂(genlantis；san diego,ca,usa)、baculoporter转染试剂(genlantis；san diego,ca,usa)、troganporter
tm
转染试剂(genlantis；san diego,ca,usa)、ribofect(bioline；taunton,ma,usa)、plasfect(bioline；taunton,ma,usa)、unifector(b-bridge international；mountain view,ca,usa)、surefector(b-bridge international；mountain view,ca,usa)或hifect
tm
(b-bridge international,mountain view,ca,usa)等。
[0586]
其他试剂可用于增强所施用核酸的渗透，包括二醇类，如乙二醇和丙二醇，吡咯类，如2-吡咯，氮酮类和萜类，如柠檬烯和薄荷酮。
[0587]
载体
[0588]
本发明的某些组合物也在制剂中含有载体化合物。如本文所使用，“载体化合物”或“载体”可以指核酸或其类似物，其是惰性的(即，本身不具有生物活性)，但被体内过程作为核酸识别，该体内过程例如通过降解生物活性的核酸或促使其从循环中去除而降低核酸的生物利用率。核酸和载体化合物的共同施用(通常后一种物质过量)可导致肝脏、肾脏或其他循环外贮库中回收的核酸量明显减少，这大概是由于载体化合物和核酸之间对共同受体的竞争。例如，当和聚肌苷酸、葡聚糖硫酸酯、聚胞苷酸或4-乙酸胺基-4’异硫氰基-二苯乙烯-2,2
’‑
二磺酸共施用时，部分硫代磷酸dsrna在肝组织中的回收可减少(miyao等，dsrna res.dev.,1995,5,115-121；takakura等，dsrna&nucl.acid drug dev.,1996,6,177-183)
[0589]
赋形剂
[0590]
与载体化合物相反，“药物赋形剂”或“赋形剂”是用于将一种或多种核酸递送到动
物的药学可接受的溶剂、悬浮剂或任何其他药理学惰性载体。赋形剂可以是液体或固体，并考虑计划施用的方式进行选择，当与给定的药物组合物的核酸和其他组分结合时，能提供所需体积、稠度等。典型的药物赋形剂包括但不限于：粘合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填充剂(例如，乳糖及其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如，淀粉、淀粉羟基乙酸钠等)；和润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠等)。
[0591]
也可以使用与核酸没有有害反应的适于非肠胃外施用的药学可接受的有机或无机赋形剂来配制本发明组合物。适当的药学可接受载体包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
[0592]
核酸的局部施用制剂可以包含无菌和非无菌的水溶液、常用溶剂例如醇中的非水溶液，或核酸在液体或固体油基质中的溶液。该溶液也可以包含缓冲液、稀释剂及其他适当添加剂。可以使用与核酸没有有害反应的适于非肠胃外施用的药学可接受的有机或无机赋形剂。
[0593]
适当的药学可接受赋形剂包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
[0594]
其他组分
[0595]
本发明组合物还可以包含通常在药物组合物中发现的其他附加组分，以本领域确定的使用量存在。因此，例如，该组合物可以包含其他相容的药学活性物质例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可以包含对物理配制本发明组合物的多种剂型有用的其他材料，例如着色剂、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当添加这样的材料时，应当不会不适当地干扰本发明组合物组分的生物活性。该制剂可以灭菌，并且如有必要，与不会有害地与制剂的核酸相互作用的助剂混合，所述助剂例如是润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂、调味剂和/或芳香族物质等。
[0596]
水悬浮液可以包含增加悬浮液粘性的物质，例如包括羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液也可以包含稳定剂。
[0597]
在一些实施方式中，本发明的药物组合物包含(a)一种或多种irna化合物和(b)一种或多种通过非rnai机制起作用的抗细胞因子生物剂。此类生物制品的实例包括干扰lect2和至少一种lect2结合配偶体相互作用的药剂。
[0598]
这些化合物的毒性和治疗效果可以通过例如用于测定ld50(50％的人群死亡的剂量)和ed50(50％的人群治疗有效的剂量)的细胞培养物或实验动物的标准药物方法来测定。毒性与治疗效果的剂量比是治疗指数，其可用比例ld50/ed50来表示。优选显示高治疗指数的化合物。
[0599]
由细胞培养试验和动物研究获得的数据可被用于制定供人使用的剂量范围。本发明的组合物的剂量通常在包含ed50但几乎没有或没有毒性的循环浓度范围内。基于使用的剂型和使用的施用途径，剂量可以在该范围内改变。对于本发明方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以最初从细胞培养试验评估。可以在动物模型中制定剂量以达到该化合物
的循环血浆浓度范围，或者，适当时，达到目标序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，达到降低的多肽浓度)，该范围包含在细胞培养中测定的ic50(即，实现症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)。这种信息可用于更精确地确定人类的有用剂量。血浆水平例如可以通过高效液相色谱法测定。
[0600]
除以上讨论的施用外，本发明的irna可以与有效治疗与lect2表达相关的疾病或病症的其他已知药剂组合施用。在任何情况下，施用医师可以根据使用本领域已知或本文描述的标准效果测定观察到的结果来调整irna施用的剂量和时机。
[0601]
治疗与lect2基因表达相关病症的方法
[0602]
本公开涉及报销lect2的irna在抑制lect2表达和/或治疗与lect2表达相关的疾病、病症或病理过程中的用途。
[0603]
在一个方面中，提供了一种治疗与lect2表达相关的病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本文公开的irna(例如，dsrna)。在一些实施方式中，irna抑制(减少)lect2表达。在一些实施方式中，irna增加lect2表达。
[0604]
如本文所用，“与lect2表达相关的病症”、“与lect2表达相关的疾病”、“与lect2表达相关的病理过程”等包括其中lect2表达改变(例如，相对于正常水平减少或增加)的任何病况、病症或疾病。在一些实施方式中，lect2表达减少。在一些实施方式中，lect2表达增加。在一些实施方式中，lect2表达减少或增加在受试者血液(例如，血浆)中是可检测的。在一些实施方式中，在来自受试者的组织样品中(例如，在肾脏样品或肝脏样品中)可检测到lect2表达的降低或增加。可以相对于在疾病发展之前在同一个体中观察到的水平或相对于没有患有该疾病的一个或多个其他个体来评估降低或增加。减少或增加可能限于身体的特定器官、组织或区域(例如，肾脏或肝脏)。
[0605]
如本文所用，根据本文所述方法治疗的“受试者”包括人或非人动物，例如，哺乳动物。哺乳动物可以是，例如，啮齿类(例如，大鼠或小鼠)或灵长类(例如，猴)。在一些实施方式中，所述受试者是人。
[0606]“有需要的受试者”包括患有、疑似患有与lect2表达相关的病症或有发展与lect2表达相关的病症的风险的受试者。在一些实施方式中，所述受试者患有或疑似患有与lect2表达相关的病症。在一些实施方式中，所述受试者有发展与lect2表达相关的病症的风险。
[0607]
在一些实施方式中，所述受试者是充当与lect2表达相关的疾病(例如，lect2淀粉样变性)模型的动物。
[0608]
lect2淀粉样变性
[0609]
在一些实施方式中，与lect2表达相关的病症是淀粉样变性，例如，lect2淀粉样变性。已在若干临床研究中描述了lect2淀粉样变性。参见，例如，benson,m.d.等，(2008)kidney international,74:218-222；murphy,c.l.等，(2010)am j kidney dis,56(6):1100-1107；larsen,c.p.等，(2010)kidney int.,77(9):816-819；holanda,d.g.等，(20011)nephrol.dial.transplant.,26(1):373-376；以及sethi,s.等，(2012)kidney international 82,226
–
234(在下文中称为sethi等)。
[0610]
lect2淀粉样变性的临床和病理特征与淀粉样蛋白轻链(al)淀粉样变性相似。这些症状包括例如肾病和肾衰竭的症状，例如，体液潴留、肿胀和呼吸急促。淀粉样变性可能影响心脏、周围神经系统、胃肠道、血液、肺和皮肤。心脏并发症包括例如心力衰竭和心律不
齐。其他症状包括例如中风、胃肠道病症、肝脏肿大、脾功能减退、肾上腺和其他内分泌腺功能减退、皮肤颜色变化或生长、肺部问题、出血和瘀伤问题、疲劳和体重减轻。在一些实施方式中，本文所述的方法与本文所述的一种或多种症状的改善有关。
[0611]
例如，在以下描述了用于诊断淀粉样变性的方法，例如，lect2淀粉样变性，leung,n.等，(2010)blood，2012年09月04日线上发表；doi 10.1182/blood-2012-03-413682；shiller,s.m.等，(2011)。laboratory methods for the diagnosis of hereditary amyloidoses,amyloidosis-mechanisms and prospects for therapy,dr.svetlana sarantseva(编著)，isbn:978-953-307-253-1；sethi等，(见上文)和美国专利申请公开号20100323381。
[0612]
根据sethi等提供的结果，lect2淀粉样变性占肾淀粉样变性病例的很大比例。参见sethi等的表1，其显示了通过激光显微切割和肾活检和/或肾切除标本的质谱研究的127例肾淀粉样变性病例中有26例被确定为lect2淀粉样蛋白类型。sethi等还报道了载脂蛋白e蛋白和血清淀粉样蛋白p成分(sap)也存在于所有lect2淀粉样变性病例中。
[0613]
在一些实施方式中，淀粉样变性(例如，lect2淀粉样变性)涉及全身性淀粉样蛋白沉积。在一些实施方式中，淀粉样变性(例如，lect2淀粉样变性)完全或主要位于特定组织或器官(例如，肾或肝)。
[0614]
在一些实施方式中，淀粉样变性(例如，lect2淀粉样变性)是遗传性的。
[0615]
在一些实施方式中，lect2淀粉样变性是通过对来自受试者的样品(例如，活检样品)的分析来诊断的。在一些实施方式中，活检样品是肾活检。在一些实施方式中，样品是肾切除样品。在一些实施方式中，样品来自肝活检或来自其他切除的肝组织。在一些实施方式中，使用选自免疫组织化学、lect2免疫测定、电子显微镜、激光显微切割和质谱法中的一种或多种的方法分析样品。在一些实施方式中，lect2淀粉样变性是使用激光显微切割和质谱法诊断的。
[0616]
在一些实施方式中，淀粉样变性(例如，lect2淀粉样变性)影响肾脏，例如，涉及肾脏中的淀粉样蛋白沉积。在一些实施方式中，淀粉样变性会损害肾功能。在一些实施方式中，所述受试者具有体液潴留、肿胀和呼吸急促中的一种或多种。在一些实施方式中，所述受试者患有肾病综合征。在一些实施方式中，所述受试者具有蛋白尿。在一些实施方式中，所述受试者患有肾衰竭。
[0617]
在一些实施方式中，淀粉样变性(例如，lect2淀粉样变性)影响肝脏，例如，涉及肝脏中的淀粉样蛋白沉积。在一些实施方式中，淀粉样变性会损害肝功能。在一些实施方式中，所述受试者患有肝炎，例如，慢性肝炎。在一些实施方式中，肝炎是病毒性肝炎。
[0618]
已发现lect2淀粉样变性在墨西哥裔美国人中特别普遍，并且还与lect2基因的g等位基因的纯合性有关，该基因在成熟蛋白质的第40位(未加工蛋白中的氨基酸58)处编码缬氨酸。参见，例如，benson,m.d.等，(2008)kidney international,74:218-222；murphy,c.l.等，(2010)am j kidney dis,56(6):1100-1107。
[0619]
在一些实施方式中，所述受试者是墨西哥血统。在一些实施方式中，所述受试者是墨西哥裔美国人。
[0620]
在一些实施方式中，所述受试者携带lect2基因的g等位基因，该基因在成熟蛋白的第40位(未加工蛋白中的氨基酸58)处编码缬氨酸。在一些实施方式中，所述受试者是g等
位基因的纯合子(g/g基因型)。在一些实施方式中，在受试者中表达的lect2蛋白在成熟蛋白的第40位(或在未加工蛋白中的氨基酸58)具有缬氨酸。
[0621]
在一些实施方式中，所述方法降低lect2表达。在一些实施方式中，相对于治疗前同一个体的水平评估lect2表达的降低。在一些实施方式中，通过比较治疗受试者(或受试者组)中的lect2表达水平与对照受试者(或受试者组)，例如，未治疗受试者(或受试者组)或使用对照治疗(例如，不针对lect2的irna(例如，dsrna))的受试者(或受试者组)的水平，显示该方法降低lect2表达。
[0622]
在一些实施方式中，该方法减少淀粉样蛋白沉积，例如，包含lect2蛋白或其部分的淀粉样蛋白的沉积。在一些实施方式中，蛋白是野生型蛋白。在一些实施方式中，蛋白是人lect2蛋白或其部分，其在第40位(成熟的分泌蛋白的第40位，或在未加工蛋白的氨基酸58处，如本文所述)处包含缬氨酸。在一些实施方式中，该方法减少淀粉样蛋白沉积物的尺寸、数量和/或程度。
[0623]
在一些实施方式中，该方法减少与淀粉样蛋白沉积相关的一个或多个症状。
[0624]
在一些实施方式中，dsrna以将dsrna靶向特定器官或组织的形式施用以抑制器官或组织中的淀粉样蛋白沉积。
[0625]
在一些实施方式中，dsrna靶向肝脏。在一些实施方式中，dsrna与将dsrna靶向肝脏(例如，肝细胞)的配体，例如，galnac配体(例如，如本文所述的galnac配体)缀合。
[0626]
本文还提供了一种减少淀粉样蛋白沉积的方法，所述方法包括向有需要的受试者(例如，患有、疑似患有lect2淀粉样变性或有发展lect2淀粉样变性风险的受试者)施用如本文公开的dsrna。在一些实施方式中，该方法减少(例如，阻止或减小)淀粉样蛋白沉积物的尺寸、数量和/或程度。淀粉样蛋白沉积物的尺寸、数量和/或程度可以使用本领域公知的任何方法(例如，免疫测定、免疫组织化学、质谱)来评估。淀粉样蛋白沉积的减少可以涉及淀粉样蛋白沉积(例如，淀粉样蛋白沉积物的尺寸、数量和/或程度)减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。
[0627]
在本文提供的方法中，irna(例如，dsrna)及其组合物以治疗有效量施用。例如，可以通过与适当的对照进行比较来确定施用lect2 sirna的治疗作用。例如，通过对例如淀粉样变性(例如，lect2淀粉样变性)患者组中的任何适当参数(例如，评估淀粉样蛋白沉积的尺寸、数量或程度的参数)与适当对照组中的相同参数进行比较，可以确定淀粉样蛋白沉积的抑制。对照组(例如，交叉设计中的一组相似个体或同一组个体)可以包括，例如，未治疗人群、已使用常规治疗治疗的人群；已使用安慰剂或非靶向irna治疗的人群；等等。
[0628]
类风湿性关节炎
[0629]
类风湿性关节炎也是与lect2表达相关的病症。特别是，在日本人群中，发现在成熟蛋白的第40位(或未加工蛋白的氨基酸58)处具有编码异亮氨酸的lect2基因的一个a等位基因会增加发展成类风湿性关节炎的总体风险。具有两个a等位基因与疾病严重程度密切相关。参见，kameoka,y.等，(2000)arth rheum,43(6):1419-20。
[0630]
在本文提供的方法一个实施方式中，与lect2表达相关的病症是类风湿性关节炎。在一个实施方式中，dsrna在患有类风湿性关节炎的受试者中抑制lect2表达。在一些此类实施方式中，dsrna抑制滑膜组织和/或滑液衍生细胞(例如，单核细胞和成纤维细胞)中的lect2表达。在一些实施方式中，dsrna靶向编码成熟蛋白第40位(在未加工蛋白中的氨基酸
58)处的异亮氨酸的mrna。
[0631]
肝损伤
[0632]
lect2表达可在急性肝损伤期间增加。
[0633]
在本文提供的方法一个实施方式中，与lect2表达相关的病症是急性肝损伤。在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)调节(例如，增加或减少)lect2表达。在一些实施方式中，irna调节肝脏中的lect2表达。在一些实施方式中，irna减少在肝脏中的lect2表达。在一些实施方式中，irna增加在肝脏中的lect2表达。
[0634]
组合疗法
[0635]
在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)与第二疗法(例如，一种或多种其他疗法)组合施用，所述第二疗法已知有效治疗与lect2表达相关的病症(例如，lect2淀粉样变性)或此类病症的症状。irna可以在第二疗法之前、之后或同时施用。在一些实施方式中，irna在第二疗法之前施用。在一些实施方式中，irna在第二疗法之后施用。在一些实施方式中，irna与第二疗法同时施用。
[0636]
第二疗法可以是其他治疗剂。irna和其他治疗剂可以在同一组合物中施用，或者其他治疗剂可以作为单独组合物的一部分施用。
[0637]
在一些实施方式中，第二疗法是有效治疗病症或病症的症状的非irna治疗剂。
[0638]
在一些实施方式中，待通过本文公开的组合物或方法治疗的病症是影响肾功能的lect2淀粉样变性，例如，通过在肾脏中的淀粉样蛋白沉积影响。在一些此类实施方式中，irna与支持肾功能的疗法(例如，透析、利尿剂、血管紧张素转换酶(ace)抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂(arb)或透析)联合施用。
[0639]
在一些实施方式中，待通过本文公开的组合物或方法治疗的病症是涉及肝脏中淀粉样蛋白沉积的lect2淀粉样变性。在一些此类实施方式中，irna与支持肝功能的疗法联合施用。
[0640]
在一些实施方式中，待通过本文公开的组合物或方法治疗的病症是lect2淀粉样变性，并且irna与切除受淀粉样变性影响的一个或多个器官的全部或部分(例如，切除受淀粉样变性影响的全部或部分肾或肝组织)联合施用。除去任选地与替代全部或部分除去的器官一起进行(例如，与肾或肝器官移植一起进行)。
[0641]
施用剂量、途径和时机
[0642]
可以向受试者(例如，人受试者，例如，患者)施用治疗量的irna。治疗量可以是例如0.05-50mg/kg。例如，治疗量可以是0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0或2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50mg/kg dsrna。
[0643]
在一些实施方式中，配制用于向靶器官(例如，向肝脏)递送的irna。
[0644]
在一些实施方式中，将irna配制成脂质制剂，例如，如本文所述的lnp制剂。在一些此类实施方式中，治疗量是0.05-5mg/kg，例如，0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0mg/kg dsrna。在一些实施方式中，脂质制剂(例如，lnp制剂)是通过静脉内施用的。在一些实施方式中，将irna(例如，dsrna)配制成lnp制剂，并以0.1至0.5mg/kg的剂量施用(例如，静脉内施用)。
[0645]
在一些实施方式中，irna在一段时间内通过静脉内输注施用，如在5分钟、10分钟、15分钟、20分钟或25分钟的时间段内。
[0646]
在一些实施方式中，irna是如本文所述的galnac缀合物形势。在一些此类实施方式中，治疗量是0.5-50mg，例如，0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50mg/kg dsrna。在一些实施方式中，galnac缀合物是皮下施用的。在一些实施方式中，irna(例如，dsrna)是galnac缀合物形势，并以1至10mg/kg的剂量施用(例如，皮下施用)。
[0647]
在一些实施方式中，施用是例如定期重复的，如每天、每两周(即，每两周)，持续一个月、两个月、三个月、四个月或更长时间。在初始治疗方案之后，可以以较低频率进行治疗。例如，每两周施用一次持续三个月后，可以每月重复施用一次，持续六个月或一年或更长时间。
[0648]
在一些实施方式中，irna药剂以两剂或更多剂施用。在一些实施方式中，后续剂量的数量或量取决于所需效果的实现情况，例如，淀粉样蛋白沉积的抑制，或治疗或预防效果的实现情况，例如，与病症相关的一种或多种症状的减轻或预防。
[0649]
在一些实施方式中，按照时间表施用irna药剂。例如，irna药剂可以每周一次、每周两次、每周三次、每周四次或每周五次施用。在一些实施方式中，时间表包括有规律的间隔施用，例如，每小时、每四小时、每六小时、每八小时、每十二小时、每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每周、每两周或每月一次。在一些实施方式中，irna药剂以达到所需效果所需的频率施用。
[0650]
在一些实施方式中，时间表涉及间隔很近的施用，然后是更长的时间段，在此期间不施用。例如，时间表可以包括在相对较短的时间内(例如，大约每6小时、大约每12小时、大约每24小时、大约每48小时或大约每72小时)施用的一组初始剂量，然后是更长时间段(例如，约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周或约8周)期间不施用irna药剂。在一个实施方式中，rna药剂最初每小时施用一次，后来以更长的间隔施用(例如，每天、每周、每两周或每月)。在另一个实施方式中，irna药剂最初每天施用，后来以更长间隔施用(例如，每周、每两周或每月)。在某些实施方式中，更长的时间间隔随着时间的推移而增加，或者是根据所期望的效果的实现来确定的。
[0651]
在施用全剂量irna之前，可以向患者施用更小剂量，如5％输注剂量，并监测不良反应，如过敏反应或者升高的脂质水平或血压。在另一个实例中，可以监测患者的不良影响。
[0652]
用于调节lect2基因表达的方法
[0653]
在又一个方面中，本公开提供了一种用于调节(例如，抑制或激活)lect2基因表达的方法，例如，在细胞中或在受试者中。在一些实施方式中，细胞是离体、体外或体内。在一些实施方式中，细胞在肝脏(例如，肝细胞)中。在一些实施方式中，细胞是在受试者(例如，哺乳动物，比如例如，人)中。在一些实施方式中，如本文所述，所述受试者(例如人)有被诊断为与lect2表达相关的病症的风险或者被诊断为与lect2表达相关的病症。
[0654]
在一个实施方式中，该方法包括将细胞与如本文所述的irna接触，irna的量可有效降低细胞中lect2基因表达。如本文所用，“接触”包括直接接触细胞，以及间接接触细胞。例如，当向受试者施用包含irna的组合物(例如，静脉内或皮下)时，可以接触受试者内的细胞。
[0655]
lect2基因表达可以基于lect2 mrna、lect2蛋白的表达水平或与lect2基因的表
达水平在功能上相关的另一个参数的水平来评估。在一些实施方式中，lect2表达被抑制至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一些实施方式中，irna具有0.001-0.01nm、0.001-0.10nm、0.001-1.0nm、0.001-10nm、0.01-0.05nm、0.01-0.50nm、0.02-0.60nm、0.01-1.0nm、0.01-1.5nm、0.01-10nm范围内的ic
50
。ic50值可以相对于适当的对照值标准化，例如，非靶向irna的ic
50
。
[0656]
在一些实施方式中，该方法包括将如本文所述的irna引入细胞并将细胞维持足够的时间以获得lect2基因的mrna转录物的降解，从而抑制细胞中lect2基因表达。
[0657]
在一个实施方式中，该方法包括向哺乳动物施用本文所述的化合物(例如，包含靶向lect2的irna的化合物)，以使得靶lect2基因表达减少如延长的持续时间，例如，至少两、三、四天或更长时间，例如，一周、两周、三周或四周或更长时间。在一些实施方式中，lect2表达的降低在首次施用后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时或24小时内可检测到。
[0658]
在另一个实施方式中，该方法包括向哺乳动物施用如本文所述的组合物，以使得与未治疗的动物相比，靶lect2基因表达增加例如至少10％。在一些实施方式中，lect2的激活在延长的持续时间内发生，例如，在至少两天、三天、四天或更长时间，例如，一周、两周、三周、四周或更长时间。不希望受到理论的束缚，irna可以通过稳定lect2 mrna转录物，与基因组中的启动子相互作用和/或抑制lect2表达的抑制剂来激活lect2表达。
[0659]
可用于本公开的方法和组合物的irna特异性靶向lect2基因的rna(初级或加工的)。可以如本文别处所述制备和实施使用irna抑制lect2基因表达的组合物和方法。
[0660]
在一个实施方式中，该方法包括施用含有irna的组合物，其中irna包含与待治疗的受试者例如哺乳动物例如人的lect2基因的rna转录物的至少一部分互补的核苷酸序列。可以通过本领域公知的任何适当的方式施用组合物，包括但不限于口服、腹膜内或胃肠外途径，包括颅内(例如，心室内、实质内和鞘内)、静脉内、肌肉内、皮下、透皮、气道(气溶胶)、鼻腔、直肠和局部(包括口腔和舌下)施用。
[0661]
在某些实施方式中，组合物通过静脉输注或注射施用。在一些此类实施方式中，组合物包含用于静脉内输注的脂质配制的sirna(例如，lnp制剂，如lnp11制剂)。
[0662]
在其他实施方式中，组合物是皮下施用的。在一些此类实施方式中，组合物是与galnac配体缀合的irna。在一些此类实施方式中，配体将irna靶向至肝脏(例如，肝细胞)。
[0663]
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语和本发明所属领域的技术人员通常所理解的具有相同意义。虽然本文描述的方法和材料的类似或等效物可用于实施或测试本发明的irna和方法，但适当的方法和材料描述如下。本文所提到的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献以引用方式全部合并于此。如果冲突，以本说明书包括定义为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的而非限制性的。具体实施方式
[0664][0665]
1.一种用于抑制lect2表达的双链核糖核酸(dsrna)，其中所述dsrna包含有义链和反义链，所述反义链包含对于lect2 rna转录物的互补区，其中所述反义链包含与表2a-2b、3a-3b、6或7中列出的反义序列之一相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，或其
药学上可接受的盐。
[0666]
2.一种用于抑制lect2表达的双链核糖核酸(dsrna)，其中所述dsrna包含长度为15-30个核苷酸的有义链和长度为15-30个核苷酸的反义链，并且所述反义链与表2a、2b、3a、3b、6或7中列出的靶序列的至少15个连续核苷酸互补，或其药学上可接受的盐。
[0667]
3.根据实施方式1或权利要求2所述的dsrna，其中所述dsrna包含至少一个修饰的核苷酸。
[0668]
4.根据实施方式3所述的dsrna药剂，其中不超过五个有义链的核苷酸和不超过五个反义链的核苷酸是未修饰的核苷酸。
[0669]
5.根据实施方式3所述的dsrna药剂，其中所述有义链的全部所述核苷酸和所述反义链的全部所述核苷酸包含修饰。
[0670]
6.根据前述实施方式中任一项所述的dsrna，其中所述dsrna包含长度为15-30个碱基对的双链体区。
[0671]
7.根据实施方式6所述的dsrna，其中所述双链体区的长度为17-25个碱基对。
[0672]
8.根据实施方式6或实施方式7所述的dsrna，其中所述双链体区的长度为19-22个碱基对。
[0673]
9.根据实施方式6-8中任一项所述的dsrna，其中所述双链体区的长度为21个碱基对。
[0674]
10.根据前述实施方式中任一项所述的dsrna，其中所述反义链包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与来自表2a、2b、3a、3b、6或7的任一个中列出的反义序列之一相比具有0、1、2或3个错配的至少15个连续的核苷酸。
[0675]
11.根据前述实施方式中任一项所述的dsrna药剂，其中所述有义链包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与来自表2a、2b、4a、4b、5a、5b、6a或6b的任一个中列出的对应于所述反义序列的有义序列之一相比具有0、1、2或3个错配的至少15个连续的核苷酸。
[0676]
12.根据前述实施方式中任一项所述的dsrna，其中所述反义链包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与来自表2a、2b、3a、3b、6或7的任一个中列出的反义序列之一相比具有0、1、2或3个错配的至少17个连续的核苷酸。
[0677]
13.根据前述实施方式中任一项所述的dsrna药剂，其中所述有义链包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与来自表2a、2b、4a、4b、5a、5b、6a或6b的任一个中列出的对应于所述反义序列的有义序列之一相比具有0、1、2或3个错配的至少17个连续的核苷酸。
[0678]
14.根据前述实施方式中任一项所述的dsrna，其中所述反义链包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与来自表2a、2b、3a、3b、6或7的任一个中列出的反义序列之一相比具有0、1、2或3个错配的至少19个连续的核苷酸。
[0679]
15.根据前述实施方式中任一项所述的dsrna药剂，其中所述有义链包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与来自表2a、2b、4a、4b、5a、5b、6a或6b的任一个中列出的对应于所述反义序列的有义序列之一相比具有0、1、2或3个错配的至少19个连续的核苷酸。
[0680]
16.根据前述实施方式中任一项所述的dsrna，其中所述反义链包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与来自表2a、2b、3a、3b、6或7的任一个中列出的反义序列之一相比具有0、1、2或3个错配的至少21个连续的核苷酸。
[0681]
17.根据前述实施方式中任一项所述的dsrna药剂，其中所述有义链包含核苷酸序
列，所述核苷酸序列包含与来自表2a、2b、4a、4b、5a、5b、6a或6b的任一个中列出的对应于所述反义序列的有义序列之一相比具有0、1、2或3个错配的至少21个连续的核苷酸。
[0682]
18.根据实施方式1-17中任一项所述的dsrna，其中所述互补区的长度为至少17个核苷酸。
[0683]
19.根据实施方式1-18中任一项所述的dsrna，其中所述互补区的长度为21至25个核苷酸之间。
[0684]
20.根据实施方式1-19中任一项所述的dsrna，其中所述互补区的长度为23个核苷酸。
[0685]
21.根据前述实施方式中任一项所述的dsrna，其中每条链长度不超过30个核苷酸。
[0686]
22.根据前述实施方式中任一项所述的dsrna，其中至少一条链包含至少1个核苷酸或2个核苷酸的3’突出端。
[0687]
23.根据前述实施方式中任一项所述的dsrna，其中dsrna包含平末端。
[0688]
24.根据实施方式3-23中任一项所述的dsrna，其中至少一个所述修饰的核苷酸选自以下：2
’‑
o-甲基修饰的核苷酸、包含5’硫代磷酸酯基团的核苷酸，以及与胆固醇衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸。
[0689]
25.根据实施方式3-24中任一项所述的dsrna，其中至少一个所述修饰的核苷酸选自以下：2
’‑
脱氧-2
’‑
氟修饰的核苷酸、2
’‑
脱氧修饰的核苷酸、锁定核酸(lna)、无环核苷酸、脱碱基核苷酸、乙二醇核苷酸(gna)、2
’‑
氨基修饰的核苷酸、2
’‑
烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然碱基的核苷酸。
[0690]
26.根据实施方式3-25中任一项所述的dsrna，其中在所述核苷酸上的修饰选自以下：锁定核酸(lna)、无环核苷酸、己糖醇或己糖核酸(hna)、环己烯核酸(cena)、乙二醇核酸(gna)、2
’‑
甲氧基乙基、2
’‑
o-烷基、2
’‑
o-烯丙基、2
’‑
c-烯丙基、2
’‑
氟、2
’‑
o-甲基、2
’‑
脱氧、2
’‑
羟基及其组合。
[0691]
27.根据实施方式3-26中任一项所述的dsrna，其中在所述核苷酸上的修饰是2
’‑
o-甲基、2
’‑
氟或者这两者以及任选地gna。
[0692]
28.根据实施方式3-27中任一项所述的dsrna，其中不超过五个所述有义链核苷酸和不超过五个所述反义链核苷酸包含除2
’‑
o-甲基修饰的核苷酸、2
’‑
氟修饰的核苷酸、2
’‑
脱氧修饰的核苷酸、锁定核酸(una)或甘油核酸(gna)以外的修饰。
[0693]
29.根据前述实施方式中任一项所述的dsrna，其中所述药剂包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。
[0694]
30.根据实施方式29所述的dsrna药剂，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键在一条链的3’末端。
[0695]
31.根据实施方式30所述的dsrna药剂，其中所述链是所述反义链。
[0696]
32.根据实施方式30所述的dsrna药剂，其中所述链是所述有义链。
[0697]
33.根据实施方式30所述的dsrna药剂，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键在一条链的5’末端。
[0698]
34.根据实施方式33所述的dsrna药剂，其中所述链是所述反义链。
[0699]
35.根据实施方式33所述的dsrna药剂，其中所述链是所述有义链。
[0700]
36.根据实施方式29所述的dsrna药剂，其中一条链的每个所述5’末端和3’末端包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。
[0701]
37.根据实施方式36所述的dsrna药剂，其中所述链是所述反义链。
[0702]
38.根据前述实施方式中任一项所述的dsrna药剂，其中在所述双链体的所述反义链的所述5’末端1位处的所述碱基对是au碱基对。
[0703]
39.根据实施方式36所述的dsrna药剂，其中所述有义链具有总共21个核苷酸和所述反义链具有总共23个核苷酸。
[0704]
40.根据前述实施方式中任一项所述的dsrna，其中所述有义链与至少一个配体缀合。
[0705]
41.根据实施方式40所述的dsrna，其中所述配体附接至所述有义链的所述3’末端。
[0706]
42.根据实施方式40或实施方式41所述的dsrna，其中所述配体包含碳水化合物。
[0707]
43.根据实施方式40-42中任一项所述的dsrna，其中所述配体是galnac配体。
[0708]
44.根据实施方式40-43中任一项所述的dsrna，其中所述配体是
[0709][0710]
45.根据实施方式40-44中任一项所述的dsrna，其中所述配体是通过接头附接的。
[0711]
46.根据实施方式45所述的dsrna，其中所述接头是二价或三价支链接头。
[0712]
47.根据实施方式45所述的dsrna，其中所述配体和接头如式xxiv中所示：
[0713][0714]
48.根据实施方式40-47中任一项所述的dsrna，其中所述配体将所述dsrna靶向至肝细胞。
[0715]
49.根据前述实施方式中任一项所述的dsrna，其中所述互补区由选自表2a-2b、3a-3b、6或7中公开的反义序列的反义序列组成。
[0716]
50.根据前述实施方式中任一项所述的dsrna，其中所述dsrna包含有义链和反义链，所述有义链由选自表2a-2b、3a-3b、6或7中公开的有义序列的有义序列组成，和反义链
由选自表2a-2b、3a-3b、6或中公开的反义序列的反义序列组成。
[0717]
51.一种用于抑制lect2表达的双链核糖核酸(dsrna)，其中所述dsrna包含有义链和反义链，所述反义链包含对于lect2 rna转录物的互补区，其中所述有义链包含gsgsucagafucfufufcaaaauaaaul96(seq id no:143)的序列和全部修饰，和所述反义链包含asufsuuaufuufufgaagafucfugaccsgsg(seq id no:144)的序列和全部修饰。
[0718]
52.一种用于抑制lect2表达的双链核糖核酸(dsrna)，其中所述dsrna包含有义链和反义链，所述反义链包含对于lect2 rna转录物的互补区，其中所述互补区基本上与seq id no:1的核苷酸669-691互补。
[0719]
53.一种细胞，其包含根据前述实施方式中任一项所述的dsrna。
[0720]
54.一种人细胞，与其他相似的未处理细胞相比，所述人细胞包含降低的lect2 mrna水平或lect2蛋白水平，其中任选地所述水平降低至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
[0721]
55.根据实施方式30a所述的人细胞，其通过包括使所述人细胞与实施方式1-52中任一项所述的dsrna药剂接触的方法产生。
[0722]
56.一种用于抑制lect2基因表达的药物组合物，所述组合物包含实施方式1-52中任一项所述的dsrna。
[0723]
57.根据实施方式56所述的药物组合物，其中在非缓冲溶液中施用dsrna。
[0724]
58.根据实施方式57所述的药物组合物，其中所述非缓冲溶液是盐水或水。
[0725]
59.根据实施方式56所述的药物组合物，，其中使用缓冲溶液施用所述dsrna。
[0726]
60.根据实施方式59所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液包含醋酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐、磷酸盐或其任何组合。
[0727]
61.根据实施方式59或实施方式60所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(pbs)。
[0728]
62.根据实施方式56-61中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含脂质制剂。
[0729]
63.根据实施方式62所述的药物组合物，其中所述脂质制剂是lnp制剂。
[0730]
64.根据实施方式62或实施方式63所述的药物组合物，其中所述脂质制剂是lnp11制剂。
[0731]
65.根据实施方式56-64中任一项所述的药物组合物，其中所述dsrna靶向至肝脏细胞或肝细胞。
[0732]
66.根据实施方式56-65中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物是静脉内施用的。
[0733]
67.根据实施方式56-65中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物是皮下施用的。
[0734]
68.根据实施方式66所述的药物组合物，其中所述组合物包含脂质制剂并且是静脉内施用的。
[0735]
69.根据实施方式56-68中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含与选自碳水化合物配体或galnac配体的配体缀合的dsrna。
[0736]
70.一种在细胞中抑制lect2表达的方法，所述方法包括：
[0737]
(a)接触，例如，将实施方式1-52中任一项所述的dsrna引入所述细胞中，和
[0738]
(b)将步骤(a)的所述细胞维持足够长的时间以获得lect2基因的mrna转录物的降解，从而在所述细胞中抑制所述lect2基因表达。
[0739]
71.一种在细胞中抑制lect2表达的方法，所述方法包括：
[0740]
(a)接触，例如，将实施方式1-52中任一项所述的dsrna引入所述细胞中，和
[0741]
(b)将步骤(a)的所述细胞维持足够长的时间以降低lect2mrna、lect2蛋白或者lect2 mrna或lect2蛋白这两者的水平，从而在所述细胞中抑制所述lect2基因表达。
[0742]
72.根据实施方式70或实施方式71所述的方法，其中离体、在体外或在体内处理所述细胞。
[0743]
73.根据实施方式70-72中任一项所述的方法，其中所述细胞存在于需要治疗、预防和/或控制与lect2表达相关的病症的受试者中。
[0744]
74.根据实施方式73所述的方法，其中所述受试者是人。
[0745]
75.根据实施方式73所述的方法，其中所述病症是淀粉样变性。
[0746]
76.根据实施方式75所述的方法，其中所述淀粉样变性是lect2淀粉样变性。
[0747]
77.根据实施方式70-76中任一项所述的方法，其中所述细胞是肝脏细胞或肝细胞。
[0748]
78.根据实施方式70-77中任一项所述的方法，其中所述lect2表达被抑制至少20％。
[0749]
79.根据实施方式70-78中任一项所述的方法，其中lect2 mrna和/或lect2蛋白表达被抑制至少50％。
[0750]
80.根据实施方式70-79中任一项所述的方法，其中所述lect2表达被抑制至少90％。
[0751]
81.根据实施方式70-80中任一项所述的方法，其中抑制lect2基因表达使得来自所述受试者的生物样品(例如，血清样品)中的lect2蛋白水平降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
[0752]
82.一种治疗与lect2表达相关的病症的方法，其包括向需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的
[0753]
(i)根据实施方式1-52中任一项所述的dsrna或
[0754]
(ii)根据实施方式56-59中任一项所述的药物组合物。
[0755]
83.一种治疗lect2淀粉样变性的方法，其包括向需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的
[0756]
(i)根据实施方式1-52中任一项所述的dsrna或
[0757]
(ii)根据实施方式56-59中任一项所述的药物组合物。
[0758]
84.根据实施方式82或实施方式83所述的方法，其中所述受试者患有淀粉样变性或有发展淀粉样变性的风险。
[0759]
85.根据实施方式82-84中任一项所述的方法，其中所述淀粉样变性是lect2淀粉样变性。
[0760]
86.根据实施方式82-85中任一项所述的方法，其中治疗包括改善所述病症的至少一种体征或症状(例如，其中所述病症是淀粉样变性(例如，lect2淀粉样变性))。
[0761]
87.根据实施方式86所述的方法，其中淀粉样变性(例如，lect2淀粉样蛋白)的至少一种体征或症状包括对淀粉样蛋白的沉积物或者lect2的存在或水平(例如，lect2基因、lect2 mrna或lect2蛋白)进行测量。
[0762]
88.根据实施方式82-87中任一项所述的方法，其中治疗包括预防所述病症的进展。
[0763]
89.根据实施方式82-88中任一项所述的方法，所述治疗包括抑制或减少细胞(例如，肝细胞)中lect2表达或活性。
[0764]
90.根据实施方式89所述的方法，其中所述治疗导致所述细胞中lect2 mrna与基线相比平均减少至少30％。
[0765]
91.根据实施方式89所述的方法，其中所述治疗导致所述细胞中lect2 mrna与基线相比平均减少至少60％。
[0766]
92.根据实施方式89所述的方法，其中所述治疗导致所述细胞中lect2 mrna与基线相比平均减少至少90％。
[0767]
93.根据实施方式82-92中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
[0768]
94.根据实施方式73-93中任一项所述的方法，其中所述dsrna皮下或静脉内施用至所述受试者。
[0769]
95.根据实施方式70-94中任一项所述的方法，其中所述dsrna或包含所述dsrna的组合物是根据给药方案施用的。
[0770]
96.根据实施方式95所述的方法，其中所述给药方案是每周、每两周或每月。
[0771]
97.根据实施方式70-96中任一项所述的方法，其中所述方法减少lect2淀粉样蛋白沉积。
[0772]
98.根据实施方式73-97中任一项所述的方法，其还包括测量所述受试者中lect2(例如，lect2基因、lect2 mrna或lect2蛋白)的水平。
[0773]
99.根据实施方式98所述的方法，其中测量所述受试者中lect2的水平包括测量来自所述受试者的生物样品(例如，组织、血液或血清样品)中lect2基因、lect2 mrna或lect2蛋白的水平。
[0774]
100.根据实施方式73-99中任一项所述的方法，其还包括进行血液测试、成像测试或者肝脏或肾脏活检。
[0775]
101.根据实施方式98-100中任一项所述的方法，其中测量所述受试者中lect2(例如，lect2基因、lect2 mrna或lect2蛋白)的水平在使用所述dsrna药剂或所述药物组合物治疗之前进行。
[0776]
102.根据实施方式101所述的方法，其中，在确定受试者的lect2(例如，lect2基因、lect2 mrna或lect2蛋白)水平高于参考水平之后，向所述受试者施用所述dsrna药剂或所述药物组合物。
[0777]
103.根据实施方式98-102中任一项所述的方法，其中测量所述受试者中lect2(例如，lect2基因、lect2 mrna或lect2蛋白)的水平在使用所述dsrna药剂或所述药物组合物治疗之后进行。
[0778]
104.一种在患有lect2淀粉样变性的受试者中减少lect2淀粉样蛋白沉积的方法，所述方法包括向所述受试者施用
[0779]
(i)根据实施方式1-52中任一项所述的dsrna或
[0780]
(ii)根据实施方式56-49中任一项所述的药物组合物。
[0781]
105.根据实施方式82-104中任一项所述的方法，其中所述dsrna以0.05-50mg/kg的剂量施用。
[0782]
106.根据实施方式82-105中任一项所述的方法，其中所述dsrna以0.01mg/kg至5mg/kg所述受试者体重的浓度施用。
[0783]
107.根据实施方式82-106中任一项所述的方法，其中将所述dsrna配制成lnp制剂，并以0.1mg/kg至0.5mg/kg的剂量施用。
[0784]
108.根据实施方式82-107中任一项所述的方法，其中将所述dsrna缀合物至galnac配体。
[0785]
109.根据实施方式82-108中任一项所述的方法，其中将所述dsrna缀合至galnac配体，并以1mg/kg至10mg/kg的剂量(任选地1mg/kg或3mg/kg的剂量)的剂量施用。
[0786]
110.一种载体，其编码实施方式1-52中任一项所述的dsrna的至少一条链。
[0787]
111.一种细胞，其包含实施方式110所述的载体。
[0788]
实施例
[0789]
实施例1：lect2 sirna
[0790]
本文提供的核酸序列使用标准命名法表示。参见表1的缩写。
[0791]
表1：在核酸序列表示中使用的核苷酸单体的缩写。
[0792]
应当理解的是，当这些单体存在于寡核苷酸中时，其通过5
’‑3’‑
磷酸二酯键相互连接。
[0793]
[0794]
[0795][0796]1l96的化学结构如下所示：
[0797][0798]
实验方法
[0799]
生物信息学
[0800]
转录物
[0801]
一组靶向人lect2的sirna，“白细胞衍生趋化素2”(人类：ncbi refseqid nm_002302.2；ncbi geneid:3950)，以及毒理学物种lect2直系同源物(食蟹猴：xm_005557840；小鼠：nm_010702；大鼠：nm_001108405)是使用定制r和python脚本设计的。人nm_002302refseq mrna，版本2的长度为1077个碱基。这组sirna设计的基本原理和方法如下：从位置10到位置1077的每个潜在19mer sirna的预测有效性是使用线性模型确定的，该线性模型从20,000多种针对大量脊椎动物基因的不同sirna设计中直接测量mrna敲低。将lect2 sirna的子集设计为在人和食蟹猴之间具有完美或接近完美的匹配。将另一个子集设计为与人类、食蟹猴和小鼠lect2直系同源物完美或接近完美匹配。将另一个子集设计为与人类、食蟹猴、小鼠和大鼠lect2直系同源物完美或接近完美匹配。对于sirna的每条链，在强力搜索(brute force search)中使用自定义python脚本来测量sirna与靶物种转录组中所有潜在比对之间错配的数量和位置。对种子区域中的错配给予额外的权重，在本实施例中定义为反义寡核苷酸的位置2-9，以及sirna的切割位点，在此定义为反义寡核苷酸的位置10-11。错配的相对权重为2.8；1.2：1用于种子错配、切割位点和其他位置，直至反义位置19。将第一个位置的不匹配忽略。通过对每个加权错配的值求和来计算每条链的特异性分数。优先考虑其在人类中的反义评分》＝2.2并且预测有效性为》＝50％的lect2转录物敲低的sirna。示例性寡核苷酸对在表2a和表2b(一个集合)以及表3a和表3b(另一个集合)中得到证实。每组的修饰序列分别列于表2a和表3a中。每个集合的未修饰序列分别列于表2b和表3b中。
[0802]
[0803]
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[0819][0820]
实施例2；lect2 sirna的体外筛选
[0821]
实验方法
[0822]
细胞培养和转染:
[0823]
通过将5μl opti-mem加0.1μl lipofectamine rnaimax(invitrogen,carlsbad ca目录号#13778-150)每孔加入5.1μl sirna双链体到384孔板中，独立转染食蟹猴原代肝细胞，然后在室温下孵育15分钟。然后将含有5x103个原代食蟹猴肝细胞的40μl invitrogro cp培养基(bioivt目录号#z99029)添加到sirna混合物中。在rna纯化之前，将细胞孵育24小时。单剂量实验在10nm最终双链体浓度下进行。
[0824]
rna分离:
[0825]
在biotek-el406平台上使用dynabead(invitrogen，目录号#61012)使用自动化方案分离总rna。简言之，将70μl裂解/结合缓冲液和10μl含有3μl磁珠的裂解缓冲液添加到含有细胞的板中。将板在电磁振荡器上在室温下孵育10分钟，然后捕获磁珠并去除上清液。然后用150μl洗涤缓冲液a洗涤珠结合的rna 2次，并用洗涤缓冲液b洗涤一次。然后用150μl洗脱缓冲液洗涤小珠，重新捕获并去除上清液。
[0826]
cdna合成:
[0827]
使用abi高容量cdna逆转录试剂盒(applied biosystems,foster city,ca，目录号#4368813)合成cdna。每个反应将含有1.2μl 10x缓冲液、0.48μl 25x dntp、1.2μl 10x随机引物、0.6μl逆转录酶、0.6μl rnase抑制剂和7.92μl h2o的12μl预混液添加到上面分离的rna中。将板密封、混合并在电磁振荡器上在室温下孵育10分钟，然后在37℃下孵育2h。
[0828]
实时pcr:
[0829]
在384孔板(roche目录号#04887301001)的每孔中，将2μl cdna添加到含有0.5μl gapdh taqman探针(hs99999905)、0.5μl lect2探针和5μl lightcycler 480探针预混液(roche目录号#04887301001)的预混液中。用定制的食蟹猴gapdh探针和食蟹猴lect2探针(mf02803673_m1)探测食蟹猴原代肝细胞qpcr。实时pcr在lightcycler480实时pcr系统(roche)中使用δδct(rq)测定进行。在两个独立的转染中测试每个双链体，并将数据标准化为用非靶向对照sirna转染的细胞。为了计算相对倍数变化，使用δδct方法分析实时数据，并将其归一化为用20nm ad-1955转染的细胞或假转染细胞进行的测定。
[0830]
结果
[0831]
表4a(对应于表2a和表2b中的sirna)和表4b(对应于表3a和表3b中的sirna)中显示了用两组示例性lect2 sirna在原代猴肝细胞中单剂量筛选的结果。单剂量实验在10nm最终双链体浓度下进行，数据表示为相对于ad-1955非靶向对照的剩余信息百分比。
[0832]
表4a:使用一组示例性lect2 sirna的食蟹猴lect2内源性体外10nm筛选
[0833]
[0834]
[0835][0836]
表4b：使用另一组示例性lect2 sirna的食蟹猴lect2内源性体外10nm筛选
[0837]
[0838][0839]
实施例3:lect2 sirna的体内筛选
[0840]
在啮齿类aav模型中三个示例性lect2 sirna的药效学
[0841]
在啮齿类aav模型中研究的三种示例性lect2 sirna、ad-454781、ad-1333461和
ad-454746的序列和化学性质如图2中所示。使用人lect2构建体静脉内注射野生型b6/c57小鼠(charles rivers laboratory)，所述人lect2构建体是在肝脏特异性启动子tbg下在aav8病毒颗粒中包装的(2x10
11 gc/小鼠)。两周后，向小鼠皮下注射2mg/kg图2中所示的三种lect2 sirna之一，或pbs对照。在治疗后第14天，收获肝脏，用于使用特异性识别lect2的探针进行qpcr分析(如在实施例2中所描述的进行)。将小鼠gapdh用作标准化对照。用δδct方法计算肝脏中人lect2 mrna的相对水平，归一化为pbs对照组，并以lect2剩余百分比描绘在图3中的y轴上。如图3中所示，ad-454746sirna的施用导致lect2肝脏mrna减少约70％；ad-133461sirna导致减少60％；而ad454781sirna导致的降幅最大，为约80％。
[0842]
还从用sirna或pbs对照处理的小鼠采集全血。在治疗前和治疗后第14天，将全血收集在肝素化管中，以产生肝素血浆。血浆以1:50-1:75稀释并在lect2特异性elisa上进行检测以量化蛋白的循环水平。为了进行elisa，将板在4℃下预包被过夜，使用100μl小鼠抗人lect2捕获抗体(r&d目录号#mab722)，将其稀释至浓度1μg/ml。使用pbs-t洗涤板，在室温下用pbs/3％bsa封闭1小时，然后再洗涤5次。然后，将血浆样品(每孔100μl)添加到板中，并在室温下震荡(～600rpm)孵育1小时。将人血浆标准品(abcam，目录号#ab188467，500ug/ml，批号#gr3202526-3)作为对照。然后，将板洗涤五次，将检测抗体(abd31038.2抗-col_hlect2,fab-max-fh biorad)添加到板(每孔100μl)中，然后在室温下震荡(～600rpm)孵育1小时。随后，将板洗涤5次，将人抗细菌碱性磷酸酶：hrp抗体(bio-rad，目录号#hca275p)添加到孔(每孔100μl)中，然后在室温下震荡(～600rpm)孵育1小时。洗涤板，随后添加tmb试剂(tmb surmodics目录号#tmbs-0100-01)并孵育10分钟。然后，使用100μl硫酸终止溶液(nova-终止溶液，surmodics目录号#astp-0100-01)淬灭该反应，并在450nm下测量吸光度。
[0843]
使用来自lect2特异性elisa的值，血浆lect2蛋白的相对水平通过对给药前的蛋白水平进行归一化来计算，将其描述为在图3中y轴上剩余lect2的百分比。如在图3中所示，ad-454746sirna的施用导致lect2血浆蛋白水平降低约75％；ad-133461sirna导致降低70％；以及ad454781sirna导致的降幅最大，为约80％。
[0844]
在食蟹猴中三个示例性lect2 sirna的药效学
[0845]
以0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg的递增剂量将图2中描述的三个lect2 sirna皮下注射至食蟹猴中(分别为图4a-4c)。在给药前和给药后的不同时间点将血浆收集在肝素化管中，将其描述在图4a-4c的x轴上。通过elisa定量lect2血浆蛋白的循环水平。血浆lect2蛋白的相对水平通过归一化为治疗前的蛋白水平来计算，将其描述为在图4a-4c的y轴上血浆lect2蛋白的敲低。如可以在图4a-4c中所见，在沉默中存在剂量依赖性增加，因为当全部三种lect2 sirna以3mg/kg施用时观察到最高的蛋白水平敲低(图4c)。然而，施用低至0-3mg/kg的每种sirna确实导致lect2蛋白的一些敲低(图4a)。此外，在所施用的全部三个剂量中，ad-454781sirna在治疗后的所有时间点导致蛋白水平的最高敲低(图4a-4c和表5)。对于以1mg/kg或3mg/施用的每种lect2 sirna，在猴治疗后第29天量化的血浆lect2蛋白敲低也总结在下表5中。
[0846]
表5：如通过lect2血浆蛋白水平敲低百分比所测量的在食蟹猴中三个示例性lect2 sirna的有效性和持续时间
[0847][0848][0849]
使用ad-86459和ad-86460sirna在啮齿动物中评估lect2的敲低
[0850]
将lect2 sirna、ad-86459和ad-86460(表6和表7)或者pbs对照皮下注射至sd-1大鼠(图5a)和cd-1小鼠(图5b)。每月以10mg/kg施用实验和对照治疗。首次给药后3、6或12个月收获肝脏。分离肝rna用于qpcr分析(如实施例2所述进行)，使用特异性针对小鼠/大鼠lect2的引物和探针，还使用小鼠/大鼠gapdh，将其作为标准化对照。用δδct方法计算肝脏中啮齿动物lect2 mrna的相对水平，归一化为pbs对照组，并以表达倍数差异描绘在图5a-5b中的y轴上。数据以平均值
±
标准差表示在图5中，每个点表示一只啮齿动物。在大鼠(图5a)和小鼠(图5b)中，ad-86459 sirna和ad-86460 sirna在采样的初始治疗后的所有时间点导致肝脏中的lect2mirna几乎完全敲低。
[0851]
表6：lect2 sirna修饰的序列
[0852][0853]
表7：lect2 sirna未修饰的序列
[0854][0855]
使用ad-81725 sirna在食蟹猴中评估lect2的敲低
[0856]
使用lect2 sirna ad-81725或pbs对照皮下注射食蟹猴(图6a-6b)。每月以3mg/kg施用实验和对照治疗。首次给药后6个月收获肝脏。分离肝rna用于qpcr分析(如实施例2所述进行)，施用特异性针对食蟹猴lect2的引物和探针，还使用食蟹猴gapdh，将其作为标准化对照。用δδct方法计算肝脏中食蟹猴lect2 mrna的相对水平，归一化为pbs对照组，并以表达倍数差异描绘在图6a中的y轴上。数据以平均值
±
标准差表示在图6a中，每个点表示一只猴。ad-81725sirna导致在初始给药后6个月时猴肝脏中lect2 mirna的几乎完全敲低。
[0857]
还在肝素化管中收集全血，治疗前和在初始治疗后的六个月内每月收集一次(图6b)。分离血浆并用于通过对人/食蟹猴lect2蛋白特异的elisa来测量lect2蛋白的循环水平。lect2蛋白的相对水平通过归一化为治疗前蛋白水平来计算，将其描述为在图6b的y轴上剩余的血浆lect2蛋白。ad-81725 sirna导致猴中lect2血浆蛋白水平降低＞99％，这在第一次给药后采样的每个时间点都观察到(图6b)。
[0858]
等同物
[0859]
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的本公开的具体实施方式的很多等同物。此类等同物旨在涵盖在下述权利要求中。