一种基于RPA—LFS快速检测近平滑念珠菌的引物探针组合及其应用的制作方法

一种基于rpa
—
lfs快速检测近平滑念珠菌的引物探针组合及其应用
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于rpa—lfs快速检测平滑念珠菌的引物探针组合及其应用。


背景技术：

2.近几十年来，由念珠菌引起的医院感染发生率显著上升。在这个属中，近平滑念珠菌是发病率最显着增加的物种，导致新生儿和重症监护病房患者中10-25％的念珠菌血症。近平滑念珠菌感染与使用医疗器械有关，例如中心静脉导管、肠胃外营养管理和卫生保健工作者接触等(arikan et al.2019；goemaere et al.2018)。近平滑念珠菌归于真菌界、半知菌亚门、芽孢菌纲、隐球酵母目、隐球酵母科，假丝酵母菌属，是医院感染分离出的第二或第三最常见的念珠菌相关物种，该菌极易引发念珠菌病，在低体重新生儿中占主导地位，其次是危重患者或癌症患者，患者被感染主要通过侵入性手术，例如中心静脉导管放置、手术和肠外营养等(yacoub et al.2016；toth et al.2017)。近几十年来侵袭性念珠菌病的发病率有所增加，在欧洲、亚洲和南美洲的一些医院，由近平滑念珠菌引发念珠菌病的检出率甚至超过白色念珠菌(t
ó
th et al.2019)，甚至在一些医院超过白色念珠菌。目前，临床上常用于该菌的鉴定方法为传统真菌培养法，以及基于dna扩增的pcr限制性片段长度多态性(pcr-rflp)，随机扩增多态性dna(rapd)、实时pcr、内含子长度的pcr分析多态性，另外基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof ms)，泛真菌标志物的测序分析和近年来兴起的等温检测等也被应用于该菌的检测。由于近平滑念珠菌感染病程进展迅速，因此亟需快速、灵敏、实时的现场检测方法满足临床诊断的迫切需求。
3.传统真菌培养法是真菌感染性疾病诊断的金标准，随着分子诊断技术的不断发展，基于dna扩增的pcr限制性片段长度多态性(pcr-rflp)(neji et al.2017)，随机扩增多态性dna(rapd)(al-tekreeti et al.2018)、实时pcr(souza et al.2012)、内含子长度的pcr分析多态性(feng et al.2014)，以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (maldi-tof ms)(ferreira et al.2011)，泛真菌标志物的测序分析都被应用于近平滑念珠菌的临床检测中(guinea et al.2021)。同时，等温扩增由于不受仪器和实验室场景限制，更是在现场检测中越来越多的受到重视。目前所报道的等温扩增技术主要有环介导等温扩增技术(lamp)(fallahi et al.2020)、依赖于核酸序列的扩增技术(nuclear acid sequence-basedamplification，nasba)(huang et al.2019)、滚环扩增技术(rolling circle dnaamplification， rca)(carinelli et al.2017)、单引物扩展技术(single primer isothermal amplification，spia) (yang et al.2021)、依赖于解旋酶等温扩增技术(helicase-dependent isothermal dnaamplification,had)(jeong et al.2009)、链替代扩增技术(strand displaced amplification, sda)(zhang et al.2017)等。重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplication，rpa) 技术是最近兴起的恒温扩增技术，能够兼顾以上方法的优点，弥补不足，满足快速、特异、灵敏及便携的快速诊断需求的检
测方法。
4.传统真菌培养法是真菌感染性疾病诊断的金标准，随着分子诊断技术的不断发展，基于dna扩增的pcr限制性片段长度多态性(pcr-rflp)(neji et al.2017)，随机扩增多态性dna(rapd)(al-tekreeti et al.2018)、实时pcr(souza et al.2012)、内含子长度的 pcr分析多态性(feng et al.2014)，以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (maldi-tof ms)(ferreira et al.2011)，泛真菌标志物的测序分析都被应用于近平滑念珠菌的临床检测中(guinea et al.2021)。同时，等温扩增由于不受仪器和实验室场景限制，更是在现场检测中越来越多的受到重视。目前所报道的等温扩增技术主要有环介导等温扩增技术(lamp)(fallahi et al.2020)、依赖于核酸序列的扩增技术(nuclear acid sequence-basedamplification，nasba)(huang et al.2019)、滚环扩增技术(rolling circle dnaamplification， rca)(carinelli et al.2017)、单引物扩展技术(single primer isothermal amplification，spia) (yang et al.2021)、依赖于解旋酶等温扩增技术(helicase-dependent isothermal dnaamplification,had)(jeong et al.2009)、链替代扩增技术(strand displaced amplification, sda)(zhang et al.2017)等。重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplication，rpa) 技术是最近兴起的恒温扩增技术，能够兼顾以上方法的优点，弥补不足，满足快速、特异、灵敏及便携的快速诊断需求的检测方法。
5.除了传统的真菌培养法可以鉴别近平滑念珠菌外，基于核酸检测的分子诊断越来越受到重视。qpcr由于特异性强，灵敏度高，实时等优点被大规模应用在核酸检测中，尤其在当下全球流行的新型冠状病毒的检测中更是崭露头脚(kim et al.2021；shelite et al. 2021)。由于各地进行的大规模核酸筛查，对实验室环境和训练有素的专业人员的要求也越来越高，其中包括核酸提取仪、扩增仪等仪器依赖也不容忽视。另外，由于不当操作产生的气溶胶污染问题更是核酸检测实验室的灭顶之灾。rpa由于在37℃的常温下就可以实现对核酸进行指数扩增，不需要昂贵的热循序仪器和专业的实验室人员，因此可以适用于患者的居家检测或者条件苛刻地区的现场检测，可以成为qpcr核酸检测的有效补充。elisa 检测试剂盒适用于体外定量检测人血清、血浆，细胞培养液或其它相关生物液体中蛋白含量，也常被应用于近平滑念珠菌的检测中，其原理为双抗体夹心法检测抗原蛋白，酶标板采用高亲和力抗体作为包被物，检测时酶标板孔加入待检样品或标准品，再加入生物素化抗体,反应后加入链霉亲和素，最后加入单组份底物液。如果待检样品中含有蛋白，底物液在hrp催化下显色，加入终止液终止显色后，在酶标仪od450/od630读取吸光值，吸光值大小与待检测样品中蛋白浓度呈正相关，根据标准品浓度/吸光值绘制的标准曲线，可计算出待检样品中含量(roy et al.2020；tsurusawa et al.2021)。这一方法的不足之处就是不能在疾病初期进行有效检测，因此容易延误病情，威胁患者健康，而rpa由于高灵敏度可以弥补这一不足之处，快速，特异，便携的完成对近平滑念珠菌的检测。


技术实现要素：

6.为了解决背景技术中的技术问题，本发明提供了一种基于rpa—lfs快速检测平滑念珠菌的引物探针组合及其应用，所采用的技术方案如下：
7.关于引物和探针设计与筛选，使用primer premier 5.0软件(premier biosoft
international,ca,usa)设计基于fsk2基因的两对rpa引物。对于引物，在输入特定靶向区域的序列后，参数设置如下：产物大小设置为80bp-150bp。引物大小设置为30bp-35bp，3
′
末端不超过三个连续碱基的互补配对，最大发夹分数为5，最大引物-二聚体分数设置为 5，最大poly-x设置为5。使用ncbi网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) 上的primer-blast确认引物和探针的序列的物种特异性。将正向引物5’向后延伸15-23 bp，使用primer premier 5软件评估探针和反向引物性能，理论上尽可能避免探针和反向引物之间形成二聚体、发夹结构等，探针大小为46-53bp，gc含量为30-80％，tm为57-80℃。探针5'端用fitc标记，3'端用c3 spacer封闭，探针中间的碱基换成四氢呋喃(thf)，在thf 位点之前至少有30bp碱基，而后至少有15bp的碱基，反向引物的5'端用生物素标记。
8.rpa反应，根据制造商的说明，使用liquid dna amplification kit (twistdx inc.,maidenhead,uk)进行rpa反应。50μl反应体系包含25μl 2
×
反应缓冲液、5μl 10
×
basic e-mix、2.5μl 20
×
core mix、2.4μl 10μm正向引物、2.4μl 10μm 反向引物和9.2μl蒸馏水。将2.5μl的280mm醋酸镁和1μl的模板添加到反应管的盖子中。短暂离心后，将反应混合物在37℃下孵育30分钟。使用pcr清洁试剂盒(上海明治生物技术有限公司，中国上海)纯化rpa扩增产物，并在2％琼脂糖凝胶上进行电泳。
9.rpa-lfs，rpa反应是按照twistdna扩增nfo试剂盒(twistdx ltd., maidenhead,uk)的制造商说明进行。每个50μl的反应混合物包含2.1μl的每个引物(10 μm)，0.6μl的探针(10μm)，2.0μl的模板，以及其他标准反应成分。引物和探针是由安徽通用生物技术有限公司合成的。为了启动反应，加入2.5μl的醋酸镁(280mm)，反应混合物在37℃下孵育20分钟。然后，将5μl扩增产物稀释20倍点在lfs(优思达生物科技有限公司，中国杭州)上。lfs由样品垫、金标抗体垫(用小鼠源性aunp标记的抗fitc抗体浸泡)、测试线(涂有链霉亲和素)、对照线(涂有抗小鼠抗体)和吸收垫组成，通过溶剂迁移途径排列。将rpa扩增产物加入到lfs的样品垫中，并将lfs插入到100μl的溶剂中约2分钟，直到测试线和对照线被目测。
10.qpcr，引物和探针列于表1。特定的引物和探针针对近平滑念珠菌的fsk2基因，用于qpcr检测。qpcr反应混合物包含12.5μl monamptm taqman qpcr混合物(天根生物技术有限公司，北京，中国)，0.5μm正向和反向引物，0.2μm探针，1μl基因组dna，并加入蒸馏水至25μl。循环程序为95℃10分钟，然后在罗氏lightcycler 480 qpcr机器上进行95℃15秒和55℃60秒的40个循环。
11.引物验证筛选策略，从近平滑念珠菌基因组中选择了fsk2作为rpa-lfs的检测靶标。使用ncbi primer-blast在fsk2基因的序列上搜索引物，得到了2个潜在的引物对(表 1)。这些引物通过对目标基因片段的扩增和无模板对照进行了初步筛选。扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，比较目标基因的扩增性能和无模板对照中引物二聚体的形成。选择了显示出最佳扩增性能且没有引物二聚体形成的引物对f2/r2(图1a)。候选探针是通过将正向引物f2的3'端延长16bp获得的。预测了该探针和反向引物产生的所有可能的交叉二聚体，随后对碱基进行了修改(表1)，直到不能形成二聚体(图1b)。最后，在探针上游设计、筛选和测试的五个正向引物，lfs结果显示f1/r2/p，f2/r2/p，f3/r2/p，f4/r2/p 均能有效扩增目的基因片段，但是f1/r2，f2/r2，f3/r2没有添加模板的负对照出现假阳性信号，只有f4/r2/p符合检测要求，能够有效扩增fsk2基因片段，且不添加模板的负对照没有被扩增(图1c)。因
此，f4/r2/p被用于后续的实验中。
12.表1：引物和探针
[0013][0014][0015]
表2：本发明中使用的株菌
[0016]
[0017][0018]
菌株获得，近平滑念珠菌atcc 22019/90018/200954/7330购自上海柯维化工科技有限公司，临床样本中分离出15株近平滑念珠菌，其它22种常见病原菌由本实验室提供用于验证基于fsk2(genbank:eu221326.1)基因的rpa-lfs方法的特异性，包括candidatropicalis atcc 20962,candida albicans atcc 10231,candida dubliniensis,candida krusei, candida glabrata,aspergillus fumigatus,cryptococcus neoformans atcc 14116,enterococcusfaecium,escherichia coli o157,pseudomonas aeruginosa,staphylococcusaureus,staphylococcus capitis,staphylococcus epidermidis,staphylococcushaemolyticus,staphylococcus hominis,staphylococcus saprophytics,staphylococcuswameri,stenotrophomonas maltophilia,streptococcus pneumonia,viridans streptococci, klebsiella pneumoniae,acinetobacter baumannii atcc 1960。本院采集疑似念珠菌感染患者的样本共计281份。
[0019]
基因组提取，所有的细菌菌株在作为模板之前都在100℃下沸煮10分钟以释放dna。如果没有特别说明，则使用1μl 105cfu/ml的热处理的培养物作为模板。对于近平滑念珠菌和其他真菌，使用genejet基因组dna纯化试剂盒(天根生物技术有限公司，北京，中国)从培养物或临床样品中按照制造商的说明提取和纯化基因组dna。按照制造商的说明，使用qubit 4荧光仪(thermo fisher scientific)对提取的基因组dna进行定量。
[0020]
rpa利用结合特异性引物的重组酶结打开双链并与靶标片段结合，利用ssb使打开的双链保持单链状态，利用具有链置换活性的聚合酶bsu识别引物3’端进行快速扩增，只需
在30-45℃反应20min左右即可获得大量的扩增产物(piepenburg et al.2006)。rpa的扩增产物可以用凝胶电泳、荧光检测器和侧流条(lfs)进行检测。然而，在实验室外，凝胶电泳和荧光检测的使用场景是受限的。相反，lfs适用于条件苛刻地区的现场检测，检测结果可以通过肉眼直接观察而不要专门的显示装置，也不需要复杂的热循环设备和经过严格培训的科研技术人员。lfs的可视化取决于探针的5'和3'端分别被异硫氰酸荧光素 (fitc)标签和c3阻滞位点标记，反向引物被生物素标记。探针与扩增链的结合是通过内切酶iv(nfo)的裂解探针的中间四氢呋喃(thf)位点从而释放出探针的3'端进行延伸，最终扩增产物的5'和3'端分别被fitc和生物素标记。被aunp标记的抗fitc抗体可以与扩增产物结合，随后被检测线上的链霉亲和素捕获并聚集从而产生红色阳性信号，质控线上的二抗能够捕获未结合扩增产物的aunp标记的抗fitc抗体，也就是说无论有无扩增产物，质控线都会产生红色信号(lee et al.2021；yang et al.2020)。rpa-lfs检测在作为各种传染病的诊断性试验时，可以达到快速反应时间和良好的准确性。
[0021]
本发明的有益效果是：
[0022]
本发明利用rpa-lfs扩增近平滑念珠菌fsk2(beta-1,3-glucan synthase catalytic subunit 2)基因，通过引入碱基错配(探针修改4个碱基，反向引物修改1个碱基)优化引物探针设计，从而获得特异性强、灵敏度高的引物探针组合用于临床样品检测，本研究针对22种临床常见病原菌进行rpa-lfs检测，对该系统的检测系统的敏感性和特异性进行测定，对收集的281份临床实际样本分别通过rpa-lfs和qpcr进行检测，用以评估所建立rpa-lfs系统检测性能，为近平滑念珠菌的检测提供可靠的分子诊断方法，满足临床上快速、特异、灵敏、便携的现场检测的迫切需要；
[0023]
本研究所开发的基于重组酶聚合酶等温扩增结合胶体金试纸条(rpa-lfs)的近平滑念珠菌的临床快速可视化分子诊断技术，能够在20min内获得检测结果，同时具有特异性强、灵敏度高、仪器依赖小，不需要经过专业训练的实验人员,可操作性强，能够进行现场检测，满足床边诊断或者偏远地区条件薄弱基层医院的需求，对近平滑念珠菌的快速检测具有重要意义；
[0024]
总之，已建立的rpa-lfs检测方法简单、快速、准确，不需要实验室设施，并可与简单快速的dna提取方法相结合，用于近平滑念珠菌引发感染的家庭检测，及时的诊断可以促进该真菌感染的早期治疗，适于全面推广和应用。
附图说明
[0025][0026]
图1为引物-探针组合的筛选；
[0027]
图2为近平滑念珠菌rpa-lfs检测的检测下限的确定；
[0028]
图3为引物对f4/r2/p对近平滑念珠菌的特异性验证；
[0029]
图4为f4/r2/p的特异性。
具体实施方式
[0030]
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0031]
实施例1
[0032]
如图1-图4所示：
[0033]
图1为引物-探针组合的筛选。(a)针对fsk2的两个不同引物组的rpa结果。每套引物的名称显示在每个泳道的顶部。反应中使用了ntc。所有反应在37℃下进行20分钟。图片代表了三个独立实验的结果。(b)用primer premier 5软件对用于检测fsk2基因的引物-探针组进行配对分析和序列修饰。探针和引物的相关dna碱基替换。dna链显示为水平线，匹配的碱基用垂直线表示。分子标记列在图(b)下。(c)rpa-lfs检测的引物
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探针组的有效性。每套引物的名称显示在每个泳道的顶部，n。测试线和对照线的位置在右边显示。所有反应在37℃下进行20分tc表示各自引物对的无模板对照钟。图片代表了三个独立实验的结果。
[0034]
图2为rpa-lfs检测系统敏感度测定，为了确定rpa-lfs系统检测近平滑念珠菌的最低检测下限(lod)，测试了近平滑念珠菌10倍梯度稀释菌液，范围从100到105cfu/ μl(反应体积：50μl，每个反应中加入1μl近平滑念珠菌灭活菌液)。在10cfu/μl 的测试线上出现了一条红色的条带。而且，红色条带随着近平滑念珠菌菌液浓度的增加而变深(图2a)。为了测试该系统是否能抵抗其他真菌dna的干扰，在rpa反应中加入 105个cfu/μl另一种常见病原菌—白色念珠菌的灭活菌液。结果显示白色念珠菌灭活菌液没有干扰近平滑念珠菌的检测(图2b)。我们得出结论，rpa-lfs系统的检测下限是每个反应10个cfu/50μl，检测灵敏度不受其他真菌的干扰。此外，当使用100(8个样品中6个阳性结果，6/8)和10(1/8)cfu数量的模板时，并非所有的检测都产生阳性结果。为了进一步确定rpa-lfs检测的准确检测下限，通过spss软件对八个独立检测的数据进行统计分析，进行probit回归分析。在95％的概率下，最低检测下限为每反应11.7cfu(图 2c)。
[0035]
图3为引物对f4/r2/p对近平滑念珠菌的特异性验证。(a)#1-#17是指从临床样本分离的17个近平滑念珠菌，ntc表示无模板对照。测试线和对照线的位置标在条形图的右边。反应在37℃下进行20分钟。图像代表三个独立实验的结果。
[0036]
图4f4/r2/p的特异性。近平滑念珠菌atcc 22019被用作阳性对照，对其他致病原菌进行了测试，物种名称在每个条带的顶部标明。ntc表示无模板对照。测试线和对照线的位置标在条形图的右边。反应在37℃下进行20分钟。图像代表三个独立实验的结果。
[0037]
临床样本检测，为了验证rpa-lfs的实际应用效果，采集了281个临床样本分别进行rpa-lfs和qpcr检测。结果如表3所示，89份样本属于近平滑念珠菌，检出率为31.7％。与qpcr和传统培养方法的检测结果一致。实验结果表明，rpa-lfs与qpcr具有相同的准确性，且这些结果与传统培养方法的结果一致。
[0038]
表3：检测分析表
[0039][0040]
菌株获得，近平滑念珠菌atcc 22019/90018/200954/7330购自上海柯维化工科技有限公司，临床样本中分离出15株近平滑念珠菌，其它22种常见病原菌由本实验室提供用于验证基于fsk2(genbank:eu221326.1)基因的rpa-lfs方法的特异性，包括candidatropicalis atcc 20962,candida albicans atcc 10231,candida auris,candidadubliniensis,candida krusei,candida glabrata,aspergillus fumigatus,cryptococcus neoformansatcc 14116,enterococcus faecium,escherichia coli o157,pseudomonasaeruginosa,staphylococcus aureus,staphylococcus capitis,staphylococcusepidermidis,staphylococcus haemolyticus,staphylococcus hominis,staphylococcussaprophytics,staphylococcus wameri,stenotrophomonas maltophilia,streptococcuspneumonia,viridans streptococci,klebsiella pneumoniae,acinetobacter baumannii atcc1960。本院采集疑似念珠菌感染患者的样本共计281份。
[0041]
基因组提取，所有的细菌菌株在作为模板之前都在100℃下沸煮10分钟以释放dna。如果没有特别说明，则使用1μl 105cfu/ml的热处理的培养物作为模板。对于近平滑念珠菌和其他真菌，使用genejet基因组dna纯化试剂盒(天根生物技术有限公司，北京，中国)从培养物或临床样品中按照制造商的说明提取和纯化基因组dna。按照制造商的说明，使用qubit 4荧光仪(thermo fisher scientific)对提取的基因组dna进行定量。
[0042]
引物和探针设计与筛选，使用primer premier 5.0软件(premier biosoft international, ca,usa)设计基于fsk2基因的两对rpa引物。对于引物，在输入特定靶向区域的序列后，参数设置如下：产物大小设置为80bp-150bp。引物大小设置为30bp-35bp，3
′
末端不超过三个连续碱基的互补配对，最大发夹分数为5，最大引物-二聚体分数设置为5，最大 poly-x设置为5。使用ncbi网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)上的 primer-blast确认引物和探针的序列的物种特异性。将正向引物5’向后延伸15-23bp，使用primer premier 5软件评估探针和反向引物性能，理论上尽可能避免探针和反向引物之间形成二聚体、发夹结构等，探针大小为46-53bp，gc含量为30-80％，tm为57-80℃。探针5'端用fitc标记，3'端用c3 spacer封闭，探针中间的碱基换成四氢呋喃(thf)，在thf 位点之前至少有30bp碱基，而后至少有15bp的碱基，反向引物的5'端用生物素标记。
[0043]
rpa反应，根据制造商的说明，使用liquid dna amplification kit (twistdx inc.,maidenhead,uk)进行rpa反应。50μl反应体系包含25μl 2
×
反应缓冲液、5μl 10
×
basic e-mix、2.5μl 20
×
core mix、2.4μl 10μm正向引物、2.4μl 10μm 反向引物和9.2μl蒸馏水。将2.5μl的280mm醋酸镁和1μl的模板添加到反应管的盖子中。短暂离心后，将反应混合物在37℃下孵育30分钟。使用pcr清洁试剂盒(上海明治生物技术有限公司，中国上海)纯化rpa扩增产物，并在2％琼脂糖凝胶上进行电泳。
[0044]
rpa-lfs，rpa反应是按照twistdna扩增nfo试剂盒(twistdx ltd., maidenhead,uk)的制造商说明进行。每个50μl的反应混合物包含2.1μl的每个引物(10 μm)，0.6μl的探针(10μm)，2.0μl的模板，以及其他标准反应成分。引物和探针是由安徽通用生物技术有限公司合成的。为了启动反应，加入2.5μl的醋酸镁(280mm)，反应混合物在37℃下孵育20分钟。然后，将5μl扩增产物稀释20倍点在lfs(优思达生物科技有限公司，中国杭州)上。lfs由样品垫、金标抗体垫(用小鼠源性aunp标记的抗fitc抗体浸泡)、测试线(涂有链霉亲和素)、对照线(涂有抗小鼠抗体)和吸收垫组成，通过溶剂迁移途径排列。将rpa扩增产物加入到lfs的样品垫中，并将lfs插入到100μl的溶剂中约2分钟，直到测试线和对照线被目测。
[0045]
qpcr，引物和探针列于表1。特定的引物和探针针对近平滑念珠菌的fsk2基因，用于qpcr检测。qpcr反应混合物包含12.5μl monamptm taqman qpcr混合物(天根生物技术有限公司，北京，中国)，0.5μm正向和反向引物，0.2μm探针，1μl基因组dna，并加入蒸馏水至25μl。循环程序为95℃10分钟，然后在罗氏lightcycler 480 qpcr机器上进行95℃15秒和55℃60秒的40个循环。
[0046]
从近平滑念珠菌基因组中选择了fsk2作为rpa-lfs的检测靶标。使用ncbiprimer-blast在fsk2基因的序列上搜索引物，得到了2个潜在的引物对(表1)。这些引物通过对目标基因片段的扩增和无模板对照进行了初步筛选。扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，比较目标基因的扩增性能和无模板对照中引物二聚体的形成。选择了显示出最佳扩增性能且没有引物二聚体形成的引物对f2/r2(图1a)。候选探针是通过将正向引物f2 的3'端延长16bp获得的。预测了该探针和反向引物产生的所有可能的交叉二聚体，随后对碱基进行了修改(表1)，直到不能形成二聚体(图1b)。最后，在探针上游设计、筛选和测试的五个正向引物，lfs结果显示f1/r2/p，f2/r2/p，f3/r2/p，f4/r2/p均能有效扩增目的基因片段，但是f1/r2，f2/r2，f3/r2没有添加模板的负对照出现假阳性信号，只有f4/r2/p符合检测要求，能够有效扩增fsk2基因片段，且不添加模板的负对照没有被扩增(图1c)。因此，f4/r2/p被用于后续的实验中。
[0047]
分子检测技术需要选择诊断性的扩增目标，以有效检测特定物种。许多研究已经评估了各种检测近平滑念珠菌感染的方法。在这些方法中，fsk2基因最常被用作检测目标，因此，我们设计了一对引物探针来检测近平滑念珠菌。本研究结果表明，碱基错配对检测下限没有明显的影响，rpa-lfs能准确地检测出近平滑念珠菌。rpa-lfs检测的最低检测下限是10cfu，这一灵敏度高于qpcr，即每个反应10
0-10cfu。此外，rpa-lfs检测近平滑念珠菌的方法简单而快速，因为检测可以在30分钟内完成(5分钟用于样品前处理， 20分钟用于扩增，5分钟用于lfs分析)。这种方法仅需要37℃的等温温度，相反，pcr、 qpcr和lamp方法需要温度控制设备和相对较长的反应时间。对临床样本的评估表明， rpa-lfs测定的准确性
很好。对不同患者样本的检测显示，用rpa-lfs检测阳性样本与qpcr的检测结果相当，表明rpa-lfs检测提出了一种可供选择的检测方法。
[0048]
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
[0049]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。