一种用于检测人ALDH2基因中rs671位点的试剂盒和方法

一种用于检测人aldh2基因中rs671位点的试剂盒和方法
技术领域
1.本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测人aldh2基因中rs671位点的试剂盒和方法


背景技术：

2.人线粒体乙醛脱氢酶2(aldh2)基因位于人类第十二号染色体上。aldh2存在300多个单核苷酸多态性(snp)位点，位于外显子上的rs671突变位点最为常见。rs671位于12号外显子上，野生型位点为g,突变型位点为a。分别构成三种基因型：野生型gg，杂合突变型ga，纯合突变型aa。当多态性位点为a时，其编码的多肽链第504位氨基酸glu被lys取代，引起酶失活。aldh2在乙醇代谢中起到了极为重要的作用，它是是乙醇代谢途径中的关键酶，乙醇进入人体后由乙醇脱氢酶代谢为乙醛，再由乙醛脱氢酶代谢为水和二氧化碳。乙醛脱氢酶的缺乏可以导致乙醛的堆积，乙醛在人体内可以刺激皮肤黏膜及上呼吸道黏膜，导致眼球充血、水肿，咳嗽胸闷甚至呼吸窘迫综合征的出现。乙醛也可以通过肝脏代谢，引起肝功能受损，最终导致酒精肝，甚至肝硬化。现也有相当一部分研究证明，乙醛与癌症的发生也有一定的相关性。乙醛脱氢酶g/g野生型乙醛代谢能力强，乙醛在人体内停留时间短，g/a杂合型及a/a纯合突变型乙醛代谢能力极弱，此类人群大量饮酒后，易出现脸红、恶心、心悸等症状，且体内乙醛的浓度是野生型人群的10倍以上，乙醛在体内累积，与dna或蛋白形成加合物，也可诱导活性氧的产生，加重对肝脏细胞的损害，这类人群不适宜饮酒。同时，临床心绞痛急性发作使用药物硝酸甘油由aldh2代谢，而其突变体使硝酸甘油代谢速率大大降低，从而无法产生一氧化氮，难以发挥药效。因此通过检测人aldh2基因多态性可用于检测“饮酒基因”及指导硝酸甘油合理用药。
3.目前aldh2基因rs671多态性的检测方法主要有pcr-荧光探针法、测序法和基因芯片法。采用pcr-荧光探针法检测，用扩增曲线及δct值进行结果判定，这种方法的不足之处在于所设计的正常探针在检测突变位点时也会出现扩增曲线，这种时候结果会模棱两可，增加复查的几率，增大了人力、试剂的损耗。dna测序及基因芯片技术需要昂贵的仪器和专业的操作人员，并不适合于基层医院的开展。
4.专利cn105063178a公开了一种基于fret探针熔解曲线法检测aldh2基因多态性的试剂盒及方法，其需要两条探针才能检测aldh2多态性，探针价格昂贵，检测成本高；cn 109055560 a公开的aldh2基因多态性检测方法的结果显示引物二聚体的熔解峰较明显，纯合野生型gg在88℃也会有一个干扰峰，可见其引物设计以及探针特异性差，有明显的非特异扩增，会造成结果判读失误；cn 103525904 a公开了一种利用染料法介导的熔解曲线对aldh2进行基因分型的aldh2基因多态性检测方法，由于evagreen dye染料具有非特异性，在检测时难以与检测其他多态性位点同时进行，并且有杂峰时无法判读杂峰的具体来源。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种用于检测aldh2基因的试剂盒和方法。
6.本发明提供了一种seq id no.1、seq id no.2所示的引物对。
7.本发明还提供了一种seq id no.3所示的探针。
8.本发明还提供了一种seq id no.1、seq id no.2所示的引物对和seq id no.3所示探针在制备检测aldh2基因的试剂中的用途。
9.进一步地，所述试剂是检测人aldh2基因中rs671位点的试剂。
10.本发明还提供了一种用于检测人aldh2基因中rs671位点的试剂盒，它包括seq id no.1、seq id no.2所示的引物对和seq id no.3所示的探针。
11.进一步地，它还包括实时荧光pcr预混液。
12.进一步地，它还包括taq dna聚合酶、mgcl2、dntp和反应缓冲液。
13.进一步地，所述试剂盒的组成为：
14.pcr反应总体积为20μl时，
[0015][0016]
其余为无菌双蒸水；
[0017]
其中，模板dna的浓度为5ng/μl～200ng/μl；引物的浓度为50-800nm；探针的浓度为50-800nm。
[0018]
本发明还提供了一种前述试剂盒在用于检测人aldh2基因中rs671位点中的用途。
[0019]
本发明最后提供了一种检测人aldh2基因中rs671位点的方法，它包括如下步骤：
[0020]
(1)提取样本dna：取待检组织，提取其中的dna；
[0021]
(2)基因扩增：用权利要求5～权利要求8任意一项所述的试剂盒对待检样本中的dna进行扩增；
[0022]
(3)结果检测：在95℃1min，37℃2min，60℃至95℃以每秒0.05℃上升并收集荧光做熔解曲线；
[0023]
其中，所述待检组织为全血。
[0024]
进一步地，步骤2)所述扩增的程序为：95℃30s激活酶活性，95℃15s变性，58℃15s退火，72℃15s延伸并收集荧光，变性、退火、延伸三个步骤重复40个循环。
[0025]
进一步地，步骤3)所述熔解曲线中熔解峰出现在58
±
0.5℃是野生型aldh2基因；熔解峰出现在49
±
0.5℃是纯合突变型aldh2基因；熔解峰出现双峰则为杂合突变型aldh2基因。
[0026]
进一步地，所述野生型aldh2基因的rs671位点为g；所述杂合突变型或纯合突变型的aldh2基因的rs671位点为a。
[0027]
本发明具有如下有益效果：
[0028]
本发明用于检测aldh2基因的试剂盒和方法，对于每个snp位点仅需一条自淬灭探针，操作简便、快速，在同一反应体系内闭管进行pcr和杂交，减少了pcr扩增产物的交叉污染，结果易判断。采用本发明试应用熔解曲线法检测snp分型情况的结果可靠，检测结果通
过熔解曲线tm值进行判定，结果直观、易判定，准确性高，具有广泛的应用前景。
[0029]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0030]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0031]
图1g/g野生型，g/a杂合突变和a/a纯合突变pcr扩增曲线
[0032]
图2g/g野生型，g/a杂合突变和a/a纯合突变熔解曲线
[0033]
图3g/g野生型测序结果
[0034]
图4g/a杂合突变测序结果
[0035]
图5a/a纯合突变测序结果
具体实施方式
[0036]
实施例1本发明检测人aldh2基因中rs671位点的试剂盒和检测方法一、本发明试剂盒成分
[0037]
包含seq id no.1、seq id no.2所示的引物对和seq id no.3所示的探针；如表1所示：
[0038]
表1本发明引物及探针
[0039]
编号引物与探针序列seq id no.1f:5
’‑
caggtcccacactcacagtt-3’seq id no.2r:5
’‑
ggctacaagatgtcggggag-3’seq id no.3p:5
’‑
fam-caggcatacactgaagtg-bhq1-3’[0040]
注：f为5’端引物，r为3’端引物，p为探针。
[0041]
二、采用本发明试剂盒检测aldh2基因rs671位点
[0042]
1、dna提取
[0043]
按照dna提取试剂盒的使用操作说明书进行全血dna提取。得到的dna储存-20℃。
[0044]
(1)取1.5ml灭菌离心管1支，加入200μl裂解液和20μl消化液，再加入200ul全血(冷藏血液需先轻振混匀)，振荡混匀2分钟，56℃水浴6分钟。
[0045]
(2)取出离心管，放置冷却到室温，5000rpm离心1分钟。加入300μl异丙醇，轻轻颠倒混匀8次，如有半透明悬浮物，不影响dna的提取与后续实验。
[0046]
(3)将吸附柱放入收集管内，将上述溶液转入吸附柱内，静置1分钟，12,000rpm离心1分钟，弃收集管内废液。
[0047]
(4)将吸附柱放回收集管内，加500μl洗涤液至吸附柱内，静置1分钟，12,000rpm离心1分钟，弃收集管内废液。
[0048]
(5)将吸附柱放回收集管内，加500μl洗涤液至吸附柱内，12,000rpm离心1分钟，弃收集管内废液。
[0049]
(6)将吸附柱放回收集管内，12,000rpm离心1分钟，离去残留的洗涤液。
[0050]
(7)取出吸附柱，放入新的1.5ml离心管内，向离心柱吸附膜上加入50μl洗脱液，静置1分钟，12,000rpm离心1分钟，收集dna溶液。提取得到的dna即可用于下一步实验或-20℃保存。
[0051]
2、dna浓度和纯度的测定
[0052]
使用核酸蛋白分析仪检测dna浓度及纯度，dna浓度在5ng/μl～200ng/μl之间，a260/a280值在1.5～2.0之间时，适宜于本方法。
[0053]
3、实时荧光pcr扩增
[0054]
aldh2基因的pcr扩增采用20μl的反应体系：包括pcr反应预混液(2
×
)10μl，5’端、3’端引物(50-800nm)各0.8μl，0.2μl，探针(50-800nm)0.8μl，dna模板(5ng/μl～200ng/μl)1μl，用无菌双蒸水补足20μl。每个样品设置两个平行反应体系。
[0055]
pcr扩增反应程序为：95℃30s激活酶活性，95℃15s变性，58℃15s退火，72℃15s延伸并收集荧光，变性、退火、延伸三个步骤重复40个循环。
[0056]
也可用等效的商品化试剂盒进行扩增。
[0057]
4、熔解曲线分析
[0058]
在95℃1min，37℃2min，60℃至95℃以每秒0.05℃上升并收集荧光做熔解曲线。
[0059]
5、结果判断：
[0060]
熔解峰出现在右侧58
±
0.5℃是纯合野生g/g型；熔解峰出现在左侧49
±
0.5℃是纯合突变a/a型；熔解峰出现双峰则为杂合突变g/a型。
[0061]
6结果表述
[0062]
结果为纯合野生g/g型，表述为“野生型aldh2基因”。
[0063]
结果为纯合突变a/a型，表述为“未纯合突变型aldh2基因”。
[0064]
结果为杂合突变g/a型，表述为“杂合突变型aldh2基因”。
[0065]
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：
[0066]
试验例1aldh2基因的rs671位点检测研究
[0067]
1、试剂和仪器
[0068]
1.1试剂
[0069]
寡核苷酸从sangon biotechnology co.,ltd.(中国上海)获得。使用前溶于超纯水并保存在-20℃。2
×
实时荧光pcr预混液由vazyme(中国南京)提供，临床样本收集自西南医科大学附属医院。
[0070]
1.2仪器
[0071]
基因组dna提取试剂盒(qiagen)，nanodrop 2000仪器(thermo fisher scientific)cfx 96实时pcr仪器(bio-rad，美国)，电泳仪(六一电泳厂，北京)。
[0072]
2、方法
[0073]
2.1dna提取：
[0074]
按照dna提取试剂盒的使用操作说明书进行全血dna提取。得到的dna储存-20℃。
[0075]
(1)取1.5ml灭菌离心管1支，加入200μl裂解液和20μl消化液，再加入200ul全血(冷藏血液需先轻振混匀)，振荡混匀2分钟，56℃水浴6分钟。
[0076]
(2)取出离心管，放置冷却到室温，5000rpm离心1分钟。加入300μl异丙醇，轻轻颠倒混匀8次，如有半透明悬浮物，不影响dna的提取与后续实验。
[0077]
(3)将吸附柱放入收集管内，将上述溶液转入吸附柱内，静置1分钟，12,000rpm离心1分钟，弃收集管内废液。
[0078]
(4)将吸附柱放回收集管内，加500μl洗涤液至吸附柱内，静置1分钟，12,000rpm离心1分钟，弃收集管内废液。
[0079]
(5)将吸附柱放回收集管内，加500μl洗涤液至吸附柱内，12,000rpm离心1分钟，弃收集管内废液。
[0080]
(6)将吸附柱放回收集管内，12,000rpm离心1分钟，离去残留的洗涤液。
[0081]
(7)取出吸附柱，放入新的1.5ml离心管内，向离心柱吸附膜上加入50μl洗脱液，静置1分钟，12,000rpm离心1分钟，收集dna溶液。提取得到的dna即可用于下一步实验或-20℃保存。
[0082]
2.2pcr扩增：
[0083]
采用荧光定量pcr的方法进行检测，步骤如下：
[0084]
(1)按实施例1方法对提取dna进行浓度纯度测定；
[0085]
(2)用hplc-water将引物、探针进行稀释，至浓度为10μm；
[0086]
(3)配制扩增反应体系：aldh2基因rs671多态性的快速分析检测涉及的反应体系由以下组分配制而成：
[0087]
试剂体积/浓度2
×
aceq u probe master mix10.0ul上游引物200-800nm下游引物50-200nm检测探针200-800nmdna模板1uldd-water补足20.0ul
[0088]
pcr扩增程序：95℃30s激活酶活性，95℃15s变性，58℃15s退火，72℃15s延伸并收集荧光，变性、退火、延伸三个步骤重复40个循环。
[0089]
熔解曲线分析程序：95℃1min，37℃2min，60℃至95℃以每秒0.05℃上升并收集荧光。
[0090]
3、结果
[0091]
针对aldh2基因设计了引物和探针，将人类aldh2基因进行特异pcr扩增，并可以对扩增信号进行实时的监控(如图1)。
[0092]
针对rs67多态性位点设计探针，探针5’端修饰fam荧光基团，3’端修饰bhq1淬灭基团，探针会与扩增产物结合杂交，记录熔解曲线熔解峰出现的温度范围，从而对基因进行快速检测。熔解峰出现在右侧58℃左右是纯合子g/g型；熔解峰出现在左侧49℃左右是突变纯合子a/a型；熔解峰出现双峰则为杂合子g/a型(如图2)。g/g野生型、g/a杂合突变型、a/a纯合突变型测序结果如图3，图4和图5。
[0093]
收集了临床50例标本进行比对(包括32例g/g野生型、16例g/a杂合突变型和2例a/a纯合突变型)，以测序结果为金标准，熔解曲线方法结果与测序结果符合率为100％。本发明的基因检测方法，与现有的基因多态性检测方法相比，具有显著提高的特异性和灵敏度。
[0094]
综上，本发明用于检测aldh2基因的试剂盒和方法，对于每个snp位点仅需一条自
淬灭探针，操作简便、快速，在同一反应体系内闭管进行pcr和杂交，减少了pcr扩增产物的交叉污染，结果易判断。准确性高。