一种维生素诱导的木质素降解酶及提高酶活的方法和应用

1.本发明涉及生物化工领域，具体涉及一种通过添加维生素类诱导物提高木质素降解酶的酶活，从而实现高效生物降解木质素的方法。


背景技术：

2.现如今化石资源消耗越来越严重，生物质作为来源广泛、储量丰富的可再生原料而受到广泛关注。木质素作为第二大可再生的高分子化合物，也是唯一含有苯环的天然高分子化合物。通常木质素作为农业、造纸工业和木材工业的副产物，由于得不到充分利用变成了环境污染物。资源危机和环境污染的日益加剧使人们开始意识到可再生的木质素作为原料生产能源及其他高附加值产品具有很好的前景。
3.木质素是一种由苯丙烷单元组成的不规则、随机交联的聚合物，源自3种芳香醇单体：香豆醇、松柏醇和芥子醇，三种主要单体通过c-c、c-o和β-o-4等化学键连接而成。目前木质素降解主要有物理法、化学法和生物法。物理化学法降解木质素存在能耗高、条件极端、“二次污染”等缺陷，不符合我国可持续发展的生态环境建设和资源利用政策。生物法降解木质素具有条件温和、专一性强、无污染、成本低等特点，并且对微生物生长起抑制作用的物质较少，更具发展优势。
4.真菌被认为在木质素降解过程中扮演着主要作用。对木质素降解效果较突出且研究较深的为白腐真菌，可通过分泌多种木质素降解酶类氧化断裂木质素的化学键而有效降解木质素，其中在这个过程中真菌分泌的木质素降解酶是关键，与木质素降解有关的降解酶以漆酶(laccase,lac)、锰过氧化物酶(manganese peroxidase,mnp)和木质素过氧化物酶(lignin peroxidase,lip)为主，另外还有其他一些辅助酶的作用。
5.真菌分泌的木质素降解酶对木质素降解有很大的帮助，其催化氧化断裂了木质素的化学键，将复杂的木质素大分子裂解为小分子有机物，从而达到降解木质素的目的。在此过程中，最重要的、最关键的是木质素降解酶的酶活，但目前的发酵方法所生产的木质素降解酶酶活较低，这一问题限制了木质素原料的降解利用。而添加诱导物可以有效刺激真菌分泌木质素降解酶，但多数诱导物存在各种各样的缺点，芳香族化合物如香草醛本身含有毒性可能会影响菌株的生长；藜芦醇只对lip的分泌有很大影响，对lac和mnp分泌影响不大，存在只对单一酶有影响、效率低的问题；金属离子如cd
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可能会造成环境污染等，因此研究添加一种能高效无污染诱导真菌产木质素降解酶的诱导物，以此提高真菌产生的木质素降解酶酶活从而实现高效生物降解木质素目标的方法非常重要，而维生素是一种极具优势的诱导物，具有高效环保、易于放大、价格低廉等优势。


技术实现要素：

6.为解决现有技术中存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种通过外源添加维生素诱导物提高木质素降解酶酶活的方法及其应用，通过在培养过程中外源添加维生素类诱导物高效提升木质素降解酶活性，从而有效提高了木质素的生物降解率。该方法具有高
效环保低廉、操作工艺简单、培养条件温和、易于放大生产等优势。
7.本发明是通过下述技术方案来实现的。
8.本发明一方面，提供了一种维生素诱导提高木质素降解酶酶活的方法，包括：
9.将白腐真菌菌株接种到固体培养基上恒温培养，再将培养好的真菌接种至液体培养基中培养种子液；
10.向液体培养基中添加维生素溶液，再将接种量为1～10％(v/v)的种子液接种至已添加维生素溶液的液体培养基中，控制生物培养条件，制备得到活性提高的木质素降解酶。
11.作为优选，所述白腐真菌选自：变色栓菌、桦革裥菌、黄孢原毛平革菌、糙皮侧耳、朱红密孔菌、射脉菌、烟管菌或凤尾菇。
12.作为优选，所述固体培养基包括：
13.马铃薯浸粉5～10g/l、葡萄糖20～30g/l、琼脂5～15g/l、氯霉素0.02～0.08g/l。
14.作为优选，所述液体培养基包括：
15.葡萄糖10～30g/l、蛋白胨2～8g/l、酵母粉1～5g/l、七水硫酸镁0.03～0.07g/l、硫酸锰0.02～0.08g/l、琥珀酸0.5～2.5g/l、酒石酸铵0.5～2.5g/l、吐温80 0.1～0.9ml/l、微量元素20～80ml/l，其余为水；液体培养基ph值为5～6。
16.作为优选，微量元素包括：
17.氯化钠0.1～2.0g/l、七水合硫酸亚铁0.01～1.0g/l、六水合氯化钴0.05～0.5g/l、七水合硫酸锌0.05～0.5g/l、五水合硫酸铜0.05～0.5g/l、十二水合硫酸铝钾0.005～0.05g/l、硼酸0.005～0.05g/l、二水合钼酸钠0.005～0.05g/l。
18.作为优选，所述维生素为维生素b9、烟酸、维生素b6、泛酸、维生素c和肌醇中的一种或多种。
19.作为优选，所述维生素溶液采用0.22μm滤膜过滤除菌后添加至液体培养基中，添加的浓度为0.5～3g/l。
20.作为优选，所述生物培养条件为：生物反应器培养温度为25～35℃，转速为100～250rpm，培养周期为5～20天。
21.本发明另一方面，提供所述方法得到的维生素诱导的木质素降解酶。
22.本发明再一方面，提供木质素降解酶在生物降解木质素中的应用，将含有木质素降解酶的种子液按照1％(v/v)的接种量接种至含有1～5g/l木质素的液体培养基中，降解木质素。
23.本发明由于采取以上技术方案，其具有以下有益效果：
24.通过外源添加维生素溶液提高白腐真菌所产木质素降解酶酶活，利用木质素降解酶显著促进木质素的降解产生更多小分子高附加值产物，还可用于促进印染工业废水的脱色、生物制浆等行业。
25.本发明通过向培养体系中添加维生素类诱导物，成功大幅度促进菌株所分泌的木质素降解酶(漆酶和锰过氧化物酶)的酶活，并且将该方法应用于生物降解木质素，促进了木质素降解酶的大规模工业化开发与木质素的生物资源化利用。
具体实施方式
26.下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明
用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
27.本发明提供的维生素诱导提高木质素降解酶酶活的方法，包括：
28.步骤1，将白腐真菌菌株接种到固体培养基上恒温20～30℃培养7～9天，再将培养好的白腐真菌接种至ph值为5～6的液体培养基中，在25～35℃，100～300rpm的摇床中培养7～10天作为培养种子液。
29.其中，白腐真菌选自变色栓菌，其中白腐真菌不限于变色栓菌，还可以采用桦革裥菌、黄孢原毛平革菌、糙皮侧耳、朱红密孔菌、射脉菌、烟管菌或凤尾菇。
30.固体培养基包括：马铃薯浸粉5～10g/l、葡萄糖20～30g/l、琼脂5～15g/l、氯霉素0.02～0.08g/l。
31.液体培养基包括：葡萄糖10～30g/l、蛋白胨2～8g/l、酵母粉1～5g/l、七水硫酸镁0.03～0.07g/l、硫酸锰0.02～0.08g/l、琥珀酸0.5～2.5g/l、酒石酸铵0.5～2.5g/l、吐温80 0.1～0.9ml/l、微量元素20～80ml/l，其余为水。
32.其中，微量元素包括氯化钠0.1～2.0g/l、七水合硫酸亚铁0.01～1.0g/l、六水合氯化钴0.05～0.5g/l、七水合硫酸锌0.05～0.5g/l、五水合硫酸铜0.05～0.5g/l、十二水合硫酸铝钾0.005～0.05g/l、硼酸0.005～0.05g/l、二水合钼酸钠0.005～0.05g/l。
33.步骤2，向液体培养基中添加浓度为0.5～3g/l维生素溶液，维生素溶液采用0.22μm滤膜过滤除菌后添加至液体培养基中；再将接种量为1～10％(v/v)的种子液接种至已添加维生素溶液的液体培养基中，控制生物反应器培养温度为25～35℃，转速为100～250rpm，培养周期为5～20天，制备得到活性提高的木质素降解酶。
34.其中，维生素为维生素b9、烟酸、维生素b6、泛酸、维生素c和肌醇中的一种或多种。维生素类诱导物的作用为提高菌株产木质素降解酶的酶活，从而提高木质素的降解率。
35.可将该方法应用于木质素的降解，提高其降解效率，将废弃有机物高效转化成多种高附加值产物，达到废弃物的增值化开发与利用。
36.下面给出不同的实施例来进一步说明本发明效果。
37.实施例1
38.1)配制固体培养基：马铃薯浸粉6g/l、葡萄糖23g/l、琼脂9g/l、氯霉素0.04g/l。
39.2)配制液体培养基：葡萄糖15g/l、蛋白胨7g/l、酵母粉3g/l、七水硫酸镁0.06g/l、硫酸锰0.07g/l、琥珀酸0.5g/l、酒石酸铵0.8g/l、吐温80 0.7ml/l、微量元素30ml/l，其余为水。
40.其中，微量元素包括：氯化钠1.55g/l、七水合硫酸亚铁1.0g/l、六水合氯化钴0.4g/l、七水合硫酸锌0.35g/l、五水合硫酸铜0.4g/l、十二水合硫酸铝钾0.05g/l、硼酸0.05g/l、二水合钼酸钠0.035g/l。
41.3)制备木质素降解酶：
42.将变色栓菌菌株接种到固体平板培养基上，置于恒温培养箱25℃培养7天，直至菌丝铺满整个平板。用接种环挑取一环菌丝，接种至ph值为6的液体培养基中，在30℃，250rpm的摇床中培养7天作为种子液。在接种前向发酵培养基中添加0.5g/l过滤灭菌后的泛酸溶液，然后将得到的种子液按照6％(v/v)的接种量接种至液体发酵培养基中，在25℃，100rpm的摇床中培养5天，每天定期取样，将得到的发酵液离心，取上清液即为粗酶液。
43.实施例2
44.1)配制固体培养基：马铃薯浸粉9g/l、葡萄糖30g/l、琼脂15g/l、氯霉素0.07g/l。
45.2)配制液体培养基：葡萄糖30g/l、蛋白胨4g/l、酵母粉5g/l、七水硫酸镁0.06g/l、硫酸锰0.07g/l、琥珀酸2.2g/l、酒石酸铵1.5g/l、吐温80 0.9ml/l、微量元素80ml/l，其余为水。
46.其中，微量元素包括：氯化钠1.5g/l、七水合硫酸亚铁0.09g/l、六水合氯化钴0.45g/l、七水合硫酸锌0.5g/l、五水合硫酸铜0.3g/l、十二水合硫酸铝钾0.04g/l、硼酸0.035g/l、二水合钼酸钠0.05g/l。
47.3)制备木质素降解酶：
48.将变色栓菌菌株接种到固体平板培养基上，置于恒温培养箱25℃培养8天，直至菌丝铺满整个平板。用接种环挑取一环菌丝，接种至ph值为5.5的液体培养基中，在35℃，200rpm的摇床中培养10天作为种子液。在接种前向发酵培养基中添加0.8g/l过滤灭菌后的维生素c和维生素b6溶液，然后将得到的种子液按照8％(v/v)的接种量接种至液体发酵培养基中，在35℃，200rpm的摇床中培养18天，每天定期取样，将得到的发酵液离心，取上清液即为粗酶液。
49.实施例3
50.1)配制固体培养基：马铃薯浸粉8g/l、葡萄糖25g/l、琼脂10g/l、氯霉素0.05g/l。
51.2)配制液体培养基：葡萄糖20g/l、蛋白胨4g/l、酵母粉3g/l、七水硫酸镁0.05g/l，硫酸锰0.05g/l、琥珀酸1.5g/l、酒石酸铵1.5g/l、吐温80 0.5ml/l、微量元素50ml/l，其余为水。
52.其中，微量元素包括：氯化钠2.0g/l、七水合硫酸亚铁0.08g/l、六水合氯化钴0.4g/l、七水合硫酸锌0.3g/l、五水合硫酸铜0.5g/l、十二水合硫酸铝钾0.03g/l、硼酸0.04g/l、二水合钼酸钠0.05g/l。
53.3)制备木质素降解酶：
54.将变色栓菌菌株接种到固体平板培养基上，置于恒温培养箱30℃培养8天，直至菌丝铺满整个平板。用接种环挑取一环菌丝，接种至ph值为5的液体培养基中，在30℃，200rpm的摇床中培养9天作为种子液。在接种前向发酵培养基中添加1g/l过滤灭菌后的维生素c溶液，然后将得到的种子液按照1％(v/v)的接种量接种至液体发酵培养基中，在30℃，200rpm的摇床中培养20天，每天定期取样，将得到的发酵液离心，取上清液即为粗酶液。
55.实施例4
56.1)配制固体培养基：马铃薯浸粉5g/l、葡萄糖22g/l、琼脂12g/l、氯霉素0.02g/l。
57.2)配制液体培养基：葡萄糖10g/l、蛋白胨6g/l、酵母粉2g/l、七水硫酸镁0.04g/l、硫酸锰0.02g/l、琥珀酸1.0g/l、酒石酸铵2.0g/l、吐温80 0.7ml/l、微量元素20ml/l，其余为水。
58.其中，微量元素包括：氯化钠1.5g/l、七水合硫酸亚铁1.0g/l、六水合氯化钴0.3g/l、七水合硫酸锌0.4g/l、五水合硫酸铜0.3g/l、十二水合硫酸铝钾0.04g/l、硼酸0.03g/l、二水合钼酸钠0.03g/l。
59.3)制备木质素降解酶：
60.将变色栓菌菌株接种到固体平板培养基上，置于恒温培养箱30℃培养9天，直至菌丝铺满整个平板。用接种环挑取一环菌丝，接种至ph值为5的种子液培养基中，在30℃，
200rpm的摇床中培养9天作为种子液。在接种前向发酵培养基中添加1.5g/l过滤灭菌后的维生素b9溶液，然后将得到的种子液按照1％(v/v)的接种量接种至液体发酵培养基中，在30℃，200rpm的摇床中培养20天，每天定期取样，将得到的发酵液离心，取上清液即为粗酶液。
61.实施例5
62.1)配制固体培养基：马铃薯浸粉7g/l、葡萄糖26g/l、琼脂13g/l、氯霉素0.08g/l。
63.2)配制液体培养基：葡萄糖15g/l、蛋白胨8g/l、酵母粉1g/l、七水硫酸镁0.07g/l、硫酸锰0.08g/l、琥珀酸2.5g/l、酒石酸铵2.5g/l、吐温80 0.3ml/l、微量元素70ml/l，其余为水。
64.其中，微量元素包括：氯化钠1.2g/l、七水合硫酸亚铁0.09g/l、六水合氯化钴0.4g/l、七水合硫酸锌0.45g/l、五水合硫酸铜0.45g/l、十二水合硫酸铝钾0.035g/l、硼酸0.03g/l、二水合钼酸钠0.03g/l。
65.3)制备木质素降解酶：
66.将变色栓菌菌株接种到固体平板培养基上，置于恒温培养箱25℃培养9天，直至菌丝铺满整个平板。用接种环挑取一环菌丝，接种至ph值为5的液体培养基中，在35℃，300rpm的摇床中培养10天作为种子液。在接种前向发酵培养基中添加1.7g/l过滤灭菌后的肌醇溶液，然后将得到的种子液按照10％(v/v)的接种量接种至液体发酵培养基中，在35℃，200rpm的摇床中培养20天，每天定期取样，将得到的发酵液离心，取上清液即为粗酶液。
67.实施例6
68.1)配制固体培养基：马铃薯浸粉10g/l、葡萄糖20g/l、琼脂5g/l、氯霉素0.06g/l。
69.2)配制液体培养基：葡萄糖25g/l、蛋白胨2g/l、酵母粉2g/l、七水硫酸镁0.03g/l、硫酸锰0.06g/l、琥珀酸2.0g/l、酒石酸铵0.5g/l、吐温80 0.1ml/l、微量元素60ml/l，其余为水。
70.其中，微量元素包括：氯化钠1.5g/l、七水合硫酸亚铁0.09g/l、六水合氯化钴0.4g/l、七水合硫酸锌0.5g/l、五水合硫酸铜0.4g/l、十二水合硫酸铝钾0.05g/l、硼酸0.04g/l、二水合钼酸钠0.03g/l。
71.3)制备木质素降解酶：
72.将变色栓菌菌株接种到固体平板培养基上，置于恒温培养箱20℃培养9天，直至菌丝铺满整个平板。用接种环挑取一环菌丝，接种至ph值为6的液体培养基中，在25℃，100rpm的摇床中培养10天作为种子液。在接种前向发酵培养基中添加2g/l过滤灭菌后的烟酸溶液，然后将得到的种子液按照3％(v/v)的接种量接种至液体发酵培养基中，在35℃，250rpm的摇床中培养15天，每天定期取样，将得到的发酵液离心，取上清液即为粗酶液。
73.下面通过测定酶活的方法确定实施例1-6的降解酶酶活。
74.测定木质素降解酶酶活的方法为：
75.漆酶酶活采用abts法测定：反应测试总体积为1ml，包括0.2ml的0.5mmol/l abts溶液、0.1ml的酶液和0.7ml的50mmol/l丙二酸钠缓冲液(ph值为4.5)，酶液最后加入到测试体系中用于启动反应。测试过程在室温下反应3min，测定波长为420nm，消光系数ε为36000l/(mol
·
cm)。酶活单位(u/l)定义为一分钟内与1μmol底物反应所消耗的酶量。
76.锰过氧化物酶酶活采用2,6-dmp法测定：反应体系总体积为1ml，其中包括0.8ml的
50mmol/l丙二酸钠缓冲液(ph值为4.5)，50μl的10mmol/l mnso4，50μl的10mmol/l 2,6-dmp和50μl的酶液，最后加入50μl的10mmol/l h2o2到测试体系中用于启动反应。测试过程在室温下反应3min，测定波长为470nm，消光系数ε为49600l/(mol
·
cm)。酶活单位(u/l)定义为一分钟内与1μmol底物反应所消耗的酶量。
77.对比例1-6
78.分别对实施例1-6中不添加维生素进行培养产酶作为对比例。
79.下面表1给出了实施例1-6与对应对比例木质素降解酶酶活的测定情况。
80.表1.木质素降解酶最高酶活的测定情况
[0081][0082]
从对比例1-6和实施例1-6可知，在向培养体系中添加维生素后，各小组菌株分泌的木质素降解酶即漆酶和锰过氧化物酶的酶活均出现了大幅度的提高(见表1)，其中，实施例1-6中添加维生素小组的漆酶最大酶活数值为5693.26u/l、6032.76u/l、6993.96u/l、10736.12u/l、9162.35u/l、7472.22u/l，分别提高了2.13、2.62、3.21、3.03、3.23、3.09倍；实施例1-6中添加维生素小组的锰过氧化物酶最大酶活数值为4525.16u/l、4873.52u/l、5282.26u/l、8659.27u/l、7532.46u/l、5891.13u/l，分别提高了1.78、1.92、2.36、2.60、2.75、2.13倍。
[0083]
本发明实施例进一步给出了采用木质素降解酶进行木质素降解的方法：
[0084]
向上述实施例中含有木质素降解酶的种子液按照1％(v/v)的接种量加入至含有1～5g/l木质素的发酵培养基中培养，并测定木质素降解率。
[0085]
下面给出具体降解木质素的实施例。
[0086]
实施例7
[0087]
向实施例3的液体培养基中加入1g/l的木质素，培养结束后测定降解率。
[0088]
实施例8
[0089]
向实施例4的液体培养基中加入3g/l的木质素，培养结束后测定降解率。
[0090]
实施例9
[0091]
向实施例6的液体培养基中加入5g/l的木质素，培养结束后测定降解率。
[0092]
对比例7-9
[0093]
分别对实施例7-9中不添加维生素进行培养产酶降解木质素，测定降解率。
[0094]
下面表2给出了实施例7-9与对比例的木质素降解率的测定结果。
[0095]
表2.木质素降解率的测定情况
[0096][0097]
从对比例7-9与实施例7-9对比可知，对照组7与实验组7的降解率分别为17.75％和35.20％，提高了0.98倍；对照组8与实验组8的降解率分别为14.6％和33.8％，提高了1.32倍；对照组9与实验组9的降解率分别为12.4％和23.8％，提高了0.92倍。说明维生素的添加有助于木质素降解酶酶活性的提高，从而高效促进了木质素的生物降解。该方法促进了木质素降解酶的大规模工业化开发与木质素的生物资源化利用。
[0098]
本发明并不局限于上述实施例，在本发明公开的技术方案的基础上，本领域的技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中的一些技术特征作出一些替换和变形，这些替换和变形均在本发明的保护范围内。