异嗜性抗体阻断剂HBR-7及其制备方法与流程

异嗜性抗体阻断剂hbr-7及其制备方法
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，特别涉及一种异嗜性抗体阻断剂hbr-7及其制备方法。


背景技术：

2.阻断剂是一种能消除免疫测试干扰的试剂。免疫测试干扰大部分是由病人样本中异噬性抗体和试剂溶液中检测用抗体之间产生非特异性交叉结合引起的，异噬性抗体即为人抗动物免疫球蛋白抗体(如human anti-mouse antibody,hama)，这类异噬性抗体在免测测试中会导致错误的检测结果。
3.异噬性抗体会导致“假阴性”或“假阳性”检测结果，尤其在双抗体夹心法检测方法中。在样本中没有目标分析物质时，异噬性抗体可能会结合检测用抗体，形成假阳结果，在样本中存在目标分析物质时，被异噬性抗体检测用抗体可能因为空间位阻无法与目标分析物结合，形成假阴结果。
4.消除异噬性抗体干扰的常用方法为添加异噬性抗体阻断剂。在免疫诊断试剂盒中添加高效纯化鼠igg是消除由hama造成干扰的一种有效方法，同时为了提高阻断效果，将单体鼠igg交联获得交联型igg聚体可有效地提高阻断效果。
5.阻断剂市场用量非常大，常用的鼠igg大规模纯化方法为硫酸铵分级沉淀法，辛酸-硫酸铵法或亲和法，其纯化方法较为粗犷，纯化出的鼠igg存在规模放大、纯度、稳定性等问题，且操作较为复杂。将单体igg变为聚体igg的方法有物理方法和化学方法，物理方法常采用高温处理、低ph处理等，这类方法可控性差、形成聚体能力有限且对抗体有一定的损害，因此使igg抗体多聚化的方法多为化学方法，即利用一些化学试剂与抗体氨基酸残基上的羧基或氨基反应，通过形成分子间共价键将igg单体交联成聚体，常用的化学试剂有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)、双琥珀酰亚胺辛二酸酯(dss)、戊二醛等试剂。通过化学交联形成的igg多聚体会大幅度提高鼠igg对检测样本中异噬性抗体干扰的消除能力。
6.本发明采用戊二醛法对单体igg进行交联获得聚合型hbr-7。


技术实现要素：

7.为了解决现有技术中的问题，本发明提供了一种异嗜性抗体阻断剂hbr-7及其制备方法，异嗜性抗体阻断剂hbr-7具备良好阻断异噬性抗体干扰能力，其单体鼠igg包括其可变区的氨基酸序列和核苷酸序列。
8.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
9.一种异嗜性抗体阻断剂hbr-7，异嗜性抗体阻断剂hbr-7单体igg，包括轻链和重链，其中，
10.轻链的3个互补决定区cdr序列分别为，
11.cdr1：stgavttinfa，
12.cdr2：gtgnqyin，
13.cdr3：alenyswwv；
14.重链的3个互补决定区cdr序列分别为，
15.cdr1：gsifgytgytm，
16.cdr2：pyligntls，
17.cdr3：ayrdgyfdy。
18.进一步的，所述轻链的3个互补决定区cdr1、cdr2、cdr3的序列分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3所示；所述重链的3个互补决定区cdr1、cdr2、cdr3的序列分别如seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6所示。
19.进一步的，所述轻链可变区氨基酸序列如seq id no.7所示；所述重链可变区氨基酸序列如seq id no.8所示。
20.进一步的，所述轻链可变区核苷酸序列如seq id no.9所示；所述重链可变区核苷酸序列如seq id no.10所示。
21.一种异嗜性抗体阻断剂hbr-7的制备方法，包括以下步骤：
22.s1、proteing亲和法纯化单体；
23.s2、戊二醛交联获得聚合型hbr-7；
24.s3、聚合型hbr-7处理；
25.s4、缓冲液及保存液的配制。
26.进一步的，所述步骤s1包括以下步骤：
27.s11、样品准备：冷冻的hbr-7腹水在10-15℃融化，先用脱脂棉过滤，再用20微米孔径滤纸过滤，去除油脂、沉淀蛋白和组织碎片；
28.柱准备：填装500ml protein g填料，用纯化水洗涤5-10倍柱体积，去除乙醇；
29.s12、平衡：protein g柱用平衡缓冲液10mm ph＝7.2的pbs平衡5倍柱体积，柱平衡好后将蛋白紫外检测仪显示值a280值调整为0，作为基线；
30.s13、上样：取腹水用两倍体积的平衡缓冲液10mm ph 7.2的pbs稀释作为样品上样，使用蠕动泵在20-25℃条件下上样，流速为5-6ml/min；
31.s14、平衡：上样完成后再用平衡缓冲液10mm ph 7.2的pbs平衡5-10倍柱体积，平衡至无蛋白流出，即蛋白紫外检测值a280显示值为0；
32.s15、解离：平衡完成后使用0.1m甘氨酸缓冲液进行解离，当蛋白紫外检测仪显示值大于0.3时开始收集蛋白，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.3时停止收集蛋白，收集管中预先加入0.1倍收集体积的2m ph8.0的tris和0.03倍收集体积的5m nacl；
33.s16、平衡：解离完成后继续用0.1m甘氨酸缓冲液洗涤柱至无蛋白流出，用平衡缓冲液10mm ph＝7.2的pbs平衡柱5-10倍柱体积；
34.s17、透析：合并收集蛋白组分，收样量为11.5g-12.0g，浓度不低于13mg/ml，使用交联缓冲液60mm醋酸进行透析，透析比例1:20，换液3次，透析间隔不低于4小时；
35.s18、重复6次步骤s12-s17，收集纯化所得的抗体。
36.进一步的，所述步骤s2包括以下步骤：
37.s21、量取步骤s1中纯化得到的抗体体积，倒入烧杯中，置于冰浴1h；
38.s22、将冰浴放在在磁力搅拌器上，在交联过程中始终保持冰量没过抗体液面，搅
拌且用1ml移液枪加入25％戊二醛，即250mg/ml至终浓度为0.4mg/ml，速度为25s/ml；
39.s23、继续冰浴搅拌30-35min；
40.s24、均匀加入2m甘氨酸至终浓度为0.01m，速度为10s/ml，使用磁力搅拌器搅拌30min，取样进行hplc检测；
41.s25、样品使用0.01m ph7.4的pbs 2％甘油保存缓冲液透析，透析比例1:20，换液3次，透析间隔不低于4小时。
42.进一步的，所述步骤s3包括以下步骤：
43.s31、解透析袋，抗体在4℃下离心10min，离心时转速为9000rpm/min，400目滤布过滤抗体；
44.s32、使用nano300紫外分光光度计测定抗体浓度，用0.01m ph7.4的pbs 2％甘油缓冲液稀释至12.5mg/ml，将抗体浓度乘以系数0.8，即为最终浓度并记录测量结果；
45.s33、所述步骤s32中处理好的抗体中加入0.1％抗体体积的proclin300防腐剂，混合均匀，使用0.22μm滤膜过滤；抗体外观为淡黄色透明液体，无明显沉淀和絮状物；4℃保存，避免冻融；使用时，用10mm ph7.4的pbs稀释，使用浓度≤25μg/ml。
46.进一步的，所述步骤s4包括：
47.s41、制备交联缓冲液60mm醋酸，ph6.0：
48.称取4.059g三水合乙酸钠，量取7.2ml 36％乙酸，倒入1l烧杯中，再加入纯化水，搅拌溶解，2.5m naoh调节ph至6.0，纯化水定容至1l；
49.s42、制备透析缓冲液10mm pbs，ph7.2：
50.称取2.87g na2hpo4·
12h2o、0.31g nah
2 po4·
2h2o和9g nacl，倒入1l烧杯中，再加入纯化水，搅拌溶解，2.5m naoh调ph至7.2，纯化水定容至1l；
51.s43、制备透析缓冲液10mm pbs，ph7.4：
52.称取2.87g na2hpo4·
12h2o、0.31g nah
2 po4·
2h2o和9g nacl，倒入1l烧杯中，再加入纯化水，搅拌溶解，2.5m naoh调ph至7.4，纯化水定容至1l；
53.s44、制备0.1m甘氨酸缓冲液，ph2.7：
54.称取7.51g甘氨酸，倒入1l烧杯中，再加入纯化水，搅拌溶解，用浓盐酸调ph至2.7，纯化水定容至1l；
55.s45、制备5m nacl：
56.称取292.2g nacl，倒入1l烧杯中，再加入超纯水，搅拌溶解，超纯水定容至1l，
57.s46、制备2m tris，ph8.0：
58.称取242.18g tris，倒入1l烧杯中，再加入纯化水，搅拌溶解，用浓盐酸调ph至8.0，纯化水定容至1l；
59.s47、制备保存缓冲液0.01m ph7.4的pbs 2％甘油：
60.称取2.87g na2hpo4·
12h2o、0.31g nah2po4·
2h2o、9g nacl和20ml甘油，倒入1l烧杯中，再加入纯化水，搅拌溶解，2.5m naoh调ph至7.4，纯化水定容至1l。
61.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
62.本发明筛选出异嗜性抗体阻断剂hbr-7单体igg，并获得其重链和轻链可变区，测序后得到其独特的核苷酸序列，采用戊二醛法将单体igg交联获得聚合型hbr-7，具有良好异噬性抗体阻断效果。
63.本发明中igg单体纯化方法：使用protein g纯化出的抗体纯度高，稳定性强，更有利于批量生产方面。
64.本发明中hbr-7制备(igg单体交联)：使用透析缓冲液60mm醋酸(ph 6.0)进行透析使产品有更好的交联效果，聚体含量更高，保存缓冲液0.01m pbs(ph7.4) 2％甘油提高产品稳定性。
附图说明
65.图1是阻断剂hbr-7的聚合效果图，其中：1为有效部分聚合型，2为单体igg；
66.图2是亲和力数据结果图。
具体实施方式
67.下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。
68.实施例1
69.一种异嗜性抗体阻断剂hbr-7，异嗜性抗体阻断剂hbr-7单体igg，包括轻链和重链，其中，
70.轻链的3个互补决定区cdr序列分别为，
71.cdr1：stgavttinfa，
72.cdr2：gtgnqyin，
73.cdr3：alenyswwv；
74.重链的3个互补决定区cdr序列分别为，
75.cdr1：gsifgytgytm，
76.cdr2：pyligntls，
77.cdr3：ayrdgyfdy。
78.轻链的3个互补决定区cdr序列分别为，
79.cdr1：seq id no.1：ser-thr-gly-ala-val-thr-thr-ile-asn-phe-ala，
80.cdr2：seq id no.2：gly-thr-gly-asn-gln-tyr-ile-asn，
81.cdr3：seq id no.3：ala-leu-glu-asn-tyr-ser-trp-trp-val；
82.重链的3个互补决定区cdr序列分别为，
83.cdr1：seq id no.4：gly-ser-ile-phe-gly-tyr-thr-gly-tyr-thr-met，
84.cdr2：seq id no.5：pro-tyr-leu-ile-gly-asn-thr-leu-ser，
85.cdr3：seq id no.6：ala-tyr-arg-asp-gly-tyr-phe-asp-tyr。
86.轻链可变区氨基酸序列：seq id no.7：
87.》light-chain
88.glnalavalvalthrglngluseralaleuthrthrserproglygluthrvalthrleuthrcysargserserthrglyalavalthrthrileasnphealaasntrpvalglnglulysproasphisleuphethrglyleuileglythrglyasnglntyrileasnargalaproglyvalproalaargpheserglyserleuileglyasplysalaalaleuthrilethrglyalaglnthrgluaspglualailetyrphecysalaleugluasntyrsertrptrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleuglyglnprolysserserproservalthrleupheproproserserglugluleugluthrasnlysalathrleuvalcysthrilethraspphetyrproglyvalv
althrvalasptrplysvalaspglythrprovalthrglnglymetgluthrthrglnproserlysglnserasnasnlystyrmetalasersertyrleuthrleuthralaargalatrpgluarghissersertyrsercysglnvalthrhisgluglyhisthrvalglulysserleuser
89.重链可变区氨基酸序列：seq id no.8：
90.》heavy-chain
91.gluvalglnleuglnglnserglyprogluleuvalargproglyalasermetlysilesercyslysalaserglyserilepheglytyrthrglytyrthrmetasntrpvallysglnserhisglylysasnleuglutrpileglyprotyrleuileglyasnthrleusertyrasnglnlysphelysglylysalathrleuthrvalasplysserserserthralatyrmetgluleuleuserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcysalatyrargaspglytyrpheasptyrtrpglyglnglythrthrleuthrvalserseralalysthrthrproproservaltyrproleualaproglyseralaalaglnthrasnsermetvalthrleuglycysleuvallysglytyrpheprogluprovalthrvalthrtrpasnserglyserleuserserglyvalhisthrpheproalavalleuglnseraspleutyrthrleuserserservalthrvalproserserthrtrpprosergluthrvalthrcysasnvalalahisproalaserserthrlysvalasplyslysilevalproargaspcysglycyslysprocysilecysthrvalprogluvalserservalpheilepheproprolysprolysaspvalleuthrprothrleuthrprolysvalthrcysvalvalvalalaileserlysaspaspprogluvalglnphesertrpphevalaspaspvalgluvalhisthralaglnthrglnproargglugluglnpheasnserthrpheargservalsergluleuproilemethisglnasptrpleuasnglylyslysgluphelyscysargvalasnseralaalapheproalaproileglulysthrileserlysthrlysglyargprolysalaproglnvaltyrthrileproproprolysgluglnmetalalysasplysvalserleuthrcysmetilethraspphepheprogluaspilethrvalglutrpglntrpasnglyglnproalagluasntyrlysasnthrglnproilemetaspthraspglysertyrphevaltyrserlysleuasnvalglnlysserasntrpglualaglyasnthrphethrcyssercysleuhisgluglyleuhisasnhishisthrglulysserleuserhisserproglylys
92.轻链可变区核苷酸序列：seq id no.9：
93.》light-chain
94.caggcggtggtgacccaggaaagcgcgctgaccaccagcccgggcgaaaccgtgaccctgacctgccgtagcagcaccggcgcggtgaccaccattaactttgcgaactgggtgcaggaaaaaccggatcatctgtttaccggcctgattggcaccggcaaccagtatattaaccgtgcgccgggcgtgccggcgcgttttagcggcagcctgattggcgataaagcggcgctgaccattaccggcgcgcagaccgaagatgaagcgatttatttttgcgcgctggaaaactatagctggtgggtgtttggcggcggcaccaaactgaccgtgctgggccagccgaaaagcagcccgagcgtgaccctgtttccgccgagcagcgaagaactggaaaccaacaaagcgaccctggtgtgcaccattaccgatttttatccgggcgtggtgaccgtggattggaaagtggatggcaccccggtgacccagggcatggaaaccacccagccgagcaaacagagcaacaacaaatatatggcgagcagctatctgaccctgaccgcgcgtgcgtgggaacgtcatagcagctatagctgccaggtgacccatgaaggccataccgtggaaaaaagcctgagc
95.重链可变区核苷酸序列：seq id no.10：
96.》heavy-chain
97.gaagtgcagctgcagcagagcggcccggaactggtgcgtccgggcgcgagcatgaaaattagctgcaaagcgagcggcagcatttttggctataccggctataccatgaactgggtgaaacagagccatggcaaaaacctggaatggattggcccgtatctgattggcaacaccctgagctataaccagaaatttaaaggcaaagcgaccctgaccgtgg
ataaaagcagcagcaccgcgtatatggaactgctgagcctgaccagcgaagatagcgcggtgtattattgcgcgtatcgtgatggctattttgattattggggccagggcaccaccctgaccgtgagcagcgcgaaaaccaccccgccgagcgtgtatccgctggcgccgggcagcgcggcgcagaccaacagcatggtgaccctgggctgcctggtgaaaggctattttccggaaccggtgaccgtgacctggaacagcggcagcctgagcagcggcgtgcatacctttccggcggtgctgcagagcgatctgtataccctgagcagcagcgtgaccgtgccgagcagcacctggccgagcgaaaccgtgacctgcaacgtggcgcatccggcgagcagcaccaaagtggataaaaaaattgtgccgcgtgattgcggctgcaaaccgtgcatttgcaccgtgccggaagtgagcagcgtgtttatttttccgccgaaaccgaaagatgtgctgaccccgaccctgaccccgaaagtgacctgcgtggtggtggcgattagcaaagatgatccggaagtgcagtttagctggtttgtggatgatgtggaagtgcataccgcgcagacccagccgcgtgaagaacagtttaacagcacctttcgtagcgtgagcgaactgccgattatgcatcaggattggctgaacggcaaaaaagaatttaaatgccgtgtgaacagcgcggcgtttccggcgccgattgaaaaaaccattagcaaaaccaaaggccgtccgaaagcgccgcaggtgtataccattccgccgccgaaagaacagatggcgaaagataaagtgagcctgacctgcatgattaccgatttttttccggaagatattaccgtggaatggcagtggaacggccagccggcggaaaactataaaaacacccagccgattatggataccgatggcagctattttgtgtatagcaaactgaacgtgcagaaaagcaactgggaagcgggcaacacctttacctgcagctgcctgcatgaaggcctgcataaccatcataccgaaaaaagcctgagccatagcccgggcaaa
98.如表1所示，异嗜性抗体阻断剂hbr-7备良好的亲和力，被异噬性抗体结合能力，与其他阻断剂相比如下表所示：
99.表1
100.loading sample idresponsekd(m)kon(1/ms)kdis(1/s)本发明阻断剂0.8751.01e-104.25e 054.29e-05其他阻断剂0.84351.21e-105.28e 056.38e-05
101.实施例2
102.一种异嗜性抗体阻断剂hbr-7的制备方法，包括以下步骤：
103.s1、proteing亲和法纯化单体，包括以下步骤：
104.s11、样品准备：冷冻的hbr-7腹水在10-15℃融化，先用脱脂棉快速过滤，再用20微米孔径快速滤纸过滤，去除油脂、沉淀蛋白和组织碎片；
105.柱准备：填装500ml protein g填料，用纯化水洗涤5-10倍柱体积，去除乙醇；
106.s12、平衡：protein g柱用平衡缓冲液10mm pbs(ph 7.2)平衡5倍柱体积，柱平衡好后将蛋白紫外检测仪显示值a280值调整为0，作为基线；
107.s13、上样：取腹水用两倍体积的平衡缓冲液10mmpbs(ph 7.2)稀释作为样品上样，使用蠕动泵在20-25℃条件下上样，流速为5-6ml/min；
108.s14、平衡：上样完成后再用平衡缓冲液10mm pbs(ph 7.2)平衡5-10倍柱体积，平衡至无蛋白流出，即蛋白紫外检测值a280显示值为0；
109.s15、解离：平衡完成后使用0.1m甘氨酸缓冲液(ph 2.7)进行解离，当蛋白紫外检测仪显示值大于0.3时开始收集蛋白，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.3时停止收集蛋白，收集管中预先加入0.1倍收集体积的2m tris(ph8.0)和0.03倍收集体积的5m nacl；
110.s16、平衡：解离完成后继续用0.1m甘氨酸缓冲液(ph 2.7)洗涤柱至无蛋白流出，用平衡缓冲液10mm pbs(ph 7.2)平衡柱5-10倍柱体积；
111.s17、透析：合并收集蛋白组分，收样量为11.5g-12.0g，浓度不低于13mg/ml，使用
交联缓冲液60mm醋酸(ph 6.0)进行透析，透析比例1:20，换液3次，透析间隔不低于4小时；
112.s18、重复6次步骤s12-s17，收集纯化所得的抗体；
113.s2、戊二醛交联获得聚合型hbr-7，包括以下步骤：
114.s21、量取步骤s1中纯化得到的抗体体积，倒入烧杯中，置于冰浴1h；
115.s22、将冰浴放在在磁力搅拌器上，在交联过程中始终保持冰量没过抗体液面，快速搅拌且用1ml移液枪加入25％戊二醛(250mg/ml)至终浓度为0.4mg/ml，速度为25s/ml；
116.s23、继续冰浴搅拌30-35min；
117.s24、均匀加入甘氨酸(2m)至终浓度为0.01m，速度为10s/ml，使用磁力搅拌器搅拌30min，取样进行hplc检测；
118.s25、样品使用0.01m pbs(ph 2.4) 2％甘油保存缓冲液透析，透析比例1:20，换液3次，透析间隔不低于4小时。
119.s3、聚合型hbr-7处理，包括以下步骤：
120.s31、解透析袋，抗体在4℃下离心10min，离心时转速为9000rpm/min，400目滤布过滤抗体；
121.s32、使用nano300紫外分光光度计测定抗体浓度，用0.01m pbs(ph7.4) 2％甘油缓冲液稀释至12.5mg/ml，将抗体浓度乘以系数0.8，即为最终浓度并记录测量结果；
122.s33、所述步骤s32中处理好的抗体中加入0.1％抗体体积的proclin300防腐剂，混合均匀，使用0.22μm滤膜过滤；抗体外观为淡黄色透明液体，无明显沉淀和絮状物；4℃保存，避免冻融；使用时，用10mm pbs(ph7.4)稀释，使用浓度≤25μg/ml。
123.s4、缓冲液及保存液的配制，包括：
124.s41、制备交联缓冲液60mm醋酸，ph6.0：
[0125][0126][0127]
用电子天平称取4.059g三水合乙酸钠，量取7.2ml 36％乙酸，倒入1l烧杯中，再加入纯化水，搅拌溶解，2.5m naoh调节ph至6.0，纯化水定容至1l；
[0128]
s42、制备透析缓冲液10mm pbs，ph7.2：
[0129]
品名原料来源1l标准量na2hpo4·
12h2o北京益利2.87gnah2po4·
2h2o北京益利0.31gnacl北京益利9g纯化水自制，质检合格定容至1l
[0130]
用电子天平称取2.87g na2hpo4·
12h2o、0.31g nah
2 po4·
2h2o和9g nacl，倒入1l烧杯中，再加入纯化水，搅拌溶解，2.5m naoh调ph至7.2，纯化水定容至1l；
[0131]
s43、制备透析缓冲液10mm pbs，ph7.4：
[0132]
品名原料来源1l标准量na2hpo4·
12h2o北京益利2.87gnah2po4·
2h2o北京益利0.31gnacl北京益利9g纯化水自制，质检合格定容至1l
[0133]
用电子天平称取2.87g na2hpo4·
12h2o、0.31g nah
2 po4·
2h2o和9g nacl，倒入1l烧杯中，再加入纯化水，搅拌溶解，2.5m naoh调ph至7.4，纯化水定容至1l；
[0134]
s44、制备0.1m甘氨酸缓冲液，ph2.7：
[0135]
品名原料来源1l标准量甘氨酸北京益利7.51g纯化水自制，质检合格定容至1l
[0136]
用电子天平称取7.51g甘氨酸，倒入1l烧杯中，再加入纯化水，搅拌溶解，用浓盐酸调ph至2.7，纯化水定容至1l；
[0137]
s45、制备5m nacl：
[0138][0139][0140]
用电子天平称取292.2g nacl，倒入1l烧杯中，再加入超纯水，搅拌溶解，超纯水定容至1l，
[0141]
s46、制备2m tris，ph8.0：
[0142]
品名原料来源1l标准量tris北京益利242.18g纯化水自制，质检合格定容至1l
[0143]
用电子天平称取242.18g tris，倒入1l烧杯中，再加入纯化水，搅拌溶解，用浓盐酸调ph至8.0，纯化水定容至1l；
[0144]
s47、制备保存缓冲液0.01m ph7.4的pbs 2％甘油：
[0145]
品名原料来源1l标准量na2hpo4·
12h2o北京益利2.87gnah2po4
·
2h2o北京益利0.31gnacl北京益利9g甘油北京益利20ml纯化水自制，质检合格定容至1l
[0146]
用电子天平称取2.87g na2hpo4·
12h2o、0.31g nah2po4·
2h2o、9g nacl和20ml甘油，倒入1l烧杯中，再加入纯化水，搅拌溶解，2.5m naoh调ph至7.4，纯化水定容至1l。
[0147]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发
明的保护范围。