一种抗人甘胆酸单克隆抗体及其应用的制作方法

一种抗人甘胆酸单克隆抗体及其应用
1.摘要
2.本发明公开了一种抗人甘胆酸的单克隆抗体，所述抗体包括轻链和重链，其中重链可变区氨基酸序列见seq id no：7，轻链可变区氨基酸序列见seq id no：8，本发明公开了制备上述单克隆抗体的方法。本发明所述的抗体能特异性识别人甘胆酸，而不与其他形式的肝酸或游离的甘氨酸小分子相结合，同时具有很好的耐热性和耐酸碱性。基于本发明所述的抗体开发的甘胆酸检测试剂盒具有成本低、灵敏度高、特异性强以及稳定性高等优点。
技术领域
3.本发明涉及生物工程技术领域，具体而言涉及一种抗人甘胆酸的单克隆抗体。


背景技术：

4.胆酸又称为胆汁酸，是人体肝脏合成的一大类胆烷酸的羟基衍生物的总称。按照胆酸是否结合其他成分可分为游离型胆酸与结合型胆酸，人胆汁中主要以结合型胆酸为主，胆酸是天然的离子化去垢剂，会表现出很强的界面活性，能够通过降低脂质、水两相之间的表面张力，使得脂类物质能够较稳定的溶解于胆汁中，因此胆酸具有促进脂类消化吸收、调节胆固醇代谢等重要生理功能。甘胆酸是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸，甘胆酸由干细胞合成，与胆汁一起进入肠道帮助食物消化，并且在回肠末端被重新吸收进入血液，血液中的胆酸会经由肝门静脉再循环回到肝脏。在正常代谢途径中，血液中的甘胆酸经过肝-肠循环会很高效地被干细胞吸收转运，因此正常生理状况下，外周血中的甘胆酸含量极低，一旦肝脏发生病变而导致干细胞摄取甘胆酸的能力下降时，例如胆汁淤积、早期酒精肝损伤、慢性活动性肝炎、急性肝炎、肝硬化、肝癌等，患者外周血中的甘胆酸含量明显高于正常人。因此测定血清甘胆酸已经作为临床评价干细胞功能和肝胆循环功能的敏感指标之一。
5.此外，妇女正常妊娠时其血清甘胆酸的含量也会随着孕周而逐步增加。一方面由于雌激素、孕激素等的影响带来的生理代谢改变，另一方面随着胎儿增大，增加了对血管的压迫，导致肝肠循环受影响并最终带来孕妇外周血甘胆酸水平的升高。如果甘胆酸的含量过高，就可能出现妊娠肝内胆汁淤积症，对胎儿发育造成影响甚至有致婴儿死亡的风险。因此，监测甘胆酸值对于孕妇和胎儿的妊娠安全也具有重要意义。
6.目前，虽然国内外已经获得了多种抗甘胆酸的单克隆抗体，但由于甘胆酸分子的特殊性，
7.这些单克隆抗体很容易受到其他胆酸或甘氨酸的影响，从而导致抗体的特异性不够理想，于此同时，试剂的稳定性是试剂产品质量的一个重要参数，会直接影响保存条件以及检测结果，而试剂的稳定性主要受抗体稳定性的影响。因此，本领域还需要研制对人甘胆酸免疫原亲和性以及特异性更高，耐受血液中甘氨酸以及胆酸等杂质干扰以及具有较好稳定性的抗体，进而开发出灵敏度高、特异性好、稳定性高的诊断试剂盒。


技术实现要素：

8.因此本发明要解决的技术问题就是：针对现有的抗人甘胆酸单克隆抗体灵敏度以及特异性低的缺陷，提供一种抗人甘胆酸单克隆抗体及其应用。
9.第一方面，本发明提供抗人甘胆酸单克隆抗体及其片段，包括轻链cdr1-3和重链cdr1-3，其特征在于，所述重链cdr1-3的氨基酸序列为：
10.cdr1：如序列表中seq id no：1所示；
11.cdr2：如序列表中seq id no：2所示；
12.cdr3：如序列表中seq id no：3所示；
13.所述轻链cdr1-3的氨基酸序列为：
14.cdr1：如序列表中seq id no：4所示；
15.cdr2：如序列表中seq id no：5所示；
16.cdr3：如序列表中seq id no：6所示。
17.优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中seq id no：7所示。
18.优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中seq id no：8所示。
19.优选地，所述重链可变区的核苷酸序列如序列表中seq id no：9所示。
20.优选地，所述轻链可变区的核苷酸序列如序列表中seq id no：10所示。
21.另一方面，本发明提供一种甘胆酸检测的试剂、试纸或试剂盒，所述试剂、试纸或试剂盒包含上述抗人甘胆酸单克隆抗体。
22.优选地，所述试剂盒采用的方法学为胶乳增强免疫比浊法。
23.与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：
24.(1)本发明提供的抗人甘胆酸单克隆抗体对血清中天然的甘胆酸抗原具有良好的亲和力和特异性，能够避免血液中甘氨酸以及胆酸等杂质带来的干扰，同时具有良好的热稳定性以及ph稳定性，可以作为甘胆酸检测的关键原料，为建立快速、灵敏检测甘胆酸的临床诊断试剂提供重要原料。
25.(2)本发明提供的甘胆酸检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)能够耐受血液中甘氨酸以及胆酸的干扰，同时具有较好的稳定性，能够对病人血液中的甘胆酸含量进行快速、准确的检测，进而对病人是否发生肝脏疾病进行准确诊断。
附图说明
26.图1为甘胆酸基因工程抗体的特异性鉴定结果；
27.图2为间接免疫荧光检测抗体热稳定性效果图。附图中各部件的标记如下：a图为本发明抗体的热稳定性效果图；b图为对照抗体的热稳定性效果图；
28.图3为间接免疫荧光检测抗体ph稳定性效果图；附图中各部件的标记如下：a图为本发明抗体的ph稳定性效果图；b图为对照抗体的ph稳定性效果图；
29.图4为甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的校准曲线图。附图中各部件的标记如下： a图为实施例7中采用本发明抗体制备的试剂盒的校准曲线图；b图为实施例7中采用对照抗体制备的试剂盒的校准曲线图；
30.图5为甘胆酸胶乳增强免疫比浊检测试剂盒抗干扰性效果图。附图中各部件的标记如下：a图以及b图为实施例7中采用本发明抗体制备的试剂盒的抗干扰实验效果图；c图
处的吸光值。只有能耐受胆酸和甘氨酸竞争的抗体，同时又能够被甘胆酸有效抑制的抗体才会通过筛选。
44.(4)经过筛选后得到能特异性识别甘胆酸抗原且耐受胆酸和甘氨酸干扰的的杂交瘤细胞，该杂交瘤表达本发明所述的抗人甘胆酸单克隆抗体，通过有限稀释法亚克隆，获得目标单克隆细胞株。
45.实施例4：单克隆抗体的生产纯化
46.使用6-8周balb/c小鼠，腹腔注射500μl无菌石蜡油以抑制小鼠免疫反应，注射一周之后向腹腔内注入约1x106数量的目的杂交瘤细胞，两周之后开始采集腹水。在采集的腹水中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵，放置于冰上搅拌30分钟，4℃12000g离心10分钟，沉淀经亲和柱纯化后得到目的抗体。
47.实施例5：单克隆抗体的亚型鉴定及基因序列克隆
48.(1)甘胆酸单克隆抗体重轻链可变区的扩增及序列测定
49.单克隆细胞长期保存，可能由于多次传代后不稳定及污染问题导致阳性克隆丢失，为解决上述问题，在本发明过程中，利用分子生物学技术，对阳性单克隆细胞株进行重链可变区 (mvh)和轻链可变区(mvl)基因扩增，并进行序列鉴定。
50.具体方法如下：收集生长状态良好的杂交瘤细胞，利用thermo公司的trizol提取杂交瘤细胞总rna，按照takara公司的primescript ii reverse transcriptase说明书的操作方法将mrna逆转录为cdna，-20℃冻存备用。具体操作流程如下。首先配制10μl总体积的模板rna/引物dna的预混液，其中包括1μl 10μm浓度的特异引物(序列为 tgggtgtctctttggacctgagagt以及gaagcctccaagaccttagaagggaa)，4μl浓度为2.5mm的 dntp混合液，5μl rna(总量小于5μg)。混匀之后于65℃处理5分钟，立即放于冰上。向预混液中加入4μl 5
×
primescript ii缓冲液，20单位的rna酶抑制剂，1μl primescriptii rtase(200单位)，混匀之后于42℃反应60分钟，再于70℃处理15分钟，之后放于冰上冷却备用。
51.以cdna为模板，采用文献报道的抗体基因扩增引物分别独立进行扩增尝试，筛选出能够高效扩增抗体基因的引物。重链所采用的引物组合为(gatgtgaagcttcaggagtc和 tcatttacccggagtccggga)，轻链所采用的引物组合为(gatgttttgatgacccaaact和 ctaacactcattcctgttgaagctcttg)分别pcr获得抗体的轻链和重链片段。按南京诺唯赞公司的phanta max super-fidelity dna polymerase说明书的操作方案进行pcr，pcr反应体系为：25μl 2
×
phanta，1μl dntp，4μl 10μm引物对，4μl杂交瘤细胞cdna，1μldna polymerase，15μl dd h2o，总反应体积为50μl。扩增条件为：预变性94℃，3min；变性94℃，30s；退火56℃，30s；延伸72℃，2min。按照omega公司omega gel extractionkit说明书对pcr产物进行胶回收，进行测序分析，获得杂交瘤细胞的重链可变区氨基酸序列为seq.id.no.7，轻链可变区序列氨基酸序列为seq.id.no.8。
52.重链可变区氨基酸序列为seq.id.no.7:
53.aspvalglnleuglnglualaglyproglyleuvallysproserglnsermetserleuthrcysservalthrg lyserserilethrhisglythrtyrtrpasntrpileargglnpheproglyasnasnleuglutrpmetglytyrleu thrtyrgluglyalaasnlystyrasnproserleulysasnargileserilethrargaspthrserasnasnglnph epheleuasnleuasnservalthrthrgluaspthralathrtyrtyrcysasnil
easntyrargtyrasplysaspp hetrpglyglnglythrthrleuthrvalserser
54.轻链可变区序列氨基酸序列为seq.id.no.8:
55.aspvalvalmetthrglnthrproleuthrleuservalserleuglyglnproalaserilesercyslysthrs erglnserleuiletyrserpheglylysthrthrleuasntrpleuleuglnargproglyhisserprolysargleu iletyrleualaserglnleuaspserglyvalproaspargpheserglyserglyserglythraspphethrleuly sileserargvalaspalagluaspleuglyiletyrtyrcysalaalaglythrhistyrprophethrpheglyargg lythrlysleugluilelys
56.(2)甘胆酸单克隆抗体重轻链可变区序列鉴定
57.将重链可变区序列克隆入pfusess-chig-mg2b-tds(invitrogen)载体，轻链可变区序列克隆入pfuse2ss-clig-mk-tds(invitrogen)载体，分别挑取博来霉素与杀稻瘟菌素抗性的菌斑，扩大培养后进行质粒抽提，并进行测序分析，选取测序结果正确的质粒共同转染入人胚胎肾上皮细胞hek293a、中国仓鼠卵巢细胞cho细胞(购自中科院昆明细胞库)，收集48 h后的细胞上清液，4000g离心30min，去除上清中细胞等杂质，并用0.45μm滤器过滤除菌后进行间接elisa实验，检测上清液中是否存在相应的甘胆酸抗体，结果如图1所示，细胞上清能够检测到甘胆酸抗体，表明筛选的甘胆酸单克隆抗体的重、轻链可变区具有较好的特异性且能够通过转染适当的受体细胞如hek293、cho细胞等表达出甘胆酸抗体。
58.实施例6：单克隆抗体的生化稳定性测定
59.将实施例4纯化得到的甘胆酸抗体和对照抗体(购自cosmo bio，fka-504-e)与荧光标签偶连，而后分别置于4℃、16℃、25℃、37℃、50℃、60℃、70℃、80℃的水浴锅中水浴30min，取出恢复至室温后，各取100μl上清与聚苯乙烯板中，检测其荧光强度，分析抗体的热稳定性。结果如图2所示，其中a为本发明的甘胆酸抗体，b为对照抗体，在温度为30-50℃范围内时，本发明抗体具有较好的稳定性，在80℃时几乎完全丧失稳定性。而对照抗体在温度为35-45℃内稳定性较好，在75℃时几乎完全丧失稳定性。实验结果说明本发明的甘胆酸抗体具有较好的热稳定性。
60.同时，将实施例4纯化得到的甘胆酸抗体和对照抗体与荧光标签偶连，而后分别置于ph 值为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的缓冲液体系中孵育30min，随后各取100μl 于聚苯乙烯板中，检测其荧光强度，分析抗体的ph稳定性。结果如图3所示，其中a为本发明的甘胆酸抗体，b为对照抗体，在ph＜7的范围内，本发明抗体随ph值的降低而降低，在 ph＝3时几乎丧失稳定性，在ph＞8的范围内稳定性逐渐下降，在ph＝11时丧失稳定性，而对照抗体在ph小于4以及大于9时即丧失稳定性。实验结果说明本发明的甘胆酸抗体具有较好的ph稳定性。
61.实施例7甘胆酸含量检测试剂盒的制备
62.本实施例中所述甘胆酸检测试剂盒采用竞争免疫比浊测定方法，该方法是将含有甘胆酸的样本与甘胆酸-蛋白偶联物竞争结合甘胆酸抗体胶乳颗粒，与甘胆酸结合的甘胆酸抗体胶乳颗粒不产生浊度，而与甘胆酸-蛋白偶联物结合的甘胆酸抗体胶乳颗粒会产生浊度变化，甘胆酸结合甘胆酸抗体胶乳颗粒的效率优于甘胆酸-蛋白偶联物，故样本中甘胆酸含量越高，反应所产生的浊度越低，浊度下降的程度与样本中甘胆酸含量成反比，使用全自动生化分析仪即可计算出样本中的甘胆酸含量。所述甘胆酸含量检测试剂盒的制备方法如下：
63.(1)甘胆酸-蛋白偶联物
64.试剂准备：
65.a液:准确称取2mg甘胆酸，将其溶解在100μl dmf试剂中；b液：用dmf配制89.4mg/ml 的nhs溶液；c液：用dmf配制60.2mg/ml的dcc(二环己基碳二亚胺)溶液；d液：称取 16mgbsa(牛血清白蛋白)，将其溶解在1ml ph为7.2的0.02mol/l磷酸盐缓冲液溶液中。
66.试剂配置：
67.分别取b液和c液各30.7μl加到100μl a液中，室温下搅拌90min；搅拌完毕的混合液加到d液中并剧烈混合，在4℃条件下搅拌12h；把反应液放入ph为7.4浓度0.01mol/lpbs溶液中透析12h，即得到甘胆酸-蛋白偶联物。
68.(2)甘胆酸抗体胶乳制备
69.取3.0g乳胶颗粒(购自jsr公司)加入ph为5.5，浓度为80mmol/l的2-吗啉代乙磺酸缓冲液300ml中，搅拌30分钟；往上述溶液中，添加40ml浓度为0.067mg/ml碳化二亚胺以及40ml浓度为0.033mg/ml n羟基琥珀酰亚胺，孵育45分钟，15000g/min离心15min，去掉上清液，用ph为8.2，浓度为0.1mol/l的磷酸盐缓冲液300ml重悬，即得胶乳颗粒混悬液，随后用ph为8.2，浓度为0.1mol/l的磷酸盐缓冲液调整体积至1400ml；之后将上述反应溶液分成等量的两份；分别将180mg实施例4制备得到的甘胆酸抗体以及对照抗体，加入到300ml ph8.2、0.1mol/l磷酸缓冲液中，搅拌均匀，然后分别缓慢的加入到上述的胶乳溶液中；抗体添加完毕后，把上述乳胶混合物置于37度的摇床中，反应2-4h；反应完全后，把0.5g/ml甘氨酸10ml加到上述混合中，反应30min；反应完全后，加入5g牛血清白蛋白，混合均匀后，室温放置12h，9000rpm/min离心15min，去掉上清液，用ph为8.2，浓度为 0.1mol/l的磷酸盐缓冲液500ml重悬，得到胶乳颗粒混悬液；将得到的胶乳颗粒混悬液再 9000rpm/min离心15min，去上清液，用500ml ph8.2、浓度0.1mol/l的磷酸盐缓冲液重悬；将再次重悬后所得的胶乳颗粒混悬液用ph8.2、浓度0.1mol/l的磷酸盐缓冲液把体积调整至 1000ml，即得实施例4制备的甘胆酸抗体包被的胶乳颗粒溶液以及对照抗体包被的胶乳颗粒溶液。
70.(3)制备试剂r1
71.将步骤(1)中制备获得的甘胆酸-蛋白偶联物与缓冲液充分混合即得甘胆酸r1试剂，所述缓冲液为浓度10-100mm的tirs-hcl溶液，所述缓冲液的ph值为7-8；所述缓冲液中含有浓度2-6wt％的peg-6000、0.7-0.9wt％的氯化钠、0.05-0.1wt％的叠氮钠、0.3wt％的pc-300 (购自supelco公司)、0.1-1wt％牛血清白蛋白以及20mm edta；所述甘胆酸r1试剂中甘胆酸-蛋白偶联物的浓度为0.05-2mg/ml；
72.(4)制备试剂r2
73.将步骤(2)中制备获得的两种甘胆酸-蛋白抗体包被的胶乳颗粒分别与悬浮缓冲液混合即得两种甘胆酸r2试剂，所述悬浮缓冲液为含有稳定剂和防腐剂的浓度为20-100mm的甘氨酸-na0h缓冲液；所述稳定剂由终浓度0.1-1.0wt％的牛血清白蛋白、0.7-0.9wt％的氯化钠、 5-50mm的乙二胺四乙酸二钠、体积浓度0.1-1.0％tx-100组成；所述防腐剂为pc-300，终体积浓度为0.05-0.1％；所述甘胆酸r2试剂中甘胆酸-蛋白抗体包被的胶乳颗粒的质量浓度为 0.05-1.0％。
74.将上述步骤(3)中制备获得的试剂r1分别与步骤(4)中制备的两种试剂r2组合，即得采用本发明实施例4纯化得到的甘胆酸抗体制备的甘胆酸检测试剂盒以及采用对照抗体
制备得到的甘胆酸检测试剂盒。
75.实施例8：甘胆酸含量检测试剂盒临床实验
76.(1)标准曲线建立
77.称取60.57mg的tris、87.66mg的nacl、186.12mg的edta
·
na2和100mg的bsa，溶于溶于8ml的蒸馏水中，调节ph值至7.5，定容至10ml，搅拌使其完全混匀，并经过0.22μm 滤膜抽滤，得到标准品稀释液。用上述标准品稀释液溶解实施例1制备的甘胆酸免疫原，制备不同浓度的标准品(0ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)。用实施例7制备的两种甘胆酸含量检测试剂盒测定不同浓度标准品中甘胆酸的含量。该方法为两点终点法，采用日立7180生化分析仪测定，包括以下步骤：向10μl待检测样本(校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品)中加入200μl的试剂1充分混匀，于37℃孵育 5分钟，再向混合体系中加入50μl试剂2，混匀，37℃恒温1分钟后，空白管调零，波长 546nm，测定各管吸光度a1，4分钟后测定各管吸光度a2。计算δa＝a2-a1。根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值δa，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。
78.采用实施例7制备的甘胆酸检测试剂盒及测量方法，采用日立7180生化分析仪测得的上述6种不同含量的甘胆酸标准品的曲线，结果如图4所示，其中每个点代表一个含量的参考标准品，其中x轴表示甘胆酸含量(ng/ml)，y轴表示吸光度。
79.(2)甘胆酸含量检测试剂盒干扰性实验
80.将浓度为3mmol/l甘胆酸抗原蛋白与浓度为3mmol/l的甘氨酸以及3mmol/l的胆酸等体积混匀，随后用不含甘胆酸的血清作为稀释液，分别稀释甘胆酸抗原蛋白以及甘胆酸抗原蛋白、甘氨酸和胆酸的混合液，分别配置浓度为30μmol/l、60μmol/l、100μmol/l、150 μmol/l、300μmol/l、600μmol/l、1200μmol/l、1800μmol/l、2400μmol/l以及 3000μmol/l的稀释样品，按照上述条件，用实施例7制备的两种甘胆酸含量检测试剂盒分别测定各稀释样品中甘胆酸的含量。结果如图5所示，采用实施例4纯化的抗甘胆酸单克隆抗体制备的试剂盒测定甘胆酸抗原蛋白以及甘胆酸抗原蛋白、甘氨酸和胆酸的混合液浓度的线性相关系数和回归直线斜率在浓度范围为30μmol/l-300μmol/l以及300μmol/l-3000 μmol/l内均达到了0.99以上，而采用对照抗体制备的检测试剂盒测定后的线性相关系数和回归直线斜率在浓度范围为30μmol/l-300μmol/l内时为0.95，而在浓度范围为300 μmol/l-3000μmol/l内时仅为0.79。实验结果表明，采用实施例4纯化的抗甘胆酸单克隆抗体制备的检测试剂盒能够耐受甘氨酸以及胆酸对甘胆酸含量测定的干扰。
81.实施例9：甘胆酸含量检测试剂盒的临床实验
82.分别选取30例健康人血清和30例临床确证已发生肝脏疾病病人的血清，按照上述条件，用实施例7制备的两种甘胆酸含量检测试剂盒分别测定各血清中甘胆酸的含量。结果如图6 所示，采用实施例4纯化的抗甘胆酸单克隆抗体制备的检测试剂盒能够明显区分出正常组和病例组样本，而采用对照抗体制备的检测试剂盒未能明显区分，实验结果说明基于本发明的抗甘胆酸抗体制备的甘胆酸含量检测试剂盒能够对甘胆酸含量进行准确测量，能够满足临床检测的需求。
83.84.85.86.