一种对光敏感的BV2工具细胞及其构建方法和应用

一种对光敏感的bv2工具细胞及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明涉及细胞生物学领域，特别涉及一种对光敏感的bv2工具细胞及其构建方法和应用。


背景技术：

2.小胶质细胞(microglia)是中枢神经系统(cns)中最小的一种神经胶质细胞，分布于整个中枢神经系统，约占胶质细胞总数的5％-10％。作为常驻中枢神经系统的免疫效应细胞，小胶质细胞隶属于单核吞噬细胞族，被广泛地认为是中枢神经系统的主要免疫效应器，小胶质细胞及其介导的神经炎症在中枢神经系统的损伤及疾病的转归过程中起着非常重要的作用，参与诸如hiv脑病、帕金森病、阿尔兹海默病、多发性硬化等人神经系统紊乱疾病。
3.bv2作为中枢神经系统内的免疫细胞，既可通过吞噬脑组织中的病原体及有害颗粒对神经元起保护作用，又可在致炎因子的作用下，激活成反应性小胶质细胞，分泌炎性细胞因子对神经元起毒性作用，是治疗神经炎症及神经退行性疾病的一个重要靶点。bv2细胞系为blasi等在1990年应用携带癌基因v-raf/v-myc的反转录病毒j2感染原代培养的小鼠小胶质细胞而获得的永生细胞系，该细胞系不仅高度纯化，而且基本具备了原代培养的小胶质细胞的形态学、表型以及各项功能特点，相对较易培养，是世界上目前使用最为广泛的体外研究小胶质细胞的细胞系。
4.传统的影响bv2细胞的兴奋性和调控细胞膜离子通道开放的方法，多通过离子通道的兴奋剂和抑制剂完成，然而，离子通道的兴奋剂和抑制剂多不具有组织特异性和小胶质细胞选择性，具有副作用大等缺点。因此，目前缺乏一种能够被选择性特异调控且可视化的bv2工具细胞。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种对光敏感的bv2工具细胞及其构建方法和应用，所述构建方法通过慢病毒作为载体，携带带有光感基因cheta和荧光基因eyfp的质粒对bv2细胞进行转染，获得一种对光敏感的bv2工具细胞，所述对光敏感的bv2工具细胞在体外研究小胶质细胞的发育、行为和功能方面具有重要意义。
6.本发明提供一种对光敏感的bv2工具细胞的构建方法，包括如下步骤：
7.(1)构建依次连接有启动子、光感基因cheta和黄色荧光标记基因的慢病毒基因载体质粒；所述启动子为cmv、ef1a、iba-1、cx3cr1、cag、tef1中的任意一种，所述黄色荧光标记基因为eyfp；
8.(2)将步骤(1)中所述的慢病毒基因载体质粒和pdelta 8.74辅助质粒、pmd2.g质粒一起转染包装细胞，培养，裂解包装细胞，用氯仿、氯化钠和peg8000纯化，取上清液，所述上清液中含有用于感染bv2细胞的慢病毒，所述慢病毒中包括依次连接的启动子、光感基因cheta和黄色荧光标记基因；本发明的转染步骤中不需要通过脂质体进行转染，可简化实验
操作的流程，节约成本。
9.(3)用步骤(2)中所述慢病毒感染bv2细胞，得到所述对光敏感的bv2工具细胞。通过实验观察，获得的对光敏感的bv2工具细胞中在蓝光刺激下能发出荧光的细胞比例高达100％，全部细胞都能够在蓝光激发下发出绿色荧光。获得的bv2工具细胞可以稳定传代，且在传代过程中荧光不随传代次数增加而减弱，转入的光感基因也不丢失。
10.进一步的，所述步骤(1)中所述的慢病毒基因载体质粒为plenti，所述载体如图2所示。使用cmv作为启动子，后接cheta光感基因，其后接eyfp荧光标记基因。当光感基因cheta表达时，细胞会发出黄色荧光。
11.进一步的，所述步骤(2)中所述的包装细胞为hek293、293t、aav293中的任意一种。
12.进一步的，所述步骤(2)中所述的纯化方法，包括如下步骤：
13.(1)收集所述裂解包装细胞后的细胞悬液，离心弃上清，加入细胞裂解溶液重悬细胞沉淀，反复冻融裂解；
14.(2)离心后，上清液加入氯仿，离心，收集上清；
15.(3)向上清液中分别加入氯化钠和peg8000，孵育；
16.(4)离心，弃上清，用缓冲液重悬沉淀；
17.(5)将重悬液加入氯仿，离心，转移上清；
18.(6)向上清液中分别加入氯化钠和peg8000，孵育；
19.(7)离心，弃上清，加入缓冲液重悬沉淀；
20.(8)加入dna酶和rna酶消化；
21.(9)加氯仿抽提，离心，吸出上层水相，所述上层水相为浓缩和纯化的慢病毒液。
22.进一步的，所述步骤(3)和所述步骤(6)中所述氯化钠的终浓度为0.5m，所述peg8000的终浓度为8％，所述8％为质量体积比。
23.利用所述的纯化方法得到的慢病毒的滴度可达10
10
，以上纯化的条件可以获得很高纯度的慢病毒。
24.本发明还提供一种对光敏感的bv2工具细胞，由所述的构建方法制备得到。
25.本发明还提供所述的对光敏感的bv2工具细胞在体外研究小胶质细胞的发育、行为和功能上的应用。
26.进一步的，所述小胶质细胞的行为包括细胞形态变化和细胞吞噬作用。
27.综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
28.1.本发明的构建方法获得一种对光敏感的转基因bv2工具细胞，使用蓝光(450-490nm)刺激，即可特异性标记和激活光照区域的对光敏感的离体bv2工具细胞。
29.2.本发明的对光敏感的bv2工具细胞无需染色即可方便观察，简化了体外实验操作的流程。
30.3.本发明的对光敏感的bv2工具细胞可以实现bv2细胞的活体可视化，可用于观察活的bv2细胞。
31.4.本发明的对光敏感的bv2工具细胞可以稳定传代，且在传代过程中荧光不随传代次数增加而减弱，转入的光感基因也不丢失。
32.5.本发明的构建方法中无需使用脂质体转染，简化流程，节约成本，纯化方法效果好，获得的慢病毒滴度可以高达10
10
，纯度非常高。
33.6.本发明的对光敏感的bv2工具细胞通过荧光可以准确的与其他细胞区分开，通过光特异性激活，在体外研究小胶质细胞的发育、行为和功能方面具有重要意义。
附图说明
34.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
35.图1为本发明的对光敏感的bv2工具细胞构建方法的流程示意图。
36.图2为携带光感基因cheta和eyfp荧光基因的慢病毒基因载体质粒的示意图，图中启动子为cmv。
37.图3为稳定传代8代的本发明的构建方法获得的对光敏感的bv2工具细胞的yfp免疫荧光染色。荧光显微镜所用激发光波长为473nm，20倍镜下拍摄。绿色：yfp，蓝色：dapi。
38.图4为对光敏感的bv2工具细胞钙信号荧光强度随时间变化的共聚焦图像和统计结果。
39.图5为蓝光刺激对本发明的对光敏感的bv2工具细胞的细胞膜电位产生影响。
具体实施方式
40.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
41.慢病毒(lentivirus)载体是以hiv-1(人类免疫缺陷i型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。本发明中使用慢病毒作为载体，携带带有光感基因cheta和荧光基因eyfp的质粒对bv2细胞进行转染。
42.为了解决普通bv2细胞不能可视化和特异性调控的问题，本发明公开了一种对光敏感的bv2工具细胞及其构建方法和应用，所述构建方法首先构建依次连接有启动子、光感基因cheta和eyfp基因的慢病毒基因载体质粒，所述质粒使用cmv、ef1a、iba-1、cx3cr1、cag、tef1中的任意一种作为启动子，后接eyfp荧光基因。以下实施例中以cmv启动子为例，ef1a、iba-1、cx3cr1、cag、tef1也都可以诱导eyfp基因的表达，与使用cmv具有相同的效果；然后用慢病毒基因载体质粒和pdelta 8.74辅助质粒、pmd2.g质粒共转染包装细胞，pdelta 8.74质粒辅助转染，pmd2.g携带编码病毒外壳蛋白的基因，包装细胞可以是hek293、293t、aav293中的任意一种；随后裂解包装细胞，纯化慢病毒。纯化慢病毒的步骤需要用到氯仿、氯化钠和peg8000，纯化后的慢病毒滴度可达10
10
，说明纯化方法十分高效，获得的慢病毒纯度很高；最后用获得的慢病毒感染bv2细胞，感染后48-72小时用荧光显微镜观察荧光，以上流程图如图1所示。
43.当使用蓝光(450-490nm)刺激，即可特异性激活光照区域bv2细胞。本发明的bv2工
具细胞激活后相关离子通道打开，产生去极化现象，与在体小胶质细胞激活功能相似，且表达黄色荧光蛋白，可以准确地区分本细胞与其他细胞，在体外研究小胶质细胞的发育、行为和功能等方面具有重要意义。由于使用慢病毒载体进行转染，本发明的bv2工具细胞在传代过程中荧光不会随传代次数增加而减弱，光感基因cheta也不会丢失。
44.实施例1构建依次连接有启动子、光感基因cheta和黄色荧光标记基因的慢病毒基因载体质粒
45.设计构建载体所用的dna片段：paci-cmv-cheta-eyfp-ecori，片段两端分别带有paci和ecori的酶切位点，使用paci与ecori两种限制性内切酶进行酶切后与载体质粒进行连接，获得目的慢病毒质粒，所述慢病毒基因载体质粒的结构如图2所示，携带有cmv启动子，后接光感基因cheta和荧光基因eyfp。
46.实施例2慢病毒的构建与获取
47.一.材料和试剂：
48.全培养基：dmen 10％fbs 1％青霉素-链霉素双抗
49.转染培养基：dmem 10％fbs(不加抗体)
50.维持培养基：dmem 2％fbs 1％青霉素-链霉素双抗
51.转染试剂：磷酸钙哺乳动物转染试剂盒(promega公司，e1200)
52.其他试剂：氯喹(sigma，c6628，25g)
53.质粒：慢病毒基因载体质粒(实施例1中制备得到)、pdelta 8.74辅助质粒、pmd2.g质粒(vsvg，外壳蛋白)，共转染3种质粒制备慢病毒。
54.二.慢病毒的构建
55.包括如下步骤：
56.1.用全培养基培养293t细胞；
57.2. 293t细胞接种到20个15cm细胞培养皿里，使细胞融合度为50％左右；
58.3.次日至细胞融合度为90％以上，开始转染。提前1-3h换液，换成20ml转染培养基。然后制备转染复合物(每个培养皿用量)：
59.pdelta 8.74辅助质粒 15μg
60.pmd2.g质粒
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15μg
61.慢病毒基因载体质粒
ꢀꢀ
15μg
62.用930μl无核酸酶的水(试剂盒内提供)混合待转染质粒，充分混合后，加140μl 2m cacl2(试剂盒内提供)；将混合液逐滴加入约1125μl2
×
hbs(试剂盒内提供)调节至与混合液等体积，边加边振荡2
×
hbs，以便迅速混匀；然后室温孵育30min；
63.4.在孵育即将结束前向培养皿的细胞培养基中加入1
‰
25mm氯喹溶液；
64.5.孵育结束后，再次涡旋混匀，并将转染复合物逐滴滴加到293t细胞培养基中，“十”字法轻柔混匀，置于37℃，5％co2培养箱中培养6-8h后，换成20ml维持培养基；
65.6.转染24h后可于荧光显微镜下观察转染情况，48-72h后收集细胞用于慢病毒纯化。
66.三.慢病毒纯化
67.试剂：peg8000(sigma,89510)，hepes(sigma,h3375)，tris-hcl，nacl，cacl2，edta，dna酶和dna酶(或核酸酶)，三氯甲烷(氯仿)
68.慢病毒的纯化包括以下步骤：
69.1.收集包装细胞悬液至500ml离心杯，4℃，3000g离心30min；弃上清，加入2ml(20盘15厘米培养皿)细胞裂解溶液(100mm tris-hcl，150mm nacl，ph 8.0)重悬细胞沉淀，经过四轮反复冻融裂解。用干冰-乙醇浴(-70℃，或者直接放入-80℃冰箱)和37℃水浴，每轮冰冻和融化时间均为10min，每次融化后进行简短涡旋，以促进裂解。
70.2. 4℃，12,000g离心30min后，将上清液转移至干净的1.5ml离心管(～4个)。
71.3.加入等体积氯仿，4℃，12,000g离心5min，收集上清至新的15ml离心管。
72.4.向上清液中分别加入1/5体积3m nacl和40％peg8000溶液至终浓度分别为0.5m nacl和8％peg8000(w/v)，置冰上孵育3h或过夜；
73.5. 4℃，3200g离心30min，弃上清，用1.0-1.5ml hbs(50mm hepes，150mm nacl，25mm edta，ph 8.0)重悬沉淀；
74.6.将重悬液转移至无菌1.5ml离心管(～3个)，加入等体积氯仿，4℃，12,000g离心5min，转移上清至新的1.5ml离心管(～2个)；
75.7.向上清液中分别加入1/5体积3m nacl和40％peg8000溶液至终浓度分别为0.5m nacl和8％peg(w/v)，置冰上孵育3h或过夜；
76.8. 4℃，12000g离心30min，弃上清，加入适量体积(100-150μl)的hbs(50mm hepes，150mm nacl，25mm edta，ph 8.0)重悬沉淀；
77.9.加入dna酶和rna酶至终浓度为1μg/ml，室温下消化30min；
78.10.加等体积氯仿抽提，然后4℃，12,000g离心5min，无菌条件下小心吸出上层水相，即为浓缩和纯化的慢病毒液，定义为终产物。一般为无色澄清液体，可用氯仿再次抽提，以除尽蛋白等杂质；
79.11.分装慢病毒液并储存于-80℃。制备得到的慢病毒携带有cmv启动子，后接光感基因cheta和荧光基因eyfp。
80.实施例3慢病毒转染bv2细胞
81.使用实施例2制备得到的慢病毒，对bv2细胞进行转染，具体操作如下：
82.1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁bv2细胞以1
×
105/孔铺到24孔板中，使用高糖dmem培养基培养，使细胞在慢病毒转染时的数量为2
×
105/孔左右。
83.2、第2天，用含有6μg/ml聚凝胺的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入10-100转染复数的适量慢病毒悬液。37℃孵育。转染复数为病毒的数量/转染的细胞的数量，转染复数小于10转染效率低，高于100细胞无法承受过多病毒而导致死亡，优选转染复数为50。聚凝胺所起的作用为提高细胞膜通透性，可以帮助快速转染。
84.3、4h后加入2ml新鲜培养基以稀释聚凝胺。
85.4、继续培养12h，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
86.5、继续培养，得到对光敏感的bv2工具细胞，进行荧光检测。本发明的对光敏感的bv2工具细胞内含有黄色荧光蛋白，一般转染48h后可见明显荧光表达，72h后更加明显。荧光细胞的比例可高达100％，转染成功后液氮冻存或直接用于实验。
87.实施例4对光敏感的bv2工具细胞的yfp免疫荧光染色
88.用实施例3制备得到的对光敏感的bv2工具细胞传代8代后进行荧光检测，yfp免疫荧光染色后用473nm的蓝光激发，在20倍镜下观察bv2工具细胞的荧光，结果如图3所示，用
dapi染细胞核，细胞核显示出蓝色，图中浅颜色的部分即为细胞核。yfp免疫荧光染色后在细胞膜和细胞质中可观察到绿色荧光，荧光清晰且亮度高，图中以白色区域表示，进而说明cheta基因成功在bv2细胞中特异性表达。此外，并没有因为传代了8次就发生荧光减弱的情况，说明本发明的bv2细胞能够稳定传代，不会因为传代就丢失荧光蛋白和光感基因cheta，所以每次实验的时候无需重新转染细胞，大大简化了实验操作的流程。
89.实施例5对光敏感的bv2工具细胞钙信号荧光强度随时间变化
90.使用钙荧光染料转染本发明的活体bv2工具细胞，图4中以bv2-cmv-cheta-eyfp表示，同时以不携带光感基因cheta的工具细胞作为对照组，图4中以bv2-cmv-gfp表示，图4a为对光敏感的bv2工具细胞钙信号荧光强度随时间变化的共聚焦图像；图4b为对光敏感的bv2工具细胞钙信号荧光强度随时间变化统计分析图。图4b的纵坐标为荧光强度，由图4a可以看出在蓝光刺激下实验组bv2-cmv-cheta-eyfp细胞荧光强度逐渐变高，而对照组bv2-cmv-gfp的荧光强度没有显著的变化。图4b的统计结果与图4a的图片显示的结果一致，在光刺激下实验组bv2-cmv-cheta-eyfp细胞荧光强度逐渐变高，停止光刺激后荧光强度立刻显著下降，说明本发明的对光敏感的bv2工具细胞灵敏度高，而对照组不论有无光照其荧光强度都没有显著变化。因为使用的是钙荧光染料，说明本发明的对光敏感的bv2工具细胞在蓝光刺激下钙离子通道开放，从而产生去极化现象。
91.实施例6光刺激对本发明的对光敏感的bv2工具细胞的细胞膜电位产生影响
92.使用本发明的对光敏感的bv2工具细胞，蓝光刺激同时进行膜片钳记录电信号，观察光刺激对细胞膜电位产生的影响。实验组为本发明的对光敏感的bv2工具细胞，图5中以cheta表示，对照组为不携带光感基因cheta的工具细胞，图5中以gfp表示，左侧第二行为电压振幅，单位为mv，左侧第二行为电流振幅，单位为pa，每5ms进行一次光刺激，图5左侧显示，随着每一次光刺激，本发明的对光敏感的bv2工具细胞的电压和电流就会发生一次变化，波形整齐，严格对应光刺激的时间周期，而不携带光感基因cheta工具细胞的对照组则不显示这种周期性的电压和电流变化，图5右图是电流振幅的统计结果，与左侧的结果一致，以上结果表明本发明的对光敏感的bv2工具细胞可以在体外特异性的光激活，灵敏性高。
93.实施例7本发明的对光敏感的bv2工具细胞的应用实例
94.本发明的对光敏感的bv2工具细胞可用于体外aβ/致炎因子环境下细胞形态变化的观察。aβ是β淀粉样蛋白，有观点认为阿尔兹海默症是由于aβ沉积导致的。小胶质细胞在体外可以呈现出不同的形态，图3中也可以观察到不同形态的bv2工具细胞，有的呈圆形，有的呈梭形，因为bv2工具细胞可以在荧光显微镜下直接看到，不需要进行免疫荧光染色，可以直接活体观察，在bv2工具细胞体系中加入aβ或致炎因子，在需要的时候进行光刺激，就可以轻易的观察到bv2细胞形态的变化，进而对于研究阿尔兹海默症和其他炎症的致病机理提供了方便快捷的手段。
95.本发明的对光敏感的bv2工具细胞可用于体外观察bv2细胞对aβ/荧光小球等的吞噬作用。荧光小球是常用的用来检测吞噬作用的工具，有直径为0.1μm、0.2μm、1μm等不同型号，通过计算细胞内吞噬的荧光小球的数量表征小胶质细胞的吞噬作用，把荧光小球加到本发明的bv2工具细胞的体系中，在需要的时候进行光刺激，就可以在荧光显微镜下观察细胞吞噬的过程以及统计细胞吞噬的荧光小球的动态变化。
96.综上，本发明公开了一种对光敏感的bv2工具细胞及其构建方法和应用，所述构建方法首先构建依次连接有启动子、光感基因cheta和eyfp基因的慢病毒基因载体质粒，所述质粒使用cmv、ef1a、iba-1、cx3cr1、cag、tef1中的任意一种作为启动子，后接光感基因cheta和eyfp荧光基因；然后用慢病毒基因载体质粒和pdelta 8.74辅助质粒、pmd2.g质粒共转染包装细胞，转染过程不需用脂质体；随后裂解包装细胞，纯化慢病毒。纯化后的慢病毒滴度可达10
10
，说明纯化方法十分高效，获得的慢病毒纯度很高；最后用获得的慢病毒感染bv2细胞，感染后48-72小时用荧光显微镜观察荧光，蓝光刺激下能够发出荧光的bv2工具细胞比例可高达100％，且传代8代后荧光强度依然没有减弱。本发明的对光敏感的bv2工具细胞无需染色即可方便观察，简化了体外实验操作的流程，可以实现bv2细胞的活体可视化，可用于观察活的bv2细胞。使用蓝光(450-490nm)刺激，即可特异性激活光刺激区域的bv2工具细胞，bv2工具细胞相关离子通道开放，产生去极化现象。本发明的对光敏感的bv2工具细胞可以在体外特异性的光激活，灵敏性高，与在体小胶质细胞激活功能相似，且表达黄色荧光蛋白，可以准确地区分本发明的bv2工具细胞与其他细胞，在体外研究小胶质细胞的发育、行为和功能等方面具有重要意义。
97.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。