鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子的PCR鉴别方法与流程

技术特征：
1.一种鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子的pcr鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）模板dna提取：取供试品用75%乙醇/无水乙醇冲洗2次或擦拭表面，滤纸吸取多余水分，晾干；用研磨仪磨成极细粉末备用，称取干燥供试品约20 mg置1.5 ml离心管中，使用新型植物组织基因组dna提取试剂盒提取样品的dna；（2）pcr扩增反应：鉴别引物，针对正品及两个伪品都有对应的特异性引物，鸡骨草上游引物：5
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caacattctttagtattttttatttcctat-3’，鸡骨草下游引物：5
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cgcgcatggtggattcacaatcc-3’；毛鸡骨草上游引物：5
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cgcattctttagtattgtttatttcgttg-3’，毛鸡骨草下游引物：5
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accttgaaccacttgcctaca-3’；相思子上游引物：5
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gtttttgaaagtaaaggagcaatatcaacag-3’，相思子下游引物：5
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acttggttacatccgccctt-3’；pcr反应体系：反应总体积为25 μl，反应体系包括艾德莱2x f8 longfast pcr mastermix 预混液 12.5 μl，上下游引物（10μmol/l）各0.75 μl，模板dna 1μl，无菌水10μl补足；另取等体积无菌水代替模板dna，作为空白对照；反应条件：将离心管置pcr仪，pcr反应参数：95℃预变性5分钟；循环反应35次（94℃变性15秒，x℃退火15秒，72℃延伸20秒）；72℃延伸5分钟；其中，针对鸡骨草引物，x为58；针对毛鸡骨草，x为54；相思子引物，x为62；（3）琼脂糖电泳检测：照琼脂糖凝胶电泳法（通则0541），配置2%琼脂糖电泳，胶中加入核酸凝胶染色剂gelred，取产物3ul进行上样，dna分子量标记上样量为2.5μl，电泳结束后在在凝胶成像仪上进行检视；供试品凝胶电泳图中，在与对照药材凝胶电泳相应的位置上：鸡骨草和毛鸡骨草在100～200bp间有明显条带，相思子引物扩增的产物在200～300bp间有明显条带，空白对照无条带。2.根据权利要求1所述的鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子的pcr鉴别方法，其特征在于，步骤（1）中使用新型植物组织基因组dna提取试剂盒提取样品的dna的具体提取步骤如下：
①
采用天根高效植物基因组dna提取试剂盒，dp350，在装有供试品的离心管中加入400 μl缓冲液fga，涡旋震荡混匀，室温放置10分钟；加入130 μl缓冲液lp2，充分混匀，涡旋振荡1分钟；12,000rpm离心5分钟，小心将上清转移至新的1.5ml离心管里；
②
加入1.5倍体积的缓冲液lp3，立即充分震荡混匀15秒；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中，12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱cb3放入收集管中；向吸附柱cb3中加入600 μl漂洗液pw，12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中；
③
重复上一步漂洗过程；将吸附柱cb3放回收集管中，12,000 rpm离心2分钟，倒掉废液；将吸附柱cb3置于室温放置2分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱cb3转入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50 μl洗脱缓冲液tb，tb已预先在金属浴中加热至65℃，室温放置5分钟，12,000 rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管
中；
④
小心把离心管中所得全部溶液重新悬空滴加至cb3的吸附膜的中间部位，室温放置5分钟，12,000 rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中；阳性对照模板dna溶液，亦按照上述方法进行。

技术总结
本发明公开了一种鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子的PCR鉴别方法，具体包括模板DNA提取、PCR扩增反应、琼脂糖电泳检测三个步骤。本发明通过找出特异性DNA片段，设计出特异性引物，通过PCR技术扩增出特异性片段，通过聚合酶链式反应(PCR)技术实现了对鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子的高效鉴别。本发明提供的方法简单易行，稳定可靠，采用该方法能够快速准确的对鸡骨草正品及其混伪品毛鸡骨草和相思子进行真伪鉴定，确保用药安全，有助于实现鸡骨草药材市场的健康发展。助于实现鸡骨草药材市场的健康发展。助于实现鸡骨草药材市场的健康发展。


技术研发人员：罗轶 吴桂凡 李立 凌婕 黄清泉
受保护的技术使用者：广西壮族自治区食品药品检验所
技术研发日：2022.04.28
技术公布日：2022/6/10